Artigo de método

Usando organoides intestinais humanos para entender o epitélio do intestino delgado no nível transcricional de uma única célula

1.8K vistas

⸱

DOI:

10.3791/66749

⸱

28 de junho de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Neste artigo

Resumo

O protocolo combina a tecnologia organoide intestinal humana com análise transcriptômica de célula única para fornecer informações significativas sobre a biologia intestinal anteriormente inexplorada.

Resumo

A transcriptômica de célula única revolucionou nossa compreensão da biologia celular do corpo humano. As culturas organoides do intestino delgado humano de última geração fornecem sistemas modelo ex vivo que preenchem a lacuna entre modelos animais e estudos clínicos. A aplicação da transcriptômica de célula única a modelos de organoides intestinais humanos (HIO) está revelando biologia celular, bioquímica e fisiologia do trato gastrointestinal anteriormente não reconhecidas. As plataformas avançadas de transcriptômica de célula única usam particionamento microfluídico e código de barras para gerar bibliotecas de cDNA. Esses cDNAs com código de barras podem ser facilmente sequenciados por plataformas de sequenciamento de última geração e usados por várias ferramentas de visualização para gerar mapas. Aqui, descrevemos métodos para cultivar e diferenciar HIOs do intestino delgado humano em diferentes formatos e procedimentos para isolar células viáveis desses formatos que são adequados para uso em plataformas de perfil transcricional de célula única. Esses protocolos e procedimentos facilitam o uso de HIOs do intestino delgado para obter uma maior compreensão da resposta celular do epitélio intestinal humano no nível transcricional no contexto de uma variedade de ambientes diferentes.

Introdução

O epitélio do intestino delgado possui duas zonas distintas: a cripta que abriga a célula-tronco intestinal (CEI) e a vilosidade, que é composta por células diferenciadas das linhagens secretora e absortiva. Somando-se a essa complexidade está a especificidade regional do epitélio que fornece propriedades funcionais únicas entre as regiões do intestino delgado. Trabalhos pioneiros estabeleceram condições de cultura nas quais tanto a cripta do intestino delgado humano quanto as zonas de vilosidades podem ser geradas ex vivo a partir de tecidos cirúrgicos ou biópsias de tecidos1. Essas culturas estão preenchendo a lacuna entre estudos em animais e ensaios clínicos e estão revelando biologia celular, bioquímica e fisiologia do trato gastrointestinal anteriormente não reconhecidas. Os HIOs são propagados como estruturas esféricas 3D usando um meio com fatores de crescimento que promovem a viabilidade de células-tronco e matrizes de suporte extracelular. Essas condições resultam em um modelo HIO semelhante a uma cripta que consiste principalmente de progenitores e células-tronco. A remoção dos fatores de crescimento promove a diferenciação do ISC (modelo semelhante a vilosidades) e a produção de células epiteliais intestinais maduras (caliciforme, enteroendócrino, tufo, enterócito) em proporções apropriadas, juntamente com proliferação e diferenciação celular, polarização, integridade da barreira, características específicas regionais e respostas fisiológicas apropriadas2. As culturas HIO são geneticamente estáveis e podem ser propagadas indefinidamente em seu estado semelhante a uma cripta. O fácil acesso à superfície apical dessas culturas é proporcionado pelas condições de cultivo que permitem o crescimento em formato monocamada3. Os HIOs também permitem que considerações sobre a variabilidade individual do hospedeiro, como genética, idade, sexo, etnia e estado da doença, sejam incluídas nas análises biológicas. As ferramentas de avaliação analítica e funcional são idênticas às usadas em abordagens centradas em linhagens celulares transformadas e incluem uma variedade de técnicas moleculares, como citometria de fluxo, microscopia, transcriptômica, proteômica e metabolômica.

A transcriptômica de célula única está revolucionando nossa compreensão da biologia e fisiologia do intestino delgado, fornecendo informações sobre as contribuições individuais de cada tipo de célula para um processo biológico. O trabalho pioneiro usando essa tecnologia forneceu uma paisagem dos tipos de células presentes no intestino humano nativo 4,5,6. As plataformas de perfil transcricional de célula única permitem a exploração da paisagem transcricional de células individuais, permitindo que a heterogeneidade celular venha à vanguarda da exploração científica. Em algumas plataformas de perfil transcricional de célula única, o particionamento microfluídico e o código de barras são usados para gerar bibliotecas de cDNA a partir de mRNAs poliadenilados celulares obtidos de até 10.000 células por amostra. Nesta plataforma, gotículas contendo células únicas, oligonucleotídeos com código de barras, reagentes de transcrição reversa e óleo formam uma vesícula de reação que resulta em todos os cDNAs de uma única célula com o mesmo código de barras. Os cDNAs com código de barras podem então ser sequenciados com eficiência usando sequenciamento de próxima geração. Os dados gerados podem ser manipulados por meio de software e ferramentas de visualização, que convertem as sequências com código de barras em mapas de visualização e perfis transcricionais de célula única. As populações de células podem ser identificadas usando bancos de dados publicamente disponíveis do epitélio do intestino delgado humano 4,5,6. Embora muitos estudos tenham utilizado esta plataforma para interrogar organoides intestinais murinos no nível de célula única, a análise das respostas transcricionais de células únicas de HIOs ficou para trás 7,8,9,10,11,12.

Aqui, fornecemos um guia passo a passo para isolar células viáveis de HIOs do intestino delgado para processamento em plataformas de perfil transcricional de célula única (Figura 1). Fornecemos diretrizes de cultura e diferenciação, juntamente com componentes de mídia que foram otimizados para diferenciação epitelial. Descrevemos métodos de recuperação celular para três formatos de cultura diferentes: culturas tridimensionais (3D) e monocamadas em plástico ou em inserções de cultura de células de membrana. Fornecemos dados de agrupamento de amostras obtidos usando software de código aberto para derivar genes diferencialmente expressos em cada cluster.

Protocolo

As linhagens organoides usadas aqui foram obtidas do Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core. Resumidamente, para estabelecer inicialmente as linhas organoides, amostras de tecido doador foram lavadas e digeridas enzimaticamente para liberar as criptas intestinais. As criptas foram embutidas em uma membrana basal e cultivadas em um meio. O Conselho de Revisão Institucional do Baylor College of Medicine aprovou o protocolo do estudo para obter amostras de tecido a partir das quais as linhas organoides foram estabelecidas, e o consentimento informado foi obtido de todos os doadores para estabelecer linhas organoides do tecido doado.

1. Passagem de HIOs 3D para expandir para diferenciação

  1. Remova e descarte o meio de poços de organoides cultivados em placas de 24 poços (ao redor da membrana sólida do embasamento) com uma pipeta P1000. Adicione 300 μL de tripsina-EDTA a 0,05% ao poço e quebre mecanicamente os organoides pipetando com uma pipeta P1000 para cima e para baixo 5x.
  2. Incubar a placa a 37 °C durante 4 min. Adicione 500 μL de meio completo sem fatores de crescimento (meio CMGF) com 10% de FBS em cada poço (Tabela 1). Use uma pipeta P1000 e um meio CMGF pipeta e uma mistura HIO, 10x para frente e para trás no poço. Transfira todo o volume para um tubo de 15 mL. Combine a passagem de vários poços para o mesmo tubo de 15 mL. Não combine mais de 10 poços por tubo.
  3. Centrifugar as células a 4 °C utilizando uma centrífuga de rotor oscilante a 100 x g durante 5 min. Remova todo o meio, mantendo o pellet no fundo do tubo. Mantenha o tubo no gelo.
  4. Calcule a quantidade de membrana basal necessária para o número de HIO revestido e ressuspenda o pellet HIO em 30 μL / poço de membrana basal usando pontas de pipeta P200 frias. Pipete a mistura de membrana basal HIO como uma gota no centro de uma placa de 24 poços usando pontas de pipeta P200 frias.
  5. Transferir a placa para uma incubadora a 37 °C. Deixe a membrana basal solidificar por 5-10 min e, em seguida, adicione 500 μL de meio completo em temperatura ambiente contendo WNT, R-espondina Tabela 1) a cada poço e cultura em uma incubadora a 37 °C. Atualize a cultura com WRNE+Y em dias alternados por 7 dias.
    NOTA: Um HIO saudável terá formato cístico com um epitélio brilhante (Figura 2). As células no meio do cisto não podem ser visualizadas. Um HIO insalubre parecerá opaco e terá um epitélio espesso com um meio sólido. A característica mais importante é a aparência brilhante.

2. Diferenciação HIO: formato 3D

  1. Use um poço de HIOs 3D para 3 poços de HIOs diferenciados 3D 1 semana após o cultivo.
  2. Remova a mídia dos poços. Disperse a membrana basal e os HIOs usando uma pipeta P1000 e adicione 500 μL de CMGF- frio por poço e pipete para cima e para baixo pelo menos 5x. Gire HIOs a 4 ° C usando uma centrífuga de rotor oscilante a 100 x g por 5 min. Remova todo o meio mantendo o pellet no fundo do tubo.
  3. Adicione 30 μL de membrana basal por poço de HIOs em semeamento. Pipete a gota de 30 μL da membrana basal com HIOs em um poço de uma placa de 24 poços. Incubar a 37 °C durante 10 min. Adicione 500 μL de mídia WRNE+Y/Diff (50/50).
  4. Mude o meio para o meio de diferenciação após 24 h por mais 3 dias, atualizando o meio em dias alternados. Prepare 3 poços por amostra para agrupar para reduzir a variabilidade técnica.

3. Diferenciação HIO: formato monocamada

  1. Cubra as inserções de cultura de células de membrana ou alvéolos de uma placa de 96 poços com 100 μL / alvéolo de colágeno placentário humano IV (1 mg / ml em ácido acético 100 mM) diluído em H2O frio (1:30). Incubar a 37 °C durante um mínimo de 1,5 h ou no máximo durante a noite. Para inserção de cultura de células de membrana, adicione H2O estéril no espaço da placa para umidificar a placa; para placas de 96 poços, adicione H2O estéril nos poços não utilizados.
  2. Colete HIOs 3D cultivados em WRNE por 7 dias, removendo o meio e recuperando a membrana basal e as células adicionando 500 μL / poço de EDTA frio 0,5 mM (EDTA 0,5 M diluído 1: 1000 em PBS estéril). Use uma pipeta P1000 para pipetar organoides e solução para cima e para baixo 5x e transfira para um tubo de microcentrífuga de 15 mL. Não agrupe mais de 10 poços de organoides por tubo. Centrifugue durante 5 min a 300 x g num rotor de balde oscilante a 4 °C.
    NOTA: Para preparar 3 poços em uma placa de 96 poços, use 1 poço de HIOs 3D. Para preparar 1 inserção de cultura de células de membrana, use 1 poço de HIOs 3D (a densidade de semeadura de células únicas é de aproximadamente 1-2 x 105 células/poço para placa de 96 poços, 2,5-3 x 105 células/poço para inserção de cultura de células de membrana).
  3. Remova 500 μL de meio, deixando o pellet no fundo do tubo. Dissocie os HIOs adicionando 500 μL de tripsina a 0,05% / EDTA 0,5 mM e incubando por 4-5 min a 37 ° C. Pipete vigorosamente para cima e para baixo por ~ 50x usando um P1000. Evite fazer bolhas pipetando contra a lateral do tubo.
  4. Inative a tripsina adicionando 1 mL de CMGF contendo 10% de FBS. Filtre grandes aglomerados de células não digeridas umedecendo um filtro de células de 40 μm com 1 mL de CMGF contendo 10% de FBS e adicionando as células ao topo do filtro celular. Use a gravidade para permitir que as células passem pelo filtro e descarte o filtro de células que contém aglomerados de células.
  5. Colete as células por centrifugação por 5 min a 400 x g em um rotor de balde oscilante à temperatura ambiente.
  6. Remova o líquido do inserto de cultura de células de membrana revestida de colágeno ou da placa de 96 poços. Ressuspenda o pellet HIO em 100 μL / poço de WRNE contendo 10 μM Y-27632 e, em seguida, pipete para o compartimento superior do inserto de cultura de células de membrana ou para a placa de 96 poços. Para inserção de cultura de células de membrana, adicione 600 μL de WRNE contendo 10 μM Y-27632 no compartimento inferior do poço.
  7. Remova o meio após 24 h da parte superior e inferior da inserção de cultura de células de membrana ou da placa de 96 poços e substitua por meio de diferenciação por 5 dias. Prepare 3 poços por amostra para agrupar para reduzir a variabilidade técnica.

4. Preparação de suspensões unicelulares a partir de HIOs 3D diferenciados para transcriptômica unicelular

  1. Coloque o reagente de digestão enzimática de células a 37 °C em uma incubadora de CO2 para descongelar e aquecer 30 minutos antes do início da digestão 3D HIO. Verifique os HIOs usando um microscópio de campo claro a 10x para garantir a saúde da célula.
  2. Remova o meio dos poços e adicione 500 μL de solução de recuperação de células frias aos poços. Pipete para cima e para baixo algumas vezes para liberar as células da membrana basal usando uma pipeta P1000 e pontas de pipeta padrão. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: O uso de poços replicados garante um número adequado de células e reduz a variação de poço para poço. Não combine poços antes da etapa 4.7 abaixo.
  3. Incube os tubos das células no gelo por 10 min, pipetando para cima e para baixo a cada 5 min. Coletar as células por centrifugação por 3 min a 400 x g a 4 °C.
  4. Remova o líquido do tubo, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. Ressuspenda as células em 500 μL de reagente de digestão celular enzimática pré-aquecido. Pipete para cima e para baixo com um P1000 pelo menos 10x.
  5. Incubar os HIOs durante 30 min a 37 °C numa incubadora de CO2 . A cada 10 min, pipete todo o volume 10x usando uma pipeta P1000 para ajudar a dissociar as células. Evite introduzir bolhas de ar na suspensão da célula.
  6. Pulverize as células por 3 min a 400 x g a 4 °C. Remova o sobrenadante, ressuspenda as células em 1 mL de meio de diferenciação e armazene no gelo.
    NOTA: A partir deste ponto, os HIOs devem ser mantidos sempre no gelo.
  7. Pipete as células para cima e para baixo 50x rapidamente usando um P1000 para garantir que os HIOs sejam dissociados em células únicas. Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar nesta etapa, pois isso causará perda de células.
  8. Filtre todo o volume através de um filtro de ponta de 70 μm usando uma ponta de pipeta P1000. Use um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para coletar o eluído.
    NOTA: A ponta do filtro não ficará entupida se o tempo de digestão for suficiente. Use várias pontas de filtro se o filtro ficar entupido; Não force o volume através do filtro.
  9. Repita a etapa 4.8 com um filtro de ponta de 40 μm. Armazene amostras no gelo.
  10. Conte células individuais viáveis em uma câmara de contagem de células usando a exclusão de azul de tripano, adicionando 5 μL de azul de tripano a 0,4% a 5 μL de suspensão celular. Diluir a amostra conforme necessário para 1000 células/μL. Se a densidade celular for inferior a 1000 células/μL, pellet cells por 2 min a 400 x g a 4 °C, remova o meio original e ressuspenda no meio de cultura celular. Este protocolo normalmente produz 5 x 105-1 x 106 células.
    NOTA: A preparação de uma suspensão de alta qualidade (90% viável e 90% de células únicas) é essencial para dados de célula única de alta qualidade. No entanto, a experiência indica que a viabilidade de até 75% pode ser aceita nos casos em que o tratamento, como infecção ou aplicação de pequenas moléculas, afeta a viabilidade.
  11. Prepare bibliotecas de DNA para plataformas de perfil transcricional de célula única de acordo com os protocolos do fabricante. Processe os dados de acordo com os protocolos de melhores práticas para análise de dados scRNAseq13,14.

5. Preparação de suspensões unicelulares a partir de HIOs diferenciados em inserto de cultura de células de membrana

  1. Coloque o reagente de digestão celular enzimática a 37 °C em uma incubadora de CO2 para descongelar e aquecer 30 minutos antes do início da digestão da inserção de cultura de células de membrana HIO. Divida o reagente de digestão celular enzimática pré-aquecido em alíquotas de 200 μL em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, 1 tubo por inserto de cultura de células de membrana. Manter os tubos na incubadora a 37 °C até estarem prontos a ser utilizados.
  2. Prepare PBS-EDTA adicionando 5 μL de EDTA 0,5 M a 5 mL de PBS. Alíquota de 500 μL de PBS-EDTA em uma placa de 24 poços, 1 poço por inserto de cultura de células de membrana.
  3. Lave as células com PBS-EDTA: transfira as inserções de cultura de células de membrana de alvéolos contendo meios de crescimento para os alvéolos contendo PBS-EDTA. Remover o meio de cultura celular do lado apical e substituí-lo por 100 μL de PBS-EDTA. Tome cuidado para não perturbar a camada celular.
  4. Descarte imediatamente o PBS-EDTA adicionado ao lado apical das inserções de cultura de células de membrana. Remova a inserção de cultura de células de membrana do poço, seque-a tocando suavemente a borda em uma toalha de papel e, em seguida, inverta-a na bancada. Use uma lâmina de bisturi afiada para remover a membrana da pastilha, cortando ao redor da circunferência interna da membrana. Trabalhe rapidamente para evitar o ressecamento.
  5. Use uma pinça para transferir a membrana para o tubo de microcentrífuga pré-aquecido de 1,5 mL preenchido com reagente de digestão enzimática de células e certifique-se de que a membrana esteja completamente submersa. Repita para todas as inserções adicionais de cultura de células de membrana.
    NOTA: Aumentar o volume do reagente de digestão enzimática celular para 500 μL pode ajudar a dissociar monocamadas densas.
  6. Dissociar as células incubando tubos com membranas a 37 °C numa incubadora de CO2 . Misture pipetando suavemente todo o volume 5x com uma pipeta de 200 μL a cada 10 min para um total de 30 min. Evite bolhas e sucção da membrana para preservar a viabilidade.
  7. Transfira uma pequena alíquota de células (1-2 μL) para uma lâmina de vidro a cada 10 minutos para avaliar a dissociação, avaliando qualitativamente a porcentagem de células individuais. Pode levar até 50 minutos com pipetagem adicional para atingir 80% -90% de células únicas, dependendo do tipo de HIO. Raspe suavemente a membrana com uma ponta de pipeta durante as etapas de mistura para estimular a dissociação, principalmente para células difíceis de dissociar, no entanto, a raspagem pode afetar a viabilidade.
  8. Combine 3 poços replicados por condição em um único tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (600 μL no total). Adicione 400 μL de meio de cultura celular (diff) + 10 μM de ROCKi (1 mL de volume total). Misture delicadamente pipetando.
    NOTA: O uso de poços replicados garante um número adequado de células e reduz a variação de poço para poço. Os poços devem ser agrupados nesta etapa.
  9. Filtre todo o volume através de um filtro de ponta de 70 μm usando uma ponta de pipeta de 1 mL. Colete o fluxo em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: A ponta do filtro não ficará entupida se o tempo de digestão for suficiente. Use várias pontas de filtro se o filtro ficar entupido; não force a passagem do volume.
  10. Repita a etapa 5.9 com um filtro de ponta de 40 μm. Armazene amostras no gelo.
  11. Conte células individuais viáveis em uma câmara de contagem de células usando a exclusão de azul de tripano, adicionando 5 μL de azul de tripano a 0,4% a 5 μL de suspensão celular. Dilua a amostra conforme necessário para 1000 células/μL. Se a densidade celular for inferior a 1000 células/μL, gire 2 min a 400 x g a 4 °C para granular as células, remova o meio original e ressuspenda em WRNE+Y na densidade celular desejada. Este protocolo normalmente produz 4 x 105 - 6 x 105 células.
    NOTA: A preparação de suspensão de alta qualidade (90% viável e 90% de células únicas) é essencial para dados de célula única de alta qualidade. No entanto, a experiência indica que a viabilidade de até 75% pode ser aceita nos casos em que o tratamento, como infecção ou aplicação de pequenas moléculas, afeta a viabilidade.
  12. Prepare bibliotecas de DNA para as plataformas de perfil transcricional de célula única de acordo com os protocolos do fabricante. Processe os dados de acordo com os protocolos de melhores práticas para análise de dados scRNAseq13,14.

6. Preparação de suspensões unicelulares a partir de HIOs diferenciados como monocamadas de 96 poços

  1. Coloque o reagente de digestão enzimática celular a 37 °C em uma incubadora de CO2 para descongelar e aquecer 30 minutos antes do início da digestão HIO em monocamada.
  2. Prepare PBS-EDTA adicionando 5 μL de EDTA 0,5 M a 5 mL de PBS. Descarte o meio de cultura de células da placa de 96 poços e substitua-o por 100 μL de PBS-EDTA. Tome cuidado para não perturbar a camada celular.
  3. Dissocie as células: Descarte o PBS-EDTA e adicione 100 μL de reagente de digestão celular enzimática quente a cada poço. Coloque a placa a 37 °C em uma incubadora de CO5% 2 e misture pipetando suavemente todo o volume 5x com uma ponta de pipeta de 200 μL a cada 10 min por 20-30 min. Evite bolhas para preservar a viabilidade.
    NOTA: Aumentar o volume do reagente de digestão celular enzimática para 500 μL pode ajudar na dissociação de monocamadas densas.
  4. Transfira uma pequena alíquota de células (1-2 μL) para uma lâmina de vidro a cada 10 minutos para avaliar a dissociação. Pode levar até 50 minutos para atingir 80% -90% de células únicas, dependendo do tipo de HIO. Raspe suavemente a placa com uma ponta de pipeta durante as etapas de mistura para estimular a dissociação, principalmente para células difíceis de dissociar; no entanto, a raspagem pode afetar a viabilidade.
  5. Combine 3 poços replicados por condição em um único tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (300 μL no total). Adicione 700 μL de meio de cultura celular (diff) + 10 uM ROCKi (1 mL de volume total). Misture delicadamente pipetando.
    NOTA: O uso de poços cultivados replicados garante um número adequado de células e reduz a variação de poço para poço.
  6. Filtre todo o volume através de um filtro de ponta de 70 μm usando uma ponta de pipeta de 1 mL. Colete o fluxo em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: A ponta do filtro não ficará entupida se o tempo de digestão do reagente de digestão enzimática das células for suficiente. Use várias pontas de filtro se o filtro ficar entupido; não force a passagem do volume.
  7. Repita a etapa 6.6 com um filtro de ponta de 40 μm. Armazene amostras no gelo.
  8. Conte células individuais viáveis em uma câmara de contagem de células usando a exclusão de azul de tripano, adicionando 5 μL de azul de tripano a 0,4% a 5 μL de suspensão celular. Diluir conforme necessário para 1000 células/μL. Se a densidade celular for inferior a 1000 células/μL, gire 2 min a 400 x g 4 °C para granular as células, remova o meio original e ressuspenda em meio de cultura celular + ROCKi na densidade celular desejada. Este protocolo normalmente produz 2 x 105 - 6 x 105 células.
    NOTA: A preparação de suspensão de alta qualidade (90% viável e 90% de células únicas) é essencial para dados de célula única de alta qualidade. No entanto, a experiência indica que a viabilidade de até 75% pode ser aceita nos casos em que o tratamento, como infecção ou aplicação de pequenas moléculas, afeta a viabilidade.
  9. Prepare bibliotecas de DNA de acordo com os protocolos do fabricante da plataforma de perfil transcricional de célula única. Processe os dados de acordo com os protocolos de melhores práticas para análise de dados scRNAseq13,14.

Resultados

As suspensões unicelulares foram agrupadas de 2-3 poços de inserção de cultura de células de membrana, monocamada e HIOs 3D para garantir rendimento celular suficiente e reduzir a variação de poço para poço. Bibliotecas de células únicas foram preparadas usando reagentes específicos para a plataforma de perfil transcricional de célula única. e sequenciado com leituras finais emparelhadas em uma plataforma de sequenciamento de última geração, 30.000 leituras/célula. As leituras foram mapeadas, contadas e analisadas usando ferramentas analíticas para genômica de célula única. Células de baixa qualidade com mais de 20% de leitura mitocondrial ou menos de 200 genes contados foram excluídas da análise. Para avaliar a qualidade das células, plotamos o número de genes, UMIs e porcentagem de leituras mitocondriais por célula (Figura 3); células de alta qualidade contêm aproximadamente 3500 genes, 15,000 UMIs e 10% de leituras mitocondriais. Após a filtragem, obtivemos de 4000 a 9500 células individuais, dependendo do formato de crescimento do HIO. O agrupamento não supervisionado e a redução da dimensão UMAP identificaram agrupamentos distintos que representam os tipos de células esperados, incluindo enterócitos absortivos e células secretoras (Figura 4).

figure-results-1
Figura 1: Esboço das etapas do protocolo. Esquemas descrevendo as principais etapas no revestimento de HIOs em diferentes formatos para o fluxo de trabalho de dados de célula única. Esta imagem foi criada usando Biorender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Imagens de campo claro. Os HIOs prontos para processamento foram fotografados usando um microscópio de campo claro com ampliação de 5X. Esquerda, organoides 3D; placa intermediária de 96 poços; certo, transwell. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Controle de qualidade dos dados. Exemplo de métricas de células individuais analisadas isoladas de HIOs jejunais cultivadas como monocamadas em placas de 96 poços. Os gráficos de violino mostram o número de genes (nFeature_RNA), UMIs (nCount_RNA) e a porcentagem de leituras mitocondriais (percent.mt) por célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: UMAPs de células individuais analisadas. (A) Um total de 9952 células únicas foram isoladas de HIOs jejunais diferenciados cultivados em placas de 96 poços. (B) Um total de 5623 células únicas foram isoladas de HIOs jejunais diferenciados cultivados em inserções de cultura de células de membrana. (C) Um total de 4402 células únicas foram isoladas de HIOs 3D ileais diferenciados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

WRNE Meio de CrescimentoMeio de diferenciação
ComponenteVolumeConcentração FinalMeio WRNE sem meio condicionado L-WRN, Nicotinamida e SB202190
*Y-27632 (5 mM) opcional200 μL10 μM
A 83-01 (500 μM)100 μL500 nM
DMEM/F12 avançado45 mL
B272 mL
EGF (50 μg/mL)100 μL50 ng/mL
Gastrina (10 μM)100 μL10 nM
GlutaMax (100X)1 mL
HEPES 1 M1 mL
L-WRN Con- Mídia50 mL~50%
N21 mL
N-acetilcisteína (500 mM)100 μL500 μM
Nicotinamida 1 M1 mL10 mM
SB202190 (10 mM)100 μL10 μM
Total Volume100 mL
CMGF- Médio
DMEM/F12 avançado500 mL
Glutamamax5 ml100X
1 M Hepes5 ml

Tabela 1: Composição de vários meios utilizados.

Discussão

Usando plataformas genômicas de célula única, sistemas biológicos complexos, como culturas HIO derivadas de tecidos que modelam o epitélio intestinal, podem ser divididos para produzir contribuições celulares individuais para a resposta biológica geral 4,5,6. A heterogeneidade celular e as populações de células raras também podem ser identificadas e interrogadas. A entrada celular precisa ser otimizada para maximizar a saída usando plataformas baseadas em transcriptômica de célula única. Aqui, descrevemos protocolos que produzirão suspensões de célula única altamente viáveis e de boa qualidade que aumentarão a probabilidade de obter dados transcriptômicos de alta qualidade a jusante. A familiaridade com o protocolo é de extrema importância, e recomenda-se que várias execuções práticas sejam realizadas antes de prosseguir com a preparação da biblioteca. A obtenção reprodutível de suspensões viáveis de células únicas é sugerida antes de usar as células para preparação da biblioteca. A rapidez com que o protocolo é implementado é de extrema importância, pois a velocidade é diretamente proporcional aos resultados da viabilidade. Com base nisso, é aconselhável limitar o número de amostras manuseadas ao mesmo tempo. Recomenda-se a interface com a entidade que preparará as bibliotecas antes de iniciar esses protocolos para obter assistência na solução de problemas.

A viabilidade do HIO influencia diretamente a biblioteca de DNA enviada para sequenciamento. A viabilidade celular do HIO depende de várias etapas na preparação da suspensão de célula única, incluindo dissociação, centrifugação, tampões, pipetagem e precisão de contagem. O objetivo de preparar os HIOs para a plataforma é equilibrar a manutenção da viabilidade celular com a qualidade da amostra. Fundamental para a obtenção de dados de alta qualidade é a minimização de agregados celulares, células mortas, ácidos nucléicos não celulares e inibidores bioquímicos da transcrição reversa. As células moribundas aumentam o ruído de ácido nucleico e contribuem para a aglomeração celular, levando a falhas de dados e plataformas 7,8,9,10,11,12. A filtragem com um tamanho de filtro apropriado pode ajudar a remover grandes agregações e melhorar a qualidade dos dados.

Vários fatores precisam ser considerados para minimizar a morte de células HIO ao preparar suspensões de células únicas. É necessário obter pelo menos 80% de células viáveis, e >90% de viabilidade é ainda mais desejável. Amostras com alto número de células não viáveis podem ser melhoradas usando estratégias para remover células mortas, como microesferas baseadas em colunas, embora exijam mais células iniciais e maiores volumes de amostra devido à perda durante o manuseio. Os HIOs são particularmente sensíveis a tampões e sofrerão morte celular se deixados por muito tempo em RT em certos tampões. Os meios organoides resultam na menor quantidade de perda celular e formação de agregados. A pipetagem também pode afetar a viabilidade do HIO durante a dissociação. As pontas de furo regulares podem cisalhar organoides, ajudando a se dissociar em suspensões de célula única; no entanto, pipetar muito rapidamente com uma ponta de furo regular pode causar danos às células HIO devido às forças de cisalhamento. A pipetagem lenta com pontas de furo largo minimiza o estresse nas células HIO e melhora muito o número de células viáveis a jusante. Centrifugação, lavagem e ressuspensão são outros fatores que podem influenciar a qualidade das suspensões de células únicas HIO. A centrifugação com balde oscilante resulta em peletização mais suave das células HIO, resultando em menor número de células mortas, minimizando a perda de células. Finalmente, a precisão da contagem para determinar a concentração é essencial para garantir que o número máximo de células chegue à plataforma para síntese da biblioteca. A atenção a esses detalhes resultará na minimização do estresse nas células HIO durante o processo de isolamento e garantirá a maior probabilidade de retorno de dados após o processamento.

Embora a transcriptômica de célula única seja uma ferramenta poderosa para dissecar perfis biológicos e respostas no nível de célula única 4,5,6, existem várias limitações que precisam ser consideradas ao aplicar a tecnologia para analisar culturas organoides intestinais humanas. Primeiro, pode haver variação transcricional significativa devido à variabilidade técnica introduzida durante a preparação e sequenciamento da biblioteca ou devido a efeitos de lote resultantes da preparação da amostra. Além disso, o sequenciamento pode resultar em viés de cobertura onde há profundidade de sequenciamento desigual entre genes ou células. Isso causa desafios ao detectar genes pouco expressos ou identificar populações de células raras. Em segundo lugar, a identificação dos tipos celulares pode ser difícil devido à heterogeneidade celular e transcricional das culturas organoides e a um perfil celular menos diferenciado quando comparado ao epitélio intestinal nativo. O acoplamento de respostas transcricionais a fenótipos funcionais também é um desafio e requer validação adicional usando outras abordagens ou ensaios. Em terceiro lugar, essa abordagem não inclui a consideração do contexto espacial ou da dinâmica temporal das células. O procedimento de dissociação remove a capacidade de inferir interações célula-célula dos dados transcricionais. Ele fornece apenas um único instantâneo no tempo do estado celular, em vez de um continuum biológico. Finalmente, as abordagens transcricionais de célula única podem ser caras e exigir ferramentas computacionais especializadas e experiência em bioinformática. No entanto, essa abordagem ainda continua sendo uma ferramenta dominante de última geração para entender a heterogeneidade celular e identificar novos tipos de células.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores reconhecem as bolsas U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 e NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
[Leu15]-Gastrina ISigma-AldrichG914510 nM
0,05% Tripsina-EDTAInvitrogen25300054
0,4% Azul de tripanoMillipore-SigmaT8154
0,5 M EDTACorning46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-Corning21-040-CM
24 mm TranswellCostar3412
Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon de 24 poçosThermo Scientific142475
40 µ filtro de células mFalcon352340
40 µ Filtro de ponta Flowmi SPBel-Art LabwareH13680-0040
70 µ m Filtro de ponta FlowmiSP Bel-Art LabwareH13680-0070
placa de 96 poçosCorning3595
A-83-01Tocris2939500 nM
AccutaseStemCell Technologies7920
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
B27 suplementoInvitrogen17504-0441X
Cromo Next GEM Célula Única 3' GEM, Biblioteca & Kit de Contas de Gel v3.110x GenomicsPN-1000128
Colágeno IVSigma-AldrichC5533-5MG33 µ g/mL
Corning Cell Recovery Solution VWR354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 mM
HEPES 1MInvitrogen15630-08010 mM
L-WRN mídia condicionadaATCCCRL-3276
Matrigel, GFR, sem fenolCamundongo 356231
recombinante EGFInvitrogenPMG804350 ng/mL
N2 suplementoInvitrogen17502-0481X
N-AcetilcisteínaSigma-AldrichA9165-5G500 µ M
NicotinamidaSigma-AldrichN063610 mM
SB202190Sigma-AldrichS706710 µ M
TranswellCorning3413
Y27632Tecnologias de Células-Tronco7230810 µ O
Corning

Referências

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Blutt, S. E., et al. Gastrointestinal microphysiological systems. Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).
  3. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  4. Elmentaite, R., et al. Cells of the human intestinal tract mapped across space and time. Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).
  5. Hickey, J. W., et al. Organization of the human intestine at single-cell resolution. Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).
  6. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  7. Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).
  8. Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).
  9. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).
  10. Beumer, J., et al. BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states. Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).
  11. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).
  12. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).
  13. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  14. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

mica de C lula nicaCultura de OrganoidesDissocia o CelularPerfil TranscricionalParticionamento Microflu dicoSequenciamento de Nova Gera oIdentifica o de Tipos CelularesMicroscopia de Campo Claro

Artigos relacionados