Artigo de método

Diagnóstico baseado em CRISPR no local de atendimento com reagentes pré-misturados e liofilizados

DOI:

10.3791/66703

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16 de agosto de 2024

 ,  , 
1School of Biomolecular Science and Engineering, Vidyasirimedhi Institute of Science and Technology (VISTEC)

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos a preparação passo a passo de amplificação isotérmica baseada em recombinase liofilizada pré-misturada e reações baseadas em Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), que podem ser usadas para a detecção de biomarcadores de ácido nucleico de patógenos de doenças infecciosas ou outros marcadores genéticos de interesse.

Resumo

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O diagnóstico molecular por detecção baseada em Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas Regularmente Interespaçadas (CRISPR) tem alta precisão diagnóstica e atributos adequados para uso em ambientes de ponto de atendimento, como tempos de resposta rápidos para resultados, leituras simples e convenientes e sem necessidade de instrumentos complicados. No entanto, as reações podem ser complicadas de realizar no ponto de atendimento devido aos seus muitos componentes e etapas de manuseio manual. Aqui, fornecemos um protocolo otimizado passo a passo para a detecção robusta de patógenos de doenças e marcadores genéticos com amplificação isotérmica baseada em recombinase e reagentes baseados em CRISPR, que são pré-misturados e liofilizados em formatos facilmente armazenados e prontos para uso. Reagentes liofilizados pré-misturados podem ser reidratados para uso imediato e manter altas eficiências de amplificação e detecção. Também fornecemos um guia de solução de problemas para problemas comumente encontrados ao preparar e usar reagentes liofilizados pré-misturados para diagnósticos baseados em CRISPR, para tornar a plataforma de detecção mais acessível às comunidades mais amplas de diagnóstico/testes genéticos.

Introdução

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O diagnóstico baseado em CRISPR para a detecção de biomarcadores de ácidos nucleicos foi relatado pela primeira vez em 2017 1,2,3,4 e, desde então, foi comprovado como diagnóstico de última geração com testes aprovados pela Food and Drug Administration (FDA), particularmente para a detecção de RNA do Coronavírus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), em vários países 5,6,7,8. Além da doença do coronavírus 2019 (COVID-19), as tecnologias demonstraram ser eficazes para detectar diversos vírus e bactérias 9,10,11,12,13, mutações e deleções de doenças genéticas e podem ser projetadas para detectar biomarcadores de proteínas e pequenas moléculas 2,12. Os diagnósticos baseados em CRISPR geralmente combinam métodos de amplificação isotérmica - como amplificação da polimerase recombinase (RPA) ou amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) 14 , 15 - com detecção baseada em CRISPR usando enzimas associadas a CRISPR (Cas) guiadas por RNA com atividade de endonuclease "colateral" após o reconhecimento do alvo3. O uso duplo de amplificação isotérmica e detecção baseada em CRISPR confere vários atributos desejáveis às tecnologias, particularmente alta precisão diagnóstica próxima à da reação em cadeia da polimerase (PCR) padrão-ouro e capacidade de multiplexar e detectar pequenas diferenças de sequência, incluindo polimorfismos de nucleotídeo único 1,9.

As versões mais precisas do diagnóstico baseado em CRISPR, no entanto, contêm vários componentes e etapas e podem ser complicadas de executar com não especialistas ou no ponto de atendimento (POC). Para enfrentar esse desafio de estender o uso de diagnósticos baseados em CRISPR altamente precisos para configurações de POC, desenvolvemos protocolos para preparar amplificação isotérmica baseada em recombinase pré-misturada, liofilizada e reações de detecção baseadas em CRISPR, que são fáceis de usar e armazenar7. Esses protocolos devem complementar os excelentes protocolos existentes sobre diagnósticos baseados em CRISPR14, que contêm informações adicionais sobre a produção de componentes bioquímicos necessários para diagnósticos baseados em CRISPR7, diretrizes de design1 e formulações usando técnicas alternativas de amplificação isotérmica 2,14,15,16 e enzimas Cas12. Em última análise, esperamos que os diagnósticos baseados em CRISPR possam ajudar a realizar a detecção nucleica rápida, barata e sensível em ambientes onde análises portáteis e sem instrumentais são necessárias 1,9,17.

Usamos principalmente a combinação de detecção baseada em RPA e Cas13 em nossos protocolos. O RPA funciona em temperaturas próximas ao ambiente (37-42 °C) e, portanto, tem baixos requisitos de energia e equipamentos. Outras reações de amplificação isotérmica requerem temperaturas mais altas (LAMP, 60-65 °C; amplificação de deslocamento de fita (SDA), 60 °C; reação de amplificação exponencial (EXPAR), 55 °C; e amplificação dependente de helicase (HDA), 65 °C)2. O design dos primers RPA também não é complexo, ao contrário dos primers LAMP, e pode ser estendido para amplificação multiplexada 7,9,14. Embora a multiplexação além de dois alvos com RPA seja difícil na prática, existem diretrizes claras sobre como projetar primers de RPA multiplexados para minimizar a interferência18.

Embora a contaminação por transferência continue sendo um grande problema no fluxo de trabalho de duas etapas, os amplicons gerados de RPA são pequenos em tamanho e menos propensos a causar contaminação por transferência em comparação com grandes amplicons concateméricos do LAMP14. Os primers RPA podem ser projetados de acordo com as diretrizes padrão14: eles geralmente têm 25-35 nucleotídeos de comprimento com temperaturas de fusão de 54 a 67 °C. O tamanho do amplicon deve ser menor que 200 pares de bases. A enzima transcriptase reversa (RT) pode ser adicionada ao RPA para permitir a amplificação do RNA, e na transcrição reversa-RPA (RT-RPA), outra enzima Ribonuclease H (RNase H) é normalmente adicionada em pequenas quantidades para ajudar a resolver o RNA: DNA híbrido resultante e promover a reação de amplificação 5,19. Para permitir a transcrição de T7 para detecção baseada em Cas13, o promotor da RNA polimerase T7 pode ser colocado na extremidade 5' do primer RPA direto.

Depois que os amplicons são gerados a partir do RPA, eles podem ser detectados com enzimas Cas programadas por crRNA. Entre as várias enzimas Cas que podem ser usadas para detecção de amplicon, preferimos variantes Cas13 direcionadas a RNA devido à sua alta atividade de clivagem1 e preferências de clivagem de polinucleotídeos bem caracterizadas 7,9, a última das quais pode ser usada para detecção multiplexada. A sequência de crRNA para Cas13 é projetada para ser complementar (complemento reverso) ao local alvo no RNA produzido com sequências espaçadoras e de repetição direta (DR). A sequência de crRNA e os primers RPA não devem se sobrepor, para evitar a detecção indesejada baseada em Cas de produtos de amplificação fora do alvo, o que aumenta o fundo e os falsos positivos14.

A detecção baseada em Cas depende de diferentes modalidades de detecção para monitorar a clivagem de moléculas de ácido nucleico repórter (repórteres de RNA para reações baseadas em Cas13) 1 , 2 , 14 . Diferentes modalidades de detecção incluem colorimetria, leituras eletroquímicas, fluorescência, leituras de sequenciamento e tiras de fluxo lateral2. Nós nos concentramos na leitura de fluorescência dada uma variedade de fluoróforos e repórteres, como cianina 5 (Cy5), rodamina X (ROX) e carboxifluoresceína (FAM), que podem ser efetivamente excitados usando uma única fonte de luz LED azul, e sua fluorescência analisada por um leitor de microplacas ou um termociclador em tempo real 7,14. Além disso, a leitura de fluorescência é fácil de configurar e permite monitoramento contínuo, o que permite a quantificação em tempo real. A pré-amplificação multiplexada de RPA e a detecção multiplexada baseada em Cas13 usando enzimas Cas podem ser combinadas com leituras de fluorescência multicoloridas para a detecção simultânea de múltiplos alvos genéticos 2,7.

Em nossos protocolos, primeiro amplificamos isotermicamente o RNA com RT-RPA adicionando a amostra de RNA à forma liofilizada do reagente RT-RPA (Figura 1). Durante o RT-RPA, o promotor T7 é adicionado ao amplicon de DNA de fita dupla gerado. Em seguida, os produtos RPA são transferidos para a detecção liofilizada baseada em Cas13, que também contém RNA polimerase T7. Esta reação de detecção converterá amplicons de DNA em RNA (via T7 RNA polimerase), que pode ser prontamente detectada com Cas13 programada por crRNA. O Cas13 ativado por alvo clivaria as moléculas repórter para produzir um sinal de fluorescência detectável 2,7,14. Embora os protocolos aqui pertençam à detecção por Leptotrichia wadei (LwaCas13a), eles podem ser estendidos para detecção simultânea e multiplexada de até quatro alvos usando enzimas ortogonais Cas13 e Cas12 7,9. As reações de detecção baseadas em RPA e Cas também podem ser combinadas em um único tubo, embora com perda de sensibilidade14.

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Figura 1: Fluxo de trabalho de detecção baseado em CRISPR. O fluxo de trabalho ilustra a detecção de dois genes-alvo. Primeiro, as regiões de interesse dentro do alvo de DNA são amplificadas isotermicamente com RPA; a reação pode ser realizada com transcrição reversa (RT-RPA) ao detectar alvos de RNA. Depois disso, a transcrição T7 converte amplicons de dsDNA em RNAs, que por sua vez são reconhecidos por complexos Cas13-crRNA capazes de provocar atividade colateral de RNase após a ligação ao alvo. A clivagem de repórteres de fluorescência temperada produz sinais de fluorescência que podem ser monitorados usando um leitor de microplacas, visualizados por um transiluminador de LED ou usados com um termociclador em tempo real. Abreviaturas: CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; TR = transcrição reversa; RPA = amplificação da polimerase recombinase; Cas = proteína associada a CRISPR; LED = diodo emissor de luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As principais características dos protocolos apresentados aqui são as formulações de pré-mistura para liofilização. A pré-mistura simplifica o uso da reação e aumenta a reprodutibilidade, mas muitos componentes dentro da detecção baseada em RPA e Cas - particularmente a transcrição reversa e alguns cofatores lábeis, como o ATP, não são estáveis em solução. Portanto, formulamos as soluções pré-misturadas de forma que possam ser liofilizadas para armazenamento de longo prazo e fácil transporte e implantação 1,9,20. Reagentes liofilizados pré-misturados também ajudam a melhorar a sensibilidade de detecção, pois maior volume de amostra (e, portanto, maior entrada de DNA / RNA) pode ser adicionado para reconstituir a reação10. Em nossas formulações, usamos principalmente trealose21 como crioprotetor em reações de detecção liofilizadas de RPA e Cas7. Além da preservação do reagente, a trealose também promove as reações por meio do aumento da estabilização enzimática 16,22,23,24 e da diminuição das temperaturas de fusão do dsDNA 23. Explorações de outros estabilizadores 5,7,21,25,26 além da trealose podem produzir formulações ainda mais ideais para diferentes cenários de uso.

Protocolo

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1. Preparação de reagentes pré-misturados RT-RPA liofilizados

  1. Preparação do equipamento
    1. Prepare um dewar ou bandeja de nitrogênio líquido para congelamento rápido de reações. Encha o dewar ou a bandeja com nitrogênio líquido.
    2. Liofilizador
      1. Verifique se há água condensada nos tubos de drenagem e no interior da câmara; Remova a água, se necessário.
      2. Limpe o interior da câmara e o rack de metal do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com solução de descontaminação RNase, seguida de etanol a 70%.
      3. Feche a porta da câmara e a válvula de liberação de vácuo.
      4. Ligue o liofilizador.
      5. Defina manualmente a temperatura da prateleira para -30 °C.
    3. Equipamento de biologia molecular
      1. Limpe o seguinte com a solução de descontaminação RNase: pipetas, racks de ponteira de pipeta, um misturador de vórtice, uma minicentrífuga spin-down e um marcador permanente.
      2. Limpe o seguinte com água da torneira e, em seguida, limpe com papel de limpeza: racks de plástico para tubos de microcentrífuga e uma caixa de espuma para gelo.
      3. Prepare um bloco de aquecimento (usado para dissolver/resolubilizar a solução de triglicina) limpando-o com solução de descontaminação RNase e etanol a 70%. Em seguida, ligue-o e ajuste a temperatura para 60 °C.
  2. Preparação de reações de RPA pré-misturadas
    NOTA: Esta formulação é para 10 reações (usando três pastilhas de RPA).
    1. Verifique se há algum precipitado na solução de triglicina antes de usar. Se houver precipitados, dissolva-os incubando a 60 °C e misturando bem antes de usar. Resfrie a solução de triglicina antes de adicionar outros reagentes sensíveis ao calor.
      NOTA: Os precipitados podem se formar facilmente se o tubo for deixado em temperatura ambiente por um período prolongado.
    2. Remova três tubos de tiras de pellets RPA do freezer; Bata nos tubos de tira batendo-os suavemente contra a bancada do laboratório para desalojar os pellets brancos.
    3. Transfira todos os três pellets para um tubo de microcentrífuga A de 1,5 mL.
    4. Pipete 25 μL de água sem nuclease para enxaguar qualquer pó de RPA restante nos tubos de tira e transfira a solução de enxágue para um novo tubo de microcentrífuga B de 1,5 mL.
    5. Adicione 10 μL da solução de triglicina 0,57 M e 10 μL de mistura de primer (10 μM cada) ao tubo master mix B.
    6. Tubo de mistura de vórtice B; Em seguida, gire para baixo e coloque o tubo no gelo.
    7. Adicione 28,4 μL do tampão RPA 5x (preparado a partir de 500 μL de 50% (p/v) PEG20000, 250 μL de 1 M Tris pH 7,4 e 100 μL de ditiotreitol (DTT) 100 mM ao tubo mastermix B e misture bem batendo forte ou agitando várias vezes.
      NOTA: Fazemos a solução desta maneira para ajudar a diluir/diminuir a viscosidade do PEG no tubo mastermix, antes de adicionar tudo para solubilizar os pellets de RPA.
    8. Transfira os pellets coletados no tubo A da Etapa 1.2.3 para o tubo mastermix B e, em seguida, inverta o tubo mastermix várias vezes para misturar. Observe se a solução parece homogênea e monofásica (também parecerá ligeiramente opaca) e, em seguida, coloque o tubo no gelo.
      NOTA: Se a mistura não for completa, o PEG pode fazer com que a solução/suspensão se separe em fases.
    9. Adicione 0,71 μL de 200 unidades/μL RT e 2,84 μL de 5 unidades/μL RNase H ao tubo mastermix. Bata suavemente ou inverta o tubo mastermix para cima e para baixo várias vezes. Gire para baixo e coloque o tubo no gelo.
      NOTA: Adicionamos essas enzimas após mistura pesada de etapas anteriores, uma vez que RT e RNase H são sensíveis ao cisalhamento devido à mistura; não há mais vórtice após a adição de RT / RNase H.
    10. Alicote 8,4 μL da solução mastermix para 10 tubos pré-resfriados de 1,5 mL e coloque os tubos no gelo. Para fazer isso, mergulhe a ponta da pipeta na solução mastermix e puxe a solução mastermix para a ponta lenta e continuamente para evitar a formação de bolhas de ar e garantir uma medição precisa do volume. Dispense a solução mastermix em um tubo pré-resfriado de 1,5 ml.
      NOTA: Com 8,4 μL alíquotas, em nossa experiência, haverá ~ 1-2 μL de suspensão restante no tubo mastermix. O experimentador pode ajustar ligeiramente o volume de alíquota para baixo para garantir reagentes suficientes para todas as 10 reações. Use técnicas de pipetagem adequadas ao manusear soluções viscosas.
    11. Após a conclusão da alíquota, coloque os tubos em uma prateleira de metal submersa em nitrogênio líquido para prepará-los para a liofilização. Deixe os tubos submergirem em nitrogênio líquido por 5 min.
      NOTA: Como a liofilização remove o excesso de solução, ela nos permite adicionar mais entrada de DNA / RNA, o que ajuda a aumentar a sensibilidade. As reações RPA pré-misturadas liofilizadas podem ser armazenadas a -20 °C por 8 meses. A liofilização ajuda na reprodutibilidade se um determinado experimento for realizado usando mastermixes RPA preparados no mesmo lote, portanto, fazer um lote maior também ajuda.
  3. Liofilização
    1. No liofilizador, verifique as temperaturas do coletor e da prateleira. Se necessário, aguarde até que a temperatura do coletor atinja -75 ± 5 °C e a temperatura da prateleira atinja -30 ± 1 °C.
    2. Cubra os tubos abertos no rack de metal com uma folha de papel de limpeza, coloque o rack de metal junto com os tubos abertos na prateleira do liofilizador e feche a porta da prateleira.
    3. Selecione o programa mostrado na Tabela 1 e pressione iniciar. Após 30 min da etapa de secagem secundária (20 °C, <0.1 mbar; a temperatura é mantida infinitamente definindo o tempo da etapa para "infinito"), pressione parar o programa.
      NOTA: Deixamos os tubos aquecerem no liofilizador para evitar a condensação de água.
    4. Libere a pressão abrindo a válvula de liberação de vácuo e, em seguida, remova o rack da prateleira. Tampe os tubos imediatamente e armazene as reações liofilizadas a -20 °C.
      NOTA: As reações pré-misturadas liofilizadas de RPA e CRISPR-Cas13a podem ser armazenadas a -20 °C por 8 meses.

2. Preparação de reagentes de detecção pré-misturados CRISPR-Cas13a liofilizados

NOTA: Siga a etapa 1.1 para a preparação do equipamento.

  1. Preparação de reação pré-misturada CRISPR-Cas13a (10 reações)
    1. Remova os seguintes itens do armazenamento e coloque-os no gelo: 10 μL de LwaCas13a (produzido internamente 7,8,14) (2 mg / mL), tampão de armazenamento Cas, 10 ng / μL (225 nM) crRNA, 25 mM rNTP, 50 Unidade / μL T7 RNA polimerase, 2 μM de repórter de fluorescência FAM.
    2. Prepare uma solução de trabalho de LwaCas13a a 126 μg / mL (900 nM) adicionando 148,8 μL de tampão de armazenamento de Cas (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,6 M NaCl, 5% de glicerol, 2 mM DTT) a 10 μL de 2 mg / mL de LwaCas13a.
    3. Prepare a reação mastermix CRISPR-Cas13a da seguinte forma: 71 μL de água livre de RNase, 20 μL de 400 mM Tris pH 7,4, 20 μL de trealose a 60% (p/v), 10 μL de 10 ng/μL (225 nM) crRNA (aqui, visando os genes s e n do SARS-CoV-2), 8 μL de mistura rNTP 100 mM (25 mM cada), 6 μL de 50 unidades/μL T7 RNA polimerase, 25 μL de 2 μM de repórter de fluorescência FAM e 10 μL de 126 μg/mL (900 nM) LwaCas13a. Misture bem invertendo o tubo mastermix; Então, gire para baixo.
    4. Alíquota de 17 μL do mastermix em 10 tubos de 1,5 mL colocados no gelo. Coloque os tubos em uma prateleira submersa em nitrogênio líquido e deixe os tubos submersos em nitrogênio líquido por 5 min.
  2. Liofilização
    1. No liofilizador, verifique as temperaturas do coletor e da prateleira e espere até que a temperatura do coletor atinja -75 ± 5 °C e a temperatura da prateleira atinja -30 ± 1 °C.
    2. Coloque os tubos no liofilizador. Selecione o programa mostrado na Tabela 1 e pressione iniciar. Após 30 min da etapa de secagem secundária (25 °C, <0.1 mbar; a temperatura é mantida infinitamente ajustando o tempo da etapa para "infinito"), pare o programa.
    3. Libere a pressão abrindo a válvula de liberação de vácuo e remova o rack da prateleira. Tampe os tubos imediatamente e armazene as reações liofilizadas a -20 °C.
      NOTA: Os reagentes pré-misturados liofilizados de RPA e CRISPR-Cas13a podem ser armazenados a -20 °C por 8 meses.

3. Amplificação de ácido nucleico RT-RPA

NOTA: Para evitar contaminação cruzada, as áreas do local de trabalho e os pipetadores devem ser separados para pré-amplificação, adição de amostra e pós-amplificação. Recomendamos o uso de ponteiras de pipeta filtradas.

  1. Pré-aqueça uma incubadora de agitação térmica a 42 °C.
  2. Adicione 1 μL de mistura de solução de acetato de magnésio (Mg (OAc) 2) e acetato de potássio (KOAc) (composta de 196 mM Mg (OAc) 2 e 1,5 M KOAc) na lateral do tubo que contém o pellet RT-RPA liofilizado e pré-misturado (da seção 1).
    NOTA: Um truque para adicionar a mistura de Mg(OAc)2 e KOAc: a gota deve ser colocada em torno da marca de volume de 1 mL do tubo. Aqui, a queda será claramente visível e provavelmente não será perdida com o fechamento do tubo ou outras ações. A amplificação começará depois de girar para baixo para coletar a gota no fundo do tubo. Ao processar mais de uma reação por vez, a amplificação pode ser iniciada simultaneamente.
  3. Ressuspenda o pellet RT-RPA adicionando 12,4 μL da amostra de RNA (ou das amostras de controle).
    NOTA: A sequência de adição é amostra negativa/controle negativo, RNA/DNA a ser testado, amostra positiva/controle positivo.
  4. Para iniciar a reação RT-RPA, gire brevemente a solução adicionada das etapas 3.2 e 3.3 usando uma minicentrífuga de rotação à temperatura ambiente por 3 s.
  5. Misture batendo cuidadosamente no tubo e, em seguida, faça outro breve centrifugação por 3 s.
  6. Incubar a reação a 42 °C durante 60 minutos, colocando-a num bloco de aquecimento pré-aquecido ou numa incubadora de agitação térmica.
  7. Após o término da reação, retire os tubos de reação e coloque-os no gelo antes de prosseguir para a etapa de detecção CRISPR-Cas (seção 4).
    NOTA: O produto amplificado por RPA pode ser usado na reação de detecção imediatamente ou pode ser armazenado a 4 °C por vários dias ou a -20 °C por vários meses.

4. Detecção de ácido nucleico CRISPR-Cas13

  1. Ligue um leitor de microplacas de fluorescência, defina e pré-aqueça a temperatura de aquecimento para 37 °C e selecione o programa mostrado na Tabela 2.
  2. Coloque uma placa de 384 poços no gelo.
  3. Ressuspenda a reação de detecção pré-misturada CRISPR-Cas liofilizada (da seção 2) adicionando 17 μL de solução de cloreto de magnésio 8 mM. Misture batendo cuidadosamente no tubo; Em seguida, gire brevemente para baixo por 3 s e coloque o tubo no gelo.
  4. Transfira 18 μL da mistura de reação ressuspensa para cada poço da placa pré-resfriada de 384 poços em gelo.
  5. Adicionar 2 μL do produto RPA preparado no ponto 3 a cada poço de reação.
  6. Remova a placa do gelo, coloque-a rapidamente em um leitor de microplacas de fluorescência pré-aquecido e pressione iniciar.
    NOTA: Uma placa de 384 poços foi colocada no gelo para permitir a sincronização do início da reação quando a placa de 384 poços é transferida para um leitor de microplacas de fluorescência pré-aquecido.

Resultados

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Destacamos a cinética da geração do sinal de fluorescência FAM a partir da detecção combinada dos genes s e n do SARS-CoV-2 e como as informações foram usadas para determinar as condições ideais para formulações de reação pré-misturadas liofilizadas. Em todos os casos, incluímos amostras com valores de Ct bem dentro do limite de detecção determinado (LoD) (Ct ~ 31-33), bem como aquelas com Ct no LoD (Ct ~ 35-37)7, para permitir a diferenciação de protocolos com melhor sensibilidade.

Para RT-RPA liofilizado e pré-misturado, descobrimos que a inclusão de KOAc na reação pré-misturada afetou negativamente a sensibilidade da reação (Figura 2A). Portanto, omitimos o KOAc da reação pré-misturada e o adicionamos com o iniciador da reação, Mg (OAc) 2, uma vez que a amostra de RNA foi adicionada. Também usamos ensaios semelhantes para determinar a concentração ideal de um crioprotetor trealose (Figura 2B) e os efeitos da triglicina7 na reação RT-RPA liofilizada (Figura 2C). Portanto, reações RT-RPA pré-misturadas e liofilizadas ideais foram preparadas com trealose a 6%, sem KOAc (mas foi adicionado posteriormente após a amostra de RNA) e suplementadas com triglicina, conforme descrito na seção 1 do protocolo.

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Figura 2: Otimizando reações RT-RPA liofilizadas e pré-misturadas. A reação RT-RPA foi preparada usando primers direcionados ao gene n do SAR-CoV-2. Mg(OAc)2 foi excluído de todas as reações pré-misturadas. Foram avaliados os efeitos de (A) KOAc, (B) trealose e (C) triglicina adicionados às reações pré-misturadas. O monitoramento da reação por meio da fluorescência FAM gerada foi realizado usando um termociclador em tempo real ou um leitor de microplacas de fluorescência. Dados individuais de medições triplicadas são mostrados. Abreviaturas: RT = transcrição reversa; RPA = amplificação da polimerase recombinase; CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; Cas = proteína associada a CRISPR; SAR-CoV-2 = Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus 2; Ct = limiar do ciclo; FAM = carboxifluoresceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para reações liofilizadas e pré-misturadas à base de Cas13a, verificamos a importância de ter o crioprotetor correto: trealose a 6% ou sacarose a 2%19 funcionaram bem, enquanto a sacarose a 1% ou 5% p/v PEG20000 não preservou a eficiência da reação após a liofilização (Figura 3). O MgCl2 foi omitido de todas as reações e adicionado na etapa de reidratação. A reação de detecção baseada em Cas13 liofilizada ideal foi preparada com trealose a 6%, conforme mostrado na seção 2 do protocolo.

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Figura 3: Otimizando reações de detecção baseadas em Cas13 liofilizadas e pré-misturadas. A reação de detecção foi realizada a 37 °C usando o produto RPA do gene SARS-CoV-2 n. Os testes foram feitos antes e após a liofilização. O MgCl2 foi excluído de todas as reações pré-misturadas. Foram avaliadas as habilidades de (A) trealose, (B) PEG20000 e (C) sacarose em preservar a eficiência da reação após a liofilização. O monitoramento da reação por meio da fluorescência FAM gerada foi realizado usando um termociclador em tempo real. São mostrados dados individuais de medições triplicadas para as condições "após a liofilização" e uma réplica das condições "antes da liofilização". A Figura 3A,B foi retirada de Patchsung et al.7. Abreviaturas: RPA = amplificação da polimerase recombinase; SAR-CoV-2 = síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2; FAM = carboxifluoresceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os reagentes liofilizados e pré-misturados para reações baseadas em RT-RPA e Cas13 são estáveis a -20 ° C por pelo menos 8 meses [Figura 4].

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Figura 4: Testes de estabilidade de reagentes RPA e CRISPR-Cas13a liofilizados e pré-misturados a -20 °C. Teste de estabilidade em (A) 30 dias, (B) 45 dias, (C) 3 meses, (D) 5 meses, (E) 8 meses. Dados individuais de medições triplicadas são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O LoD de reações liofilizadas baseadas em RT-RPA e Cas13 para a detecção dos genes s e n do SARS-CoV-2 é mostrado na Figura 5. A cinética de geração de sinal pode ser melhorada na detecção de dois genes em comparação com quando apenas um gene é detectado.

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Figura 5: Sensibilidade analítica da detecção de gene único versus gene duplo. (A) O LoD de RT-RPA singleplex liofilizado e detecção baseada em Cas visando o gene s do SAR-CoV-2. (B) O LoD de RT-RPA singleplex liofilizado e detecção baseada em Cas visando o gene n do SAR-CoV-2. (C) O LoD de RT-RPA multiplex liofilizado e detecção dupla baseada em Cas visando os genes s e n . O LoD foi determinado usando RNAs SARS-CoV-2 diluídos em série, cujos valores de Ct foram determinados usando um ensaio RT-qPCR direcionado ao gene n . São mostrados dados individuais de 3-6 medições replicadas. Abreviaturas: LoD = limite de detecção; TR = transcrição reversa; RPA = amplificação da polimerase recombinase; CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; Cas = proteína associada a CRISPR; SAR-CoV-2 = Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus 2; Ct = limiar do ciclo; qPCR = reação em cadeia da polimerase quantitativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além da detecção de vírus, apresentamos um protótipo de uma ferramenta de genotipagem POC baseada no diagnóstico CRISPR, para ajudar a identificar espécies de cobras venenosas endêmicas da Tailândia (Figura 6). A identificação mais rápida e precisa de espécies de serpentes por meio de amostras de DNA coletadas de feridas de mordidas pode ajudar na administração imediata de antivenenos, melhorando a chance de sobrevivência do paciente. Visamos regiões dentro do gene mitocondrial do citocromo b (cytb) de oito espécies de cobras, incluindo Ophiophagus hannah (King cobra) (Figura 6A) e mostramos que a detecção de substitutos de DNA sintético do gene O. hannah cytb pode atingir o nível attomolar de sensibilidade (Figura 6B, C).

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Figura 6: Um protótipo para detecção baseada em CRISPR para identificar espécies de cobras de envenenamento por picada de cobra. (A) Primers RPA e design de crRNA LwaCas13a para a detecção do gene cytb de Ophiophagus hannah. O promotor T7 (saliência T7) foi colocado na extremidade 5' do primer RPA dianteiro. (B) Cinética da geração de sinal FAM ao longo de 60 min e (C) fluorescência FAM final da detecção mediada por LwaCas13a de entradas sintéticas de dsDNA correspondentes aos segmentos do gene cytb de O. hannah. Diferentes concentrações de entrada (0, 10-9, 10-12, 10-15 e 10-18 M) foram usadas. Os dados são ± média dp de medições triplicadas. Abreviaturas: RPA = amplificação da polimerase recombinase; CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; Cas = proteína associada a CRISPR; FAM = carboxifluoresceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Liofilização de reagentes de detecção pré-misturados CRISPR-Cas13a
PassoTaxa de rampaTemperatura da prateleiraTempo (hh:mm)Vácuo
(°C/min)(°C)(mbar)
Congelar 13-30desligado-
Seco 13-30desligado0
Seco 23401:000
Seco 3320∞0

Tabela 1: Configurações de liofilizador de reagentes de detecção RT-RPA e CRISPR-Cas13a pré-misturados. Abreviaturas: RT = transcrição reversa; RPA = amplificação da polimerase recombinase; CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; Cas = proteína associada a CRISPR.

ParâmetroAmbiente
Temperatura37 °C
Ciclo cinéticoTempo de duração02:00 (mm:ss)
Intervalo de tempo02:30 (mm:ss)
TrêmuloTempo de duração1 segundo
ModoLinear
Amplitude1 milímetro
Intensidade de fluorescênciaComprimento de onda de excitação488 milhas náuticas
Comprimento de onda de emissão520 nm
ModoInício
Posição Z24470
Ganhar71
Tempo de integração20 μs
Número de intermitências25

Tabela 2: Programa leitor de microplacas de fluorescência para detecção de ácidos nucleicos.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Existem etapas críticas neste protocolo. Para segregação de área, recomenda-se o uso de espaços separados para extração de ácido nucleico, preparação de mastermix (área de pré-amplificação), adição de amostra e detecção de amplicon (área de pós-amplificação). Cada área deve ser definida usando um conjunto separado de ferramentas e equipamentos. Não traga ferramentas de uma área para outra área, especialmente da área de pós-amplificação para a área de pré-amplificação. A limpeza das áreas de trabalho é necessária: deve-se limpar as áreas de trabalho, pipetas, vórtices e marcadores permanentes com solução de descontaminação RNase/DNase/Clorox a 3% seguida de etanol a 70% ou água deionizada autoclavada. É necessária a lavagem de material de laboratório básico e peças removíveis de instrumentos, como racks de plástico de tubo de 1,5 mL e o adaptador de rotor de uma minicentrífuga. A água livre de nuclease é usada como controle negativo e componente de reação e, portanto, é um reagente sensível que pode ser contaminado se não for manuseado com cuidado. Portanto, recomendamos fazer pequenas alíquotas de água para serem usadas apenas uma vez.

Sempre execute uma reação de controle negativo usando os primers de ensaio para verificar se há contaminação. Além disso, para evitar problemas de contaminação, recomendamos preparar a reação de controle negativo adicionando água livre de nuclease na área de pré-amplificação em vez da sala de adição de amostra. A mistura de acetato de magnésio e acetato de potássio deve ser aliquotada em pequenos volumes (~ 20 μL / tubo) que são usados apenas uma vez para evitar a contaminação do reagente com amplicons de transporte. Ao adicionar a mistura de acetato de magnésio-potássio a reações RPA de pré-mistura liofilizada, recomendamos trocar a ponta da pipeta todas as vezes. Para o fluxo de trabalho de experimentos, mantenha o fluxo de trabalho unidirecional, desde experimentos de pré-amplificação até pós-amplificação. Mude de espaços de trabalho "mais limpos" (pré-amplificação) para espaços de trabalho "mais sujos" (pós-amplificação).

Para modificações e solução de problemas do método para evitar a contaminação por transferência de amplicons, recomendamos separar espacialmente as três etapas principais do experimento: preparação da reação RPA; adição de amostra; e as etapas de amplificação e detecção. O mastermix deve ser preparado em uma área livre de modelos do laboratório. Ao trocar os vestiários, troque também as luvas e os jalecos. Trabalhe unidirecionalmente da pré à pós-amplificação. Evite usar a mesma pipeta para etapas diferentes. É melhor que diferentes conjuntos de pipetas sejam organizados para estas etapas: preparação de mastermixes; adição do molde DNA/RNA; e a transferência do produto amplificado. Use pontas filtradas, tente evitar a formação de aerossóis o máximo possível e evite tocar no interior do tubo ao abri-lo. Se os experimentos de amplificação mostrarem contaminação, todos os reagentes devem ser trocados. Se possível, vá a outro laboratório com reagentes frescos e verifique se a contaminação persiste. Além de reagentes, não traga mais nada, incluindo pipetas. Tente autoclavar pipetas se forem autoclaváveis.

Para melhorar a taxa de amplificação (otimização do ensaio), primeiro consulte as instruções do fabricante, como o manual RPA da TwistDx, para garantir projetos ideais. Em seguida, tente otimizações empíricas das reações, como a adição de aditivos de reação conhecidos por aumentar as reações RPA e CRISPR7; aumentar os tempos de reação (por exemplo, tempo de reação RPA até 60 min); ou variando sequências e concentrações de primers. Também recomendamos adicionar o máximo de volume de amostra possível; O uso de reagentes liofilizados permite que mais volume de amostra seja adicionado. Para reduzir a fluorescência de fundo, pode-se fazer uma etapa de inativação de calor (75 ° C por 5 min) após o término do RPA, antes de passar para a detecção, ou otimizar a concentração do repórter. Muito repórter dará um fundo mais alto. Além disso, a adição de inibidores de RNase ajuda a prevenir a degradação independente de Cas do repórter.

Além de otimizar as condições de reação baseadas em (RT)-RPA e CRISPR e seus procedimentos de manuseio, deve-se garantir que os reagentes usados sejam de boa qualidade e que a etapa de extração de ácido nucleico que precede todas as reações seja bem-sucedida. Os reagentes liofilizados fornecem alta sensibilidade de detecção, são portáteis, permitem testes POC e podem ser aplicados a diversas amostras clínicas. Além disso, o RPA liofilizado (RT) pode ser reidratado instantaneamente adicionando o extrato de ácido nucleico de amostras clínicas. Um estudo anterior mostrou maior sensibilidade ao colocar um volume maior de entrada de ácido nucleico sem volume restrito, aumentando efetivamente a quantidade total de ácido nucleico alvo.

Os diagnósticos baseados em CRISPR foram adaptados para detectar patógenos por meio da coleta de amostras clínicas, como swabs nasofaríngeos e de garganta, urina e soro 7,8,11. Também tem sido aplicado para distinguir variantes de nucleotídeo único, identificar genes de resistência a antibióticos em organismos resistentes a antimicrobianos e detectar mutações associadas ao câncer. A utilidade da tecnologia pode ser maior em aplicações de campo onde reações bioquímicas projetadas para amplificação isotérmica e detecção baseada em CRISPR podem ser combinadas com dispositivos e leituras prontos para campo, como um fluorômetro portátil ou tiras de fluxo lateral.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.P. e C.U. registraram uma patente na Tailândia sobre as formulações para detecção multiplexada de RNA SARS-CoV-2. R.K. declara não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A reconhece o financiamento do Siam Commercial Bank no âmbito do VISTEC-Siriraj Frontier Research Center e do Thailand Science Research and Innovation (TSRI), fundo fundamental, ano fiscal de 2024, número de concessão FRB670026/0457. RK e MP são apoiados por fundos de bolsa de estudos e assistência de pesquisa da VISTEC, respectivamente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MaterialSolução de
betaínaSigma-AldrichB0300-1VL
Água tratada com DEPCInvitrogenAM9915G
Dithiothreitol (DTT)Merck3870-25GM
EpiScript transcriptase reversaLucigenERT12925K
Gly-Gly-Gly& nbsp;Sigma-AldrichSIA-50239-1G
LwaCas13aProduzindo internamenteNome da cepa: Leptotrichia wadei, Abreviatura: Lwa, Nome da proteína: LwaCas13a
Solução de cloreto de magnésio, 1MSigma-AldrichM1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polimeraseLucigen30223-2
Poli (etilenoglicol)Sigma-Aldrich81300-1KG
Solução de acetato de potássio, 5MSigma-Aldrich95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution MixNEBN0466L
RNase HNEBM0297L
SacaroseTCITCI-S0111-500G
Trealose DihidratadaSigma-AldrichSIA-90210-50G
Solução de cloridrato de Trizma, 1M, pH 7,4Sigma-AldrichT2194-100ML
TwistAmp Kit básicoTwistDxTABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Transiluminador de luz azul/brancoBio-HelixBP001CU
Dry Bath Dual BlockELITE4-2-EL-02-220Modelo: EL-02
Microplaca de fluorescência leitorTecan30050303Modelo: Secador de congelamento Infinite 200 Pro
LABCONCO794001030FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Greinerde 384 poçosGDE0784076F-Bottom, pequeno volume, Hibase, Med. Encadernação, Preto
Termociclador em tempo real (Sistema de PCR em tempo real CFX Connect)Bio-Rad185-5201Modelo: Módulo CFX Connect Optics
Oligonucleotide
s-gene forward RPAprimer IDTGAAATTAATACGACTCAC
TATAGGGAGGTTTCAAAC
TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primerIDTTCCTAGGTTGAAGA
TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primerIDTGAAATTAATACGACTC
ACTATAGGAACTTCTC
CTGCTAGAATGGCTG
primer RPA reverso do genen IDTCAGACATTTTGCTCTC
AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA para o gene sSynthegoGAUUUAGACUACCCCAAAAAC
GAAGGACUAAAACGCAGCAGCA
CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA para o gene nSynthegoGAUUUAGACUACCCCAAAAACG
AAGGACUAAAAAAAGCAAG
AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ repórterIDT56-FAM/rUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primerIDTGAAATTAATACGACTCACTA
TAGGGTACGGATGAACCATA
CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primerIDTAAGATCCATAGTAGATTC
CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah IDTGCGCATCCATATTCTTCAT
CTGCATTTAGTTTTAGTCC
CCTTCGTTTTTGGGGTA
GTCTAAATCCCCTATAGT
GAGTCGTATTAATTTC
Microplaca

Referências

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