Artigo de método

Imagens ao vivo para quantificar a radiossensibilidade celular em organoides tumorais derivados de pacientes

DOI:

10.3791/66680

⸱

5 de abril de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Weill Cornell Medical College, 2Sandra and Edward Meyer Cancer Center, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 4Caryl and Israel Englander Institute for Precision Medicine, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, detalhamos uma abordagem direta de imagem ao vivo para quantificar a sensibilidade dos organoides tumorais derivados do paciente à radiação ionizante.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A radioterapia (RT) é um dos pilares do tratamento clínico moderno do câncer. No entanto, nem todos os tipos de câncer são igualmente sensíveis à irradiação, muitas vezes (mas nem sempre) devido às diferenças na capacidade das células malignas de reparar danos oxidativos ao DNA provocados por raios ionizantes. Os ensaios clonogênicos têm sido empregados há décadas para avaliar a sensibilidade das células cancerígenas cultivadas à irradiação ionizante, principalmente porque as células cancerígenas irradiadas geralmente morrem de maneira tardia que é difícil de quantificar com técnicas assistidas por citometria de fluxo ou microscopia de curto prazo. Infelizmente, os ensaios clonogênicos não podem ser empregados como tal para modelos tumorais mais complexos, como organoides tumorais derivados de pacientes (PDTOs). De fato, a irradiação de PDTOs estabelecidos pode não necessariamente anular seu crescimento como unidades multicelulares, a menos que seu compartimento semelhante a um tronco seja completamente erradicado. Além disso, a irradiação de suspensões unicelulares derivadas de PDTO pode não recapitular adequadamente a sensibilidade das células malignas à RT no contexto de PDTOs estabelecidos. Aqui, detalhamos uma adaptação de ensaios clonogênicos convencionais que envolve a exposição de PDTOs estabelecidos à radiação ionizante, seguida de dissociação de célula única, replaqueamento em condições de cultura adequadas e imagens ao vivo. As células-tronco derivadas de PDTO não irradiadas (controle) reformam PDTOs em crescimento com uma eficiência específica de PDTO, que é influenciada negativamente pela irradiação de maneira dose-dependente. Nessas condições, a eficiência de formação de PDTO e a taxa de crescimento podem ser quantificadas como uma medida de radiossensibilidade em imagens de lapso de tempo coletadas até que as PDTOs de controle atinjam uma ocupação de espaço predefinida.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A radioterapia de feixe externo (RT) é um dos pilares da oncologia moderna, refletindo não apenas uma atividade anticancerígena pronunciada associada a um espectro bem definido de efeitos colaterais geralmente gerenciáveis1, mas também uma disponibilidade clínica excepcionalmente ampla (a maioria dos centros de câncer nos países desenvolvidos está equipada com aceleradores lineares modernos para RT de feixe externo)2. Em consonância com essa noção, a RT é globalmente empregada com sucesso tanto para fins curativos, geralmente no contexto da doença em estágio inicial 3,4, quanto para aplicações paliativas, para conter sintomas (por exemplo, dor) de tumores metastáticos5. Dito isto, nem todas as malignidades são igualmente sensíveis à RT, refletindo uma série de características intrínsecas e microambientais das células cancerígenas 6,7,8,9. Como um exemplo autônomo, várias alterações genéticas e epigenéticas associadas ao câncer que influenciam o reparo do DNA e a homeostase redox foram associadas ao aumento ou diminuição da radiossensibilidade intrínseca, refletindo em grande parte a capacidade da RT de matar células cancerígenas, causando danos diretos e dependentes de espécies reativas de oxigênio (ROS) ao DNA e outras macromoléculas 10,11,12,13.

Nas últimas décadas, ensaios clonogênicos têm sido rotineiramente empregados para avaliar a radiossensibilidade de células cancerígenas humanas e murinas cultivadas 14,15,16. De fato, enquanto os quimioterápicos e outros estressores geralmente matam células malignas de maneira bastante rápida, a RT empregada em doses clinicamente relevantes na maioria das vezes provoca uma forma retardada de morte celular que não pode ser simplesmente quantificada com técnicas assistidas por citometria de fluxo ou microscopia de curto prazo, como medir a captação celular de corantes vitais (que coram seletivamente as células mortas) 24-72 h após a exposição a um estímulo citotóxico17. Além de serem simples e dependerem de reagentes bastante baratos, os ensaios clonogênicos têm sido particularmente convenientes, pois permitem a implementação do chamado modelo "quadrático linear", que é uma ferramenta matemática bastante simples para a análise quantitativa da resposta à dose de RT18,19. Na mesma linha, as células cancerígenas cultivadas (incluindo linhagens celulares estabelecidas, bem como células primárias derivadas de pacientes) forneceram uma plataforma conveniente para testar vários aspectos da biologia do câncer, incluindo (mas não se limitando a) sensibilidade ao tratamento de maneira bastante direta, mas simplificada, sendo uma das principais limitações a ausência de um microambiente tumoral estruturado (TME) 20 , 21. De fato, as culturas de células cancerígenas bidimensionais são intrinsecamente incapazes de recapitular as comunicações e interações célula-célula com a matriz extracelular e como ocorrem no câncer22,23. Os organoides tumorais derivados de pacientes (PDTOs) surgiram como modelos tumorais que, pelo menos em parte, contornam essa limitação 24,25,26.

Infelizmente, os ensaios clonogênicos convencionais não podem ser empregados para avaliar a radiossensibilidade das PDTOs. Por um lado, a irradiação de PDTOs estabelecidos pode não comprometer necessariamente seu crescimento como uma unidade multicelular, a menos que seu compartimento semelhante a um tronco - que é responsável pela formação e maturação de PDTOs, mas exibe maior resistência a danos ao DNA em comparação com células compostas por PDTO mais diferenciadas27 - seja completamente erradicado. Por outro lado, a irradiação de suspensões unicelulares derivadas de PDTO pode não recapitular adequadamente a radiossensibilidade das células que compõem PDTO (incluindo células-tronco), conforme exibido no contexto de PDTOs formadas. Aqui, detalhamos uma técnica que aproveita imagens ao vivo de PDTOs de câncer de mama para monitorar a eficácia na formação de PDTO e a taxa de crescimento de células derivadas de PDTO previamente expostas à irradiação ionizante em comparação com suas contrapartes não irradiadas. Com as variações necessárias refletindo amplamente a biologia diferencial de PDTOs individuais (por exemplo, requisitos de meios de cultura, taxa de crescimento), esperamos que este protocolo seja adequado para o estudo da radiossensibilidade em um amplo painel de PTDOs de origem mamária e não mamária.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura organoide

NOTA: Os PDTOs TNBC#1 foram estabelecidos em nosso laboratório com base em tecido tumoral removido cirurgicamente de uma paciente com câncer de mama triplo-negativo (TNBC) que forneceu consentimento informado para participar de um protocolo de biobanco (IRB21-06023682). Após validação por histologia e sequenciamento de RNA (RNAseq), os PDTOs TNBC # 1 são cultivados em gotas de matrigel a 66% (as chamadas 'cúpulas') em meio de cultura DMEM / F12 enriquecido (Tabela 1) e passados a cada 2-3 semanas na proporção de 1: 2-1: 1028.

  1. Semear PDTOs na proporção de 1:2-1:10 cerca de 2 semanas antes da irradiação em placas separadas e não aderentes de 6 poços, uma por cada dose de radiação testada (mais controles negativos, que serão fornecidos por PDTOs não expostos à radiação ionizante).
  2. Adicione 3 mL de meio de cultura DMEM/F12 enriquecido fresco aos PDTOs a cada 3-4 dias.
    NOTA: As condições de semeadura e cultura podem exigir alguma adaptação para evitar que os PDTOs adquiram uma aparência muito reconhecível, semelhante a um anel, indicativa de necrose do núcleo ao microscópio e para garantir a viabilidade ideal na irradiação.

2. Radiação

  1. Os PDTOs estão prontos para irradiação quando atingem o tamanho médio (aproximadamente 100 μm, conforme determinado preliminarmente em microscopia de campo claro com uma referência de escala) e ocupação da cúpula (aproximadamente 80%). Passe os PDTOs nesta fase para evitar superlotação.
  2. Irradie as cúpulas contendo PDTO usando o irradiador Small Animal Research Radition Platform (SARRP) (ou um irradiador alternativo para aplicações in vitro ou in vivo ) em modo de campo aberto (sem colimador), fornecendo doses únicas de 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy e 10 Gy. As TDTO não irradiadas proporcionam condições adequadas de controlo negativo.
    NOTA: A calibração do teste de dosimetria deve ser realizada antes de cada experimento para garantir que os PDTOs fechados com Matrigel recebam a dose de radiação planejada. Essas doses foram escolhidas com base em avaliações preliminares da radiossensibilidade dos PDTOs TNBC#1 e, portanto, podem exigir ajustes para outros PDTOs.

3. Dissociação

  1. Imediatamente após a irradiação, lave cada cúpula de matrigel contendo PDTO com 2 mL de meio de cultura DMEM/F12 enriquecido e ressuspenda-os em 1-3 mL de TrypL-E usando uma micropipeta p1000. Repita cerca de 30 vezes para cada poço.
  2. Colete a suspensão celular em um tubo de centrífuga de 50 mL e incube por ~ 5 min em banho-maria a 37 ° C.
  3. Pulverize as células centrifugando-as a 800 x g por 5 min em temperatura ambiente.
  4. Remova o excesso de TrypL-E para deixar ~ 1 mL no tubo e adicione 3x o volume enzimático original (consulte a etapa 3.1) do meio DMEM / F12 enriquecido para lavar as células.
  5. Filtrar a suspensão celular com um filtro de malha de 40 μm. Esta etapa garante que nenhum aglomerado de células permaneça no plaqueamento e que cada novo PDTO se origine de uma única célula.
  6. Conte as células em um contador de células automatizado após a coloração com 10% de azul de tripano em PBS e ressuspenda-as para ter 800 células em 50 μL de meio DMEM / F12 enriquecido mais 66% de matrigel a 4 ° C (condições para 1 cúpula).
  7. Placa cada cúpula em um poço individual a partir de uma placa de cultura de 48 poços compatível com imagens ao vivo, evitando a formação de bolhas. Recomenda-se triplicados técnicos para cada dose de radiação.
  8. Coloque as placas em uma incubadora de cultura de células (37 ° C, 5% CO2) por 30 min para solidificar o matrigel.
  9. Adicione 0,5-1 mL de meio DMEM/F12 enriquecido, remova bolhas potenciais e coloque placas no sistema de imagem ao vivo dentro de uma incubadora de cultura de células. Deixe a placa se equilibrar até a temperatura definida por cerca de 30 min antes de fazer a imagem.
    NOTA: O Matrigel solidifica a temperaturas >4 °C, o que implica que esta temperatura deve ser preservada até que a solidificação seja necessária.

4. Imagem ao vivo

  1. No software Incucyte, selecione Agendar para adquirir.
  2. Clique no sinal de mais no canto superior esquerdo de Launch Add Vessel.
  3. Para verificar repetidamente ou uma vez, selecione Verificar ao agendar e clique em Avançar.
  4. Para criar ou restaurar embarcação, selecione Criar nova embarcação e clique em Avançar.
  5. Para selecionar o tipo de digitalização, selecione Organoide e clique em Avançar.
  6. Definições de digitalização: Escolha QC < ' Fase + Canais de Imagem de Campo Claro. '4x Objetivo' é selecionado automaticamente. Em seguida, clique em Avançar.
  7. Seleção de embarcações: Escolha a chapa validada por software apropriada de acordo com o número de catálogo.
  8. Localização da embarcação: Selecione a localização da placa no instrumento de acordo com o layout e clique em Avançar.
  9. Padrão de digitalização: Selecione os poços de acordo com o layout da placa e clique em Avançar.
  10. Caderno do Navio: Placa de identificação (opcional: nome, tipo de célula e passagem). Crie um mapa de placas clicando no sinal de mais no canto superior direito do layout da placa, 'Criar mapa de placas'.
  11. No Editor de mapa de placas, indique o tipo de célula clicando no ícone Criar nova célula na seção Células , aplique aos poços apropriados clicando no ícone de adição e selecione os poços apropriados. Opcional: O número de células e passagens semeadas pode ser indicado. Repita para cada linha celular.
  12. Indique o tratamento clicando no ícone Criar nova célula na seção Condições de crescimento , aplique aos poços apropriados clicando no ícone de adição e selecione os poços apropriados. Repita para cada condição experimental. Em seguida, clique em OK > Avançar.
  13. Configuração de análise: 'Adiar análise até mais tarde' é selecionado automaticamente; Clique em Avançar.
  14. Agendamento de verificação: Escolha digitalizar duas vezes por dia, indefinidamente. Clique em Avançar. Monitore a escuridão dos PDTOs de controle para obter o ponto final ideal, pois eles tendem a entrar em colapso quando crescidos demais.
  15. Resumo: Confira o resumo e clique em Adicionar ao Agendamento.
    NOTA: As propriedades de digitalização podem ser visualizadas e a programação pode ser editada, se necessário, clicando com o botão direito do mouse na linha do tempo de digitalização.

5. Análise

  1. No software compatível, selecione Exibir. Isso também pode ser operado a partir de um computador conectado ao sistema via intranet.
  2. Selecione o experimento desejado clicando duas vezes nele.
  3. Selecione o ícone Iniciar análise .
  4. Selecione Criar nova definição de análise e clique em Avançar.
  5. Tipo de análise: Selecione Organoide e clique em Avançar.
  6. Canais de imagem: 'Fase + Campo claro' é selecionado por padrão, clique em 'Avançar'.
  7. Selecione um conjunto de imagens representativas para análise. Clique em Avançar. Recomenda-se escolher pontos de tempo precoces e tardios e diferentes condições de tratamento, por exemplo, controle e diferentes doses de radiação.
  8. Execute a Definição de Análise para TNBC#1 seguindo as etapas abaixo:
    1. Na imagem: Selecione Visualizar atual ou 'Visualizar tudo' para visualizar a máscara padrão das imagens atuais ou selecionadas. Repita à medida que os parâmetros de análise são alterados para atualizar a máscara.
    2. Segmentação: Defina o Raio para 300, o Fundo de Sensibilidade para 80, a Divisão de Borda para ON e a Sensibilidade de Borda para 70.
    3. Limpeza: Defina o preenchimento do orifício para 5E+05 μm2 e ajuste o tamanho para 0 pixels.
    4. Filtros: Não defina nenhuma área mínima ou máxima, excentricidade mínima definida como 0,19 e nenhuma excentricidade máxima. Clique em Avançar.
  9. Tempos e poços de varredura: Selecione todos os pontos de tempo e poços de varredura desejados. Clique em Avançar. Opcional: Selecione Analisar Verificações Futuras.
  10. Salvar e aplicar definição de análise: Insira o nome da definição e clique em Avançar.
  11. Visualize o Resumo e clique em Concluir.
  12. Uma janela pop-up é exibida para informar ao usuário que a análise entrou na Fila de Análise. Clique em OK. Quando a janela Fila de Análise for aberta, as tarefas restantes poderão ser visualizadas.
  13. Se necessário, recupere a análise concluída na Visualização selecionando a seta azul na coluna Análises , ao lado do Nome da embarcação e clicando com o botão direito do mouse no Nome da definição de análise. Em seguida, visualize os dados brutos no software clicando em Métricas de análise gráfica ou exporte para análise adicional selecionando Exportar definição de análise.
    NOTA: A exportação de dados brutos pode ser personalizada na janela Métricas de análise de gráfico . A Contagem de Organoides, a Área Total, a Excentricidade Média e a Escuridão podem ser exportadas separadamente e os dados organizados no menu suspenso Selecionar Agrupamento clicando em Nenhum, Colunas, Linhas ou Replicações de Mapa de placas. Para TNBC#1, para exportação de dados brutos, Métricas de Análise de Gráfico e para a opção de rolagem Selecionar Agrupamento , a opção Nenhum foi escolhida. Esses parâmetros de importação foram escolhidos com base em avaliações preliminares com TNBC#1 PDTOs. Portanto, eles podem exigir ajustes para outros PDTOs, o que é possível no software com base nos recursos de "Visualização". Recomendamos adaptar os parâmetros de importação em (1) imagens iniciais que contêm principalmente células únicas ou pequenos PDTOs, e (2) imagens coletadas em pontos de tempo tardios para garantir que grandes PDTOs também sejam adquiridos em condições de controle e tratadas.

Resultados

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Os PDTOs TNBC#1 foram expostos a uma dose única de radiação de 0 (controles não irradiados), 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy ou 10 Gy no dia 0. Imediatamente após, os PDTOs foram dissociados para obter uma suspensão unicelular para cada condição experimental. As células derivadas de PDTO foram semeadas em placas de 48 poços dentro de cúpulas de matrigel de 66% (50 μL cada) depositadas no centro dos poços, em 3 repetições técnicas por condição. As placas foram colocadas em um sistema de imagem ao vivo e fotografadas a cada 6 h usando a objetiva do módulo organoide 4X por um total de 30 dias. A irradiação de PDTOs TNBC#1 com RT em uma dose única de 2 Gy atrasou significativamente o crescimento de PDTO, enquanto doses de radiação ≥4 Gy (até 10 Gy) completaram a regeneração de PDTOs em crescimento (Figura 1).

figure-results-1
Figura 1: Imagens ao vivo de organoides tumorais derivados de pacientes (PDTOs). Os organoides tumorais derivados de pacientes TNBC#1 (PDTOs) de câncer de mama foram deixados sem tratamento ou expostos à dose de radiação indicada, logo seguidos por dissociação, replaqueamento e imagem com um sistema de imagem de células vivas. Imagens representativas após ajuste de contraste (A) e avaliações quantitativas (B, média ± EPM) são relatadas. Escala da imagem: 1,19 x 1,16 mm (1,38 mm2). Barra de escala: 400 μm; inserções: 200 μm. ****p < 0,001 (ANOVA de duas vias, em comparação com 0 Gy); ####p < 0,001 (ANOVA de duas vias, em comparação com 2 Gy). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ComponenteConcentração
DMEM F/121X
GlutaMax1X
Hepes10 mM
PenStrep100 U/mL
B271X
Nac1,25 mM
Nicotinamida10 mM
Inibidor do Receptor TGFbeta A83-010,5 μM
p38 inibidor de MAP p38i SB2021901 μM
Cabeça10%
Mídia Rspondin10%
FGF1020 ng/mL
FGF75 ng/mL
NR (Heregulin)5 nM
Primocin100 μg/mL
Y-27632 (RhoKi)5 μM
Fator de crescimento epidérmico hEGF5 ng/mL

Tabela 1: Composição do meio de cultura PDTO.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos uma adaptação de ensaios clonogênicos convencionais que aproveita PDTOs de câncer de mama e imagens ao vivo para quantificar a radiossensibilidade do PDTO com base em (1) a persistência de células-tronco formadoras de PTDO após a irradiação de PDTO in vitro e (2) a taxa de crescimento dos PDTOs que essas células (podem) gerar. As etapas críticas deste protocolo incluem (1) o estabelecimento de PDTOs para uma ocupação de cúpula que permita boa viabilidade, (2) exposição de PDTO à irradiação ionizante em diferentes doses, incluindo condições de controle irradiadas simuladas; (3) dissociação de PDTO em células únicas; (4) replaqueamento de células individuais derivadas de PDTO; e (5) imagens ao vivo até uma ocupação de cúpula predefinida em condições de controle.

Com modificações mínimas, principalmente ligadas à eficiência de formação de PDTO e à taxa de crescimento de PDTO em condições de controle (que provavelmente variam consideravelmente entre diferentes PDTOs), esperamos que este protocolo seja adaptável a várias plataformas de imagem ao vivo disponíveis comercialmente, bem como a vários PDTOs, de derivação mamária e não mamária. Por um lado, espera-se que a eficiência basal de formação de PDTO na dispersão de uma única célula influencie o número de células individuais a serem replantadas para obter novas PDTOs em uma densidade que permita não apenas a quantificação de PDTO baseada em imagem, mas também o crescimento normal de PDTOs não tratados. Por outro lado, espera-se que a taxa de crescimento da PDTO afete a duração do ensaio, pois a fusão de PDTOs adjacentes deve ser evitada para preservar as capacidades analíticas ideais. Assim, determinar a eficiência de formação de PDTO e a taxa de crescimento de PDTO em condições de controle para cada PDTO individual é fundamental para a correta implementação deste protocolo.

Embora esse método seja bastante simples, ele tem algumas limitações. Primeiro, um número excessivamente baixo de células formadoras de PDTO pode prejudicar a regeneração de PDTOs em crescimento normal após a dissociação de uma única célula. De fato, embora a passagem rotineira do PDTO possa ser alcançada por dissociação incompleta, as avaliações quantitativas, oferecidas por este protocolo, dependem da geração de uma suspensão unicelular (que pode ser confirmada visualmente durante a contagem). Em segundo lugar, uma taxa de crescimento excessivamente lenta pode estender consideravelmente a duração do ensaio e potencialmente resultar em uma estimativa imprecisa da radiossensibilidade. De fato, é concebível que um tempo de cultura prolongado, conforme necessário para que PDTOs de crescimento lento atinjam um tamanho compatível com o ponto final, possa oferecer chances extras para que as células formadoras de PDTO subletalmente irradiadas se recuperem do estresse e restaurem PDTOs detectáveis (embora de crescimento lento). Finalmente, espera-se que a dissociação de PDTOs logo após a irradiação imponha estresse adicional às células formadoras de PDTO, potencialmente aumentando a radiossensibilidade como resultado de comunicações célula-célula alteradas nas fases iniciais de recuperação. Atrasar a dissociação de 24-72 h pode fornecer informações sobre a contribuição relativa das comunicações célula-célula preservadas para a capacidade das células formadoras de PDTO de se recuperarem de danos macromoleculares impostos pela RT.

Embora as plataformas de imagem ao vivo ofereçam um método conveniente para monitorar longitudinalmente a formação e o crescimento de PDTO, imagens de ponto único também podem ser usadas para o mesmo objetivo. Nesse caso, deve-se prestar atenção para garantir que os PDTOs adjacentes não se fundam antes da imagem, e a taxa de crescimento pode ser avaliada em função do tamanho do PDTO normalizado para a duração do ensaio.

Na era da medicina personalizada do câncer, avaliar a sensibilidade de tumores individuais ao tratamento é de extrema importância, pois fornece algumas dicas para o desenho de estratégias terapêuticas individualizadas com maior eficácia29. O protocolo aqui descrito se encaixa nesse esforço, fornecendo uma abordagem conveniente para estimar a sensibilidade celular de PDTOs individuais à radiação ionizante (isoladamente ou combinada com outras modalidades terapêuticas). Dito isso, ainda não foi demonstrado se a medição da radiossensibilidade das células cancerígenas a partir de PDTOs prevê com precisão a resposta de pacientes individuais com câncer à RT focal. Correlacionar a radiossensibilidade de PDTOs distintos à irradiação com a resposta clínica à RT de seus respectivos doadores fornecerá informações importantes sobre essa possibilidade.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sem relação com este trabalho, o SCF é/tem mantido contratos de pesquisa com a Merck, Varian, Bristol Myers Squibb, Celldex, Regeneron, Eisai e Eli-Lilly, e recebeu honorários de consultoria/assessoria da Bayer, Bristol Myers Squibb, Varian, Elekta, Regeneron, Eisai, AstraZeneca, MedImmune, Merck US, EMD Serono, Accuray, Boehringer Ingelheim, Roche, Genentech, AstraZeneca, View Ray e Nanobiotix. Sem relação com este trabalho, a SD recebeu honorários de consultoria/assessoria da Lytix Biopharma, EMD Serono, Ono Pharmaceutical, Genentech e Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc., e é/tem mantido contratos de pesquisa com a Lytix Biopharma, Nanobiotix e Boehringer-Ingelheim. Não relacionada a este trabalho, a LG é/tem mantido contratos de pesquisa com a Lytix Biopharma, Promontory e Onxeo, recebeu honorários de consultoria/assessoria da Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, OmniSEQ, Onxeo, The Longevity Labs, Inzen, Imvax, Sotio, Promontory, Noxopharm, EduCom e Luke Heller TECPR2 Foundation, e detém opções de ações da Promontory.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Raymond Briones e Wen H. Shen (Weill Cornell Medical College, Nova York, NY, EUA) por sua ajuda no desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi apoiado por uma Concessão Transformativa do Consórcio de Câncer de Mama do US DoD BCRP (#W81XWH2120034, PI: Formenti).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
40 µ Filtro de malha MThomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Celômetro Auto T4 Contador de Células de Campo BrilhanteNexcelom
DMEM F/12Corning 12634-010
Fator de Crescimento Epidérmico hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL Microscópio de Fluorescência Digital Invertido Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 
HepesInvitrogen 15630-080
Software IncuCyte 2021AVersão Sartorius: 2021A
Incucyte SX1Modelo SX1Incucyte
validado 48 placa de poçosCorning 3548
MatrigelDiscovery Labware354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
NicotinamidaSigma-AldrichN0636
NogginComprado do Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, EUA
Placa de 6 poços não tratadaCellstar657 185
NR (Heregulin)Peprotech100-03
p38 inibidor de MAP p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBSCorning 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin MediaComprado do Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, EUA Plataforma de
Pesquisa de Radiação de Pequenos Animais (SARRP) Inibidor
Ltd TGFbeta
35050061 A83-01 Tocris 2939 do receptor de Xstrahl Mancha azul de tripano (0,4%)Gibco 15250-61 TrypLE Gibco 112605-028 Y-27632 (RhoKi)Selleck S1049

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Ruysscher, D., et al. Radiotherapy toxicity. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 13(2019).
  2. Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for prostate cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 111, 3, Supplement e351-e352 (2021).
  3. Harmenberg, U., Hamdy, F. C., Widmark, A., Lennernäs, B., Nilsson, S. Curative radiation therapy in prostate cancer. Acta Oncol. 50, Suppl 1 98-103 (2011).
  4. Nakano, T., Ohno, T., Ishikawa, H., Suzuki, Y., Takahashi, T. Current advancement in radiation therapy for uterine cervical cancer. J Radiat Res. 51 (1), 1-8 (2010).
  5. Spencer, K., Parrish, R., Barton, R., Henry, A. Palliative radiotherapy. BMJ. 360, k821(2018).
  6. Price, J. M., Prabhakaran, A., West, C. M. L. Predicting tumour radiosensitivity to deliver precision radiotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 20 (2), 83-98 (2023).
  7. McLaughlin, M., et al. Inflammatory microenvironment remodelling by tumour cells after radiotherapy. Nat Rev Cancer. 20 (4), 203-217 (2020).
  8. Rodriguez-Ruiz, M. E., Vitale, I., Harrington, K. J., Melero, I., Galluzzi, L. Immunological impact of cell death signaling driven by radiation on the tumor microenvironment. Nat Immunol. 21 (2), 120-134 (2020).
  9. Cytlak, U. M., et al. Immunomodulation by radiotherapy in tumour control and normal tissue toxicity. Nat Rev Immunol. 22 (2), 124-138 (2022).
  10. Hanahan, D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).
  11. Groelly, F. J., Fawkes, M., Dagg, R. A., Blackford, A. N., Tarsounas, M. Targeting DNA damage response pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 23 (2), 78-94 (2023).
  12. Renaudin, X. Reactive oxygen species and DNA damage response in cancer. Int Rev Cell Mol Biol. 364, 139-161 (2021).
  13. Klapp, V., et al. The DNA damage response and inflammation in cancer. Cancer Discov. 13 (7), 1521-1545 (2023).
  14. Constanzo, J., Garcia-Prada, C. D., Pouget, J. P. Clonogenic assay to measure bystander cytotoxicity of targeted alpha-particle therapy. Methods Cell Biol. 174, 137-149 (2023).
  15. Serrano-Mendioroz, I., Garate-Soraluze, E., Rodriguez-Ruiz, M. E. A simple method to assess clonogenic survival of irradiated cancer cells. Methods Cell Biol. 174, 127-136 (2023).
  16. Petroni, G., et al. Radiotherapy delivered before CDK4/6 inhibitors mediates superior therapeutic effects in ER(+) breast cancer. Clin Cancer Res. 27 (7), 1855-1863 (2021).
  17. Alvarez-Abril, B., et al. Cytofluorometric assessment of acute cell death responses driven by radiation therapy. Methods Cell Biol. 172, 17-36 (2022).
  18. Bodey, R. K., Evans, P. M., Flux, G. D. Application of the linear-quadratic model to combined modality radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 59 (1), 228-241 (2004).
  19. Unkel, S., Belka, C., Lauber, K. On the analysis of clonogenic survival data: Statistical alternatives to the linear-quadratic model. Radiat Oncol. 11, 11(2016).
  20. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  21. Buqué, A., Galluzzi, L. Modeling Tumor immunology and immunotherapy in mice. Trends Cancer. 4 (9), 599-601 (2018).
  22. Lee, S. Y., Bissell, M. J. A Functionally robust phenotypic screen that identifies drug resistance-associated genes using 3D cell culture. Bio Protoc. 8 (22), e3083(2018).
  23. Mina, J. Bissell: Context Matters. Trends Cancer. 1 (1), 6-8 (2015).
  24. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  25. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  26. van Renterghem, A. W. J., van de Haar, J., Voest, E. E. Functional precision oncology using patient-derived assays: Bridging genotype and phenotype. Nat Rev Clin Oncol. 20 (5), 305-317 (2023).
  27. Vitale, I., Manic, G., De Maria, R., Kroemer, G., Galluzzi, L. DNA damage in stem cells. Mol Cell. 66 (3), 306-319 (2017).
  28. Sachs, N., et al. A Living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  29. Zhou, Z., et al. Harnessing 3D in vitro systems to model immune responses to solid tumours: A step towards improving and creating personalized immunotherapies. Nat Rev Immunol. 24, 18-32 (2024).

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