Artigo de método

Otimização do Método de Oclusão da Artéria Cerebral Média Longa para Reperfusão Completa

DOI:

10.3791/66720

⸱

22 de novembro de 2024

 ,  , 
1Department of Histology and Embryology, University of Zagreb School of Medicine, 2Croatian institute for brain research, University of Zagreb School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo apresenta um guia passo a passo para os pesquisadores realizarem o procedimento de oclusão da artéria cerebral média em camundongos usando o método modificado da artéria carótida externa Longa. As modificações apresentadas neste artigo visam aumentar a acurácia da oclusão da artéria cerebral média e garantir a reperfusão completa.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O modelo de oclusão da artéria cerebral média serve como modelo animal primário para o estudo do AVC isquêmico. Apesar de ser utilizado em pesquisas há mais de três décadas, sua padronização permanece inadequada. Predominantemente realizado em ratos e camundongos, o procedimento apresenta desafios devido à natureza menor e mais frágil dos camundongos. Ao contrário do método da artéria carótida comum de Koizumi, a artéria carótida externa Longa é o único modelo de AVC de filamento intraluminal que garante a reperfusão completa pós-isquemia. Esse aspecto tem importância crítica para estudos que investigam fenômenos de reperfusão. As modificações cirúrgicas demonstradas neste artigo garantem o fluxo sanguíneo contínuo da artéria carótida comum durante toda a fase isquêmica e após o início da reperfusão. O objetivo dessas modificações é ocluir seletivamente a artéria cerebral média, mantendo a perfusão ininterrupta em ramos proximais à artéria cerebral média durante o período de isquemia. Além disso, o início da reperfusão é súbito e pode ser controlado com precisão, modelando com mais precisão a trombectomia endovascular na medicina humana. Nosso objetivo ao apresentar este artigo em vídeo abrangente é facilitar o treinamento de novos cirurgiões e promover a padronização dos procedimentos cirúrgicos dentro da comunidade científica.

Introdução

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O acidente vascular cerebral é a segunda principal causa de morte e a terceira principal causa de morte e incapacidade combinadas1. Por sua causa, o AVC pode ser isquêmico ou hemorrágico, sendo o AVC isquêmico significativamente mais prevalente na prática clínica. O AVC isquêmico surge de um bloqueio em uma artéria que fornece sangue ao tecido cerebral, levando à isquemia, morte celular e inflamação. Desde o advento das terapias de reperfusão, como trombólise e trombectomia mecânica, um grande avanço foi feito no tratamento do AVC. No entanto, todas as terapias de reperfusão apresentam o risco de exacerbar a condição do paciente, causando o que é comumente referido como lesão de reperfusão2. O mecanismo exato da lesão de reperfusão permanece obscuro, cabendo aos estudos pré-clínicos identificar possíveis causas e medidas preventivas. Para isso, o desenvolvimento de um modelo animal pertinente para lesão de reperfusão após AVC isquêmico torna-se crucial.

A oclusão da artéria cerebral média (MCAO) é o modelo animal mais comumente usado para estudar o AVC isquêmico. É conduzido predominantemente em roedores e tem muitas variantes diferentes descritas na literatura científica até o momento 3,4. Os dois tipos principais, Koizumi e Longa, conhecidos como variantes da artéria carótida comum (ACC) e da artéria carótida externa (AEC), diferem tecnicamente pelo local da arteriotomia para inserção dofilamento5,6. Em nosso artigo recente, por meio do monitoramento in vivo da perfusão vascular, mostramos que apenas o método de Longa pode ser verdadeiramente considerado um modelo de isquemia/reperfusão cerebral7. O procedimento envolve a inserção do filamento no ECA, avançando-o através do ICA e prendendo-o no ponto de ramificação da artéria cerebral média (MCA) para induzir a isquemia do tecido cerebral. Após um período pré-determinado de isquemia, a retirada do filamento permite a reperfusão, simulando isquemia cerebral transitória. Após o início do AVC, a variável de desfecho primário usada na pesquisa é na maioria das vezes o volume da lesão infartada, que pode ser medido usando histologia ex vivo ou exames cerebrais in vivo. Os desafios nos modelos MCAO giram em torno da baixa reprodutibilidade atribuída a variâncias intervariantes, interoperadores e intersujeitos, com esta última apresentando uma limitação significativa na pesquisa pré-clínica de AVC4.

Além disso, as regiões infartadas após MCAO em roedores são maciças em relação ao tamanho do cérebro do roedor. Além disso, as regiões posteriores do hipocampo do cérebro geralmente são recrutadas para o volume do infarto, apesar de essas regiões serem dependentes principalmente do fluxo sanguíneo da artéria cerebral posterior (PCA), e não da ACM8. Como nos métodos de Koizumi e Longa descritos na literatura, a ACC é mantida ligada durante o período de isquemia devido à permeabilidade incompleta do círculo de Willis em camundongos, levando à indução de isquemia em uma região muito mais ampla do que o pretendido 5,6,9. Mesmo em métodos em que a ACC é reaberta ou reparada após o período de isquemia, os habituais 30-60 min de isquemia resultam em lesão tecidual irreversível em regiões não MCA10. Além disso, ao contrário do esperado, pesquisas anteriores mostraram que o comprimento do revestimento de silicone de um filamento não tem impacto no tamanho da lesão11. No entanto, a escolha do comprimento do revestimento de silicone do filamento foi abordada apenas em modelos com CCA ligado durante o período de oclusão.

O objetivo deste método foi modificar o método Longa MCAO em camundongos para permitir o fluxo sanguíneo ininterrupto da ACC durante o período de isquemia, aumentando assim a seletividade da MCAO, bem como garantindo a reperfusão completa da região infartada após o procedimento. Essas modificações beneficiariam muito os estudos longitudinais que pesquisam a lesão de isquemia-reperfusão em camundongos, diminuindo a taxa de mortalidade e reduzindo a variância entre os sujeitos.

Protocolo

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Todo o manejo e procedimentos dos animais foram aprovados pelo Comitê de Licenciamento de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Zagreb e pelo Comitê de Ética para a proteção de animais usados para fins científicos do Ministério da Agricultura da República da Croácia. Os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com a Lei Croata de Proteção Animal (NN 102/17, 32/19), Emendas à Lei de Proteção Animal (NN 37/13) e as Diretrizes sobre a Proteção de Animais Usados para Fins Científicos (NN 55/13) que estão de acordo com o Guia Europeu para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Diretiva 2010/63/UE).

1. Preparação do animal e do sítio cirúrgico

  1. Colocar o animal em uma caixa knock-out e induzir a anestesia com 5% de isoflurano em uma mistura de oxigênio/nitrogênio (proporção 1:2).
  2. Depois de inspecionar visualmente o estado de consciência e a frequência respiratória do animal, leve-o a uma balança de laboratório e pese-o.
  3. Verifique o reflexo beliscando a pele interdigital de um membro inferior para garantir a profundidade adequada da anestesia.
  4. Posicione o animal na mesa de operação aquecida e coloque o nariz na máscara de anestesia. Defina a temperatura inicial da mesa de operação para 36 °C e ajuste-a para manter a temperatura corporal do animal em 37 °C (medida por meio de uma sonda retal introduzida em etapas posteriores). Ao longo de todas as etapas subsequentes, ajuste a fração de volume do isoflurano para manter a frequência respiratória do animal em 100 respirações / min.
    NOTA: Todas as superfícies e materiais em contato direto com o animal devem ser desinfetados completamente antes do procedimento.
  5. Aplique pomada ocular nos olhos do animal para protegê-los da desidratação e do gás isoflurano.
  6. Vire o animal de costas e estenda o pescoço colocando um pequeno travesseiro feito de fita cirúrgica embaixo dele.
  7. Prenda os membros do animal no lugar usando fita cirúrgica. Tome cuidado para não estender muito os membros anteriores para não causar luxação da articulação do ombro inadvertidamente.
  8. Lubrifique a sonda retal usando vaselina branca e insira-a no reto para medição contínua da temperatura corporal. Prenda a sonda no lugar junto com a cauda usando fita cirúrgica.
  9. Aplicar uma injeção pré-operatória de solução salina e buprenorfina (0,5 mg/kg) por via intraperitoneal para manter o animal bem hidratado e sob analgesia durante o procedimento.
  10. Raspe o pelo do animal na região do pescoço usando uma tosquiadeira sem fio. Colete todo o pelo raspado usando pedaços de fita cirúrgica. Além disso, raspe a região com uma navalha para deixá-la completamente livre de pelos.
  11. Escolha um filamento MCAO com base no peso e/ou idade do animal medido. Retire-o do recipiente e coloque-o em uma placa de Petri em local visível. Coloque uma gota de solução salina na parte de silicone do filamento para mantê-lo limpo e livre de poeira.
    NOTA: A espessura do revestimento de silicone do filamento deve ser escolhida de acordo com as recomendações oficiais do fabricante no caso de um mouse de 12 a 16 semanas. Além disso, o comprimento do revestimento de silicone deve ser cuidadosamente planejado com antecedência, dependendo do tamanho da área de irrigação a ser ocluída (consulte Discussão).
  12. Coloque uma cortina cirúrgica limpa sobre a mesa de operação.
  13. Aplique uma gota de Betadine na pele raspada do animal. Use um cotonete para esfregar o desinfetante na pele de forma circular de dentro para fora. Depois, faça o mesmo com um cotonete embebido em etanol. Repita esta etapa 3 vezes com um novo par de cotonetes estéreis para cada repetição.
  14. Aplique um pouco de gel de lidocaína na região desinfetada do futuro local da incisão para analgesia local da ferida.

2. Cirurgia de indução de isquemia

  1. Faça uma incisão inicial na pele desinfetada usando um bisturi. Mantenha o número de golpes de incisão na pele no mínimo para facilitar a cicatrização da ferida cirúrgica.
    NOTA: Todos os instrumentos devem ter sido previamente esterilizados. O leitor deve consultar suas diretrizes institucionais para o uso de luvas estéreis ou cirúrgicas.
  2. Usando pinças tipo 7 e 5, rasgue a fáscia superficial e descole as glândulas salivares do tecido subjacente.
    NOTA: Sempre avance com uma pinça fechada e estenda-a enquanto se afasta para afastar o tecido. Dessa forma, os espaços anatômicos podem ser percorridos com o mínimo de trauma tecidual.
  3. Coloque o afastador de fio em sua posição inicial, garantindo que as glândulas salivares não interfiram nas etapas subsequentes.
  4. Remova a fáscia profunda do pescoço usando uma pinça Tipo 7 e descole os músculos esternocleidomastóideos da região carotídea para reposicionar o afastador.
  5. Reposicione o afastador para alcançar os músculos esternocleidomastóideos para permitir o acesso à região carotídea.
  6. Ressece o músculo omo-hióideo para permitir uma visão clara e uma abordagem mais fácil da região carotídea.
  7. Liberte a artéria carótida e seus ramos da veia carótida e do nervo vago, que são mantidos juntos na fáscia carotídea.
    NOTA: Esta fáscia deve ser removida com cuidado para evitar ferir o nervo vago ou causar sangramento significativo.
    1. Aperte a fáscia carotídea na lateral da tríade carotídea e puxe-a suavemente lateralmente para identificar visualmente a artéria, o nervo, a veia e todos os ramos dos vasos sanguíneos circundantes.
    2. Enquanto puxa a fáscia lateralmente, usando uma pinça Tipo 5, separe a ACC do nervo e veia adjacentes até o ponto de ramificação e a veia tireoidiana superior, que cruza a ACC.
    3. Separe completamente a parte inferior do CCA do tecido subjacente e da fáscia, usando uma pinça curva Tipo 7, certificando-se de que esteja pronta para clampear em etapas futuras.
    4. Procedendo cranialmente na região acima do ponto de ramificação do CCA, rasgue a fáscia carotídea usando duas pinças.
    5. Da mesma forma, puxe a extremidade solta da fáscia carotídea medial e lateralmente para separar com precisão a ECA e a artéria carótida interna (ACI) da fáscia e do tecido circundante, respectivamente.
    6. Libere a ECA e a ACI do tecido subjacente usando uma pinça curva Tipo 7.
  8. Com o CCA cuidadosamente preparado com seus dois respectivos ramos, levante o ECA usando uma pinça curva tipo 7 e prenda-o com uma pinça de fechamento automático tipo N0.
  9. Abaixe a pinça de fechamento automático tipo N0 com cuidado na mesa de operação.
    NOTA: Para reposicionar o clampponto de ECA, às vezes é necessário soltar levemente a alça e empurrar o ponto de ramificação ECA caudalmente. Neste ponto, é importante garantir que mais de 1 mm de ECA permaneça entre o clampeamento ECA e o ponto de ramificação.
  10. Com o ECA preso e preso firmemente com uma pinça tipo N0, introduza dois fios de seda trançados atrás do ECA.
    NOTA: A rosca craniana fará o nó de ligadura e deve ser colocada cranialmente a partir do local de fixação.
  11. Amarre o fio craniano completamente, pois é permanente, e prenda o excesso de fio com uma tesoura.
  12. Amarre o fio caudal em um nó solto.
    NOTA: Deve ser colocado próximo ao ponto de ramificação ECA e mantido solto para a passagem do filamento MCAO.
  13. Usando microclipes vasculares, clampeie o CCA e o ICA para evitar sangramento após a arteriotomia.
    NOTA: É crucial garantir que o microclipe aplicado ao CCA tenha uma pegada forte o suficiente, pois o CCA é uma artéria pulsante de alto rendimento, e não fazê-lo pode resultar em sangramento abundante e morte do animal nas etapas posteriores.
  14. Usando uma tesoura de micro-mola, faça uma pequena arteriotomia logo abaixo do local de fixação do ECA.
    NOTA: A arteriotomia precisa ser grande o suficiente para que a parte de silicone do filamento entre, mas não maior que a metade da circunferência do ECA para não comprometer a tensão mantida pela pinça tipo N0.
  15. Com um ângulo correspondente ao do ECA, insira o filamento no local da arteriotomia em uma direção proximal ao CCA, passando pelo nó de fixação frouxo no local de ramificação do ECA e aderindo ao lúmen do CCA com o filamento.
  16. Aperte o nó de fixação ao redor da parte de silicone do filamento.
    NOTA: É necessário muito cuidado neste ponto, pois o filamento tende a escorregar para fora do ECA na metade da última manobra, e colocá-lo de volta nesse ponto é muito difícil.
  17. Abra cuidadosamente o microclipe ICA e remova-o.
  18. Com o filamento parcialmente inserido no ECA e preso, faça uma arteriotomia completa, soltando assim o coto do ECA com o filamento MCAO dentro. Neste ponto, solte a pinça de fechamento automático tipo N0 e remova-a.
  19. Com um conjunto de pinças tipo 5, aperte firmemente o coto ECA e levante-o ligeiramente. Enquanto segura o filamento parcialmente inserido com outra pinça, abaixe e puxe suavemente o coto ECA para orientar a extremidade interna do filamento em direção ao ICA. Nunca aperte a parte de silicone do filamento.
  20. Com uma pinça segurando o filamento, avance lentamente o filamento através do ICA em direção ao círculo de Wills.
    NOTA: O primeiro ponto de ramificação do ICA também é o único em que o operador pode perder o ponto de ramificação MCA desejado. Portanto, é necessário um ligeiro ângulo lateral de avanço para guiar o filamento até o ponto de ramificação do MCA. Com o leve ângulo lateral de avanço, o filamento se curva para longe da artéria pterigopalatina (APP) e torna a extremidade em avanço mais propensa a entrar no círculo de Willis (Figura 1).

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Figura 1: Uma ilustração do avanço do filamento de oclusão da artéria cerebral média além do ponto de ramificação da artéria pterigopalatina. O avanço adequado do filamento (à esquerda) é obtido orientando o filamento MCAO de tal forma que ele se apoie na parede lateral do ICA e se curve para longe do ponto de ramificação do PPA. Não fazer isso (à direita) pode resultar na entrada do filamento no PPA e não causar acidente vascular cerebral. Neste último caso, o filamento não será capaz de avançar tanto quanto deveria e o cirurgião deve retirar o filamento até que sua extremidade se torne visível no ponto de ramificação da ACI e começar a avançar o filamento novamente. As artérias de cor verde representam artérias comunicantes posteriores (PcomA), principalmente não patentes em camundongos. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Avance lentamente o filamento MCAO através do círculo de Willis até sentir um aumento repentino na resistência.
    NOTA: Neste ponto, é importante observar o comprimento restante do filamento. O filamento deve avançar sem esforço a pelo menos 7 mm do ponto de ramificação ICA em um camundongo adulto.
  2. Aperte o nó de fixação para garantir que o filamento não seja deslocado durante a isquemia.
  3. Remova o clipe CCA e anote a hora.
    NOTA: Isso marca o início do início da isquemia.
  4. Compacte a extremidade solta do filamento MCAO no sulco entre o triângulo carotídeo e o músculo esternocleidomastóideo ipsilateral para que não se projete para fora da ferida cirúrgica.
  5. Remova o afastador de fio e aproxime as bordas da ferida cirúrgica. Deixe o local cirúrgico assentar por alguns segundos para que o tecido retorne à sua posição anatômica.
  6. Feche a ferida cirúrgica usando fechos de fita adesiva para facilitar a reabertura mais rápida da ferida após o período de isquemia.
    NOTA: Se um pesquisador deseja deixar o animal acordar durante o período de isquemia, recomenda-se suturar a ferida para evitar a reabertura prematura da ferida.

3. Período de isquemia

  1. Valide o sucesso da cirurgia usando ressonância magnética ou algum outro método quantitativo de medição de perfusão.
    NOTA: No caso de fazer uma ressonância magnética, a imagem ponderada em perfusão (PWI) deve mostrar isquemia crítica na região ampla da MCA e a imagem ponderada em difusão (DWI) deve delinear o local do coeficiente de difusão aparente (ADC) reduzido devido ao edema celular.
  2. Coloque o animal em uma gaiola limpa até que o período de isquemia termine.

4. Cirurgia de retirada de filamento

  1. Aproximadamente 5 minutos antes do término do tempo de isquemia alocado, posicione o animal e prenda-o novamente na mesa de operação.
  2. Remova os fechos da fita e reabra a ferida cirúrgica com o afastador de fio.
  3. Liberte a ponta solta do filamento MCAO do tecido circundante e das extremidades da rosca do nó de fixação.
  4. Com a pinça tipo N0, aperte e puxe a borda do coto ECA ventralmente para tensioná-lo. Abaixe cuidadosamente a pinça de pinça, semelhante ao primeiro procedimento cirúrgico.
    NOTA: O operador deve evitar apertar o nó de fixação, pois isso fará com que o nó não seja capaz de se desatar.
  5. Clamp o CCA novamente com um clipe microvascular.
  6. Usando uma pinça tipo 5, afrouxe o nó de fixação para permitir a retirada do filamento.
    NOTA: A melhor maneira de começar a afrouxar o nó é continuar apertando-o até que ele se separe em partes individuais e, em seguida, empurre as pontas da linha em direção ao nó.
  7. Retire lentamente o filamento MCAO até que a parte de silicone comece a sair do toco ECA. Aperte ligeiramente o nó de fixação para se preparar para a retirada completa do filamento.
  8. Quando estiver perto da extremidade de silicone do filamento, aperte o nó de fixação para que ele empurre o filamento MCAO para fora e feche o coto ECA em uma única manobra. Aperte o nó completamente depois que o filamento escorregar.
  9. Abra e remova a pinça de aperto junto com o clipe CCA.
    NOTA: Isso marca o fim do período de isquemia e o início do processo de reperfusão.
  10. Remova o afastador de fio e junte as bordas da ferida cirúrgica novamente.
  11. Suturar a ferida cirúrgica a partir da periferia, fechando a ferida completamente sem nenhum tecido subjacente visível.
    NOTA: O número de suturas necessárias depende do tamanho da ferida cirúrgica.
  12. Limpe e desinfete o local da cirurgia usando lenços umedecidos com álcool.

5. Cuidados pós-cirúrgicos

  1. Coloque o animal em uma gaiola limpa e deixe-o acordar espontaneamente da anestesia.
  2. Coloque alimentos peletizados no fundo da gaiola para facilitar o acesso. Amoleça os pellets de alimentos usando água potável. Encha uma pequena placa de Petri com água potável e leve-a também para o chão da gaiola.
  3. Nas próximas 48 h, injete 0,25 mL de solução salina com buprenorfina (0,5 mg/kg) a cada 24 h por via intraperitoneal.

Resultados

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Exames de ressonância magnética intraoperatórios ou pós-operatórios, especificamente exames de imagem ponderada em perfusão (PWI) e/ou imagem ponderada por difusão (DWI) (Figura 2) podem oferecer prova definitiva de um procedimento bem-sucedido. A PWI intraoperatória mostra isquemia crítica na região da ACM ipsilateral, confirmando que a colocação do filamento resultou em oclusão completa. A PWI pós-operatória de um procedimento bem-sucedido exibe hiperperfusão no núcleo da lesão, bem como algum grau de reperfusão nas bordas da região da ACM. As lesões de DWI intraoperatórias correspondem às regiões isquêmicas observadas na PWI intraoperatória. As lesões de DWI pós-operatórias exibem encolhimento em direção ao núcleo da lesão isquêmica, acompanhada por uma diminuição significativa no coeficiente de difusão aparente da lesão, tornando-a mais escura do que as lesões de DWI intraoperatórias e o tecido cerebral reperfundido circundante. As varreduras anatômicas T2 padrão, tanto intraoperatórias quanto pós-operatórias, geralmente não mostram nada digno de nota, a menos que ocorra hemorragia induzida por filamento

(Figura 3). Nesses casos, as varreduras PWI e DWI revelam isquemia incompleta ou inexistente.

O processo de reperfusão segue nas próximas 48 horas, e confirma-se que ocorreu em exames de ressonância magnética realizados no segundo dia após o procedimento (Figura 2, CBF no dia 2). Os exames de PWI mostram reperfusão completa no local da lesão com leve hiperperfusão no núcleo da lesão. As varreduras DWI mostram várias regiões de coeficientes de difusão aparentes reduzidos devido à formação de edema cerebral. As varreduras anatômicas em T2 indicam regiões hiperintensas de edema envolvendo regiões de ACM, sem envolvimento de regiões não ACM, como o hipocampo.

Ao acordar, o animal exibe sinais claros de AVC agudo. Os sintomas comportamentais comuns incluem aumento do tônus muscular na lateral da lesão, fazendo com que o animal flexione o tronco nessa direção. Circular e girar na direção ipsilateral também são sinais claros de um AVC agudo. A ataxia da marcha geralmente sugere o envolvimento do hipocampo no volume da lesão isquêmica. No entanto, esse sintoma pode não ter especificidade na fase hiperaguda devido aos efeitos colaterais da anestesia com isoflurano. Nos dias subsequentes, o animal deve desenvolver flexão do membro anterior ipsilateralmente e piora do estado postural, acompanhada de ausência do reflexo do bigode. A taxa de mortalidade atinge o pico em torno de 3 dias após o procedimento devido ao edema cerebral. A fase crônica começa depois que o edema cerebral começa a se resolver. Durante esse período, o animal pode apresentar retenção de urina. Por esse motivo, é importante inspecionar o animal quanto à rigidez da bexiga, bem como uma tampa firme na saída uretral. Na maioria das vezes, esse problema pode ser resolvido massageando suavemente a bexiga para facilitar a micção. Os sinais de recuperação de peso geralmente aparecem nos primeiros 7 dias após o início do AVC.

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Figura 2: Exemplo representativo de um MCAO bem-sucedido com reperfusão completa confirmada com exames de ressonância magnética. CBF, ADC e T2w significam mapas de fluxo sanguíneo cerebral, mapas de coeficiente de difusão aparente e exames anatômicos ponderados em T2, respectivamente. IntraOP, pós-operatório e D02 significam 3 momentos diferentes de imagem após o início da isquemia, após o início da reperfusão e no segundo dia após a MCAO, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Exames de ressonância magnética representativos de uma hemorragia induzida por filamento durante o procedimento MCAO. CBF, ADC e T2w significam mapas de fluxo sanguíneo cerebral, mapas de coeficiente de difusão aparente e exames anatômicos ponderados em T2, respectivamente. IntraOP, pós-operatório e D02 significam 3 momentos diferentes de imagem: após o início da isquemia, após o início da reperfusão e no segundo dia após a MCAO, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Uma ilustração da colocação adequada do filamento no ramo médio da artéria cerebral. Na maioria dos casos, a parte de silicone do filamento (de cor branca) fica alojada na parte proximal da artéria cerebral anterior (ACA) cerca de 2 mm além do ponto de ramificação da MCA. Normalmente, a região cerebral da ACA não é afetada em camundongos, pois a ACA se junta à contralateral em um ACA ázigos singular. As artérias afetadas são mostradas em cinza. À esquerda, a CCA é deixada patente durante o período de isquemia, fornecendo sangue a todos os ramos da ACI até a MCA que é ocluída com a parte de silício do filamento. À direita, o filamento é posicionado de forma idêntica, exceto que a ligadura da CCA é mantida durante o período de isquemia. Devido ao PcomA (cor verde) não ser patente na maioria dos casos, se a ligadura CCA for mantida, o AVC envolve de forma não seletiva a maior parte do hemisfério ipsilateral via MCA, AchA, VTA, HTA e PCA. Nesses casos, também podem ser observados sinais de enfarte agudo do olho (leucocoria e anisocoria) devido ao bloqueio do PPA. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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O MCAO é um procedimento altamente exigente para o operador e debilitante para o animal. Por esse motivo, é de extrema importância que os pesquisadores tenham um procedimento operacional padrão que minimize a gravidade do AVC, reduza a falha do procedimento e melhore o bem-estar do animal após o procedimento. Este protocolo MCAO destaca alguns dos principais aspectos a serem considerados ao realizar este procedimento em um mouse.

A escolha do filamento MCAO influencia o tamanho e a localização da lesão de AVC induzida e, portanto, é uma etapa crítica nesse procedimento11. Os filamentos revestidos de silicone, como os pioneiros da Doccol, deram um grande salto na redução da incidência de hemorragias induzidas por filamentos12. No entanto, os filamentos revestidos de silício vêm em uma grande variedade de tamanhos e comprimentos, representando um desafio para novos pesquisadores selecionarem os apropriados para MCAO em animais experimentais. Embora os fabricantes de filamentos geralmente forneçam diretrizes para escolher o diâmetro de filamento correto para um determinado peso animal, o comprimento do revestimento de silicone é considerado de preferência pessoal do operador e deve ser escolhido apenas com base na habilidade do operador. Neste trabalho, defendemos a minimização do comprimento do silício para garantir que a lesão induzida por AVC englobe apenas a área de irrigação da MCA, melhorando assim a reprodutibilidade. A Figura 4 ilustra que a artéria cerebral posterior (ACP), o primeiro ramo intracraniano da ACI, supre as regiões posteriores do cérebro, incluindo partes do hipocampo. Estudos recentes de micro-CT em camundongos identificaram três ramos menores adicionais decorrentes da ACI antes do ponto de ramificação da MCA13. A delicada e variável artéria hipotalâmica (ATQ), a artéria tegmental ventral (VTA) e a artéria coróide anterior (AChA), em sua ordem de ramificação, contribuem significativamente para a variabilidade intravariante e intra-sujeito8. Além disso, estudos de micro-CT mostraram que, em camundongos, a distância média dos pontos de ramificação MCA e PCA mede cerca de 1,7 mm, consideravelmente menor do que o comprimento do revestimento de silício da maioria dos filamentos fabricados14. Uma vez que o único feedback que um operador recebe ao avançar o filamento é um aumento repentino da resistência quando o filamento atinge o ponto de ramificação do MCA, o comprimento de fuga do revestimento de silicone do filamento é o que induz isquemia ao MCA e, dependendo do comprimento do revestimento de silício, ao AChA, VTA, HTA e até PCA, introduzindo variabilidade contrária ao modelo MCAO pretendido. Assim, para manter a reprodutibilidade e o bem-estar animal pós-operatório, o objetivo deve ser apenas a oclusão da ACM. A Doccol oferece filamentos MCAO com revestimentos de silicone que variam de 1 a 2 mm, mas nossa experiência indica que o uso de revestimentos de 1-2 mm geralmente resulta em uma operação simulada sem causar acidente vascular cerebral. As ressonâncias magnéticas intraoperatórias revelaram que o filamento avança até 2 mm além do ponto de ramificação da ACM na artéria cerebral anterior (ACA) antes de fornecer feedback resistivo crítico ao operador. Por esse motivo, sugerimos o uso de revestimentos de silicone que variam de 2 a 3 mm de comprimento, o que reduz o envolvimento do hipocampo em lesões de AVC em comparação com revestimentos de silicone mais longos em filamentos MCAO.

O segundo passo crítico neste procedimento é a colocação correta do filamento MCAO para obter a oclusão completa do MCA. A entrada por engano no primeiro ramo da ACI, a artéria pterigopalatina (APP), é um problema comum para o operador, pois quase não há feedback de que o filamento MCAO tomou um rumo errado durante seu avanço. Por esse motivo, recomendamos um leve ângulo lateral de avanço para que a ponta revestida de silicone do filamento se curve para longe do ponto de ramificação do PPA, tornando-o mais provável de entrar na porção intracraniana do ICA. (Figura 1) Conforme declarado na seção de protocolo, é importante observar o comprimento do filamento à direita para concluir se a colocação do filamento é adequada. No caso em que o filamento não possa ser inserido por pelo menos 7 mm do ponto de ramificação ICA, o operador deve retrair o filamento e repetir. Qualquer força desnecessária aplicada durante a inserção do filamento pode resultar em hemorragia e falha no procedimento. Para isso, uma medição contínua de perfusão laser-doppler pode ser usada para confirmar o posicionamento correto do filamento.

Garantir o fluxo sanguíneo desimpedido da ACC durante o período isquêmico é outra etapa crítica neste protocolo. Ao contrário da maioria das ilustrações que descrevem um círculo de Willis completo em um camundongo, estudos mostraram que a artéria comunicante posterior (PcomA) na maioria das vezes não é patente bilateralmente em camundongos e não pode fornecer de forma confiável o lado ipsilateral do círculo de Willis se o CCA permanecer fechado durante o período de isquemia15,16. Nesses casos, mesmo que um pesquisador selecione cuidadosamente o comprimento correto do revestimento de silicone do filamento, o curso envolverá todo o hemisfério ou apenas a região MCA, dependendo da permeabilidade de PcomA, dando origem à variação não contabilizada dos tamanhos dos traços. Por esse motivo, modificamos o procedimento para envolver a etapa de instrução em que o operador remove o clipe CCA logo após definir o filamento MCAO de oclusão. Essas modificações poderiam aumentar a precisão e a reprodutibilidade da cirurgia e, ao mesmo tempo, reduzir a heterogeneidade dos resultados. A padronização dos métodos melhoraria ainda mais a taxa de sucesso e a comparabilidade, bem como o potencial de tradução dos resultados17.

A maior limitação da técnica proposta é o fato de a ECA permanecer ligada após o procedimento, o que pode potencialmente piorar o estado do animal durante a recuperação18. Até agora, não tivemos sucesso nos esforços para reparar o ECA, mantendo a taxa de sucesso do procedimento alta o suficiente. Este continua sendo um ponto potencial para futuras melhorias no método. Além disso, minimizar o tempo em que o CCA permanece clampeado é um desafio, mas é essencial para evitar o recrutamento de regiões não-MCA no AVC. Uma vez que isso pode fornecer uma fonte de variância inter e intraoperadora, é aconselhável medir a duração do clampeamento do CCA, potencialmente permitindo que os pesquisadores contabilizem estatisticamente pelo menos uma fração da variância total observada nos tamanhos dos braçadas. Por outro lado, a habilidade e a experiência do operador desempenham um papel crucial na redução do tempo de ligadura da ACC e na duração geral do procedimento11.

O método apresentado é significativo porque permite aos pesquisadores ocluir seletivamente a ACM, tornando o início da reperfusão súbito e altamente controlável. O método mimetiza a trombectomia endovascular e sua subsequente lesão de reperfusão com mais precisão do que os métodos atualmente disponíveis, fornecendo detalhes para um modelo de lesão de isquemia/reperfusão animal reprodutível e clinicamente relevante.

Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar. Os autores não têm afiliação com nomes comerciais e marcas registradas mencionadas neste trabalho.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo projeto BRADISCHEMIA da Fundação Croata para a Ciência (UIP-2017-05-8082); GA KK01.1.1.01.0007 financiado pela União Europeia através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional e pela União Europeia através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional ao abrigo do Acordo de Subvenção nº. KK.01.1.1.07.0071, projeto "SineMozak. O trabalho dos doutorandos Rok Ister e Marta Pongrac tem sido totalmente apoiado pelo "Projeto de desenvolvimento de carreira de jovens investigadores - formação de doutorandos" da Fundação Croata para a Ciência, financiado pela União Europeia pelo Fundo Social Europeu. O procedimento foi filmado usando um smartphone Android montado em um microscópio cirúrgico usando um suporte de câmera genérico. Os materiais de vídeo foram editados e a narração foi gravada usando o editor de vídeo Wondershare Filmora.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução cutânea Betadine 10g / 100mlAlcalóide SkopjeN / A
Sutura de seda trançadaFine Science Tools18020-60
Sutura Dafilon 5/0 DS16B. BraunC0936154
Dolokain 20 mg / g gelJadran-Galenski LaboratorijN / A
Dumont # 5 fórcepsFine Science Tools11251-202 peças
Pinça Dumont #7Ferramentas de Belas Ciências11271-30
Pinça de fechamento automático Dumont N0Ferramentas de Belas Ciências11480-11
Fita Cirúrgica Durapore 1,25cm x 9,1m3M7100057169
Fita Cirúrgica Durapore 2,5cm x 9,1m3M7100057168
Termostato externoPetnap1012536
Porta-agulhas HalseyFine Science Tools12500-12
Esterilizador de contas quentesFine Science Tools18000-50
Tesoura de írisFine Science Tools14060-10
Isoflurano USPPiramal cuidados intensivosN / A
Monitor Doppler a laserMoorMOORVMS-LDF2
Metal Pet Heat PadPetnap
Micro Vannas tesoura de molaFine Science Tools15000-00
Mini-colibri retratorFine Science Tools17000-01
Pomada para os olhos RecugelBausch& LombN/A
S& T B-1 micro braçadeira de vasoFerramentas de Belas Ciências00396-012 peças
S& Pinça de aplicação de micro braçadeiraT Fine Science Tools00071-14
Schwartz micro serrefinesFine Science Tools18052-01
Stemi DV4 Spot microscópio estéreoZeiss000000-1018-453
Steri-Strip Reinforced Adhesive Skin Closures 3 mm x 75 mm3M7100236545
Pinça de tecido retoFine Science Tools11023-10
SZX Stand ArmOlympusSZ2-STS
Tec III 300 série vaporizador calibradoVaporizador Vendas e Serviços inc./A
Suporte Universal Tipo 2OlympusSZ2-STU2
VetFlo Suporte de Anestesia de Seis CanaisKent ScientificVetFlo-1225Modificado para mistura de O2/N2
1012525N

Referências

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Middle Cerebral ArteryIschemic Stroke ModelCerebral Artery OcclusionComplete ReperfusionExternal Carotid ArteryIntraluminal Filament ModelRodent Stroke ModelSurgical StandardizationPerfusion Weighted ImagingApparent Diffusion Coefficient

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