Aqui apresentamos um procedimento padronizado para intubação endotraqueal via traqueotomia seguida de toracotomia em ratos, com o objetivo de aumentar a precisão e reprodutibilidade de aplicações de não sobrevivência que requerem ventilação invasiva e exposição de órgãos torácicos em modelos in vivo de ratos.
Artigo de método
Intubação endotraqueal via traqueotomia e subsequente toracotomia em ratos para aplicações de não sobrevivência
Neste artigo
Resumo
Resumo
A intubação endotraqueal e a ventilação subsequente são frequentemente requisitos básicos para a pesquisa translacional em modelos de ratos para várias intervenções que requerem pressões de ventilação controladas ou altas ou acesso à cavidade torácica e órgãos. A intubação endoorotraqueal convencional usando a via anatomicamente existente através da boca é adequada para experimentos de sobrevivência. No entanto, esse procedimento apresenta alguns desafios, incluindo níveis geralmente mais altos de experiência e habilidade técnica necessárias, equipamentos mais avançados e maior esforço de tempo com taxas de falha de intubação relevantes e complicações, como perfuração traqueal, hipooxigenação sistêmica temporária e vazamento aéreo relevante.
Este manuscrito, portanto, apresenta um protocolo passo a passo detalhado para intubação endotraqueal por traqueotomia em modelos de ratos não sobreviventes, quando é necessário sucesso de intubação garantido, níveis constantes de oxigenação, altas pressões de ventilação ou toracotomia aberta.
O protocolo enfatiza a importância da técnica cirúrgica meticulosa para garantir resultados consistentes e confiáveis, especialmente para pesquisadores inexperientes ou sem rotina na técnica de intubação endoorotraqueal via laringoscopia direta. Espera-se, portanto, que este procedimento minimize o sofrimento dos animais e as perdas desnecessárias dos animais.
Introdução
Em geral, os roedores são capazes de compensar o desconforto respiratório por muito mais tempo do que os pacientes. Podem permanecer cardiocirculatórias estáveis e suficientes sob ventilação espontânea por muito mais tempo e durante procedimentos mais invasivos, por exemplo, mesmo através do transplante hepático, que é conhecido por ser um dos procedimentos mais estressantes paraa circulação cardiopulmonar1,2,3.
No entanto, a intubação endotraqueal é um requisito básico para a pesquisa translacional em modelos de ratos para vários ambientes e intervenções originadas de uma variedade de campos biomédicos e é essencial no cenário científico atual 4,5,6,7,8,9,10,11 . Embora a maioria dos trabalhos experimentais em animais de laboratório realizados em ratos em geral ainda não exija ventilação invasiva12, existem certas configurações experimentais que requerem intubação e assistência ventilatória controlada. Essas configurações experimentais incluem qualquer experimento que exija uma via aérea segura, altas pressões de ventilação e laparoscopia ou acesso direto à cavidade torácica e aos órgãos.
Especialmente no caso de acesso necessário à cavidade torácica e aos órgãos, a intubação endotraqueal é imperativa, pois o colapso do pulmão resultará em uma insuficiência respiratória fatal, uma vez que a pressão negativa no espaço intrapleural e o mecanismo de inspiração pelos músculos intercostais e pelo diafragma são perdidos13.
Embora existam muitas publicações sobre métodos de intubação endoorotraqueal não invasiva em roedores 14,15,16,17, parece haver uma falta de protocolos de procedimento para intubação endotraqueal invasiva por traqueostomia. Apesar da invasividade deste último, que só permite a aplicação em modelos animais não sobreviventes, há grandes vantagens da intubação via traqueostomia. Isso inclui uma curva de aprendizado mais íngreme, taxas de sucesso mais altas e persistentes, menos equipamentos técnicos necessários e melhores oportunidades de monitoramento de sucesso18,19.
O sucesso da intubação é essencial para o resultado. Embora várias intubações falsas, bem como tentativas repetidas de intubação em pacientes, estejam claramente associadas a eventos adversos e complicações tão graves quanto a morte20,21, tais eventos também são deletérios em animais de teste. Na melhor das hipóteses, eles representam uma forte variável de confusão no experimento, mas também podem levar à perda desnecessária do animal. Portanto, faz sentido aumentar as taxas de sucesso da intubação ao custo da não invasividade, se a configuração e a estratégia experimentais permitirem.
Este protocolo padronizado de intubação via traqueotomia cirúrgica oferece várias vantagens, incluindo variabilidade reduzida nas taxas de sucesso da intubação, efeitos minimizados nos parâmetros da fisiologia cardiorrespiratória e controle investigativo completo e manipulação de parâmetros. Ele ajuda a fornecer uma via aérea segura, especialmente para pesquisadores inexperientes no procedimento de intubação endotraqueal via laringoscopia direta, e permite que os pesquisadores conduzam estudos de não sobrevivência com condições altamente controladas. Destacamos os principais pontos de referência anatômicos e fornecemos informações sobre a solução de problemas de desafios comuns encontrados durante o procedimento.
Protocolo
Todas as atividades com animais descritas aqui foram aprovadas pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) do Conselho Regional de Baden-Württemberg em Karlsruhe, Alemanha. Os animais experimentais foram gerenciados de acordo com os padrões institucionais e de acordo com as leis alemãs para uso e cuidados com os animais e de acordo com as diretrizes do Conselho da Comunidade Europeia (2010/63/UE), bem como as diretrizes ARRIVE, e foram conduzidos em instalações credenciadas. Foram utilizados ratos machos da raça Spraque Dawley da Janvier Labs com peso de 400 g.
1. Preparação do procedimento (Figura 1)
- Prepare os ganchos de preparação cirúrgica dobrando cânulas em um ângulo de 135° a 1 cm em relação à ponta, conectando-as a tubos de perfusão de plástico via Luer-lock e aplicando tensão usando uma pinça cirúrgica contra mosquitos (Figura 1A,B).
- Prepare um aparelho de exposição cirúrgica de roedores.
NOTA: Além da disponibilidade de plataformas comerciais, estas também podem ser facilmente autoconstruídas de forma econômica, como neste estudo.- Para isso, use uma placa de aço de 40 cm x 50 cm com 4 mm de espessura. Crie vários furos de 8 mm usando uma broca de aço no local desejado para os pontos de tensão subsequentes. Coloque as hastes de fixação em forma de Y nesses locais.
- Coloque uma almofada de aquecimento em cima da placa de aço do aparelho de exposição cirúrgica para fornecer suporte térmico.
- Prepare os ganchos de preparação cirúrgica com tubos de plástico acoplados e pinças cirúrgicas contra mosquitos para posteriormente aplicar tensão ao tecido para exposição cirúrgica.
- Remova o plugue de uma seringa de plástico de 10 mL com uma extremidade Luer-lock macho e corte a extremidade proximal da seringa. Insira a parte distal na bolsa de ventilação conforme ilustrado e feche-a hermeticamente, cobrindo-a com um tubo termoencolhível e aplicando calor suave usando uma tocha de laboratório (Figura 1D-F).
- Encurte e chanfre diferentes tamanhos de cateteres intravenosos e insira um fio-guia de um conjunto de cateterismo líder arterial com a extremidade do fio flexível na ponta no tamanho do cateter mais apropriado para o respectivo tamanho de animal (presumivelmente 14 G) para a técnica de Seldinger subsequente22,23 durante a intubação (Figura 1G,H).
Figura 1: Configuração experimental. (A) Uma cânula dobrada conectada a um tubo de perfusão usado como gancho de preparação cirúrgica. (B) Gancho de preparação com grampo posicionado em uma haste de fixação metálica. (C) Animal sedado antes da intervenção. (D) Bolsa de ventilação de neonatologia. (E-F) Montagem hermética de uma seringa Luer-lock na bolsa de ventilação usando um tubo termoencolhível. (G) Cateteres intravenosos encurtados e chanfrados em diferentes tamanhos com fio-guia de um conjunto de cateterismo líder arterial para a técnica de Seldinger. (H) Construção final feita sob medida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Anestesia e analgesia
- Anestesie o rato com a medicação de sua escolha.
NOTA: Aqui, a anestesia e a analgesia foram estabelecidas com cetamina 10% (100 mg/mL), xilazina 2% (20 mg/mL), carprofeno 50 mg/mL e isoflurano. Uma diluição de 1:10 de xilazina e carprofeno foi usada como soluções estoque para aplicação.- Induzir a anestesia colocando o animal em uma caixa de indução inundada com oxigênio a 100% a uma taxa de entrada de 5 L/min complementada por 4% (v) de isoflurano usando um vaporizador.
- Após a inconsciência, remova o animal da caixa de indução e injete (i.p.) com 100 mg / kg de peso corporal de cetamina e 4 mg / kg de peso corporal de xilazina.
NOTA: Isso corresponde a 40 mg de cetamina (0,4 mL da solução original) e 1,6 mg de xilazina (0,08 mL da solução original ou 0,8 mL da solução 1:10) para um animal de 400 mg. - Coloque o animal de volta na caixa de indução inundada com isoflurano até que o efeito da injeção intravenosa se instale.
- Garanta a profundidade anestésica adequada testando a falta de resposta do rato a uma pinça firme do dedo do pé.
- Aplique pomada oftálmica nos olhos.
- Avalie e mantenha a profundidade da anestesia durante a cirurgia.
- Quando os efeitos narcóticos parecerem diminuir com o tempo (aproximadamente a cada hora), injete (s.c) no animal 50 mg / kg de peso corporal de cetamina e 1 mg / kg de peso corporal de xilazina. Isso corresponde a 20 mg de cetamina (0,2 mL da solução original) e 0,4 mg de xilazina (0,2 mL da solução 1:10) para um animal de 400 mg.
- Forneça analgesia adicional antes da toracotomia com uma injeção s.c. de 5 mg / kg de peso corporal de carprofeno. Isso corresponde a 2 mg de carprofeno (0,04 mL da solução original ou 0,4 mL da solução 1:10) para um animal de 400 mg.
3. Preparo cirúrgico (Figura 2)
- Saturar a circulação animal com oxigênio, oferecendo inalação de oxigênio a 100% por meio de uma máscara neonatal transnasal (Figura 2A).
- Após 5 min, troque a máscara neonatal transnasal para a confecção de uma bolsa de ventilação neonatal com uma seringa plástica masculina com ponta Luer-lock conforme descrito acima e ofereça oxigênio em transbordamento com a ponta da seringa próxima à ponta nasal do animal (Figura 2B).
- Realize uma incisão na pele toracocervical mediana no comprimento desejado e exponha a situação cirúrgica usando os ganchos de preparação cirúrgica (Figura 2C,D).
- Avance a preparação por dissecção romba com tesoura fina através da fáscia cervical. Exponha o músculo esternocleidomastóideo e infra-hióideo e lateralize o músculo infra-hióideo mediano para a direita após a dissecção da membrana lateral esquerda (Figura 2E-G).
- Realize a dissecção romba em direção à traqueia e tunelização da traqueia usando pinças overholt (Figura 2H-I).
- Estilingue a traqueia usando uma alça de vaso de silicone e estilingue duplo a traqueia distal usando uma sutura de polifilamento para posterior fixação da cânula endotraqueal (Figura 2J-N).
Figura 2: Preparação da traqueia. (A) Inalação de oxigênio via máscara. (B) Mude da máscara para a seringa Luer-lock macho para aplicação de oxigênio. (C) Incisão cutânea toracocervical. (D) Preparação através da fáscia cervical. (E) exposição do músculo esternocleidomastóideo e do músculo infra-hióideo. (F) Lateralização do músculo infra-hióideo mediano. (G) Dissecção romba em direção à traqueia. (H) tunelização da traqueia usando pinças overholt. (I) Lançamento da traqueia usando uma alça de vaso de silicone. (J-N) Duplo slinging caudal da traqueia com sutura de polifilamento para posterior fixação da cânula endotraqueal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Procedimento de intubação (Figura 3)
- Alongue a traqueia com um alicate atraumático (Figura 3A, B).
- Realizar uma incisão parcial da traqueia de 180° de circunferência com tesoura (Figura 3C-F).
- Introduzir um fio-guia de Seldinger com a extremidade flexível na traqueia (Figura 3G-H) e, em seguida, introduzir o cateter intravenoso modificado de circunferência apropriada na traqueia guiado pelo fio de Seldinger (Figura 3I-N).
- Remova o fio de Seldinger (Figura 3O), conecte a ponta Luer-lock do cateter traqueal à bolsa de ventilação modificada e inicie uma ventilação manual suave e protetora dos pulmões com alta frequência e baixo volume corrente (Figura 3P). Realize a ventilação manual enquanto a toracotomia mediana não tiver sido realizada e o pulmão não estiver à vista.
- Amarre a sutura bloqueada previamente colocada com um nó deslizante para evitar vazamento aéreo e remoção acidental do cateter (Figura 3Q-T).
Figura 3: Intubação endotraqueal por traqueostomia. (A) Situação inicial após o preparo. (B) Alongamento caudal da traqueia com alicate atraumático. (C-F) Incisão parcial da traqueia de 180° de circunferência. (G, H) Introdução de um fio-guia de Seldinger na traqueia. (I-M) Introdução do cateter intravenoso modificado na traqueia guiado pelo fio de Seldinger. (NO) Remoção do fio de Seldinger. (P) Conexão Luer-lock do cateter traqueal à bolsa de ventilação modificada. (Q-T) Amarração da sutura bloqueada previamente colocada para evitar a remoção acidental do cateter. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Ventilação manual e toracotomia mediana (Figura 4)
- Inicie a toracotomia mediana a partir do xifóide usando uma tesoura de material rombudo e estável (Figura 4A,B) e continue cranialmente através do esterno. Sempre pausar a ventilação por alguns segundos ao avançar com a tesoura subesternalmente e ao cortar para evitar trauma no pulmão (Figura 4C-E).
- Ganhe exposição torácica usando ganchos de preparação cirúrgica e remova as membranas serosais mediastinais (Figura 4F-H).
- Continue a ventilação manual com a frequência e o volume corrente desejados e expanda o monitoramento (por exemplo, estabelecer uma medição da pressão arterial intra-arterial, instalar um cateter venoso central ou arterial pulmonar, dependendo da finalidade ou da respectiva questão de pesquisa) (Figura 4I-L).
Figura 4: Ventilação manual e toracotomia mediana. (A) situação inicial após a intubação. (BE) Toracotomia mediana a partir do xifóide. (F-I) Exposição torácica com ganchos de preparo cirúrgico. (J) Configuração final durante a ventilação. (K-L) o processo de ventilação manual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Eutanásia
- Alcançar a eutanásia por cardiectomia abrupta e afiada usando tesoura no animal profundamente anestesiado.
Resultados
A intubação endotraqueal via traqueotomia e subsequente toracotomia foi realizada em 10 ratos machos (peso médio de 405 ± 30 g) para aplicações de não sobrevivência. O procedimento foi realizado por um residente cirúrgico do segundo ano. A taxa de sucesso definida pela sobrevida acima de 20 min de intubação e ventilação foi de 100%. A duração média do preparo e intubação do procedimento desde a incisão na pele até a fixação do tubo de intubação foi de 6:55 ± 0:53 min (Tabela 1).
| Número de animais utilizados | 10 |
| Peso corporal (média e desvio-padrão) | 405 ± 30 g |
| Taxa de sucesso da intubação | 100% |
| Duração do procedimento (média e desvio-padrão) | 6:55 ± 0:53 min |
| Saturação média de oxigênio | 96% |
| Saturação mínima de oxigênio | 92% |
Tabela 1: Resultados representativos. Resultados representativos do protocolo em 10 animais.
A saturação foi monitorada por meio de uma sonda de oximetria de pulso autoadesiva de uso único na perna traseira e nunca caiu abaixo de 92%. A ventilação espontânea foi contida até a incisão do diafragma. Todos os ratos sobreviveram aos 20 minutos necessários para as medidas experimentais até a eutanásia intencional por meio de cardioectomia aguda abrupta (Figura 5).
Figura 5: Saturação periférica de oxigênio. Saturação periférica de oxigênio medida durante toda a duração deste procedimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussão
Somente nos EUA, cerca de 110 milhões de ratos e camundongos são usados em experimentos com animais por ano24. Embora não seja possível encontrar estatísticas confiáveis, uma porcentagem relevante deles receberá ventilação com suporte, especialmente nas áreas de pesquisa pulmonar e cardíaca, bem como anestesiologia. A maioria desses animais recebe intubação endoorotraqueal não invasiva, o que acarreta uma série de desafios. Isso inclui curvas de aprendizado mais lentas, maiores taxas de falha na intubação, maior número de reintubações e complicações respiratórias associadas, bem como vazamentos respiratórios25. A intubação não invasiva, portanto, geralmente requer pessoal de pesquisa mais experiente, tecnologia mais avançada, como fibra óptica, capnometria e ventiladores mecânicos, e maiores recursos financeiros e materialistas26. Todo o aspecto da intubação é, portanto, um fator de confusão significativo relevante na análise estatística subsequente e na heterogeneidade interindividual dos resultados. No entanto, a intubação endoorotraqueal não invasiva é frequentemente a única opção viável em projetos de experimentos longitudinais.
As alternativas são traqueostomia para acesso traqueal de longo prazo necessário em experimentos longitudinais ou traqueostomia cirúrgica para "uso único" em experimentos de não sobrevivência. Embora existam protocolos sobre a técnica microcirúrgica para traqueostomia em ratos27, atualmente não existem protocolos para intubação endotraqueal via traqueostomia em modelos de ratos não sobreviventes.
O procedimento padronizado aqui descrito para intubação endotraqueal via traqueotomia e subsequente toracotomia em ratos, portanto, representa um método valioso para pesquisadores envolvidos em estudos de não sobrevida. Este procedimento não requer pessoal especializado nem treinamento extensivo. Tem uma taxa de sucesso de intubação muito maior do que a intubação endoorotraqueal e permite etapas de procedimento muito mais controladas.
As limitações das técnicas apresentadas incluem principalmente a invasividade do procedimento e, consecutivamente, a compatibilidade exclusiva com experimentos de não sobrevivência. Devido aos grandes defeitos na pele e nos tecidos moles, bem como à fístula traqueal incisional, a extubação e a recuperação desse procedimento não são viáveis nem recomendadas, principalmente quando combinadas com toracotomia.
Ao solucionar desafios comuns encontrados durante o procedimento, gostaríamos de chamar a atenção para os seguintes pontos e recomendações: deve-se preparar equipamentos e medicamentos o mais extensivamente possível. O experimentador deve realizar o controle hemostático meticulosamente por meio de preparação fina e usando cotonetes não traumáticos. O experimentador deve preparar a traqueia em um comprimento de pelo menos 0,5 cm para permitir mobilidade suficiente e usar a alça do vaso de silicone para não perder a traqueia após a incisão, pois isso pode resultar em aspiração e asfixia quando a traqueia é perdida na profundidade do tecido devido ao fenômeno de fundo. Incise apenas parcialmente a traqueia com um golpe claro da tesoura. Idealmente, deve-se incisar 180° de circunferência. Abaixo disso, pode resultar em falha na intubaria. Acima disso, pode resultar em rompimento da traqueia com retração de ambas as extremidades na profundidade do tecido e subsequente asfixia. Ao amarrar a sutura de polifilamento para prender o tubo de intubação, um nó deslizante deve ser usado para garantir estanqueidade suficiente para evitar vazamento de ar ou deslocamento acidental do tubo e, ao mesmo tempo, evitar o fechamento não intencional do tubo. Deixar o fio de Seldinger no lugar durante a sutura pode evitar o fechamento não intencional. Ao realizar a ventilação manual usando a bolsa de ventilação, deve-se evitar estritamente o barotrauma do pulmão por altos volumes correntes. Em vez disso, deve-se procurar ventilação protetora dos pulmões, alta frequência e baixa expiração, especialmente desde que a toracotomia não tenha sido realizada e os volumes pulmonares não possam ser avaliados visualmente.
Ao oferecer uma metodologia detalhada e reprodutível, este protocolo facilita a padronização dos procedimentos experimentais, melhorando a confiabilidade e a comparabilidade dos dados entre os estudos. Como resultado, esse método contribui para o refinamento das técnicas científicas na pesquisa pré-clínica, aumentando a relevância translacional das descobertas nos campos da fisiologia, farmacologia, ciências cirúrgicas e biomédicas.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem que o serviço de armazenamento de dados SDS@hd apoiado pelo Ministério da Ciência, Pesquisa e Artes Baden-Württemberg (MWK) e pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) por meio da concessão INST 35/1314-1 FUGG e INST 35/1503-1 FUGG. Além disso, os autores agradecem o apoio do NCT (Centro Nacional de Doenças Tumoral em Heidelberg, Alemanha) por meio de seu programa estruturado de pós-doutorado e do programa de Oncologia Cirúrgica. Também reconhecemos o apoio por meio de fundos estaduais aprovados pelo Parlamento Estadual de Baden-Württemberg para a Innovation Campus Health + Life Science Alliance Heidelberg Mannheim do programa de pós-doutorado estruturado para Alexander Studier-Fischer: Inteligência Artificial em Saúde (AIH) - Uma colaboração de DKFZ, EMBL, Universidade de Heidelberg, Hospital Universitário de Heidelberg, Hospital Universitário de Mannheim, Instituto Central de Saúde Mental, e o Instituto Max Planck de Pesquisa Médica. Além disso, reconhecemos o apoio do DKFZ Hector Cancer Institute no University Medical Center Mannheim. Pela taxa de publicação, agradecemos o apoio financeiro da Deutsche Forschungsgemeinschaft no âmbito do programa de financiamento "Open Access Publikationskoste", bem como da Universidade de Heidelberg.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ambu Spur II Bolsa de ventilação de uso único para recém-nascidos | Meier Medizintechnik | 335 102 000 | Bolsa de ventilação |
| BD Microlance 3 cânula 20 G | BD (Beckton, Dickinson) | 301300 | Cânula |
| BD Microlance Discardit II Seringa de 20 mL | BD (Beckton, Dickinson) | 300296 | Seringa de plástico |
| Hastes de fixação | Legefirm | 500343896 | Diapasões utilizados como hastes de fixação metálicas em forma de Y |
| Tubo termo-retráctil | Sekesoer | RSG-400 | Tubo termo-retráctil |
| Cateter intravenoso | BD (Beckton, Dickinson) | 393230 | BD Venflon Pro Cateter intravenoso de segurança 14 G; encurtado com tesoura; em alternativa, pode ser utilizado 16 G ou 18 G |
| Tubo perfusor de plástico | M. Schilling GmbH | S702NC150 | Tubo de ligação COEX 150 cm |
| Sutura de polifilamento | COVIDIEN | CL331 | Sutura cirúrgica de polifilamento recomendada com uma força de 1 a 2; a agulha pode ser removida |
| Royal Gardineer Almofada de aquecimento Tamanho S, 20 Watt | Royal Gardineer | IP67 | Almofada de aquecimento |
| Fio guia Seldinger | VYGON | 115.798 | Fio guia de metal do conjunto de líder arterial |
| Abraçadeira de laço de vaso de silicone | SERAG WIESSNER | SL26 | Gravata de laço de vaso de silicone 2,5 mm vermelho |
| Ratos Spraque Dawley | Janvier Labs | Ratos machos pesando 400 gramas | |
| Placa de aço | Maschinenbau Feld GmbH | C010206 | Chapa galvanizada, 40 x 50 cm, espessura 4,0 mm |
Referências
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Reimpressões e permissões
