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Condensados sintéticos e arquiteturas semelhantes a células de nanoestruturas de DNA anfifílico

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DOI:

10.3791/66738

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31 de maio de 2024

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 2Department of Chemistry, Imperial College London, 3fabriCELL, Imperial College London

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo para preparação de condensados biomoleculares sintéticos constituídos por nanoestrelas de DNA anfifílico a partir de seus oligonucleotídeos de DNA constituintes. Os condensados são produzidos a partir de um único componente de nanoestrela ou de dois componentes e são modificados para sustentar a transcrição in vitro de RNA a partir de um molde de DNA incorporado.

Resumo

Gotículas e condensados sintéticos estão se tornando constituintes cada vez mais comuns de sistemas biomiméticos avançados e células sintéticas, onde podem ser usados para estabelecer compartimentalização e sustentar respostas semelhantes à vida. As nanoestruturas de DNA sintético demonstraram potencial significativo como blocos de construção formadores de condensado devido à sua forma programável, funcionalização química e comportamento de automontagem. Recentemente, demonstramos que as "nanoestrelas" de DNA anfifílico, obtidas pela marcação de junções de DNA com porções hidrofóbicas, constituem uma solução particularmente robusta e versátil. Os condensados de DNA anfifílicos resultantes podem ser programados para exibir arquiteturas internas complexas e multicompartimentais, responder estruturalmente a vários estímulos externos, sintetizar macromoléculas, capturar e liberar cargas úteis, sofrer transformações morfológicas e interagir com células vivas. Aqui, demonstramos protocolos para a preparação de condensados de DNA anfifílicos a partir de oligonucleotídeos de DNA constituintes. Abordaremos (i) sistemas monocomponentes formando condensados uniformes, (ii) sistemas de dois componentes formando condensados núcleo-casca e (iii) sistemas nos quais os condensados são modificados para suportar a transcrição in vitro de nanoestruturas de RNA.

Introdução

As células sintéticas são dispositivos em escala micrométrica (10-50 μm) construídos de baixo para cima para replicar funções e estruturas de células biológicas existentes 1,2. As células sintéticas são frequentemente ligadas por membranas construídas a partir de vesículas de bicamada lipídica 3,4,5,6,7, polimerossomos 8,9 ou proteinossomos10,11, que também podem ser usados para estabelecer compartimentalização interna12,13. Inspiradas nas organelas sem membrana conhecidas por sustentar várias funcionalidades em células vivas14, estruturas como coacervados poliméricos, condensados biomoleculares e hidrogéis estão ganhando força como alternativas versáteis e robustas para estabelecer compartimentalização externa e interna em células sintéticas 15,16,17,18.

Aproveitando o versátil kit de ferramentas da nanotecnologia de DNA19, várias soluções foram desenvolvidas para projetar gotículas e condensados sintéticos a partir da automontagem de nanoestruturas artificiais de DNA, cujo tamanho, forma, funcionalidade, valência e interações mútuas podem ser programados com precisão20. Gotículas ou condensados de DNA são biocompatíveis e podem atuar como andaimes para células sintéticas e organelas, hospedando reações químicas e biomoleculares21, computando informações22,23, capturando e liberando cargas24,25 e sustentando respostas estruturais26.

Entre os diversos projetos de nanoestruturas de DNA formadoras de condensado, as nanoestrelas de DNA anfifílicas - apelidadas de estrelas C - provaram ser robustas e versáteis27. As estrelas C são motivos ramificados simples que consistem em uma junção fixa de DNA (normalmente de quatro vias), da qual emergem braços de DNA de fita dupla (ds)28. Os braços são então derrubados com porções hidrofóbicas, normalmente colesterol, tornando as nanoestruturas anfifílicas e conduzindo sua condensação após um simples recozimento de um pote. Os condensados C-star oferecem programabilidade estrutural e funcional precisa, incluindo a possibilidade de estabelecer arquiteturas multicompartimentais29,30, respondendo estruturalmente a gatilhos de DNA e cátions31, sintetizando macromoléculas29, capturando e liberando cargas úteis32 e interagindo com células vivas33. Abaixo, descreveremos e discutiremos protocolos para produzir condensados de estrela C a partir de seus oligonucleotídeos constituintes.

O protocolo resume a preparação de condensados unários (um componente) e binários (dois componentes), utilizando três designs diferentes de C-star (Figura 1) - "Não responsivo", "TMSD-responsivo" e "Modelagem de RNA". A estrela C "não responsiva" (painel A) consiste em quatro "fitas centrais" com sequências distintas formando a junção de quatro vias. Quatro oligonucleotídeos idênticos modificados por colesterol estão conectados à junção, garantindo que uma molécula de colesterol esteja presente no final de cada braço. As estrelas C não responsivas constituem andaimes simples e inertes para condensados unários e binários. Na estrela C "responsiva a TMSD" (painel B), a conexão entre as fitas colesterolizadas e a junção é garantida por uma fita "Toeholding bridge", que apresenta um domínio "toehold" de fita simples (ss) DNA. Na presença de uma fita de DNA invasora com um domínio de toehold complementar, uma reação de deslocamento da fita mediada pelo toehold pode ser desencadeada34, em que o invasor desloca a ponte Toeholding, quebrando a conexão entre a junção e as porções hidrofóbicas e desencadeando a desmontagem da rede de DNA32. Finalmente, a estrela C de "modelagem de RNA" (painel C) inclui uma modificação de "Base" complementar a uma fita de "Ponte", a última das quais liga o modelo de ssDNA transcritível para o aptâmero de brócolis29. Detalhes da sequência dos oligonucleotídeos constituintes para os três tipos de projetos de estrelas C mencionados aqui podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1 e em trabalhos anteriores 29,30,32.

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Figura 1. Esquemas de três designs diferentes de nanoestrelas de DNA anfifílico (estrelas C). Sequências de oligonucleotídeos para vários exemplos de estrelas C descritas aqui podem ser encontradas na Tabela Suplementar 1. (A) Esquema de uma estrela C projetada para formar condensados não responsivos, com as fitas de oligonucleotídeos componentes "Núcleo 1", "Núcleo 2", "Núcleo 3", "Núcleo 4" (colorido em tons de rosa) e "Colesterol terminal" (colorido em azul). Cada cor única representa uma fita de oligonucleotídeo de sequência única. "Núcleo 1" e "Núcleo 3" são parcialmente complementares a "Núcleo 2" e "Núcleo 4", mas não complementares entre si. (B) Esquema de uma estrela C projetada para se desmontar após a adição de uma fita invasora por meio do deslocamento da fita mediada pelo apoio do pé, conforme descrito no trabalho anterior32. Esta estrela C é composta por fitas "Core" e "Colesterol terminal" (coloridas em cinza), bem como uma fita "Complemento terminal" (mostrada em laranja) e uma fita "Toeholding bridge" (mostrada em azul-petróleo escuro). Este último contém uma saliência de seis nucleotídeos à qual uma fita invasora adequadamente projetada pode se ligar e, subsequentemente, deslocar totalmente a fita "Toeholding bridge", que causa a dissociação da junção central da nanoestrela (composta por "Core 1, 2, 3 e 4") dos duplexes compostos pelas fitas "Complemento terminal" e "Colesterol terminal". (C) Esquema de uma estrela C funcionalizada com um molde de DNA para um aptâmero de RNA. Este também é composto pela fita "Colesterol terminal" e "Núcleo 2, 3 e 4" (todos mostrados em cinza), bem como uma versão estendida da fita "Núcleo 1" (mostrada em rosa), uma fita "Base" (marrom), uma fita "Ponte" (amarelo) e o "Modelo de Aptâmero" (verde). O duplex de DNA composto pelas duas últimas fitas forma a região promotora da polimerase T7, que marca o local de início da transcrição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os condensados C-star se formam após o recozimento térmico dos oligonucleotídeos constituintes, que no protocolo aqui apresentado é conduzido dentro de capilares de vidro selados com uma seção transversal retangular de alta proporção. Esses recipientes oferecem várias vantagens principais: i) A vedação garante que a evaporação seja completamente evitada nas etapas de recozimento (às vezes lentas); ii) O fundo plano de qualidade óptica dos capilares permite a obtenção de imagens do transiente de automontagem (ou desmontagem); iii) a alta proporção dos capilares garante que os condensados pesados se depositem em uma área ampla e plana, reduzindo as chances de coalescência e agregação em estágios posteriores do transiente de automontagem que ocorreria em recipientes em forma de cunha (por exemplo, tubos de microcentrífuga) e produzindo populações de condensado relativamente monodispersas; iv) realizar o recozimento em um capilar de vidro alongado minimiza a exposição da amostra a interfaces hidrofóbicas (ar, plástico ou óleo), que foram observadas perturbando a automontagem ao recrutar os oligonucleotídeos anfifílicos colesterolizados. Uma vez concluído o protocolo de montagem, os condensados podem ser extraídos dos capilares de vidro para experimentos adicionais que envolvem reagentes adicionais.

Protocolo

NOTA: O protocolo é dividido em três seções. A Seção 1 descreve as etapas de pré-requisito, incluindo a preparação de oligonucleotídeos de DNA e capilares de vidro. A Seção 2 descreve a preparação de condensados de estrela C de vários projetos, incluindo projetos de um e dois componentes, e sua extração dos capilares de vidro. A Seção 3 descreve o uso de condensados de estrela C de modelagem de RNA de um componente para a síntese de um aptâmero de RNA. O usuário deve seguir as boas práticas de laboratório o tempo todo, garantir que todas as avaliações e mitigações de risco necessárias estejam em vigor e usar equipamento de proteção individual (EPI) adequado, incluindo luvas, óculos de segurança e jaleco. A limpeza dos tubos capilares de vidro requer sua sonicação, primeiro em uma solução surfactante e depois em isopropanol ou etanol. A extração de condensados de estrela C de tubos capilares requer o uso de uma caneta de riscagem de diamante para marcar e quebrar o vidro, com um risco associado de ferimentos causados por fragmentos de vidro. Os principais materiais, equipamentos e reagentes usados estão listados na Tabela de Materiais. A maioria dos oligonucleotídeos não funcionalizados é purificada pelo fornecedor usando dessalinização padrão, com exceção das fitas "núcleo estendido 1" e "modelo de Aptâmer", que são solicitadas com purificação por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Os oligonucleotídeos modificados com colesterol são purificados pelo fornecedor usando cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa.

1. Pré-requisitos

NOTA: As seguintes soluções devem ser preparadas em água ultrapura (Tipo I) e filtradas com filtros de seringa de 0,22 μm: Tampão Tris-EDTA (TE), compreendendo 10 mM Tris, 1 mM EDTA, a pH ~ 8,0; Tampão TE suplementado com NaCl 2 M; e tampão TE suplementado com NaCl 0,3 M. As soluções-tampão devem ser utilizadas no prazo de 2 semanas após a preparação e conservadas a 4 °C quando não estiverem a ser utilizadas. Além disso, uma solução de 1 vol% de detergente óptico alcalino em água ultrapura será usada para limpar os capilares de vidro.

  1. Preparação de oligonucleotídeos de DNA do estado liofilizado
    1. Centrifugue brevemente (2000 x g por 10-30 s) os tubos de oligonucleotídeos de DNA liofilizado para garantir que os pellets de DNA liofilizado se acumulem no fundo.
      NOTA: A centrifugação é feita à temperatura ambiente (RT) por 10-30 s. A mini centrífuga usada aqui tem como padrão 2000 x g (6000 rpm).
    2. Adicione a quantidade apropriada de tampão TE para reconstituir cada oligonucleotídeo a 100 μM. Vortex completamente para garantir a dissolução completa e, em seguida, gire os tubos para coletar todo o líquido conforme a etapa 1.1.1.
    3. Para cada solução-mãe, medir a absorvância a 260 nm e calcular a concentração final utilizando o coeficiente de extinção da sequência de oligonucleótidos em ensaio.
      NOTA: O coeficiente de extinção para uma determinada sequência de oligonucleotídeos geralmente é encontrado na folha de dados do fornecedor, mas também pode ser calculado com ferramentas on-line usando o modelo de vizinho mais próximo35 ou valores tabulados do coeficiente de extinção de nucleotídeos individuais36.
    4. Conservar os oligonucleótidos reidratados a 4 °C durante curtos períodos de tempo (até 1 semana) ou a -20 °C para armazenamento a longo prazo (até 6 meses).
  2. Limpeza de tubos capilares de vidro
    1. Sonicate em detergente ótico alcalino a 1% para componentes óticos em água desionizada.
      1. Pegue o número necessário de tubos capilares de vidro a serem limpos e coloque-os em um recipiente alto e estreito (por exemplo, um béquer ou um tubo de centrífuga de 15/50 mL) de forma que os capilares não fiquem planos na base do recipiente.
      2. Adicione o detergente ao recipiente, enchendo-o logo acima do nível dos tubos capilares. Certifique-se de que não haja bolhas de ar presas dentro dos tubos capilares - toque para remover, se necessário. Cubra frouxamente o recipiente (por exemplo, em papel alumínio ou usando a tampa do tubo da centrífuga, certificando-se de que não esteja bem fechado).
      3. Defina um banho-maria de sonicação para 40 °C, coloque o recipiente coberto na vertical no banho e sonice por 30 min. Certifique-se de que a folha, se usada, não entre em contato com a água do banho de sonicação.
        NOTA: O banho de sonicação usado neste estudo tem como padrão uma frequência de sonicação de 60 Hz e uma potência de sonicação de 150 W.
        CUIDADO: Nunca adicione ou remova itens de um banho de sonicação durante a corrida; Sempre pause o protocolo primeiro.
      4. Quando a sonicação estiver concluída, desligue o elemento de aquecimento do banho-maria sonicante e, em seguida, enxágue bem os capilares do recipiente com água deionizada ou ultrapura - no mínimo cinco vezes, descartando a água de enxágue a cada vez.
  3. Sonicar em isopropanol ou etanol.
    1. Nos tubos capilares de vidro no recipiente de limpeza, adicione isopropanol ou etanol (mínimo 70%), enchendo até um pouco acima do nível dos tubos capilares. Como na etapa 1.2.1.2, certifique-se de que não haja bolhas de ar presas nos tubos capilares e cubra frouxamente o recipiente.
    2. Coloque o recipiente na vertical no banho de sonicação e sonice por 15-30 min.
      CUIDADO: Isopropanol e etanol são inflamáveis, com pontos de fulgor abaixo de RT. Minimize os volumes de solventes usados durante a limpeza escolhendo um recipiente de tamanho apropriado, certifique-se de que os recipientes estejam frouxamente cobertos e não deixe o banho de sonicação sem vigilância durante este stage.
    3. Quando a sonicação estiver completa, descarte adequadamente o isopropanol ou etanol e seque os capilares sob nitrogênio, manuseando-os com um tecido sem fiapos.

2. Preparação e extração de condensados de estrela C (Figura 2)

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Figura 2: Carregamento de misturas de estrelas C e extração de condensados de tubos capilares de vidro. Em todos os painéis, a mistura C-star foi substituída por uma solução aquosa de calceína 25 mM para ajudar na visibilidade. (A-E) Principais etapas, em ordem, a serem tomadas antes do recozimento, correspondendo às seções 2.1 e 2.2 do protocolo. (F-J) Principais etapas, em ordem, a serem seguidas após o recozimento, correspondendo à seção 2.3 do protocolo. Durante a extração (painéis (I-J)), os condensados de DNA sedimentarão do capilar para o reservatório tampão, desde que o tubo da microcentrífuga seja armazenado verticalmente. Os condensados não serão visíveis a olho nu. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Preparação de misturas C-star para condensados monocomponentes
    NOTA: Os detalhes da sequência para vários projetos de componentes individuais podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1 e em trabalhos anteriores 29,30,32. Os protocolos de recozimento lento definidos nas etapas 2.1.9 e 2.2.2 foram desenvolvidos para garantir o relaxamento das redes de nanoestrelas em morfologias compactas, dadas as propriedades reológicas fortemente dependentes da temperatura das redes de nanoestrelas37.
    1. Os componentes de oligonucleotídeos e tampão variam dependendo do design de estrela C desejado. Prepare uma mistura de 60 μL de condensados de estrela C de componente único na concentração de 5 μM para a estrela C de quatro braços não responsiva, a estrela C responsiva a TMSD ou a estrela C de modelagem de RNA.
    2. Para cada projeto, pipetar os componentes apropriados listados na Tabela Suplementar 2 em um tubo de microcentrífuga separado e misturar bem por pipetagem.
      NOTA: Presume-se que todas as soluções de estoque de oligonucleotídeos estejam na concentração de 100 μM em TE.
    3. Retire todos os 60 μL de solução C-star e pipete cuidadosamente para injetar a mistura no tubo capilar de vidro limpo e seco, conforme mostrado na Figura 2A, tomando cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar.
    4. Usando uma pipeta, injete aproximadamente 9-12 μL de óleo mineral em cada extremidade do tubo capilar, tampando a amostra de forma que não haja interface livre entre a solução C-star e o ar (ver Figura 2B). Em seguida, seque cuidadosamente o tubo capilar com papel de seda para garantir que nenhum óleo esteja presente na parte externa dele (Figura 2C), tomando cuidado para não absorver óleo mineral ou solução C-star do tubo capilar. O resultado final é demonstrado na Figura 2D.
    5. Prepare um pequeno lote de cola epóxi de duas partes para aderir cada extremidade do tubo capilar, com o lado plano para baixo, a uma lamínula de vidro. Certifique-se de que as aberturas do tubo estejam completamente cobertas com cola, formando uma vedação contínua, conforme mostrado na Figura 2E.
    6. Reserve para curar por no mínimo 3 h, mas de preferência durante a noite.
    7. Após ~30 min de cura, inspecione a camada de cola quanto à presença de lacunas na vedação causadas por bolhas de ar. Se estiverem presentes, sele-os com uma pequena quantidade de cola.
    8. Enrole o tubo capilar colado à lamínula em papel alumínio, garantindo que o papel alumínio seja mantido plano na parte inferior da lamínula de vidro. A folha garante um bom contato térmico entre o mesmo e o elemento de aquecimento do termociclador (veja o próximo passo).
    9. Coloque a amostra embrulhada em um termociclador e recoze usando o seguinte protocolo: Mantenha a 95 ° C por 30 min, depois resfrie de 85 ° C a 50 ° C a -0,04 ° C · min-1 e, em seguida, resfrie de 50 ° C a RT a -0,5 ° C · min-1.
      1. Armazene os condensados C-star recozidos a 4 ° C ou RT por longos períodos (meses), desde que o capilar permaneça selado, pois o recozimento térmico esteriliza efetivamente a amostra e desnatura as nucleases. Mantenha o capilar plano durante o armazenamento e manuseio para evitar que os condensados sedimentem em uma extremidade e se agreguem.
  2. Preparação de misturas de estrelas C para condensados binários
    NOTA: Para informar a seleção de populações de estrelas C para sistemas binários, consulte o trabalho de Malouf et al., que descreve as regras de projeto e o comportamento de fase esperado de condensados binários de estrelas C30.
    1. Para preparar condensados binários, combine volumes de 30 μL das misturas C-star descritas na etapa 2.1 acima com um volume total de 60 μL, misture bem, carregue nos capilares e siga as etapas 2.1.4-2.1.8.
    2. Coloque a amostra embrulhada em um termociclador e recoze usando o seguinte protocolo: Mantenha a 95 ° C por 30 min, depois resfrie de 85 ° C a 40 ° C a -0,01 ° C · min-1 e, em seguida, resfrie de 40 ° C a RT a -0,1 ° C · min-1.
  3. Extração de condensados de estrela C de tubos capilares.
    1. Prepare um tubo de microcentrífuga grande (1,5 mL ou 2,0 mL) contendo 60 μL de NaCl 0,3 M em tampão TE.
    2. Desembrulhe a amostra capilar e use uma caneta de diamante para marcar a parte inferior da lamínula em cada extremidade interna da área colada (Figura 2F). Quebre a lamínula nesta região e descarte adequadamente.
    3. Limpe bem os tubos capilares com etanol e seque.
    4. Marque cada extremidade dos tubos capilares com a caneta de riscagem de diamante, primeiro com a parte inferior (Figura 2G), depois virando e marcando os tubos "com o lado direito para cima".
      1. Certifique-se de que as linhas de pontuação não se sobrepõem à interface óleo-água. Devem estar dentro da região aquosa para evitar que o óleo permaneça na amostra extraída.
    5. Retire as extremidades dos tubos capilares (Figura 2H), retendo a parte central do tubo e descartando o restante. Coloque o tubo capilar cortado no tubo de microcentrífuga preparado na etapa 2.3.1, certificando-se de que o fundo do tubo capilar entre em contato com a solução tampão (Figura 2I).
    6. Os condensados sedimentarão do tubo para o reservatório tampão por gravidade; permita que isso ocorra por um mínimo de 10 min (Figura 2J). Remova o tubo capilar cortado e descarte-o adequadamente. Essa abordagem de extração suave limita o risco de agregação de condensado.

3. Transcrição de um aptâmero de RNA a partir de condensados de estrela C de modelagem de RNA

NOTA: Para a produção do aptâmero de RNA de brócolis, é necessária uma solução de difluoro-4-hidroxibenzilideno imidazolidinona (DFHBI) - o pó de DFHBI é primeiro preparado como uma solução estoque a 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO), que é então diluído a 600 μM em água livre de RNase e DNase.

  1. Lavagem de condensados de estrela C de modelagem de RNA
    NOTA: Os condensados de estrela C com modelagem de RNA são lavados três vezes para garantir que os oligonucleotídeos molde não ligados sejam removidos.
    1. Deixe a solução de condensados extraídos repousar durante pelo menos 5 minutos e, em seguida, retire cerca de metade do volume do sobrenadante.
      1. Para um volume de 60 μL de condensados extraídos, remova entre 25-30 μL do sobrenadante.
      2. Pipete a partir do topo do nível do líquido para minimizar o número de condensados removidos durante esta etapa.
    2. Adicione o mesmo volume de NaCl 0,3 M em TE para substituir o sobrenadante removido e misture por pipetagem.
    3. Repita as duas etapas anteriores para um total de três ciclos.
  2. Preparação da mistura de transcrição T7
    NOTA: A mistura de transcrição T7 é preparada usando o kit de transcrição CellScript T7-FlashScribe. A etapa 3.2.2 é uma modificação do protocolo do fabricante, que pode ser encontrada aqui38. Aqui descrevemos a transcrição do aptâmero de RNA de brócolis, que induz fluorescência em DFHBI após a ligação. Para outros aptâmeros iluminados, substitua o volume de DFHBI descrito na etapa 3.2.2 pelo fluorogênio apropriado. Para outras transcrições, remova esse componente completamente.
    1. Preparar uma solução-mãe de 10 mM de DFHBI em DMSO e, em seguida, diluir uma alíquota até obter uma concentração final de 600 μM utilizando água isenta de RNase e DNase.
    2. Descongele os componentes do kit de transcrição em gelo e, em seguida, pipete o seguinte em um tubo de microcentrífuga autoclavado à temperatura ambiente usando pontas de pipeta estéreis: 2 μL de tampão de transcrição 10x T7 (fornecido no kit de transcrição), 1,8 μL de 100 mM ATP, 1,8 μL de 100 mM CTP, 1,8 μL de 100 mM UTP, 2 μL de DTT 100 mM, 2 μL de DFHBI 600 μM, 0,5 μL de inibidor de RNase, 2 μL de solução enzimática T7 (fornecida no kit de transcrição).
    3. Misture suavemente a solução pipetando.
    4. Use a mistura de transcrição para a etapa 3.3 (síntese do transcrito de RNA) imediatamente após a preparação.
  3. Síntese de transcrição de RNA
    1. Em uma câmara adequada para imagens de microscopia, pipetar 3,3 μL dos condensados lavados preparados a partir de estrelas C de modelagem de RNA e adicionar o volume total da mistura de transcrição preparada anteriormente.
    2. Adquirir imagens microscópicas durante 18 h, começando imediatamente após a adição da mistura de transcrição aos condensados.
      NOTA: As configurações de microscopia dependerão do sistema preparado. Certifique-se de que as configurações apropriadas de excitação e emissão sejam usadas para quaisquer fluoróforos na amostra, juntamente com tempos de exposição que não levarão à saturação à medida que a transcrição avança. Como em qualquer lapso de tempo, deve-se encontrar um compromisso entre um laser ou LED alto o suficiente para um bom sinal, ao mesmo tempo em que minimiza o risco de fotobranqueamento. O fotobranqueamento por longos períodos de tempo será minimizado em sistemas baseados em LED em comparação com sistemas baseados em laser. Intervalos de imagem sugeridos: 20 min nas primeiras 2 h e 30 min subsequentes.

Resultados

Após o recozimento, os condensados de estrela C podem ser visualizados diretamente no tubo capilar ou após a extração, para confirmar sua formação. Para todas as variações de projeto de estrela C, deve-se observar condensados esféricos ou poliédricos distintos com aproximadamente 10-50 μm de diâmetro, este último se formando quando ocorre a cristalização28,32. Para condensados de componente único, os condensados devem ser discretos e uniformes na aparência, e podem parecer poliédricos (Figura 3A) ou esféricos (Figura 3B,C), dependendo do projeto de estrela C usado. A morfologia dos condensados binários depende das propriedades das populações de estrelas C usadas, conforme descrito anteriormente30. A Figura 3D mostra condensados binários exibindo separação de fases, observável em imagens de campo claro. A presença de bolhas de ar no tubo capilar também pode interferir na automontagem dos condensados, muitas vezes resultando em agregação próxima à interface de ar (Figura 4A,B). Misturas preparadas incorretamente, como aquelas sem componentes de oligonucleotídeos ou aquelas preparadas com estequiometrias desequilibradas, podem resultar em condensados que não se formam ou formam redes ou agregados conectados não esféricos, como na Figura 4C. Da mesma forma, condensados binários preparados incorretamente podem exibir agregação e redes, e também podem não exibir separação de fase observável, como mostrado na Figura 4D.

Para a transcrição de aptâmeros de luz de RNA, um resultado bem-sucedido será observado monitorando o aumento da fluorescência do fluorogênio ao longo do tempo, por exemplo, por meio de microscopia (Figura 5) ou espectrofotometria.

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Figura 3: Micrografias representativas mostrando condensados de estrela C recozidos. (A) Micrografia de campo claro e inserção mostrando condensados formados a partir de uma estrela C não responsiva com um comprimento de braço de 28 pares de bases. Aqui notamos a morfologia poliédrica que reflete a ordem cristalina das estrelas C menores32. (B) Micrografia de campo brilhante e inserção mostrando condensados formados a partir de uma estrela C responsiva a TMSD, com um comprimento de braço de 50 pares de bases. Esses condensados são amplamente esféricos, embora muitos mostrem uma morfologia mais irregular indicativa de fusão de múltiplos condensados, como é esperado para estrelas C maiores, que tendem a ser mais fluidas32. (C) Micrografia de campo claro e inserção mostrando condensados formados a partir de uma estrela C não responsiva com um comprimento de braço de 35 pares de bases. Esses condensados parecem esféricos, embora os dados de espalhamento de raios-X de baixo ângulo de trabalhos anteriores mostrem que sua microestrutura é cristalina32. (D) Micrografia de campo brilhante e inserção mostrando condensados binários formados a partir de uma combinação das populações de estrelas C também usadas nos painéis (B) e (C). A combinação dessas duas populações leva à formação de condensados com separação de fases distintas, visíveis sem marcação fluorescente. Outras combinações podem não exibir separação de fases, conforme descrito em trabalhos anteriores30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Micrografias mostrando problemas comuns encontrados com condensados preparados incorretamente. (A) Micrografias de campo claro mostrando condensados formados a partir de uma estrela C não responsiva com um comprimento de braço de 28 pares de bases (que se formaram com sucesso na Figura 3A) na presença de uma bolha de ar no tubo capilar. O painel é composto por duas micrografias costuradas na linha tracejada vermelha e mostra a agregação de condensados perto da interface de ar. (B) Micrografia de campo claro mostrando condensados formados a partir de uma estrela C responsiva a TMSD de 50 pares de bases de comprimento de braço (que se formou com sucesso na Figura 3B) na presença de uma bolha de ar no tubo capilar. Aqui, os condensados se fundiram para formar uma rede interconectada contínua devido à natureza mais fluida dos condensados compostos de motivos maiores de estrelas C32. (C) Micrografia de campo brilhante mostrando condensados formados a partir de uma estrela C não responsiva com um comprimento de braço de 35 pares de bases (que se formaram com sucesso na Figura 3C). A morfologia é irregular e angular, indicando um erro de preparo, possivelmente estequiometrias desequilibradas. (D) Micrografia de campo brilhante de condensados binários formados a partir de uma combinação das populações de estrelas C como em Fig. 3D. Esses condensados são altamente conectados, como no painel (C), e também não exibem a separação de fases esperada (ver Figura 3D), indicando um erro em sua preparação. Embora as fontes exatas de erros sejam difíceis de identificar, estequiometrias incorretas ou o uso de sequências incorretas de oligonucleotídeos são causas potenciais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 5: Resultados representativos da transcrição de um molde de DNA incorporado para um aptâmero de RNA. Timelapse mostrando a síntese do aptâmero iluminado de brócolis por meio da transcrição de um molde de DNA embutido em condensados feitos a partir do motivo da estrela C descrito na Figura 1C. O aptâmero se liga ao DFHBI presente na mistura de transcrição, induzindo um aumento na fluorescência ao longo do tempo. Notável aqui é uma mudança na morfologia do condensado ao longo do tempo, que parece formar uma estrutura núcleo-casca. Este fenômeno é provavelmente devido ao inchaço da camada externa do condensado devido a um desequilíbrio transitório da pressão osmótica associado à produção local do aptâmero de RNA. A produção de aptâmeros pode ocorrer preferencialmente nas camadas externas dos condensados devido à tendência relatada da fita molde aptâmero de se acumular nessa região30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Detalhes da sequência para vários projetos de componentes individuais. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 2: Volume de componentes para cada projeto. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O protocolo descrito aqui fornece uma abordagem para a preparação de condensados de um ou dois componentes a partir de nanoestrelas de DNA anfifílico, com variações de design para introduzir diferentes respostas nos condensados. O protocolo fornecido produz condensados em uma solução tampão de NaCl 0,3 M em TE, mas as condições tampão podem ser alteradas modificando adequadamente os volumes listados acima. Trabalhos anteriores estudaram a formação de condensados C-star em 0,2 M NaCl em TE e 0,1 M NaCl em TE e em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 32 . Os condensados C-star são produzidos a uma concentração final de 5 μM, mas isso também pode ser variado modificando adequadamente as concentrações de oligonucleotídeos e/ou volumes adicionados no protocolo acima. Dependendo das variações desejadas, pode ser necessário preparar soluções de reserva de oligonucleótidos em diferentes concentrações e em diferentes tampões em comparação com o protocolo descrito na secção 1, embora os aspectos práticos do protocolo permaneçam os mesmos. O design C-star pode ser prontamente modificado para introduzir uma funcionalidade ou resposta diferente, conforme detalhado em trabalhos anteriores32. As variações de design incluem a introdução de motivos que respondem a mudanças de pH32, íons de potássio31 ou sequências de oligonucleotídeos30,32. Caso sejam desejados novos projetos, é aconselhável primeiro testar a montagem computacionalmente (usando ferramentas como NUPACK39) e, em seguida, testar a formação das nanoestrelas equivalentes não colesterolizadas usando eletroforese em gel de agarose 32,40. A extensão da separação de fases em condensados binários dependerá da combinação de populações de estrelas C usadas, conforme descrito em trabalhos anteriores30. Observamos que os protocolos de recozimento especificados para a formação de condensado exigem escalas de tempo muito mais longas do que as típicas para dobrar pequenas nanoestruturas de DNA semelhantes a estrelas C individuais. O recozimento lento é de fato necessário para permitir o equilíbrio nas escalas de comprimento maiores dos condensados. Para condensados monocomponentes, o protocolo sugerido tem uma duração de 17 h, e para condensados binários, um protocolo de recozimento ainda mais longo (~ 3 dias) é usado para se aproximar do equilíbrio termodinâmico. Descobrimos que esses protocolos produzem resultados reprodutíveis em todas as diferentes populações de estrelas C usadas até o momento, mas se os pesquisadores desejarem melhorar o rendimento da amostra, recomendamos um estudo sistemático em que as taxas de recozimento sejam moduladas para encontrar o protocolo mais curto possível, onde as morfologias desejadas podem ser alcançadas para o sistema em teste. Recomenda-se que a retenção de 30 min a 95 °C não seja modificada, uma vez que esta etapa esteriliza efetivamente a amostra e permite o armazenamento a longo prazo em tubos capilares.

A câmara na qual os condensados em estrela C são produzidos é crucial para sua formação bem-sucedida. A câmara deve ser feita de vidro ou quartzo; O uso de recipientes de plástico como o polipropileno, um material típico para tubos de microcentrífuga, interromperá a automontagem devido às interações hidrofóbicas entre o plástico e as porções de colesterol. A proporção do recipiente de recozimento e a concentração da mistura C-star também afetarão as características dos condensados, particularmente seu tamanho e agregação. Especificamente, se um recipiente "mais alto" for usado, com uma pequena área de superfície na parte inferior em relação à sua altura, os condensados da estrela C sedimentarão na parte inferior com altas densidades superficiais, o que favorecerá a formação de pontos de contato entre os condensados. Se estes ocorrerem no final do processo de recozimento térmico, quando a temperatura é relativamente baixa e os condensados se comportam como líquidos ou sólidos altamente viscosos, os condensados em contato não relaxarão em formas esféricas e, em vez disso, formarão agregados irregulares de configurações parcialmente coalescidas. Ao pipetar a mistura C-star em tubos capilares, deve-se tomar cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar - agregados grandes tendem a se formar na interface ar / água, de modo que os condensados extraídos terão tamanho e morfologia não ideais. A secagem das extremidades dos tubos capilares após a injeção da mistura C-star ou óleo mineral levará a uma melhor adesão. O adesivo selecionado deve ser viscoso o suficiente para revestir completamente as aberturas do tubo capilar sem ser absorvido pelo tubo, inerte ao óleo mineral, compatível com o vidro e estável nas temperaturas de recozimento utilizadas. Descobrimos que o adesivo epóxi Araldite Rapid de duas partes é adequado para nossos propósitos, apesar de ser classificado apenas para temperaturas de 80 °C. Bolhas de ar ou lacunas na cola levarão a capilares imperfeitamente selados, que tendem a vazar durante o recozimento. Após a cura da cola, embrulhar as amostras em papel alumínio tem o duplo benefício de conter vazamentos e melhorar o contato térmico entre a amostra e o termociclador. A folha deve ser mantida o mais lisa e plana possível para garantir que os capilares sejam mantidos nivelados durante o recozimento. Os condensados recozidos nos capilares podem ser armazenados a longo prazo à temperatura ambiente e recozidos, se necessário. As amostras devem ser manuseadas com cuidado - os condensados podem coalescer quando em contato, portanto, os capilares devem ser armazenados planos. Para imagens de microscopia ideais, a lamínula pode ser marcada e removida, deixando os tubos capilares intactos. Os condensados tendem a ter mais de 5 μm de diâmetro, e não observamos movimento browniano significativo durante a imagem29,30.

Recomenda-se preparar vários lotes independentes de condensados C-star para garantir que as possíveis diferenças observadas entre as amostras reflitam as diferenças na composição ou nas condições de recozimento, e não as diferenças causadas por possíveis erros experimentais.

Pequenas partículas de vidro provavelmente serão introduzidas na solução condensada como resultado do processo de extração. Isso pode ser minimizado enxugando cuidadosamente as extremidades cortadas do tubo capilar com uma tira limpa de Parafilm, que é altamente eficaz na coleta de vidro, antes de colocar o tubo capilar cortado no tubo de microcentrífuga contendo a solução tampão. Durante a extração, o número de condensados extraídos pode ser maximizado girando brevemente o tubo de microcentrífuga contendo o tubo capilar cortado, embora isso aumente a probabilidade de os condensados coalescem e formarem morfologias não ideais. Após a extração, os condensados devem ser armazenados em temperaturas de geladeira (normalmente 4 °C) e usados dentro de três dias para evitar possíveis problemas de contaminação biológica e porque os condensados nos tubos de microcentrífuga se agregam e coalescem com o tempo devido às formas tipicamente arredondadas ou pontiagudas desses tubos. A pipetagem muito vigorosa de condensados extraídos deve ser evitada, pois eles podem ser danificados pelo fluxo excessivo de cisalhamento.

Para a transcrição de um aptâmero de RNA, pode ser necessário modificar o volume da mistura de transcrição usada, uma vez que o número e o tamanho dos condensados (e, portanto, a concentração do molde) em cada reação individual não podem ser controlados com precisão. Nos experimentos descritos na seção 3, um excesso de mistura de transcrição é usado em relação à concentração teórica do molde. Recomenda-se que os sobrenadantes das três etapas de lavagem (ponto 3.1) sejam retidos e utilizados para realizar reações de transcrição. Esses experimentos darão uma indicação da quantidade de modelo de aptâmero não ligado presente na solução.

Uma das principais vantagens da plataforma C-star é sua flexibilidade e modularidade. Conforme descrito acima e em trabalhos anteriores, os condensados podem ser projetados para responder a uma variedade de entradas, como deslocamento da fita mediada pelo toehold e transcrição do aptâmero de RNA separadamente ou em sequência. Combinadas com a programabilidade inerente de seus blocos de construção de DNA, as nanoestrelas de DNA anfifílicas fornecem uma solução robusta e versátil para o design e preparação de células sintéticas.

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

LM, LDM e DT reconhecem o apoio do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do Programa de Pesquisa e Inovação Horizonte 2020 (ERC-STG No 851667 - NANOCELL). O LDM reconhece o apoio de uma bolsa de pesquisa da Royal Society para bolsistas de pesquisa (RGF / R1 / 180043) e o apoio de uma bolsa de pesquisa da Royal Society University (UF160152, URF / R / 221009).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 μ m filtros de seringaSigma-AldrichSLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Óculos de cobertura retangulares, Menzel Glä serVWR631-0853
2-PropanolSigma-Aldrich34683
6 L Limpador Ultrassônico com Temporizador Digital e Calor, 230 VACCole-ParmerWZ-08895-11
Araldite Adesivo Rápido 2 Partes Cola EpóxiRSARA-400005
Bio-Rad C1000 termocicladorTubo de
Bio-Rad 2 mL com tampa de travamentoFisher Scientific15338665tubos de microcentrífuga de 2 mL para a extração de condensados C-star
Caneta de riscagem de diamanteRS394-217
Difluoro-4-hidroxibenzilideno imidazolidinona (DFHBI)Sigma-AldrichSML1627
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Eppendorf PCR Clean Incolor Tubos de Centrífuga Safe-LockFisher Scientific0030123301Tubos de microcentrífuga de 0,5 mL para a preparação de misturas C-star
Etanol Absoluto 99,8+%Fisher Scientific1043734170% de etanol é suficiente para fins de limpeza
Misturador de Vórtice Fisherbrand ZX4 IRFisherbrand13284769
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507
Diâmetro dos capilares retangulares ocos 0,40 x 4,00 mm, 50 mm de comprimentoCM Scientific2540-50
Óleo mineralSigma-Aldrich69794
Mini Centrífuga, 230 VPRISM(TM)
NaClEspectrofotômetro Sigma-AldrichS3014
NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-WUsado para medir a absorbância de oligonucleotídeos para cálculos de concentração
OligonucleotídeosTecnologias de DNA IntegradasAs sequências personalizadas de oligonucleotídeos são exclusivas do design C-star necessário.
Inibidor de RNase ScriptGuardCELLSCRIPTInibidor de RNase C-SRI6310K
T7-FlashScribe Kit de transcriçãoCambioC-ASF3507
Tampão Tris-EDTA, solução stock 100xSigma-Aldrich574793
Água destilada sem DNase/RNase UltraPureInvitrogen10977035
VWR Spec-Wipe 3 WipersVWR21914-758
Microcentrífuga da Marca 1851197 Z763128

Referências

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