A depuração hepática da insulina é fundamental para regular a homeostase da glicose. Este artigo descreve um procedimento de perfusão hepática fácil de usar para avaliar diretamente a taxa de depuração da insulina hepática in situ em camundongos.
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Artigo de método
Avaliação da depuração de insulina em camundongos por meio de perfusão hepática in situ
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A depuração hepática da insulina é essencial para manter a homeostase da glicose e está intimamente ligada a distúrbios metabólicos, como obesidade, resistência à insulina e diabetes. A medição precisa da depuração da insulina é vital para entender os mecanismos subjacentes dessas condições. Este protocolo apresenta um procedimento de perfusão hepática simples e fácil de usar em camundongos, projetado especificamente para avaliar diretamente a taxa de depuração de insulina hepática. O método envolve a canulação precisa da veia porta e da veia cava inferior supra-hepática para criar um sistema de perfusão in situ que imita as condições fisiológicas. O protocolo orienta os pesquisadores em todas as etapas do procedimento, desde a preparação cirúrgica e configuração do sistema de perfusão até a coleta e análise de amostras. Instruções detalhadas são fornecidas, juntamente com resultados representativos e dicas importantes para otimizar o procedimento. Um tutorial em vídeo acompanha o protocolo escrito, oferecendo instruções e ilustrações visualmente detalhadas, tornando-o uma referência acessível e abrangente para cientistas que exploram os mecanismos moleculares por trás do metabolismo e depuração da insulina hepática.
Introdução
A descoberta da insulina tornou-se um dos marcos do século passado. Muito se sabe sobre a regulação da síntese de insulina, secreção e suas funções fisiológicas nos tecidos metabólicos. No entanto, tem havido menos foco na degradação da insulina e seus mecanismos regulatórios. O metabolismo da insulina pode ser entendido como a interação entre a função das células beta, a resistência ou sensibilidade à insulina (RI) e a depuração da insulina. Juntamente com a secreção de insulina, a depuração hepática de insulina desempenha um papel crucial na manutenção do nível homeostático de insulina necessário para atingir os tecidos-alvo periféricos e facilitar a ação adequada da insulina1. Vários estudos identificaram a depuração de insulina prejudicada como um fator crucial na patogênese da hiperinsulinemia na síndrome metabólica, bem como em outras condições, como diabetes tipo 22, esteato-hepatite não alcoólica4 e síndrome do ovário policístico5. Assim, a hiperinsulinemia secundária à depuração reduzida pode desempenhar um papel na patogênese da doença metabólica. Estratégias que melhoram a depuração da insulina têm o potencial de reverter os impactos desfavoráveis da hiperinsulinemia nesses indivíduos.
A insulina tem um padrão único de distribuição. O nível de insulina plasmática circulante depende do equilíbrio entre a secreção e a remoção de insulina. O pâncreas secreta insulina na veia porta de forma pulsátil, direcionando-a para os hepatócitos. Como o primeiro órgão a encontrar secreção de insulina, o fígado degrada a maior parte da insulina durante sua primeira passagem, respondendo por 60% a 70% do total de insulina6. A insulina remanescente sai do fígado pela veia hepática, entrando na circulação sistêmica, onde é parcialmente utilizada pelos tecidos periféricos (principalmente músculo, tecido adiposo e rins) antes de ser extraída pelo fígado durante sua segunda passagem pela artéria hepática7.
A medição precisa da depuração da insulina é crucial. Medir diretamente a depuração da insulina hepática em estudos em humanos é um desafio porque a obtenção de amostras de sangue das veias porta e hepática é difícil. Métodos diretos e indiretos são usados para estimar a depuração da insulina em humanos e modelos animais. Aproximadamente três estratégias são empregadas para medir a depuração de insulina indiretamente. As avaliações mais frequentemente utilizadas na prática clínica envolvem métodos baseados na relação molar peptídeo C/insulina8. Essa abordagem é fundamentada na secreção equimolar de ambos os peptídeos e na ausência de extração do peptídeo C pelo fígado9. O segundo grupo de métodos depende da análise matemática das curvas de decaimento plasmático da insulina após uma entrada conhecida e específica do hormônio na circulação 2,10,11. O terceiro método baseia-se no fato de que a infusão de insulina a uma taxa constante leva a níveis estáveis do hormônio no sangue, onde a taxa de remoção coincide com a taxa de administração12. Esses métodos indiretos refletem principalmente a depuração geral da insulina no corpo. Dado que o fígado é o principal local de depuração da insulina e desempenha um papel crucial nesse processo, é essencial avaliar diretamente a depuração da insulina hepática.
Estudos anteriores mediram diretamente a extração de insulina hepática em cães saudáveis 13,14. Estudos também usaram um modelo isolado de fígado de rato perfundido para avaliar a extração de insulina do fígado15,16. Devido à alta disponibilidade de cepas geneticamente modificadas, os camundongos servem como modelos valiosos para investigar vias moleculares. Alguns estudos17 utilizaram a perfusão hepática para avaliar diretamente a depuração de insulina hepática em um modelo de camundongo. Nesses estudos, um perfusato contendo insulina humana é infundido na veia porta e coletado da veia cava inferior. A proporção de insulina absorvida pelo fígado indica sua depuração. A técnica de perfusão hepática mantém o fígado em condições quase fisiológicas, circulando um perfusado quente, oxigenado e enriquecido com nutrientes através da vasculatura hepática. No entanto, não há orientação prática suficiente e dicas essenciais para o avanço e disseminação dessa técnica.
Assim, embora a depuração hepática de insulina tenha recebido atenção crescente, seu papel nos distúrbios, bem como seus mecanismos moleculares, permanecem obscuros18. Portanto, técnicas avançadas são muito necessárias no campo da pesquisa científica. Este protocolo estabelece um procedimento detalhado de perfusão hepática modificada em camundongos para avaliar a depuração hepática da insulina. Além disso, esse método também pode ser usado para estudar os efeitos dos medicamentos no fígado, incluindo o efeito de primeira passagem, processos de transporte de medicamentos e vários outros aspectos.
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Protocolo
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Nanjing (IACUC-2105018) e seguiu as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Todos os camundongos C57BL / 6N foram mantidos em um ciclo claro / escuro de 12 horas com livre acesso a comida e água. Camundongos de seis semanas de idade foram divididos aleatoriamente em um grupo de dieta Chow (CD) e um grupo de dieta rica em gordura (HFD). O grupo HFD foi alimentado com uma dieta rica em 60% de gordura e continuou com essa dieta até as 10 semanas de idade. O peso corporal médio foi de 28,55 g ± 1,2 g para o grupo HFD e 24,3 g ± 0,48 g para o grupo controle. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação
- Realize a esterilização necessária de instrumentos cirúrgicos e consumíveis por meio de autoclavagem.
- Coloque os instrumentos cirúrgicos, sutura de seda 6-0, aplicador de algodão pequeno estéril, injeção de cloreto de sódio (500 mL), cotonetes e esponjas adequadamente na mesa de operação.
- Prepare 30 mL de solução salina heparinizada com uma concentração final de 200 UI / mL.
- Prepare dois tubos de silicone com diâmetro interno de 0,31 mm e diâmetro externo de 0,64 mm; um de 4 cm de comprimento para uso como cateter de veia porta e o outro de 10 cm de comprimento para uso como cateter de veia cava inferior.
- Prepare o tampão de perfusão Krebs-Henseleit (KRBH) contendo 5,0 mmol / L de glicose e 0,25% de BSA.
- Prepare o tampão de perfusão Krebs-Henseleit (KRBH) contendo 5,0 mmol / L de glicose, 0,25% de BSA e 4,0 ng / mL de insulina humana.
- Configure o sistema de perfusão hepática. A Figura 1 mostra os principais componentes do sistema de perfusão hepática.
2. Cateterismo cirúrgico
- Prepare a mistura anestésica seguindo os passos abaixo:
- Dilua Zoletil 50 (250 mg / 5 mL) 10 vezes com solução de cloreto de sódio a 0,9%.
- Dilua o cloridrato de xilazina (200 mg / 2 mL) 10 vezes com solução de cloreto de sódio a 0,9%.
- Misture a solução de Zoletil 50 a 0,5% com a solução de cloridrato de xilazina a 1% na proporção de 1:1.
- Anestesie os ratos.
- Verifique e registre o peso corporal do mouse. Administre a mistura anestésica por injeção intraperitoneal na dose de 5 mL / kg de peso corporal (2,5 mg / mL Zoletil 50; 5 mg / mL de cloridrato de xilazina). O início da anestesia geralmente ocorre dentro de 5 a 10 minutos após a injeção, indicado pela perda do reflexo de endireitamento e resposta reduzida a estímulos externos.
- Transfira o mouse para a mesa de operação. Prenda os membros com fita adesiva. Administre 2,5 U/g de heparina por via intraperitoneal para obter heparinização.
- Use um barbeador elétrico para aparar o pelo da pele abdominal e desinfete a área com uma solução de iodopovidona.
- Realize o cateterismo da veia porta.
- Faça uma incisão longitudinal de 4 cm do abdômen inferior em direção ao apêndice xifóide ao longo da linha abdominal média. Corte cuidadosamente o peritônio com uma tesoura para evitar danos aos órgãos viscerais. Insira o afastador abdominal do rato para expor o campo cirúrgico.
- Mova os intestinos para a direita para revelar a veia porta, o rim direito e a veia cava inferior (Figura 2A). Use uma pinça de artéria para prender a veia cava na borda superior do rim.
- Isole a veia porta (Figura 2A) e ligue a extremidade distal com uma sutura de seda 6-0. Amarre frouxamente outra sutura na extremidade proximal do vaso exposto.
- Faça uma incisão perto da extremidade ligada com uma tesoura de mola e insira o cateter. Avance o cateter através da incisão até o nível da bifurcação portal.
- Prenda ambas as ligaduras ao redor do cateter e confirme a amostragem adequada conectando a extremidade livre do cateter a uma seringa de amostragem. Lave com solução salina heparinizada e clampeie o cateter (Figura 2C).
- Remova o dispositivo de tração e reinicie os intestinos. Cubra a área cirúrgica com gaze estéril embebida em solução salina ou algodão.
- Realize cateterismo da veia cava inferior supra-hepática.
- Faça uma incisão ao longo do esterno a partir do processo xifóide, expondo o esterno.
- Corte verticalmente o esterno e corte o diafragma ao longo da margem da costela para expor a cavidade torácica.
- Expor e isolar a veia cava inferior supra-hepática (Figura 2B). Ligue cuidadosamente a extremidade distal com uma sutura de seda 6-0. Amarre frouxamente outra sutura na extremidade proximal do vaso.
- Faça uma incisão logo abaixo da extremidade ligada com uma tesoura de mola e insira um cateter de 10 cm. Avance o cateter até que a ponta do cateter esteja próxima ao fígado e amarre ambas as ligaduras com segurança. Confirme a amostragem adequada e clampeie a extremidade livre do cateter (Figura 2D).
- Enxágue a área cirúrgica com solução salina. Cubra a superfície com gaze estéril embebida em solução salina.
3. Perfusão hepática
- Eutanasiar o camundongo usando uma overdose de anestésico e toracotomia de acordo com as diretrizes institucionais para cuidados e uso de animais, garantindo que todos os procedimentos sejam realizados de maneira a minimizar o sofrimento.
- Configure o sistema de perfusão hepática, que inclui um oxigenador, um dispositivo de modulação de temperatura, uma bomba de infusão e tubos de infusão, conforme mostrado na Figura 1.
- Forneça um fluxo contínuo de gás de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono para o oxigenador.
- Ligue o banho-maria e pré-aqueça a câmara do órgão a 37 °C.
- Prepare o tampão de perfusão KRBH com e sem insulina. Preparar o sistema de tubagem com o tampão de perfusão incubado em banho-maria a 37 °C.
NOTA: O KRBH é livre de BSA e glicose. O tampão de perfusão KRBH sem insulina humana contém 5,0 mmol/L de glicose e 0,25% de BSA, enquanto o tampão de perfusão KRBH com insulina humana contém 5,0 mmol/L de glicose, 0,25% de BSA e 4,0 ng/mL de insulina humana. - Coloque o mouse em um recipiente com a temperatura ambiente mantida em aproximadamente 37 °C. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 °C.
- Infundir o tampão KRBH através do cateter da veia porta. Defina a taxa de infusão em 0,2 mL / min por meio de uma mini bomba.
- Observe que o fígado fica pálido em segundos, indicando que o tampão de perfusão está fluindo através do fígado. Para eliminar mais células sanguíneas restantes no fígado, pause a infusão por 1 minuto nos pontos de tempo de 4 e 8 minutos, iniciando o tempo no início da perfusão.
- Perfundir o fígado com tampão KRBH por um total de 10 min (excluindo as duas pausas de 1 min), representando o período de equilíbrio. Colete a amostra basal do cateter da veia cava inferior.
- Perfundir o fígado com a mesma solução enriquecida com insulina (4,0 ng/mL de insulina humana) por mais 30 min.
- Colete todas as amostras do tubo de veia cava inferior a cada 2 min.
- Registre o peso do fígado após a perfusão. Colete amostras de fígado de diferentes lóbulos, congele-as imediatamente em nitrogênio líquido e transfira para -80 ° C para armazenamento.
- Centrifugue todas as amostras de perfusão coletadas a ~ 1.000 x g por 10 min a 4 ° C. Recolher os sobrenadantes e transferi-los para -80 °C para armazenamento.
NOTA: A concentração de insulina em amostras de perfusão é medida usando kits de ensaio de imunoabsorção enzimática de insulina humana (ELISA). - Após o procedimento, certifique-se de que todos os resíduos biológicos sejam descartados de acordo com as normas de segurança.
4. Análise dos dados
- Apresente os dados em gráficos XY mostrando a produção da concentração de insulina ao longo do tempo.
- Calcule a taxa média de depuração da insulina hepática (HICRAVE) usando a seguinte fórmula:
HICRAVE = (1−Cf/Ci) × 100%
onde Ci = concentração inicial de insulina do tampão de infusão, Cf = concentração média final de insulina nos últimos 10 minutos da veia cava inferior supra-hepática.
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Resultados
Este protocolo descreve o procedimento de infusão hepática para calcular a depuração da insulina hepática diretamente. Este modelo é confiável e reprodutível. Um exemplo dos resultados obtidos de um experimento é mostrado na Figura 3. Após um período de equilíbrio de 10 minutos, o tampão KRBH suplementado com 4,0 ng/mL de insulina humana foi perfundido através da veia porta por 30 minutos. O líquido de perfusão foi coletado do cateter na veia cava inferior supra-hepática em intervalos de 2 m...
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Discussão
Etapas críticas no protocolo
Os procedimentos cirúrgicos descritos acima devem ser realizados com cuidado suave para evitar a criação de lesões no fígado. Além disso, a estrutura frágil da parede do vaso da veia hepática a torna vulnerável a punções e sangramento subsequente se não for manuseada com cuidado durante a canulação. Tubos de silicone mais macios são utilizados neste protocolo para minimizar os danos aos vasos sanguíneos. Recomenda-se que o cateterismo seja...
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Divulgações
Nenhum conflito de interesse foi declarado.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82200948, 82270921, 82170882).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 60% dieta rica em gordura | Dietas de pesquisa, EUA | D12492 | |
| Kit de ensaio de alanina aminotransferase | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-2-1 | |
| Glicose anidra | Sangon Biotech | 50-99-7 | 500 G |
| Kit de ensaio de aspartato aminotransferase | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-2-1 | |
| Soro bovino Albumina | GeminiBio | 700-107P | TS Contour Sem Ácidos |
| Graxos | Tiras | PH220800019 | |
| Contour | Bayer | DP38M3F05A | |
| Heparina Sódica | Changzhou Qian hong Bio-pharma | H32022088 | 12500 U / 2mL |
| Insulina humana | Novo Nordisk | S20191007 | 300 U / 3mL |
| Kit de imunoensaio de insulina humana | Ezassay Biotechnology | HM200 | |
| KRBH tampão (açúcar, BSA livre) | coolaber | SL65501 | 500 mL |
| Oxigenador de membrana | Xi'an Xijing Medical Appliance | 5 | |
| Tesoura microscópica | Shanghai Jinzhong | YBC020 | |
| Braçadeira Micro-serrefine | Ningbo Medical Needle | 180709 | |
| Microsurgery Fórceps | Shanghai Jinzhong | WA3010, WA3020 | |
| agulha | N-buliv | LG05-133-2 | |
| Solução de iodopovidona | Shanghai likang Desinfetante Hi-Tech | 20231016J | |
| bomba 11 Aparelho Elite | Harvard | PC5 70-4500 | |
| Retractor | Globalebio (Pequim) Technology | GEKK-10mm | 10 mm |
| Silicone Tubing | produtos científicos | #BB518-12 | 0,31 mm × 0,64 mm |
| Tubo de silicone | Fisher Scientific | #11-189-15A | ID 0,5 mm |
| Injeção de cloreto de sódio | Baxter | S2402023 | 4,5 g/500 mL |
| Sutura | de seda cirúrgicaYangzhou Huanyu Equipamento Médico | 6-0 | |
| Modulação de temperatura | Xi'an Xijing Medical Appliance | 6 | |
| Banho-maria termostático | Jiaxing Junsi Electronics | HIH-1 | 220 V 50 HZ |
| Junta de três vias | YISAI | AQTCY1.6 | ID 0,4 mm |
| Injeção de cloridrato de xilazina | ShengXin | 20240106 | 200 mg / 2mL |
| Zoletil 50 | Virbac | WK001 | 250 mg/5mL |
Referências
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Reimpressões e permissões
