O protocolo utiliza microscopia avançada de folha de luz junto com métodos adaptados de limpeza de tecidos para investigar estruturas cardíacas intrincadas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.
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Artigo de método
Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia de folha de luz (LSM) desempenha um papel fundamental na compreensão da intrincada estrutura tridimensional (3D) do coração, fornecendo informações cruciais sobre a fisiologia cardíaca fundamental e as respostas patológicas. Por meio deste, investigamos o desenvolvimento e a implementação da técnica LSM para elucidar a microarquitetura do coração em modelos de camundongos. A metodologia integra um sistema LSM personalizado com técnicas de limpeza de tecidos, mitigando a dispersão de luz dentro dos tecidos cardíacos para imagens volumétricas. A combinação de LSM convencional com costura de imagem e abordagens de deconvolução multiview permite a captura de todo o coração. Para abordar o trade-off inerente entre resolução axial e campo de visão (FOV), introduzimos ainda um método de microscopia de folha de luz varrida axialmente (ASLM) para minimizar a luz fora de foco e iluminar uniformemente o coração em toda a direção de propagação. Enquanto isso, os métodos de limpeza de tecidos, como o iDISCO, aumentam a penetração da luz, facilitando a visualização de estruturas profundas e garantindo um exame abrangente do miocárdio em todo o coração. A combinação dos métodos propostos de LSM e limpeza de tecidos apresenta uma plataforma promissora para pesquisadores na resolução de estruturas cardíacas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.
Introdução
A insuficiência cardíaca continua sendo a principal causa de mortalidade em todo o mundo, principalmente devido à falta de capacidade regenerativa dos cardiomiócitos maduros1. A intrincada arquitetura do coração desempenha um papel crucial em sua função e fornece informações sobre os processos de desenvolvimento. Uma compreensão profunda da estrutura cardíaca é essencial para elucidar os processos fundamentais da morfogênese e remodelamento cardíaco em resposta ao infarto do miocárdio. Progressos recentes demonstraram que camundongos recém-nascidos podem restaurar a função cardíaca após lesão, enquanto camundongos adultos não têm essa capacidad....
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Protocolo
Protocolos e experimentos com animais foram aprovados e conduzidos sob a supervisão do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas em Dallas (IACUC # 21-03). Camundongos C57BL6, incluindo neonatos no dia 1 pós-natal (P1) e adultos com 8 semanas de idade, foram usados neste estudo. Não foi observada diferença entre homens e mulheres. Toda a aquisição de dados e pós-processamento de imagens foram realizados por meio de software ou plataformas de código aberto com licenças de pesquisa ou educacionais. Os recursos estão disponíveis com os autores mediante solicitação razoável.
1. Preparação da amostra e limp....
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Resultados
Foi demonstrado que o LSM promove estudos cardíacos 31,32,33,34,35,36,37 devido ao risco mínimo de dano fotográfico, alta resolução espacial e seccionamento óptico, em oposição a outros métodos de imagem óptica, como técnicas de campo claro e varredura pontual <.......
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Discussão
O avanço dos métodos de imagem, computação e limpeza de tecidos proporcionou uma oportunidade incomparável para investigar extensivamente a estrutura e a função cardíaca. Isso tem um grande potencial para aprofundar nossa compreensão da morfogênese e patogênese cardíaca usando um modelo de coração de roedor intacto. Em contraste com estudos in vivo de coração de peixe-zebra usando uma abordagem semelhante 40,41,42,43, a integração de técnicas avançadas de LSM e métodos de limpeza de tecidos nos permite superar o.......
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Divulgações
Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.
Agradecimentos
Expressamos nossa gratidão ao grupo do Dr. Eric Olson no UT Southwestern Medical Center por compartilhar generosamente os modelos animais. Agradecemos todos os comentários construtivos fornecidos pelos membros da incubadora D na UT Dallas. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) e UT Dallas STARS program (YD).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1% Agarose | |||
| Baixo ponto de fusão agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Água Deionizada | - | - | |
| Produtos químicos para limpeza de tecidos | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimetilciclohexanometilamina, mistura de cis e trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Éter dibenzílico (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Diclorometano (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Grânulos fluorescentes | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Peróxido de hidrogênio (H2< / sub> O2< / sub>) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldeído (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software e algoritmos | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hö rl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Principais componentes do sistema de folha de luz personalizado | |||
| Corpo Zoom de 0.63 - 6.3X | Olympus | MVX-ZB10 | |
| Objetiva de iluminação 10X | Nikon | MRH00105 | |
| 1X objetiva de detecção | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| laser de 473nm DPSS | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| laser de 532nm DPSS | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 Laser de | Laserglow do nanômetro Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| conector de BNC | National Instrument | BNC-2110 | |
| Thorlabs | ACY254-050-A | ||
| DC-Motor Controller, 4 machados | Cabo de Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filtro | Chroma | ET525/30 | |
| Filtro | Chroma | ET585-40 | |
| Chroma | ET645-75 | ||
| Roda de filtro | Instrumento do obturador | LAMBDA 10-B | |
| Estágio de tradução motorizado | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Estágio de tradução motorizado | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Estágio de tradução motorizado | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| E / S multifuncional NI | National Instrument | PCIe-6363 | |
| Câmera sCMOS | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Motor de passo | Pololu | 1474 | |
| Lente de tubo | Olympus | MVX-TLU |
Referências
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Stelzer, E. H. K. K., et al.
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Reimpressões e permissões
