Artigo de método

Uma Radiossíntese Automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 para Uso Clínico de Rotina

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DOI:

10.3791/66708

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24 de maio de 2024

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1Radiopharmaceutical Production and Development Centre (RAPID), Medical Technology and Physics Department, Sir Charles Gairdner Hospital, 2National Imaging Facility, Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis, University of Western Australia, 3Department of Nuclear Medicine, Sir Charles Gairdner Hospital, 4Medical School, University of Western Australia

Neste artigo

Resumo

Este trabalho descreve a produção automatizada de até 1,7 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46 no sintetizador iPHASE MultiSyn para imagens PET da proteína de ativação de fibroblastos.

Resumo

[68Ga]Ga-FAPI-46 é um novo marcador promissor para a imagem da proteína de ativação de fibroblastos (FAP) por tomografia por emissão de pósitrons (PET). Os inibidores de FAP marcados (FAPIs) demonstraram captação em vários tipos de câncer, incluindo câncer de mama, pulmão, próstata, pâncreas e colorretal. O FAPI-PET também possui uma vantagem prática sobre o FDG-PET, pois não são necessários jejum e repouso. [68Ga]O Ga-FAPI-46 exibe propriedades farmacocinéticas aprimoradas, retenção tumoral aprimorada e imagens de maior contraste do que as imagens apresentadas anteriormente [68Ga]Ga-FAPI-02 e [68Ga]Ga-FAPI-04. Embora um protocolo de síntese manual para [68Ga]Ga-FAPI-46 tenha sido inicialmente descrito, nos últimos anos, métodos automatizados usando diferentes sintetizadores comerciais foram relatados.

Neste trabalho, descrevemos o desenvolvimento da síntese automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 usando o sintetizador iPHASE MultiSyn para aplicações clínicas. Inicialmente, foram investigadas a otimização do tempo de reação e a comparação do desempenho de quatro diferentes cartuchos de extração em fase sólida (SPE) para purificação do produto final. Em seguida, o desenvolvimento e a validação da produção de 0,6-1,7 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46 foram conduzidos usando esses parâmetros otimizados. O produto foi sintetizado em 89,8 ± rendimento corrigido de caimento de 4,8% (n = 6) ao longo de 25 min. O produto final atendeu a todas as especificações de controle de qualidade recomendadas e foi estável até 3 h após a síntese.

Introdução

A proteína de ativação de fibroblastos (FAP) tornou-se um alvo proeminente para imagens e terapia do câncer1,2. A PAF é um marcador específico de fibroblastos associados ao câncer (CAFs), um tipo de célula estromal que constitui grande parte do microambiente de cânceres sólidos. Os CAFs desempenham um papel fundamental no crescimento, invasão e metástase do tumor3. Eles são encontrados na maioria dos tumores sólidos, incluindo câncer de mama, próstata e pâncreas1. Ao direcionar a PAF com inibidores de pequenas moléculas marcados com radionuclídeos diagnósticos ou terapêuticos, imagens não invasivas seletivas e terapia desses cânceres podem ser alcançadas4,5,6. Moléculas inibidoras de FAP (FAPI), como FAPI-02, FAPI-04, FAPI-46 e FAPI-74 marcadas com 68Ga e 18F, representam uma classe de agentes direcionados à FAP à base de quinolina que foram desenvolvidos por equipes do Hospital Universitário de Heidelberg e do Centro Alemão de Pesquisa do Câncer (DKFZ), Alemanha7,8,9,10,11, com base em trabalhos anteriores que identificaram o altamente promissor andaime N-(4-quinolinoil)-glicil-(2-cianopirrolidina) para inibição de FAP12,13. Mais recentemente, inibidores de FAP de peptídeo cíclico, como FAP-228614 e 3BP-394015, foram desenvolvidos para imagem e terapia.

[68Ga]Ga-FAPI-04 demonstrou captação em 28 tipos diferentes de câncer, incluindo câncer de mama, pulmão, próstata, pâncreas e colorretal16. Além da vantagem prática de não exigir jejum e repouso9, o FAPI-PET mostrou uma vantagem diagnóstica sobre (ou um papel complementar com) FDG-PET, como no câncer gastrointestinal, de mama, ovário e fígado, em metástases cerebrais de câncer de pulmão17 e nos casos em que os achados do FDG são inconclusivos18. 68A FAPI marcada com Ga também mostrou algumas aplicações não oncológicas interessantes em doenças inflamatórias relacionadas ao sistema imunológico, como fibrose e artrite reumatoide19,20. O [68Ga]Ga-FAPI-46 apresentado mais recentemente, uma variante do [68Ga]Ga-FAPI-04, que tem uma ligação modificada com o ácido dodecano tetracético (DOTA), exibe propriedades farmacocinéticas aprimoradas e melhor retenção tumoral, resultando em imagens de maior contraste do que aquelas obtidas usando [68Ga]Ga-FAPI-02 ou [68Ga]Ga-FAPI-046,10. O uso de inibidores de FAP marcados para diagnóstico e tratamento está sob patente internacional21 e o uso de [68Ga]Ga-FAPI-46 está atualmente licenciado22.

As preparações relatadas de [68Ga]Ga-FAPI-46 usando 68Ga produzidos por cíclotron ou 68Ga eluídos de um gerador de 68Ge/68Ga incluem o uso de protocolos manuais e sintetizadores automatizados. Um protocolo de rotulagem manual para [68Ga]Ga-FAPI-46 foi descrito, com base em métodos relatados anteriormente para [68Ga]Ga-FAPI-02 e [68Ga]Ga-FAPI-0423,24. Embora a rotulagem manual não exija equipamento especializado, essa abordagem pode levar ao aumento da dose de radiação do operador e à variabilidade potencial dentro da produção25; daí a necessidade de automatizar a produção para aplicações clínicas de rotina. Além disso, o uso de um sintetizador automatizado é mais compatível com os regulamentos internacionais de BPF. A preparação de [68Ga]Ga-FAPI-46 foi desenvolvida em uma variedade de sintetizadores comerciais, usando 68Ga de diferentes geradores26,27,28,29,30,31,32,33 ou produzido por ciclotron68Ga34. As especificidades desses métodos automatizados estão resumidas na Tabela Suplementar S1 (Arquivo Suplementar 1). Métodos de síntese automatizados para outros inibidores de FAP marcados com 68Ga e 177Lu também foram publicados nos últimos anos35,36.

No Sir Charles Gairdner Hospital RAPID Center, desenvolvemos e validamos a preparação de [68Ga]Ga-FAPI-46 no sintetizador iPHASE MultiSyn (doravante denominado sintetizador MS). Este sintetizador é usado rotineiramente em nosso laboratório, bem como em outras instalações de produção na Austrália para a preparação de radiofármacos marcados com 68Ga, 177Lu e 89Zr37,38,39. O sintetizador MS é operado baixando uma lista de etapas de sequência do Excel para sua memória interna. Esta lista de etapas de sequência é fácil de usar e facilmente modificável. Além disso, o sintetizador permite intervenções no meio da produção, como repetir etapas, voltar às etapas anteriores, pular etapas e pausar a produção quando necessário. É equipado com detectores de radiação colocados em locais estratégicos, permitindo ao usuário monitorar o processo de produção em tempo real. O sintetizador MS é compatível com todos os geradores comerciais de 68Ga e permite a eluição de gerador simples ou duplo. O procedimento descrito neste trabalho utiliza 68Ga de um ou dois geradores de 68Ge/68Ga e envolve tanto a pré-purificação de 68Ga quanto a pós-purificação do produto final. O tempo de reação ideal e a comparação do desempenho de três tipos diferentes de cartuchos de extração em fase sólida (SPE) de pós-purificação com o fornecido no do fornecedor também foram avaliados como parte deste estudo.

Protocolo

ATENÇÃO: Este protocolo envolve o manuseio de materiais radioativos. Todos os profissionais que realizarem este trabalho devem ser adequadamente treinados no manuseio de radioisótopos não selados e devem ter a aprovação do responsável pela segurança radiológica de sua instituição. O sintetizador automatizado deve estar localizado em uma cela quente dedicada e blindada. Experimentos manuais devem ser realizados em uma cela quente blindada ou atrás de proteção contra radiação. Os experimentos preliminares para a otimização do tempo de reação e para o teste de diversos cartuchos de ECP são descritos na Seção Suplementar 1 (Arquivo Suplementar 1).

1. Preparação do sintetizador de MS

  1. Ligue o ar comprimido da cela quente, o fornecimento de gás nitrogênio, a ventilação, a luz e a energia para o laptop e o controlador lógico programável (CLP). Verifique o nível do frasco de resíduos do módulo. Substitua por um frasco vazio quando estiver ¾ cheio.
  2. Ligue o computador e faça login no software do sintetizador. Insira o nome de usuário e a senha.
  3. No software do sintetizador, pressione Baixar receita, selecione o arquivo de sequência em Excel para a produção de [68Ga]Ga-FAPI-46 e pressione Abrir. Pressione OK após o download bem-sucedido da sequência.
  4. Pressione Iniciar; insira o número do lote, o número do lote do kit de reagentes e quaisquer comentários na janela pop-up; e pressione OK.
    NOTA: A partir desse momento, a interface do usuário exibirá uma mensagem de etapa descrevendo a ação da etapa e/ou solicitando intervenção do operador.
  5. Remova o kit de hardware antigo conforme indicado pela mensagem de etapa na interface do usuário. Pressione PRÓXIMO na interface do usuário.
  6. Remova a seringa de eluição do gerador (Seringa de HCl 1) do sintetizador, conforme indicado pela mensagem de etapa na interface do usuário, puxando o apoio para o polegar da seringa para fora do encaixe do motor da seringa e desatarraxando a seringa da linha de entrada do gerador. Pressione PRÓXIMO na interface do usuário.

2. Preparação dos reagentes

OBSERVAÇÃO: Os reagentes necessários para a produção automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 (consulte Tabela 1) foram preparados em ambiente de sala limpa imediatamente antes da produção.

  1. Obtenha o kit de reagentes e o conjunto de acessórios, um tubo cônico de 50 mL contendo no mínimo 5 mL de água com concentração em nível de traço de metais; o saco de HCl 0,1 M, o frasco com 7 mg de ácido ascórbico (frasco A); o frasco de ascorbato de sódio (5 mg) (frasco B); 2 seringas de polipropileno (PP)/polietileno (PE) de 5 mL, livres de látex, PVC e óleo de silicone (três, se utilizar eluição com dois geradores) e o frasco de vidro com 50 µg de FAPI-46 (frasco C; veja Supplemental Figure S1A,B-Supplemental File 1).
  2. Despeje aproximadamente 2 mL de água na tampa do tubo de 50 mL. Aspire 1 mL de água em uma seringa de 5 mL (identifique como Seringa A). Tampe com uma agulha. Pipete 400 µL de água e adicione ao frasco de ácido ascórbico de 7 mg (frasco A) – agite suavemente para dissolver.
  3. Abra o frasco fornecido de tampão de acetato de sódio 0,25 M (do kit de reagentes) e o frasco de vidro com 50 µg de FAPI-46. Pipete 0,9 mL do tampão e adicione ao frasco de vidro com 50 µg de FAPI-46 (frasco B); misture suavemente.
  4. Retire o conteúdo do frasco A e do frasco B para dentro da Seringa A. Misture suavemente.
  5. Identifique a seringa de 5 mL fornecida no conjunto de acessórios como Seringa B. Aspire 5 mL de HCl 0,1 M do saco de HCl 0,1 M com a Seringa B; tampe com o pino dispensador fornecido.
    NOTA: Para produção utilizando eluição com dois geradores, são necessárias duas seringas de 5 mL de HCl 0,1 M.
  6. Identifique a seringa de 3 mL fornecida no conjunto de acessórios como Seringa C. Abra o frasco de solução de cloreto de sódio 5 M acidificada (do kit de reagentes), pipete 1 mL, transfira para a Seringa C e tampe com o pino dispensador fornecido.
  7. Aspire 1 mL de solução salina a 0,9% em uma seringa de 5 mL (Seringa D) e adicione ao frasco C; mantenha a Seringa D vazia.

3. Preparação da cassete de síntese e instalação da cassete

  1. Obtenha uma cassete estéril dedicada de [68Ga]Ga.
  2. Monte a cassete seguindo os passos abaixo:
    1. Desembrulhe o envelope da cassete, verifique se há danos e aperte cada conexão luer. Gire e alinhe cada torneira na cassete para garantir que não estejam travadas e que se encaixem no módulo. Remova todas as tampas dos spikes.
    2. Condicione o cartucho SPE de pré-purificação por troca catiônica forte da seguinte forma:
      1. Remova o cartucho posicionado na válvula 7 do Manifold 3 (M3) da cassete.
      2. Coloque um frasco de vidro aberto dedicado para resíduos na bancada.
      3. Acople a seringa contendo 2 mL de HCl 3 M (fornecida no kit de reagentes) ao cartucho SPE e elua lentamente o cartucho SPE gota a gota no frasco de resíduos de vidro. Remova a seringa, aspire 5 mL de ar e lave o SPE com 5 mL de ar.
        CAUTION: A etapa 3.2.2.3 exige o manuseio de um ácido forte (ácido clorídrico 3 M). Use equipamento de proteção adequado (luvas, óculos de segurança, jaleco de laboratório).
      4. Acople a seringa contendo 5 mL de água (do kit de reagentes) ao SPE e elua lentamente o SPE gota a gota no frasco de resíduos de vidro. Remova a seringa, aspire 5 mL de ar e lave o SPE com 5 mL de ar.
      5. Coloque o SPE de volta no manifold na posição da válvula 7 do M3.
    3. Pressione PRÓXIMO na interface do usuário.
    4. Monte e instale a nova cassete conforme mostrado na interface do usuário (veja Figura 1A,B se estiver usando eluição dupla), sem nenhum reagente, e seguindo as conexões descritas na Figura 1C
      1. Conecte a seringa de 10 mL (do conjunto de acessórios) à válvula 6 do M2.
      2. Instale os quatro manifolds e fixe a cassete usando os travamentos magnéticos do sintetizador.
      3. Coloque o reator no forno.
      4. Conecte as tubulações às portas G1, W2, W1, R e G2.
      5. Conecte a tubulação do lado direito da válvula 3 do M1 ao cartucho de troca catiônica na válvula 7 do M3.
      6. Instale um cartucho SPE de pós-purificação na válvula 4 do M2.
        NOTA: Uma foto da configuração final para a síntese é mostrada na Figura Suplementar S1C (Arquivo Suplementar 1).
  3. Pressione PRÓXIMO na interface do usuário para iniciar os seguintes testes na sequência listada abaixo:
    1. Teste de pressão da conexão de gás inerte com o M4.
    2. Teste de pressão da conexão entre M3 e M4.
    3. Teste de pressão do reator.
    4. Teste de pressão da conexão de resíduos com o M3.
    5. Teste de pressão do cartucho SPE de pós-purificação entre M3 e M2.
    6. Teste de pressão da conexão da seringa na válvula 6 do M2.
    7. Teste de pressão da conexão de resíduos com o M2.
    8. Teste de pressão da conexão de gás inerte com o M1.
    9. Teste de pressão do cartucho SPE de pré-purificação entre M1 e M3.
    10. Enxágue os spikes nas válvulas 10, 11 e 12 com gás inerte.
    11. Enxágue M3 e M4 com gás inerte.
    12. Enxágue os cartuchos SPE de pré-purificação e pós-purificação com gás inerte.

4. Instalação de reagentes, linha(s) do gerador(es) e frasco do produto final (consulte Figura 1A,C e Figura 1B,C se estiver usando eluição de duplo gerador)

  1. Obtenha os frascos de etanol (100%), solução salina e água para injeção do kit de reagentes; remova as tampas; e limpe cada septo com um lenço umedecido com álcool.
  2. Instale os frascos no kit nas posições M4 válvula 10, M4 válvula 11 e M4 válvula 12 quando solicitado pelo sintetizador; clique em PRÓXIMO na interface do usuário.
  3. Remova a agulha da seringa A e puxe o êmbolo até 5 mL.
  4. Desconecte a linha do orifício central do reator e transfira o conteúdo da seringa A para o frasco do reator através do orifício central do reator.
  5. Reconecte a linha ao orifício central do reator; clique em PRÓXIMO na interface do usuário.
  6. Instale a(s) linha(s) de saída do gerador na cassete na posição M1 válvula 2 (e M1 válvula 1, se for eluição com dois geradores); clique em PRÓXIMO na interface do usuário.
  7. Remova a agulha de dispensação da seringa C e instale-a na posição M1 válvula 3; clique em PRÓXIMO na interface do usuário.
  8. Remova a agulha de dispensação da seringa B, conecte o encaixe luer lock da seringa B à linha de entrada do gerador e empurre a seringa B de modo que o apoio para o polegar do êmbolo deslize para dentro do encaixe do acionador da seringa; clique em PRÓXIMO na interface do usuário.
  9. Prepare o frasco do produto final em uma cabine de segurança biológica Classe II ou equivalente, seguindo os passos abaixo:
    1. Coloque um frasco estéril de 25 mL rotulado em um recipiente de tungstênio (ou recipiente adequadamente blindado).
    2. Limpe o septo do frasco com um lenço umedecido com álcool, coloque uma tampa no recipiente e insira uma agulha de ventilação com filtro.
    3. Conecte a saída de um filtro de ventilação esterilizante de 0,22 µm de polivinilideno fluoreto (PVDF) com baixa ligação proteica a uma agulha hipodérmica estéril de 20 G. Rotule o filtro com o número do lote do produto.
    4. Insira a agulha no frasco final de produto de 25 mL com ventilação.
    5. Retire o conteúdo do frasco C (Tabela 1) para a seringa D vazia (ver passo 2.7) e adicione 4 mL de ar.
    6. Conecte a seringa D à entrada do filtro de ventilação de 0,22 µm. Empurre o conteúdo da seringa através do filtro de 0,22 µm e da agulha para dentro do frasco do produto final.
    7. Enxágue o filtro 2 vezes com 5 mL de ar. Remova a seringa do filtro de ventilação de 0,22 µm.
      NOTA: Os enxágues devem ser feitos lentamente para evitar romper a membrana do filtro.
  10. Transfira o recipiente contendo o frasco do produto final para a cela quente, conecte a tubulação final da posição M2 válvula 5 ao filtro do frasco do produto e clique em PRÓXIMO na interface do usuário.

5. Passos preliminares do sintetizador antes da marcação radiativa

  1. Aguarde a realização dos seguintes passos preliminares pelo sintetizador: pressurização do frasco de etanol (M4, válvula 10); pressurização do frasco de solução salina (M4, válvula 11); pressurização do frasco de água (M4, válvula 12); pressurização da seringa de cloreto de sódio acidificado (M1, válvula 3); condicionamento do cartucho SPE pós-purificação com etanol; condicionamento do SPE pós-purificação com água; repressurização do frasco de água (M4, válvula 12).
  2. Pressione PRÓXIMO na interface do usuário para iniciar a produção quando o sintetizador exibir a mensagem Pronto para eluir o 68Ga do Gerador.

6. Radiomarcação automatizada para produzir [68Ga]Ga-FAPI-46

OBSERVAÇÃO: A síntese automatizada é iniciada realizando-se o passo 5.2. Figura 1D descreve a reação de radiomarcação para produzir [68Ga]Ga-FAPI-46. Uma imagem representativa da interface do sintetizador e um perfil típico de radioatividade são mostrados em Figura 1A,B e Figura 2, respectivamente. Para produção utilizando eluição dupla do gerador, o sintetizador solicitará ao usuário que remova a seringa B vazia após a eluição do primeiro gerador e instale outra seringa contendo 5 mL de HCl 0,1 M no driver da seringa para a eluição do segundo gerador.

  1. No final da síntese (FOS), procure a mensagem synthesis complete exibida pelo sintetizador. Remova o filtro de ventilação esterilizante de 0,22 µm e a agulha de ventilação filtrada do frasco do produto final e recupere o recipiente de tungstênio da célula quente.

Tabela 1: Preparação dos reagentes para a produção de [68Ga]Ga-FAPI-46. Clique aqui para baixar esta tabela.

Diagrama de radiomarcação com configuração do manifold e processo da reação; inclui etapas de cromatografia.
Figura 1: Esquema da interface do usuário do sintetizador; configuração da cassete e dos reagentes para a radiosíntese automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46. (A) Configuração para produção com um único gerador. (B) Configuração para produção com dois geradores. (C) Posições dos reagentes para a produção automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 utilizando o sintetizador radioquímico MS. (D) Esquema de radiomarcação do [68Ga]Ga-FAPI-46. Abreviações: FAPI = inibidor da proteína de ativação de fibroblastos; Mn = manifold n; Wn = saída de resíduo n; Vn = válvula n; R = reator a vácuo; Gn = entrada de gás n. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico do processo de radio marcação: eluição de [68Ga]Ga3+, aprisionamento na extração em fase sólida (SPE), análise de radioatividade versus tempo.
Figura 2: Perfil típico de radioatividade no sintetizador para a síntese automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46. Abreviações: FAPI = inibidor da proteína ativadora de fibroblastos; SPE = extração em fase sólida. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

7. Dispensação de [68Ga]Ga-FAPI-46 para controle de qualidade e envio

  1. Transfira o frasco do produto para um sistema de dispensação adequadamente blindado e inverta o frasco para homogeneizar o produto.
  2. Utilizando técnicas assépticas e técnicas de proteção contra radiação, retire uma amostra de 1 mL do frasco do produto e:
    1. Aliquote 150 µL em um tubo de 1,5 mL com baixa ligação proteica (Tubo 1) para testes de controle de qualidade pré-liberação + análise de solvente residual.
    2. Aliquote 50 µL em um tubo de 1,5 mL com baixa ligação proteica (Tubo 2) para teste de endotoxinas.
    3. Aliquote 300 µL em um frasco de vidro estéril evacuado de 10 mL para teste de esterilidade (enviar a um contratante externo após a amostra ter decaído para um nível aceitável [10 meias-vidas]).
    4. Aliquote 500 µL em um frasco de vidro estéril evacuado de 10 mL para retenção.
    5. Aliquote o produto restante em um frasco (~10 mL) para doses ao paciente.

8. Controle de qualidade de [68Ga]Ga-FAPI-46

NOTA: Os testes de controle de qualidade descritos abaixo foram realizados de acordo com os procedimentos descritos na Farmacopeia Europeia40.

  1. Avalie a aparência por inspeção visual.
  2. Avalie o pH com papel indicador.
  3. Determine a meia-vida do radionuclídeo realizando três medições de atividade de uma amostra de 50 µL, utilizando uma câmara de ionização.
  4. Avalie a identidade radionuclídica e a pureza radionuclídica utilizando um espectrômetro gama de iodeto de sódio (NaI(Tl)) baseado em analisador multicanal (MCA).
  5. Avalie a identidade radioquímica por meio de radio-HPLC analítica, verificando a semelhança entre os tempos de retenção da amostra de [68Ga]Ga-FAPI-46 e de um padrão de referência não radioativo [natGa]Ga-FAPI-46 (considerando um pequeno volume de atraso entre os detectores de radioatividade e UV).
  6. Quantifique a % de pureza radioquímica por meio de radio-HPLC analítica utilizando a equação (1).
    Cálculo da pureza radioquímica; equação; AUC dos picos radioativos no cromatograma do detector de radioatividade. 
  7. Quantifique a % de pureza radioquímica por meio de radio-TLC analítica utilizando a equação (2).
    Fórmula de pureza radioquímica; método cromatográfico; AUC do pico de [68Ga]Ga-FAPI-46; frente do solvente. 
    NOTA: Os passos 8.8, 8.9 e 8.10 podem ser realizados antes ou após a liberação, conforme exigências regulatórias locais. Os passos 8.11 e 8.12 podem ser realizados após a liberação. Quaisquer ensaios pós-liberação devem ser realizados o mais breve possível após o decaimento radioativo da amostra.
  8. Quantifique o teor de solvente residual (etanol) da formulação utilizando cromatografia gasosa.
  9. Avalie os níveis de endotoxinas bacterianas utilizando um sistema de ensaio de endotoxinas baseado em cartucho (método cinético cromogênico com lisado de amebócitos de Limulus [LAL]).
  10. Avalie a integridade do filtro de 0,22 µm realizando um teste de bolhas.
  11. Avalie a pureza radionuclídica (presença de germânio-68) utilizando um espectrômetro gama ou um contador gama. Retenha a solução a ser examinada por pelo menos 48 h para permitir que o gálio-68 decaia a um nível que permita a detecção de impurezas.
  12. Avalie a esterilidade do produto.

9. Teste de estabilidade

  1. Para análise de estabilidade, retire 50 µL de [68Ga]Ga-FAPI-46 do frasco do produto final imediatamente após o EOS e, em seguida, novamente em intervalos de 1 h até 3 h após o EOS.
  2. Quantifique a pureza radioquímica em % por meio de HPLC com detecção radioativa em cada ponto temporal.
  3. Quantifique a pureza radioquímica em % por meio de TLC com detecção radioativa em cada ponto temporal.

Resultados

A eficiência de marcação radioativa avaliada entre 5 e 20 minutos de reação a 95 °C é apresentada na Tabela 2. As cartuchas de SPE pós-purificação HLB 30 mg, Strata X 60 mg e Sep-Pak C18 Plus Short 360 mg apresentaram recuperações muito semelhantes (94,3 ± 0,5% corrigida para decaimento [DC]) (Tabela 3). Em nossa experiência, a recuperação na HLB 225 mg foi muito menor (63,8 ± 3,5% DC).

Tabela 2: Resumo da conversão radioquímica da reação bruta medida por cromatografia em camada delgada (CCD) para tempos de reação de 5, 10, 15 e 20 minutos (n = 3). Abreviações: CCD = cromatografia em camada delgada; Exp. = experimento. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Resumo da % de recuperação e das análises de pureza radioquímica por TLC e HPLC de [68Ga]Ga-FAPI-46 no final da síntese (EOS), utilizando quatro cartuchos diferentes de extração em fase sólida (n = 3). Abreviações: SPE = extração em fase sólida; FAPI = inibidor da proteína ativadora de fibroblastos; EOS = final da síntese; RSD = desvio padrão relativo; TLC = cromatografia em camada delgada; HPLC = cromatografia líquida de alta eficiência. Clique aqui para baixar esta tabela.

O protocolo automatizado para a produção de [68Ga]Ga-FAPI-46 foi desenvolvido utilizando um tempo de reação de 10 min e a cartela de extração em fase sólida (SPE) Strata X de 60 mg. Foram realizadas duas séries de três lotes de validação utilizando eluições de um único gerador e de dois geradores, obtendo-se atividades médias finais do produto de 0,60 GBq e 1,6 GBq, respectivamente (Tabela 4). Em ambas as séries, o final [68O produto Ga]Ga-FAPI-46 passou por todos os testes de controle de qualidade (Tabela 4). A estabilidade do [68O produto [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46 foi avaliado mediante a análise da pureza radioquímica do produto por TLC e HPLC (Figura 3 e Figura 4) para todas as seis produções por até 3 h pós-síntese e foi maior que 98,0 ± 1,8% (n = 3) e 99,1 ± 0,9% (n = 3), respectivamente. No geral, a síntese de [68Ga]Ga-FAPI-46 foi validado com um rendimento corrigido para decaimento de 89,8 ± 4,8% (n = 6). A produção automatizada está atualmente sendo utilizada para a produção de [68Ga]Ga-FAPI-46 para apoiar ensaios clínicos.

Tabela 4: Resumo dos resultados de controle de qualidade (CQ) das corridas de validação de [68Ga]Ga-FAPI-46 (n = 6): com baixa atividade a partir de uma única eluição de gerador (n = 3) e alta atividade a partir de eluição dupla de gerador (n = 3). Clique aqui para baixar esta tabela.

Gráfico de radioatividade versus distância para compostos de \[^{68}\text{Ga}\]; resultados de separação cromatográfica.
Figura 3: Cromatograma de CLT de [68Ga]Ga-FAPI-46: (Aplicação de 5 µL) no final da síntese (EOS), utilizando papel iTLC-SG e eluente de acetato de amônio 1 M/metanol (1:1 v/v). A radioatividade foi medida com um scanner de CLT com detecção radioativa PS Plastic, integrando a cada incremento de 1 mm a uma velocidade de 1 mm/s. Abreviações: CLT = cromatografia em camada delgada; FAPI = inibidor da proteína de ativação de fibroblastos; EOS = fim da síntese; iTLC-SG = CLT instantânea em gel de sílica. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de cromatografia; detecção UV e radioativa de Ga-FAPI-46; intensidade do pico versus tempo.
Figura 4: Análise por HPLC do produto final [68Ga]Ga-FAPI-46. Coluna RP-18 encapada, fase móvel A: ácido trifluoroacético 0,1%, fase móvel B: acetonitrila pura. Gradiente: 0-0,5 min 2% B, 0,5-10,0 min 2%-35% B, 10,0-12,0 min 35% B e 12,0-15,0 min 35% B. O comprimento de onda UV foi de 280 nm e a vazão de 2 mL/min. (A) Cromatograma UV do produto [68Ga]Ga-FAPI-46, incluindo o sinal UV do ascorbato de sódio em 1,0 min e os dois picos pequenos em 4,5 e 4,8 min, correspondentes ao [natGa]Ga-FAPI-46 e ao precursor FAPI-46, respectivamente. Os cromatogramas UV dos padrões de [natGa]Ga-FAPI-46 a 10 mg/L e do precursor FAPI-46 a 10 mg/L estão apresentados na Figura Suplementar S2 (Arquivo Suplementar 1). (B) Radio-cromatograma do [68Ga]Ga-FAPI-46 (Rt [68Ga]Ga-FAPI-46 = 4,6 min - Rt do [68Ga]Ga3+ livre = 1,1 min). Abreviações: HPLC = cromatografia líquida de alta eficiência; FAPI = inibidor da proteína de ativação de fibroblastos; Na+Asc- = ascorbato de sódio. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Este documento inclui: Tabela Suplementar S1 — Detalhes relatados de sínteses automatizadas e controle de qualidade para [68Ga]Ga-FAPI-46, Seção Suplementar 1 — Experimentos preliminares: Otimização do tempo de reação e seleção da cartela de SPE pós-purificação para a produção automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 no radio-sintetizador MS, Figura Suplementar S1 — Imagens dos reagentes e configuração final para a síntese automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 no sintetizador MS, Figura Suplementar S2 — Cromatogramas UV de [natGa]Ga-FAPI-46 e do precursor FAPI-46, e Figura Suplementar S3 — Cromatograma radioativo de [68Ga]Ga-FAPI-46 para marcação com alta atividade (2,8 GBq) sem ácido ascórbico no reator. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este trabalho descreve a produção confiável e de alto rendimento de [68Ga]Ga-FAPI-46 no sintetizador MS para aplicações clínicas. O trabalho preliminar deste protocolo testou, na mesma série de experimentos, diferentes tempos de reação para a síntese de [68Ga]Ga-FAPI-46, bem como quatro cartuchos SPE diferentes para a purificação do produto final. A fim de (i) reduzir a dose de radiação para o operador e (ii) recriar as condições em que a produção de rotina de [68Ga]Ga-FAPI-46 seria desenvolvida, esses experimentos preliminares também foram conduzidos usando o sintetizador MS sempre que possível. Uma sequência [68Ga]Ga-FAPI-46 foi criada usando parâmetros semelhantes usados para a produção de [68Ga]Ga-PSMA-11 e [68Ga]Ga-DOTA-TATE. A sequência é baseada em programação passo a passo simples em uma planilha do Excel e pode ser facilmente editada. Os kits e reagentes foram montados apenas para a primeira parte da síntese de [68Ga]Ga-FAPI-46 (eluição e purificação de 68Ga; reação de marcação), omitindo as etapas finais (purificação de SPE e filtração estéril final), pois esses experimentos preliminares foram realizados no material bruto manualmente. Como resultado, o cartucho SPE pós-purificação (Strata X 60 mg), bem como os frascos de etanol, água e solução salina no Manifold 4 e o frasco do produto final não precisaram ser instalados.

A literatura publicada sobre a produção de [68Ga]Ga-FAPI-46 descreve a purificação do produto final usando diferentes cartuchos de SPE: OASIS HLB 30 mg sorvente23,29, OASIS HLB Plus 225 mg28, CM26,34, C18 Plus Sep-Pak30,32 e Sep-Pak Light C1831. Este trabalho compara três dos diferentes cartuchos de SPE utilizados na literatura (HLB 30 mg; C18 SepPak Plus Short e HLB 225 mg) com o Strata X 60 mg que é fornecido com nossos existentes para a purificação de [68Ga]Ga-PSMA-11 e [68Ga]Ga-DOTA-TATE. Até onde sabemos, o cartucho Strata X 60 mg SPE ainda não havia sido avaliado para purificação de [68Ga]Ga-FAPI-46. O Strata X 60 mg apresentou semelhantes (HLB 30 mg; C18 SepPak Plus Short) ou melhor (HLB 225 mg) do que outros SPE usados na literatura para a purificação de [68Ga]Ga-FAPI-46, no que diz respeito à eficiência de captura e eluição (Tabela 3). A eluição do HLB 225 mg com um mililitro extra de etanol não resultou em melhora significativa (resultados não mostrados). O cartucho Strata X 60 mg foi selecionado para validação da síntese totalmente automatizada descrita neste protocolo.

A síntese automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 descrita no protocolo acima pode ser descrita em quatro etapas principais. O primeiro passo é a eluição de um ou dois geradores de 68Ge/68Ga com HCl 0,1 M e subsequente aprisionamento de [68Ga]GaCl3 no cartucho de troca iônica. Segue-se a eluição de [68Ga]Ga3+ do cartucho de permuta iónica para o recipiente de reação (pré-carregado com a solução precursora contendo 50 μg de precursor FAPI-46, 1,4 ml de água contendo uma concentração de nível residual de metal e 7 mg de ácido ascórbico) utilizando uma solução acidificada de cloreto de sódio 5 M. O pH da reação de marcação é 3,5-4. O próximo passo é a reação de radiomarcação durante a qual o reator é aquecido a 95 ° C por 10 min para permitir a complexação do [68Ga] Ga3+ pela porção DOTA do precursor FAPI-46. Após o arrefecimento da mistura de reação a 40 °C, a quarta e última etapa é a purificação de [68Ga]Ga-FAPI-46, que consiste em i) aprisionamento e purificação da mistura de reação no cartucho de SPE Strata X 60 mg pós-purificação, ii) enxaguamento do cartucho de SPE Strata X 60 mg com água para preparações injetáveis, (iii) eluição do produto final com etanol, (iv) diluição com solução salina para injeção e (v) transferência para o frasco do produto final através de um filtro ventilado esterilizante de 0,22 μm. A reação pode ser monitorada em tempo real por inspeção visual e leituras de sensores (por exemplo, temperatura, pressão, vácuo, leitura de radiação e temporizadores de contagem regressiva). Uma captura de tela representativa da interface do usuário é mostrada na Figura 1A,B. O perfil de radioatividade mostrado na Figura 2 é particularmente útil para monitorar o progresso da síntese, exibindo a transferência de radioatividade através das etapas críticas descritas acima.

Foram realizadas seis validações que passaram por todas as especificações de controle de qualidade, usando um ou dois geradores de 68Ge/68Ga (2,41 GBq). Três execuções foram concluídas usando 68Ga de uma única eluição de gerador, produzindo 0,59-0,63 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46. Três execuções foram concluídas usando 68Ga eluídos de dois geradores, produzindo 1,54-1,71 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46. Cada corrida foi concluída em ~ 25 min. O método de gerador único foi projetado antecipando a necessidade de atividades superiores a serem produzidas no futuro. Consequentemente, 7 mg de estabilizador de ácido ascórbico foram adicionados à mistura de reação para evitar radiólise durante a etapa de radiomarcação, conforme descrito anteriormente por Mu et al. para a produção de [68Ga]Ga-DOTA-TATE41. Da Pieve et al.29 e Alfteimi et al.30 também relataram a adição de estabilizador de ácido ascórbico de 0,3 mg à mistura de reação para a produção automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 (Tabela Suplementar S1-Arquivo Suplementar 1). De fato, observamos radiólise significativa para uma síntese de alta atividade (~ 2,8 GBq no reator) quando o estabilizador de ácido ascórbico foi omitido da mistura de reação (Figura Suplementar S3-Arquivo Suplementar 1). Além disso, para evitar a radiólise do produto final, 5 mg de ascorbato de sódio em 1 mL de soro fisiológico a 0,9% injetáveis foram adicionados manualmente ao frasco do produto final através do filtro esterilizante, resultando em um volume de produto final de 11 mL. Cada lote foi testado até 3 h após a produção e tanto a produção de baixa atividade (eluição de gerador único) quanto a de alta atividade (eluição de gerador duplo) demonstraram excelente estabilidade radioquímica (>95% por HPLC e TLC). É importante enfatizar que a implementação deste protocolo envolve o manuseio de materiais radioativos não selados e só deve ser realizada por pessoal devidamente treinado. O protocolo deve ser realizado atrás de proteção contra radiação, de preferência dentro de uma célula quente ventilada. O objetivo esperado da síntese de [68Ga]Ga-FAPI-46 usando este protocolo é a administração a pacientes para diagnóstico por imagem. Como tal, técnicas assépticas rigorosas devem ser seguidas por toda parte. O teste de controle de qualidade de [68Ga]Ga-FAPI-46, conforme descrito no protocolo acima, é fundamental para garantir a qualidade do produto final.

Prevê-se que qualquer local que fabrique [68Ga]Ga-PSMA-11 ou [68Ga]Ga-DOTA-TATE no sintetizador MS deve estar totalmente equipado para preparar [68Ga]Ga-FAPI-46 usando o protocolo descrito aqui, com apenas pequenas modificações necessárias para o uso de geradores ou reagentes alternativos. Devido à crescente demanda por [68Ga]Ga-FAPI-46 nas clínicas, o trabalho apresentado aqui foi projetado para atender a várias necessidades e capacidades do local, desde a produção de doses de 1-2 pacientes de [68Ga]Ga-FAPI-46 por síntese no método de gerador único e até 4-5 pacientes por síntese para o método de gerador duplo, dependendo da disponibilidade da(s) câmera(s) PET.

Divulgações

Os autores não têm parcerias comerciais ou fontes de financiamento que resultem em um conflito de interesse real ou percebido relacionado a este trabalho para divulgar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem e agradecem à SOFIE Biosciences Inc. por fornecer o precursor químico FAPI-46 e o padrão [natGa]Ga-FAPI-46, à Charlies Foundation for Research pelo apoio financeiro, Stan Poniger da iPHASE Pty Ltd e à equipe de Produção de Radiofármacos (RAPID) do Departamento de Tecnologia Médica e Física do Hospital Sir Charles Gairdner por seu apoio científico e técnico. Os autores também reconhecem a assistência do WA National Imaging Facility Node, que é apoiado por financiamento de infraestrutura do Governo do Estado da Austrália Ocidental em parceria com o Governo Federal Australiano, por meio da capacidade da Estratégia Nacional de Infraestrutura de Pesquisa Colaborativa (NCRIS).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,1 M Ácido clorídrico (HCl) ultra puroABX composto bioquímico avançado (Radberg, Alemanha)HCl-103-GUsado para eluição de gerador (es)
Acetato de amônioSigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Austrália)A1542-250GUsado para fazer a fase móvel iTLC
C18 SepPak Plus curto (360 mg)ÁguasWAT020515Sílica pós-purificação SPE
Chromolith Performance RP-18 endcapped 100-4.6 monolíticoMerck Pty Ltd (Victoria (Austrália)1021290001HPLC RP-18 endcapped column, usado para controle de qualidade de HPLC
Calibrador de doseCapintecCRC-15PETUsado para calibrar e medir a atividade de 68Ga
Dual scan-RAM LabLogic Limited (VA, EUA)SR-1AScanner Radio-TLC para análise do papel iTLC
Precursor FAPI-46 (GMP)Composto bioquímico avançado ABX (Radberg, Alemanha)3601.0000.050Precursor de peptídeos
Facilidade de enchimento Frasco de vácuo estéril (10 mL)Iosotopos HUAYISVV-10CUsado para amostras de esterilidade e retenção
Facilidade de enchimento Frasco de vácuo estéril (25 mL)IosotoposHUAYISVV-25AUsado para radiomarcação de
peptídeo Ga68 do produto final com pré-purificação do geradoriPHASE Technologies (Melbourne, Austrália)MSR-120G- (RK-3296)Conjunto de reagentes 
Radiomarcação Ga68 com pré-purificação do geradoriPHASE Technologies (Melbourne, Austrália)MSH-120Hardware + conjunto de auxiliares 
Sistema de cromatografia gasosa (GC)Tecnologias Agilent (Vic, Austrália)G2630AUsado para medir solvente residual
GS Fonte padrão (Ba133)Global Medical Solutions Pty Ltd (Austrália)D-102-19Usado para calibrar o espectômetro gama
GS Fonte padrão (Co60)Global Medical Solutions Pty Ltd (Austrália)1559-84Usado para calibrar o espectômetro gama
Sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)Shimadzu Scientific Instruments (NSW, Austrália)LC-20Equipamento HPLC
Agulha de ventilação hidrofóbicaBaldwin Medical (Victoria, Austrália)1088Usado com frasco de produto final
  IGG100 Eckert & Produtos de isótopos Ziegler  (Berlim, Alemanha)Gerador IGG100-65M-NT68Ge/68Ga
Seringa de 5 mL (Seringa individual Injekt luer lock)B Braun (Melsungen, Alemanha)4606710VSeringas de polipropileno (PP)/polietileno (PE), livres de látex, PVC e seringa livre de óleo de silicone usadas para reagentes
Tecnologias Agilent de papel iTLC-SG(Vic, Austrália)SGI0001Usado para análise iTLC
Software LabLogic (LAURA)LabLogic Limited (VA, EUA)Software LAURA versão 6.1Usado para análise de rádio-TLC
Ácido L-ascórbico Trace selectFluka Sigma05878-100GUsado como eliminador de radicais na mistura de reação
Lichrosolv Acetonitrila (ACN)Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Austrália)1.00030.2500Usado para fazer HPLC fase móvel orgânica
Lichrosolv WaterSigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Austrália)1.15333.2500Usado para fazer HPLC fase móvel aquosa
Metanol (MeOH)Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Austrália)1060182500Usado para fazer detector de fase móvel iTLC
Na + < / sup > I-< / sup>LabLogic Limited (VA, EUA)1 "NaI / PMTRadiodetector usado para radio-HPLC
Oasis HLB (30 mg)Waters (Milford, MA, EUA)WAT094225Copolímero de pós-purificação SPE
Oasis HLB Plus curto (225 mg)Waters (Milford, MA, EUA)186000132Tiras de pH SPE de copolímero de pós-purificação
Thermo Fisher Scientific Australia Tty Ltd90424Usado para medir o pH do produto
Detector PS LabLogic Limited (VA, EUA)Radiodetector de plástico/PMTPS usado para rádio-TLC
  Tubo Safe Lock (1,5 mL)Eppendorf0030 120.086Usado para amostras de controle de qualidade
(+)-L-ascorbato de sódioMerck Pty Ltd (Victoria (Austrália)11140-250GEstabilizador do produto final Solução de
cloreto de sódio (NaCl) (solução salina)PfizerPS1110,9%, para injeção, grau USP
Sterican 100 NeedlesB Braun (Melsungen, Alemanha)4667093Usado para produto final
Filtro de seringa estéril (0,22 µ m)Millipore Sigma (Burlington, MA, EUA)SLGSV255FMillex-GV
Strata SCX (no kit de de hardware)Phenomenex dentro do kit de hardware da iPHASE Technologies (Melbourne, Austrália)MSH-120Sílica de pré-purificação SPE dentro do
de hardware Strata X (no kit de de hardware)Phenomenex dentro do kit de hardware da iPHASE Technologies (Melbourne, Austrália)MSH-120Sílica de pós-purificação SPE dentro do de hardware
Trace Select Water para análise de traçosHoneywell Riedel-de-Haen95305-2.5LUsado para mistura de reação e para pré-condicionar o cartucho SPE de pré-purificação
Ácido trifluoracético (TFA)Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Austrália)302031-10X1mLUsado para fazer seringa de insulina ultrafina de fase móvel aquosa HPLC
(0,5 mL)BD326769Usado para dispensar amostras de controle de qualidade
Filtro ventilado Cathivex-GV 0.22 µ m, membrana Durapore PVDF de baixa ligação a proteínasMerk Millipore (Cork, Irlanda)SLGV02505Usado para filtrar o produto final

Referências

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Reimpressões e permissões

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G lio 68 FAPI 46Tra ador PETProte na de Ativa o de FibroblastosExtra o em Fase S lidaRadioqu mica Cl nicaControle de QualidadeCartucho SPEImagem de TumoresiPHASE MultiSyn
Uma Radiossíntese Automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 para Uso Clínico de Rotina
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