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Diferenciação in vitro de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas em camundongos

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DOI:

10.3791/66718

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25 de outubro de 2024

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1Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, Department of Critical Care Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Department of Pathogenic Biology and Immunology, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, School of Medicine, Southeast University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a diferenciação de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas in vitro. Especificamente, quando combinado com uma abordagem baseada em citometria de fluxo multiparâmetro, 90% de pureza de células Th17 patogênicas podem ser obtidas de células T CD4 + virgens usando este método de diferenciação.

Resumo

In vitro As técnicas de diferenciação de células T são essenciais para investigações funcionais e mecanicistas de células T CD4+ . As células Th17 patogênicas têm sido associadas a uma ampla gama de doenças nos últimos tempos, incluindo esclerose múltipla (EM), artrite reumatóide, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), sepse e outras doenças autoimunes. No entanto, os protocolos de diferenciação in vitro atualmente conhecidos têm dificuldade em alcançar alta pureza de células Th17 patogênicas, com a eficiência de indução muitas vezes abaixo de 50%, o que é um desafio fundamental em experimentos in vitro . Neste protocolo, propomos um protocolo aprimorado de cultura e diferenciação in vitro para células Th17 patogênicas, que é usado para diferenciar diretamente células T CD4 + virgens isoladas de baços de camundongos em células Th17 patogênicas. Este protocolo fornece instruções detalhadas sobre isolamento de esplenócitos, purificação de células T CD4+ virgens e diferenciação de células Th17 patogênicas. Através deste protocolo, podemos alcançar uma pureza de diferenciação de aproximadamente 90% para células Th17 patogênicas, o que atende às necessidades básicas de muitos experimentos celulares.

Introdução

Depois de deixar o timo, os linfócitos T CD4+ virgens passam pelos órgãos linfóides secundários. Células apresentadoras de antígenos que transmitem antígenos homólogos para células T CD4+ virgens as ativam, iniciando uma série de programas de diferenciação que eventualmente resultam na produção de linhagens de células T auxiliares (Th) altamente especializadas1. A produção de interleucina 17 (IL-17) caracteriza as células Th17, uma subpopulação de células Th pró-inflamatórias2. As células Th17 desempenham um papel na defesa do hospedeiro contra patógenos extracelulares e na patogênese de muitas doenças autoimunes, como uveíte autoimune e esclerose múltipla. Sinais de receptores de células T e citocinas IL-6 e fator de crescimento transformador β (TGF-β) induzem a diferenciação de células T virgens em células Th17 por meio da fosforilação do transdutor de sinal e ativador da transcrição (STAT)33. O STAT3 é ainda amplificado em um ciclo de feedback positivo por meio de sinalização mediada por IL-23 e IL-21 4,5. A fosforilação de STAT3 pode induzir a expressão dos fatores de transcrição RORγt e RORα, que atuam como interruptores mestres que regulam o perfil de citocinas de IL-17A, IL-17F, IL-21 e IL-22 em células Th176. No entanto, foi relatado que as células Th17 induzidas por IL-6 e TGF-β são insuficientes para desencadear doenças autoimunes, que requerem co-estimulação por IL-23 ou co-estimulação separada de IL-6, IL-1β e IL-23 na ausência de TGF-β 7,8.

Os subconjuntos Th17 que não podem induzir efetivamente a encefalomielite autoimune experimental (EAE) são às vezes chamados de Th17 não patogênicos, enquanto os subconjuntos Th17 que podem induzir EAE são conhecidos como Th17 patogênicos9. Estudos atuais têm mostrado que, embora o Th17 patogênico e o Th17 não patogênico co-expressem o fator de transcrição central RORγt, existem grandes diferenças na capacidade de produzir IL-17A e propriedades pró-inflamatórias e anti-inflamatórias10. Além da alta expressão de RORγt, CCR6, STAT4 e RUNX4, que são fatores de transcrição característicos comuns de Th17, as células Th17 patogênicas também apresentam características adicionais de expressão de sinal gênico relacionadas à doença, como TBX21, IFN-γ e CXCR3, que possuem as características de subconjuntos de células Th1. As células Th17 patogênicas podem secretar altos níveis de fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), IFN-γ, TNF-α e outras citocinas 11,12. O fenótipo das células Th17 não patogênicas é instável, e somente sob a estimulação de CD3 e citocina IL-2 algumas dessas células podem se diferenciar em células Th17 patogênicas. Portanto, em modelos comuns de doenças clínicas, como artrite reumatoide, esclerose múltipla e síndrome do desconforto respiratório agudo, as células Th17 patogênicas exercem principalmente efeitos patogênicos.

Células Th17 patogênicas e não patogênicas podem se diferenciar in vitro sob a influência de diferentes citocinas. Nos últimos anos, vários estudos têm proposto métodos para induzir a diferenciação de células Th17 utilizando diferentes tipos e concentrações de citocinas. As células Th17 são estimuladas por uma combinação de IL-6, IL-1β e IL-23 13,14,15,16. Foi provado que IL-6 e TGF-β, duas citocinas necessárias para a diferenciação de células Th17, regulam sinergicamente a expressão da diferenciação de células RORγt e Th17 interagindo com duas sequências de DNA não codificantes conservadas diferentes no locus do gene Rorc 17. A fase estável das células Th17 patogênicas é mantida principalmente por IL-2318,19. A IL-23 se liga ao seu receptor e ativa a via de sinalização JAK-STAT20, causando assim a fosforilação de Jak2 e Tyk2 e promovendo a fosforilação de STAT1, STAT3, STAT4 e STAT5. IL-4 e IFN-γ são reguladores negativos dessa via. No entanto, estudos mostraram que a IL-1β pode regular positivamente a transcrição de Rorα e Rorγt através da via mTOR para manter a estabilidade do fenótipo21 da célula Th17.

Devido à heterogeneidade de inúmeros estudos, escolhemos os protocolos de indução para células Th17 patogênicas e não patogênicas das pesquisas mais recentes como controles22. Os resultados indicam que, supondo que tudo seja realizado de acordo com este protocolo, após 5 dias de cultivo sob a condição de gerar Th17 patogênico, mais de 90% das células sobreviventes podem ser células Th17 patogênicas.

Protocolo

O Comitê de Revisão Institucional para Estudos Animais da Southeast University aprovou todos os estudos em animais detalhados neste estudo, que foram realizados em conformidade com os padrões locais e institucionais. Amostras de baço foram retiradas de camundongos C57BL6/J. Camundongos fêmeas e machos, com idades entre 5 e 8 semanas, foram incluídos neste estudo. O meio de cultura e o tampão foram armazenados a 4 °C por até 1 mês. Os instrumentos cirúrgicos foram autoclavados antes do uso. Use luvas e máscaras de látex para evitar a contaminação da pele, olhos e roupas com reagentes; Use muita água ou enxágue com solução salina para a pele e os olhos.

1. Pré-revestimento da placa de cultura de tecidos de 24 poços com anti-CD3

  1. Diluir o anti-CD3 até uma concentração final de 1 μg/ml em solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (PBS) ou meio RPMI 1640.
  2. Encha uma placa de cultura de tecidos de 24 poços com 1 mL de solução anti-CD3 (1 μg/mL); Em seguida, cubra o poço com parafilme.
  3. Coloque a placa revestida com anti-CD3 na geladeira (2 °C-8 °C) por 16 h ou mantenha-a a 37 °C em uma incubadora de células por 2-3 h.

2. Isolamento do baço de camundongo e preparação da suspensão de célula única do baço

  1. Induza a anestesia completa em C57BL/6J com isoflurano a 3% e eutanasiar inalando dióxido de carbono a 100% por 2 min. Imediatamente após a morte dos camundongos, mergulhe-os em etanol 75% para desinfecção para evitar contaminação.
  2. Coloque o mouse em decúbito dorsal na bancada limpa, corte-o ao longo da linha média do abdômen e separe as estruturas abdominais camada por camada. Abra suavemente o omento maior e o estômago com uma pinça, puxe suavemente o baço com o ligamento gastroesplênico e separe o baço dos tecidos e ligamentos circundantes para obter um baço intacto (tome cuidado para evitar o esmagamento ou ruptura do baço).
    NOTA: Para manter um estado estéril, a seguinte operação é realizada em uma bancada super limpa estéril.
  3. Colocar um filtro de células de 70 μm numa placa de cultura estéril de 100 mm, adicionar o baço ao filtro de células e esmagá-lo com um êmbolo de seringa. Ao mesmo tempo, adicione 5-8 mL de fluido de lavagem homogeneizado para empurrar todas as células através do filtro para a placa de cultura.
    NOTA: A composição do kit líquido de separação de linfócitos pode ser vista na Tabela de Materiais.
  4. Centrifugar o filtrado a 450 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.
  5. Ressuspenda o sedimento celular com o diluente de amostra fornecido com o kit de separação de linfócitos ou com meio PBS ou RPMI 1640. Ajuste a concentração celular da suspensão celular para 2 × 108-1 × 109 células/mL.
    NOTA: Normalmente, 4-6 mL de diluente de amostra são necessários para um baço.
  6. Em um tubo de centrífuga, tome a mesma quantidade de solução de separação de linfócitos que a suspensão de célula única de tecido. Pipetar cuidadosamente a suspensão monocelular para a superfície da solução de separação de linfócitos e centrifugar a 800 × g, 25 °C durante 30 min. Defina a aceleração e desaceleração da centrífuga para uma faixa apropriada (por exemplo, defina em 3 se houver as marchas usuais de 1 a 9).
    NOTA: A solução de separação de linfócitos não deve ser inferior a 3 mL.
  7. Após a centrifugação, observe as quatro camadas do tubo de centrífuga de cima para baixo. A primeira camada corresponde ao diluente da amostra, seguida pela camada anular de linfócitos brancos leitosos. A terceira camada é o líquido de separação e a quarta camada consiste em glóbulos vermelhos.
  8. Use uma pipeta para puxar cuidadosamente a segunda camada de linfócitos brancos leitosos anulares para outro tubo de centrífuga e adicione 10 mL de solução de limpeza ao tubo de centrífuga para misturar as células.
  9. Centrifugue a 250 × g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante. Use 10 mL de meio RPMI 1640 para ressuspender o pellet celular para contagem de células.

3. Purificação de células T CD4+ virgens com base na seleção negativa de esferas magnéticas

NOTA: Isole as células T CD4 + virgens intocadas e altamente purificadas (CD4 + CD44lowCD62Lhigh) de esplenócitos de camundongos por seleção imunomagnética negativa.

  1. Prepare a amostra para ter 1 × 108 células/mL dentro da faixa de volume de 0,1-2 mL.
  2. Adicione 50 μL / mL de soro de rato e transfira a amostra para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL.
    NOTA: A composição do kit de classificação de células T CD4 ingênuas pode ser vista na Tabela de Materiais.
  3. Adicione 50 μL / mL de coquetel de isolamento à amostra, misture bem e incube por 7,5 min em temperatura ambiente.
  4. Adicione 50 μL / mL de coquetel de depleção à amostra, misture bem e incube por 2,5 min em temperatura ambiente.
  5. Vortex as esferas magnéticas para garantir uma dispersão uniforme. Adicione 75 μL / mL das esferas magnéticas à amostra, misture bem e incube por 2,5 min em temperatura ambiente.
    NOTA: As partículas devem aparecer uniformemente dispersas; O tempo de vórtice não deve ser inferior a 30 s.
  6. Complete a amostra com meio RPMI 1640 até um volume final de 2,5 mL. Misture várias vezes pipetando suavemente para cima e para baixo.
  7. Coloque o tubo (sem a tampa) no ímã e incube por 2.5 min em temperatura ambiente.
  8. Pegando o ímã, inverta o ímã e o tubo em um movimento contínuo e despeje a suspensão de célula enriquecida em um novo tubo.
    NOTA: Mantenha o tubo e o ímã invertidos por 2-3 s antes de girá-los na vertical. Não perturbe as gotas que possam permanecer na boca do tubo.
  9. Determine o número de células usando um hemocitômetro.
  10. Realize a análise de citometria de fluxo para células T CD4+ virgens antes e depois do isolamento (Figura 1).
  11. Transferir as células para um novo tubo de centrifugação, centrifugar a 400 × g durante 5 min à temperatura ambiente e rejeitar o sobrenadante.
  12. Ressuspenda as células em 200-500 μL de meio RPMI 1640 (suplementado com 10% de soro fetal bovino). Para cada 1 mL de cultura de células (por exemplo, ~ 106 células / mL), adicione 2 μL de coquetel de ativação de leucócitos e misture. Cultive as células em uma incubadora de CO2 a 37 ° C e umidade saturada por 4-6 h.
    NOTA: As células foram vórtices uma vez a cada 1-2 h.
  13. Centrifugar as células a 400 × g, 4 °C durante 5 min. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 μL de PBS. Adicione 1 μL de bloqueador Fc às células (por exemplo, ~ 106 células / mL). Incubar as células durante 10 min a 4 °C.
  14. Lave as células uma vez com 1 ml de PBS centrifugando a 400 × g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 200 μL de PBS.
  15. Adicione o coquetel de anticorpos (Fixable Viability Dye, 1:1.000; anti-CD4, 1:200; anti-CD44, 1:200; anti-CD62L, 1:200) e incube as células por 15-20 min no escuro a 4 ° C.
  16. Lave as células com 2 x 1 mL de PBS e, em seguida, centrifugue a 400 × g por 5 min a 4 °C.
  17. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em 250 μL de tampão fixo e incube-as por 40-60 min no escuro a 4 ° C.
    NOTA: O tampão fixo é fornecido com o tampão de coloração Foxp3/fator de transcrição, que é uma solução estoque 4x que deve ser diluída com diluente de permeabilização.
  18. Adicione 1 mL de tampão de permeabilização 1x para lavar as células 2x centrifugando as células a 300 × g, 4 °C por 5 min.
  19. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em 200 μL de tampão de permeabilização e adicione o anticorpo (Foxp3 [nuclear], 1:200) às células. Após a fixação e ruptura da membrana, incubar as misturas célula-anticorpo no escuro durante 40-60 minutos, agitando ocasionalmente durante curtos períodos a 4 °C.
    NOTA: A solução de permeabilização/lavagem é uma solução estoque 10x que deve ser diluída antes do uso com PBS.

4. Indução de células Th17 patogênicas in vitro

  1. Remova o PBS estéril das placas pré-revestidas de 24 poços antes do uso.
  2. Use meio de cultura de células Th17 (Tabela 1) e meio de contraste para cultura, incluindo meio de cultura de células Th0 (Tabela 1), meio de cultura Th17 não patogênico clássico (Tabela 1) e meio de cultura Th17 patogênico clássico (Tabela 1). Ressuspender as células T CD4+ virgens enriquecidas e dispensar em diferentes poços na mesma placa de 24 poços (pré-revestida com anti-CD3), ajustando a concentração para 4 × 105 células/mL, com 1 mL de meio em cada poço.
  3. Adicionar 1 μL/ml de solução anti-CD28 (concentração final: diluída com meio a 2 μg/ml) a cada alvéolo. Cultivar as células numa incubadora de CO2 a 5% a 37 °C durante 5 dias.
  4. Substitua o meio sobrenadante de cultura de células por meio de cultura (Th0, Th17 não patogênico, Th17 patogênico clássico e Th17 objetivo) pipetando cuidadosamente para distribuir as células uniformemente, descarte metade do meio que contém as células e, em seguida, adicione um novo meio igual ao volume de descarte no dia 2. Repita no dia 4.
  5. Observe as células sob um microscópio óptico no dia 5 (Figura 2). Recolher os sobrenadantes celulares de cada grupo e criopreservá-los a -80 °C.

5. Análise por citometria de fluxo para diferenciação de células Th17 e Th0 patogênicas

  1. Colha todas as células (por poço) após 5 dias do início da cultura. Execute as etapas 3.12-3.15.
  2. Adicione um coquetel de anticorpos (Fixable Viability Dye, 1:1.000; anti-CD4, 1:200) e incube as células por 15-20 min no escuro a 4 °C.
  3. Execute as etapas 3.17-3.19.
  4. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em 200 μL de tampão de permeabilização e adicione o coquetel de anticorpos (IL-17A [intracelular], 1:200; RORγT [nuclear], 1:200) para as células. Após a fixação e ruptura da membrana, incubar as misturas célula-anticorpo no escuro durante 40-60 minutos, agitando ocasionalmente durante curtos períodos a 4 °C.
  5. Adicione 1 mL de 1x solução de permeabilização/lavagem para lavar as células 2x, centrifugando as células a 400 × g por 5 min a 4 °C; então, descarte o sobrenadante.
  6. Examine as células em um citômetro de fluxo e analise os dados usando o software (Figura 3).
    1. Ligue o citômetro de fluxo e ligue o processo de limpeza e calibração de partida automática.
    2. Selecione o canal de laser usado neste experimento e configure um tubo em branco, tubos com coloração única e tubos de amostra.
    3. Clique na opção de tubo em branco e teste na máquina; Ajuste a tensão para que o evento da célula esteja, na medida do possível, no centro da caixa de coleta.
    4. Colete células tubulares coradas com uma única cor e execute a detecção espectral dos canais correspondentes para confirmar se o anticorpo fluorescente foi adicionado corretamente.
    5. Clique no botão de desmixagem e deixe a máquina ajustar automaticamente a compensação espectral. Com outros instrumentos de citometria de fluxo, ajuste a compensação de fluorescência normalmente.
    6. Colete cada célula de tubo de amostra, salve o formato de dados como arquivos FCS e exporte. Analise e plote no software de análise de dados de citometria de fluxo relevante.
      1. Circule a população de células principal e remova possíveis aderências celulares através das portas circulares diagonais de FSC-H e FSC-A.
      2. Circule as células vivas de acordo com a área do círculo negativo FVS; em seguida, circule a população de células CD4+.
      3. Construa a porta transversal com o eixo horizontal como IL-17 A e o eixo vertical como RORγT; a seleção dupla positiva na área Q2 é a população de células Th17.

6. Ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de secreção de IL-17A induzida por diferentes meios

  1. Descongelar os sobrenadantes das células congeladas recolhidos na secção 4.5.
  2. Adicione 100 μL do padrão diluído, branco e amostra nos poços designados. Use o selador para cobrir a placa e incubar por 90 min a 37 °C.
    NOTA: Adicione as soluções ao fundo da placa micro-ELISA sem tocar na parede interna ou causar espuma.
  3. Transvase o líquido de cada poço e adicione imediatamente 100 μL de solução de trabalho de anticorpo de detecção biotinilado. Use um novo selante para cobrir a placa e incubar por 1 h a 37 °C.
  4. Transvase a solução e adicione 350 μL de tampão de lavagem a cada poço. Após 1 min, aspire ou decanta a solução de cada poço e seque-a contra papel absorvente limpo. Repita esta etapa de lavagem 3x.
  5. Adicione 100 μL da solução de trabalho conjugada peroxidase de rábano a cada poço. Use um novo selante para cobrir a placa e incubar por 30 min a 37 °C.
  6. Transvase a solução de cada alvéolo e repita o processo de lavagem 5x conforme descrito no passo 6.4.
  7. Adicione 90 μL do reagente de substrato a cada poço e incube por cerca de 15 min a 37 °C com um novo selante, protegendo a placa da luz.
    NOTA: O tempo de reação pode ser alterado com base na mudança de cor real, mas não deve exceder 30 min. Deixe o leitor de microplacas aquecer por ~ 15 min antes da medição do OD.
  8. Adicionar 50 μL/poço de solução Stop na mesma ordem que a solução de substrato.
  9. Determine a densidade óptica (valor OD) de cada poço de uma só vez com um leitor de microplacas ajustado para 450 nm.
  10. Obtenha os valores de DO para as amostras padrão e replique os poços das amostras e subtraia os valores de DO dos poços em branco para obter os valores corrigidos. Em seguida, execute o ajuste linear com concentração como abscissa e valor OD como ordenada. Com base na equação ajustada, calcule os valores de concentração de IL-17A para os poços de amostra.
    NOTA: Após 4 dias de diferenciação, o conteúdo de IL-17A no sobrenadante de cada grupo é mostrado na Figura 4. O método de adaptação pode se referir ao software Orgin21. A curva padrão obtida neste experimento tem um valor de R2 de 0,9946.

7. Diferenciação de células T por ensaios de expressão gênica de assinatura via PCR quantitativo (qPCR)

NOTA: Para descartar a possibilidade de instabilidade da citometria de fluxo devido aos efeitos dos corantes e da fixação/ruptura, detectamos a expressão de genes característicos por qPCR para elucidar o efeito de diferenciação do Th17 patogênico no nível transcricional.

  1. Meça o número de células no final da cultura de células T. Colete as células em tubos de centrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 400 × g por 5 min. Descarte cuidadosamente todos os sobrenadantes.
  2. Extração de RNA
    NOTA: O processo de extração deve ser realizado em capela ou bancada ultralimpa para evitar a contaminação da enzima RNA.
    1. Adicione 500 μL de tampão de lise (por exemplo, a 1-2 × 106 células) ao sample tubo (etapa 7.1), agite e misture imediatamente até que não haja massa celular e deixe repousar por 1 min.
    2. Adicionar a mistura à coluna de adsorção colocada num tubo de recolha, centrifugar a 13,400 × g durante 30 s e eliminar o filtrado.
    3. Adicione a quantidade especificada de etanol absoluto ao frasco de tampão de lavagem antes de usá-lo pela primeira vez. Adicionar 500 μL de tampão de lavagem à coluna de adsorção, centrifugar a 13.400 × g durante 30 s e rejeitar o filtrado.
    4. Repita a lavagem na etapa 7.2.3.
    5. Coloque a coluna de adsorção RA no tubo de coleta vazio e centrifugue a 13.400 × g por 2 min para remover a solução de enxágue.
      NOTA: A solução de enxágue deve ser removida para evitar que o etanol residual na solução de enxágue iniba a reação a jusante.
    6. Remova a coluna de adsorção RA e coloque-a em um tubo de centrífuga limpo sem RNase. Adicione 50 μL de H2O livre de RNase ao meio da membrana de adsorção, deixe repousar por 1 min em temperatura ambiente e centrifugue a 9.600 × g por 1 min.
  3. Meça a pureza e a concentração de RNA.
  4. Sintetize a primeira fita de cDNA seguindo as instruções do fabricante do kit.
    1. Remova o DNA genômico. Pegue 500 ng do RNA molde extraído em um tubo de centrífuga sem RNase; adicione a mistura de ddH2O e 4x gDNA sem RNase para formar uma mistura. Misture delicadamente com uma pipeta e coloque em banho-maria a 42 °C por 2 min.
      NOTA: A quantidade da mistura de reação e a quantidade adicionada estão relacionadas à concentração de RNA; Consulte as instruções em detalhes. O sistema de reação de 20 μL foi usado neste experimento.
    2. Adicione diretamente um sistema de reação de transcrição reversa 5x no tubo de reação da etapa anterior. Pegue 4 μL do sistema de reação de transcrição reversa e 16 μL da mistura da etapa anterior e misture suavemente com uma pipeta.
      NOTA: O sistema de transcrição reversa inclui toda a transcriptase reversa necessária, que é um sistema de transcrição reversa configurado diretamente.
    3. Defina a reação de transcrição reversa: 37 ° C 15 min, 85 ° C, 5 s e, finalmente, resfrie a 4 ° C.
  5. Configure a reação de PCR seguindo as instruções do fabricante.
    1. Adicione 10 μL de mistura enzimática de reação de PCR 2x no tubo qPCR, 0,4 μL de primer 1, 0,4 μL de primer 2, 0,4 μL de 50x de corante de referência ROX 1, 2 μL de cDNA molde e 6,8 μL de ddH2O para preparar uma mistura de 20 μL.
    2. Realizar a PCR no instrumento de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real utilizando as seguintes regulações: fase 1, 95 °C, 30 s, Rep x 1; estágio 2, primeiro 95 °C, 10 s, depois 60 °C, 30 s, Rep x 40; estágio 3, primeiros 95 °C, 15 s, próximos 60 °C, 60 s, finalmente 95 °C, 15 s, Rep x 1.
      NOTA: Após 4 dias de diferenciação, os níveis de expressão relativa de Il17a, Il17f, Rra e Il23r em células T CD4 + virgens são mostrados na Figura 5.

Resultados

Nosso protocolo foi desenvolvido com base em pesquisas anteriores sobre a diferenciação de células Th17 patogênicas. O primeiro passo do experimento é detectar a pureza de células T CD4 + virgens isoladas do baço por classificação magnética de contas, que é a base para o sucesso de nossa subsequente diferenciação de células Th17 patogênicas. A pureza das células T CD4+ virgens foi detectada usando os marcadores de superfície CD62L23 e CD4424 , enquanto o FOXP325 foi usado como marcador de células Treg. Descobrimos que o conteúdo de células Treg foi significativamente reduzido após a triagem, e a pureza das células T CD4+ virgens pode chegar a pelo menos 95% (Figura 1). Para comparar a diferenciação de células Th17 patogênicas, células T CD4+ virgens foram cultivadas com meio Th0 (Tabela 1) e meio de diferenciação Th17 (Tabela 1) por um total de 5 dias. Verificou-se que as células T apresentaram crescimento de cluster nos meios Th0 e Th17 (Figura 2).

Em seguida, as células foram fixadas, permeabilizadas e marcadas com anticorpos contra várias citocinas em células T CD4+ diferenciadas com base na citometria de fluxo. Examinamos IL17A26 e RORγT27 como as citocinas características da diferenciação de células Th17 e descobrimos que 90% das células T CD4 + virgens se diferenciaram com sucesso em células Th17 patogênicas sob a estimulação de um novo meio de cultura de células Th17 (Figura 3). A Figura 5 mostra os genes de assinatura das células Th17 detectados por PCR, que provaram que as células Th17 patogênicas obtidas por diferenciação estavam se expressando de forma estável.

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Figura 1: Estratégia de bloqueio para análise de citocinas de assinatura em camundongos C57BL / 6J antes e depois do isolamento de células T CD4 + virgens. Abreviaturas: FSC-H = altura do pico de dispersão direta; SSC-H = altura de dispersão lateral; FSC-A = área de pico de dispersão direta; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PE = ficoeritrina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagens representativas de células T CD4+ virgens de camundongo cultivadas em condições patogênicas Th17 e Th0 por 5 dias. (A) Células Th0; (B) células Th17 patogênicas. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Análise de citometria de fluxo após diferenciação induzida por meio de cultura de células Th0 e meio de cultura de células Th17. Abreviaturas: FSC-H = altura do pico de dispersão direta; SSC-H = altura de dispersão lateral; FSC-A = área de pico de dispersão direta; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PE = ficoeritrina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: O conteúdo de IL-17A no sobrenadante do meio de cultura de células Th0 e do meio de cultura de células Th17 após a indução da diferenciação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Resultados representativos dos níveis de expressão de citocinas de assinatura em células T CD4+ diferenciadas de camundongos C57BL/6J. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Meio de cultura de células Th17 patogênico alvoMeio de cultura de células Th0Meio de cultura de células Th17 clássico não patogênicoMeio de cultura de células Th17 patogênico clássico.
ReagenteConcentração finalQuantidadeConcentração finalQuantidadeConcentração finalQuantidadeConcentração finalQuantidade
Penicilina-estreptomicina (100x)1x500 μL1x500 μL1x500 μL1x500 μL
Soro fetal bovino10%5 ml10%5 ml10%5 ml10%5 ml
β-mercaptoetanol50 μM50 μL50 μM50 μL50 μM50 μL50 μM50 μL
Suplemento GlutaMAXTM (100x)1x500 μL1x500 μL1x500 μL1x500 μL
Solução de piruvato de sódio (100x)1 mM500 μL1 mM500 μL1 mM500 μL1 mM500 μL
Gama de IFN anti-camundongo (1 mg/mL)5 μg/ml250 μL10 μg/mL500 μL10 μg/mL500 μL
IL-4 anti-camundongo (2 mg / mL)5 μg/ml125 μL5 μg/ml250 μL10 μg/mL250 μL
Ratinho rIL-1 beta (20 μg)20 ng/mLNA
rIL-6 de camundongo (20 μg)20 ng/mLNA50 ng/mLNA50 ng/mLNA
Ratinho rIL-23 (50 μg)50 ng/mLNA10 ng/mLNA
Camundongo TGF beta (100 μg)3 ng/mlNA1 ng/mLNA1 ng/mLNA
IL-2 murina (5 μg)20 ng/mLNA
RPMI 1640NAAté 50 mLNAAté 50 mLNAAté 50 mL
TotalNA50 mLNA50 mLNA50 mL

Tabela 1: Cultura de células Th17 patogênicas alvo, cultura de células Th0, meios clássicos de cultura de células Th17 não patogênicas e patogênicas.

Discussão

Este procedimento ofereceu uma maneira produtiva de aumentar o número de células T CD4 + esplênicas de camundongos virgens para a produção in vitro de células Th17 patogênicas. Embora usemos mais citocinas do que outros meios de cultura de células Th17 relatados, estamos comprometidos em otimizar as condições de crescimento de células Th17 patogênicas. Estamos considerando uma otimização adicional de nosso protocolo de diferenciação induzida.

Aqui, simplesmente usamos citometria de fluxo e qPCR para examinar a produção de citocinas características. Com algumas pequenas modificações, essa abordagem também pode ser usada para outros testes de função, como proliferação celular.

Usamos um kit de isolamento de linfócitos produzido na China para isolar linfócitos do baço de camundongo porque é eficaz e economiza tempo. As soluções de separação de linfócitos baseadas em outras marcas também podem atingir o objetivo de separar linfócitos do baço de camundongos por meio de diferentes etapas. Outro método é lisar diretamente os glóbulos vermelhos da suspensão de células do baço obtida; No entanto, descobrimos que os glóbulos vermelhos do baço geralmente não podem ser lisados de uma só vez.

Alguns problemas podem surgir durante a execução deste protocolo. Primeiro, o número de células T CD4 + virgens obtidas por classificação magnética pode ser muito baixo (etapa 3 do protocolo). Isso pode ser atribuído ao processo de esmagamento de órgãos ser insuficiente. É importante garantir que o órgão seja devidamente homogeneizado. Aumentar a frequência de enxágue durante o processo de homogeneização melhorará a taxa de recuperação. Para obter um maior número de células T CD4+ virgens de esplênico, sugerimos o uso de camundongos mais jovens (6-10 semanas de idade). Existem vários métodos disponíveis para separar os linfócitos do baço, e o rendimento pode variar dependendo do líquido de separação usado. Recomenda-se usar um líquido de separação universalmente certificado e tentar extrair a camada de linfócitos o máximo possível.

Em segundo lugar, a proporção de células T CD4+ na citometria de fluxo pode ser de <80% (etapa 5 do protocolo). Uma possível causa desse problema pode ser uma contagem imprecisa de esplenócitos, resultando em uma contagem de células maior do que a do coquetel de anticorpos adicional e das esferas magnéticas. Para aumentar a eficácia da purificação de células T CD4+ ingênuas, a contagem de células deve ser precisa. Além disso, 10% mais coquetel de anticorpos e esferas magnéticas podem ser usados em relação ao que este protocolo recomenda. Por fim, a citometria de fluxo pode ser realizada imediatamente após a classificação das células T CD4+ virgens.

Terceiro, pode não haver muitos aglomerados de células T formados durante a cultura, e a maioria das células pode ter morrido durante a diferenciação das células T (etapa 4 do protocolo). A razão potencial para esse problema pode ser a determinação imprecisa do número de células para células T CD4 + virgens antes da semeadura, resultando em uma baixa densidade celular. Recomenda-se adotar um método de contagem mais preciso para atingir a densidade celular desejada de aproximadamente 4 × 105 células/mL para cada poço em uma placa de 48 poços. Outra possível causa pode ser problemas técnicos com a incubadora de CO2 , como temperatura incorreta ou concentração de CO2 . Por fim, a força excessiva ao mudar o meio de cultura celular pode causar a morte celular.

Quarto, os níveis de expressão relativa dos genes de citocinas de assinatura podem ser baixos (etapa 7 do protocolo). Para garantir a autenticidade do RNA extraído, recomenda-se o uso de uma concentração de detecção de nanogotículas superior a 100 ng/mL. A razão potencial para a diminuição da concentração pode ser a natureza insalubre das células cultivadas, como uma grande parte das células coletadas estão mortas ou em processo de morte. Para obter a verdadeira concentração de RNA, é necessário resolver a situação que pode levar a um crescimento deficiente durante a cultura celular. Uma razão alternativa por trás dessa preocupação pode ser a contagem final de células excessivamente baixa alcançada durante a extração do RNA, possivelmente devido à perda inadvertida de células durante o descarte do sobrenadante. O emprego de técnicas avançadas de extração de RNA, como kits de extração de RNA em uma etapa, pode ser vantajoso. A proporção ideal OD260/OD280, medida pelo Nanodrop, deve estar na faixa de 1,9-2,1. No caso de uma proporção excessivamente baixa, a contaminação por proteínas torna-se uma possibilidade. Aumentar a frequência de lavagem de tampão livre de RNase pode ajudar a mitigar esse problema. Por outro lado, uma proporção estranhamente baixa implica degradação potencial do RNA. Para neutralizar esse problema, recomenda-se empregar água livre de RNase e utilizar tubos de 1,5 mL para fins de descontaminação de RNase.

Em conclusão, o protocolo atual descreve o uso de um novo meio de cultura celular para induzir diretamente células T CD4+ virgens a se diferenciarem em células Th17 patogênicas in vitro. Comparado com a separação direta, não há dúvida de que esse método é mais direto, barato e mais eficiente. A configuração do meio também é muito simples para que as células Th17 construídas possam ser usadas de forma mais intuitiva para experimentos subsequentes, fornecendo um modelo celular muito bom para o estudo de muitas doenças.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse em relação à publicação deste artigo.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de P&D da China (No.2022YFC2304604), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.81971812), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.82272235), Fundação de Ciência da Comissão de Saúde da Província de Jiangsu (No. ZDB2020009), Província de Jiangsu Pesquisa-chave, Projeto Especial do Programa de Desenvolvimento (Desenvolvimento Social) (Nº BE2021734), Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento do Ministério da Ciência e Tecnologia (Nº 2020YFC083700), Laboratório Chave da Província de Jiangsu de Medicina Intensiva (BM2020004), Projeto-chave da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81930058), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82171717), Fundos de Pesquisa Básica das Universidades Centrais (2242022K4007), e Projeto Geral da Fundação Provincial de Ciências Naturais de Jiangsu (BK20211170).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpos
Rato anti-camundongo CD62L, BV650, clone MEL-14, diluição 1:200BDCat# 564108; RRID: AB_2738597
Ratinho monoclonal anti-CD4, FITC, clone RM4-5, diluição 1:200BioLegendCat#100509; RRID: AB_312712
Ratinho monoclonal anti-IL-17A, PE, clone TC11-18H10.1, diluição 1:200BioLegendCat#506903; RRID: AB_ 315463
Rato monoclonal anti camundongo/humano CD44, APC, clone IM&, diluição 1:200BioLegendCat#103012; RRID: AB_312963
Ratos, anti-ROR&gama monoclonal; T, APC, clone B2D, diluição 1:200InvitrogenCat#17-6981-80; RRID: AB_2573253
Anticorpo monoclonal FOXP3 de rato, PE, clone FJK-16s, diluição 1:200InvitrogenCat#12-5773-82; RRID: AB_465936
Chemicals, peptides, e proteínas recombinantes
Anti-Mouse CD3 SAFIREpurificado biogemsCat#05112-25
Anti-Mouse CD28 SAFIRE biogemas purificadasCat#10312-25
Anti-Mouse IFN gamabiogemsCat#80822-25
Anti-Mouse IL-4biogemsCat#81112-25
EtanolXilong científicoCat#64-17-5
Soro bovino fetalGibcoCat#10437-028
FcR Reagente bloqueadorMiltenyi BiotecCat#130-092-575
Suplemento GlutaMAXgibcoCat#35050079
Rato rIL-1 betaSino BiológicoCat#50101-MNAE
Rato rIL-6Sino Gato Biológico# 50136-MNAE
Rato rIL-23Sino Gato Biológico# CT028-M08H
Rato TGF beta 1Sino Gato Biológico# 50698-M08H
PBSProcellCat # PB180327
Murino Recombinante IL-2peprotechCat # 212-12
RPMI 1640 com L-glutaminaGibcoCat#11875-119
Solução de penicilina-estreptomicinaGibcoCat#15070063
β-mercaptoetanolSigma-AldrichCat#M6250-100ML
strong>Ensaios comerciais críticos
Animal Kit de solução de separação de linfócitos de órgãos animaisTbdscienceCat#TBD0018SOPContém líquido de separação de linfócitos de tecido de baço animal, diluente de amostra de tecido (nº de gato 2010C1119), solução de limpeza de amostra (nº de gato 2010X1118), solução de lavagem de amostra (nº de gato. TBTDM-W), líquido de lavagem de homogeneizado de tecido (F2013TBD)
ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)VazymeCat # Q341-02https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html.
Concentrado de fixação/permeabilizaçãoinvitrogenCat#00-5123-43
Diluente de fixação/permeabilizaçãoinvitrogenCat#00-5223-56
Corante de viabilidade fixável EF506invitrogenCat#65-0866
HiScript II Q RT SuperMix para qPCR (+limpador de gDNA)VazymeCat#R223-01https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html.
Coquetel de Ativação de LeucócitosBDCat#550583
Mouse IL-17A (Interleucina 17A) Kit ELISAElabscience®Cat#E-EL-M0047
Naï ve CD4+ kit de isolamento de células T, camundongoSTEMCELLCat#19765O kit EasySep contém coquetel de isolamento de células T CD4+ de camundongo [cat no. 19852C.1], coquetel de depleção de células T de memória de camundongo [cat no. 18766C], estreptavidina RapidSphered 50001 [cat no. 50001], soro de rato normal [cat no. 13551]); armazene soro de rato apenas a -20 ° C; outros componentes a serem armazenados a 2-8 °C.
Tampão de permeabilizaçãoinvitrogenCat#00-8333-56
Kit de RNA de célula SPARKeasySparkjadeCat#AC0205-Bhttps://www.sparkjade.com/product/detail?id=85
Modelos experimentais: Organismos/cepas
Mouse: C57BL/6GempharmatechCat#000013
Oligonucleotídeos
Mouse Il17a TaqMan primers com sondaribobioNA
Mouse Il17f TaqMan primers com sondaribobioNA
Mouse Il23r TaqMan primers com sondaribobioNA
Mouse Rora TaqMan primers com sondaribobioNA
β-actina TaqMan primers com sondaribobioNA
strong>Software e algoritmos
Cytek AuroraCytekhttps://spectrum.cytekbio.com/
FlowJo v10.8.1Tree Starhttps://www.flowjo.com
GraphPad prism 9GraphPad Softwarehttps://www.graphpad-prism.cn
< forte>Outro
1 mL seringaKindlyNA
1,5 mL Tubos de centrífugaEppendorfCat#MCT-150-C
5 mL Tubos de fundo redondoCorningCat#352235
15 mL Tubos de centrífugaNESTCat#601052
Placa de cultura de tecidos de 48 poços (fundo achatado)CorningCat#3548
Tubos de centrífuga de 50 mLNESTCat#602052
70 µ m Filtro de célulasBiosharpCat#BS-70-XBS
sem rodapé placas qPCRVIOX scientificCat#V4801-M
100 mm placa de PetriCorningCat#430167
CentrífugaEppendorf5425R
Incubadora de CO2 de cultura de célulasThermo FisherHEPA Class100
Cytek AuroraCytekNA
tesoura de dissecaçãoRWDS12003-09
HemocitômetroAlphaCellCat#J633201
NanoDrop 2000 EspectrofotômetroThermo FisherND-2000
Sistema de PCR em tempo realRocheLightCycler96
Pinças cirúrgicasRWDF12005-10
TermocicladorBio-RadC1000 Touch
<< 96 poços

Referências

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