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Quantificação da morte celular induzida por citocinas em organoides colônicos humanos usando microscopia de fluorescência ao vivo

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DOI:

10.3791/66759

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2 de agosto de 2024

 , 
1APC Microbiome Ireland, University College Cork, 2School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método simples e econômico para investigar e quantificar a morte celular em organoides colônicos humanos em resposta a perturbações citotóxicas, como citocinas. A abordagem emprega um corante de morte celular fluorescente (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), microscopia de fluorescência ao vivo e software de análise de imagem de código aberto para quantificar as respostas de um único organoide a estímulos citotóxicos.

Resumo

A morte de células epiteliais intestinais (CEI) é aumentada em pacientes com doenças inflamatórias intestinais (DII), como colite ulcerativa () e doença de Crohn (DC). Isso pode contribuir para defeitos na função da barreira intestinal, exacerbação da inflamação e imunopatogênese da doença. As citocinas e os ligantes do receptor de morte são parcialmente responsáveis por esse aumento na morte do IEC. As citocinas relevantes para DII, como TNF-α e IFN-γ, são citotóxicas para IECs de forma independente e combinada. Este protocolo descreve um ensaio simples e prático para quantificar a citotoxicidade induzida por citocinas em organoides colônicos derivados de pacientes com DC usando um corante de morte celular fluorescente (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), microscopia de fluorescência ao vivo e software de análise de imagem de código aberto. Também demonstramos como usar o modelo matemático de independência de Bliss para calcular um coeficiente de interação perturbagênica (CPI) com base na citotoxicidade organoide. O CPI pode ser usado para determinar se as interações entre combinações de citocinas ou outros tipos de perturbações são antagônicas, aditivas ou sinérgicas. Este protocolo pode ser implementado para investigar a atividade citotóxica de citocinas e outros perturbagênicos usando organoides colônicos derivados de pacientes.

Introdução

O epitélio intestinal cria uma barreira física semipermeável entre o conteúdo do lúmen intestinal e os tecidos subjacentes. Para manter essa barreira de forma eficaz, as células epiteliais intestinais (IECs) sofrem uma renovação celular extremamente alta, com um ciclo contínuo de morte e regeneração celular. No entanto, durante distúrbios inflamatórios, como a doença inflamatória intestinal (DII), ocorrem níveis mais elevados de morte celular aberrante1. Isso pode promover uma quebra na função de barreira e ativação do sistema imunológico, desencadeando mais inflamação. Na doença de Crohn (DC), uma forma de DII, foi demonstrado que a sinalização de citocinas contribui para o aumento dos níveis de morte por IEC2. Ao estudar como a sinalização de citocinas induz a morte celular de IECs, espera-se que tratamentos aprimorados possam ser desenvolvidos para pacientes com DII e outros distúrbios inflamatórios intestinais1.

Na pesquisa de biologia e descoberta de alvos de drogas, a sinergia é geralmente entendida como ocorrendo quando um sistema biológico tratado com combinações de estímulos individuais mostra uma resposta à combinação que é maior do que os efeitos aditivos combinados dos estímulos únicos sozinhos. As interações sinérgicas entre citocinas foram bem documentadas na condução de respostas antivirais inatas3. As citocinas também são conhecidas por induzir a morte celular sinergicamente, inclusive em IECs4. No entanto, o papel que a sinalização sinérgica de citocinas citotóxicas desempenha em distúrbios inflamatórios intestinais, como a DII, é pouco estudado.

Os organoides intestinais humanos são microtecidos 3D produzidos in vitro que são gerados a partir de células-tronco epiteliais intestinais. Os organoides intestinais podem ser cultivados a partir de biópsias da mucosa intestinal obtidas de pacientes com DII e retêm muitas características da doença 5,6. Os organoides têm se mostrado um sistema modelo ideal para estudar a citotoxicidade de citocinas no contexto da inflamação intestinal 7,8. Anteriormente, nosso grupo caracterizou os efeitos sinérgicos de morte das citocinas relevantes para DII IFN-γ e TNF-α em organoides colônicos derivados de pacientes com DC (colonoides) 9 , 10 . No entanto, os mecanismos exatos envolvidos na mediação dessa forma de morte celular sinérgica permanecem indefinidos. Existem também potencialmente muitas outras interações citotóxicas não caracterizadas de citocinas que são relevantes para distúrbios inflamatórios intestinais.

Vários protocolos estão disponíveis para estudar a morte celular em organoides intestinais 10,11,12,13; no entanto, cada um deles tem desvantagens. Algumas dessas técnicas medem apenas a viabilidade celular e não medem a morte celular diretamente, são incapazes de avaliar as respostas de um único organoide ou requerem equipamentos caros e protocolos complexos. Metodologias robustas e diretas são necessárias para quantificar a morte celular organoide e as interações perturbagênicas em organoides intestinais. O protocolo que apresentamos é uma abordagem simples e barata para medir as respostas de um único organoide a citocinas citotóxicas, mas pode ser usado para qualquer tipo de estímulo ou perturbação. Também demonstramos como usar o modelo de sinergia de independência de Bliss para calcular um coeficiente de interação perturbagênica (CPI) que descreve as interações citotóxicas de citocinas.

Protocolo

Biópsias da mucosa colônica foram coletadas de pacientes com DC submetidos a colonoscopia de rotina como parte do tratamento padrão. A aprovação ética para o uso de amostras de tecido de pacientes e a geração de linhagens organoides colônicas a partir dessas amostras foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa Clínica dos Hospitais Universitários de Cork (CREC). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes de acordo com a Declaração de Helsinque. Todo o trabalho de cultura de tecidos com biópsias de pacientes e colonoides deve ser realizado dentro de um gabinete de biossegurança seguindo os protocolos de segurança BSL2. Certifique-se de que todo o desgaste do plástico seja estéril antes de usar. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes, instrumentos e software usados neste protocolo.

Os protocolos que nosso grupo usa para isolamento de criptas e cultura de organoides foram adaptados de métodos estabelecidos 14,15,16 e foram publicados anteriormente 9,10,17. Para o protocolo a seguir, os colonoides foram cultivados usando meios de proliferação organoide (Tabela 1). Os colonoides cultivados usando meios de proliferação organoide são indiferenciados e enriquecidos para células-tronco colônicas. O principal componente do meio de proliferação organoide é o meio condicionado com 50% de L-WRN, que contém os fatores de crescimento de nicho de células-tronco intestinais Wnt-3A (W), R-spondin 3 (R) e Noggin (N)15. O meio de proliferação organoide é preparado pela combinação de meios condicionados com L-WRN e meios sem soro 1:1, seguidos de suplementação com nicotinamida e inibidores químicos (Tabela 1).

1. Isolamento de criptas colônicas e cultura de colonóides

  1. Pré-incubar uma placa de microtitulação de 48 poços a 37 °C, 5% de CO2 por um mínimo de 72 h antes de semear com criptas.
    NOTA: A pré-incubação da placa acelera a polimerização do extrato da membrana basal (BME) durante a semeadura.
  2. Descongelar o BME em gelo a 4 °C na noite anterior ao isolamento das criptas.
  3. Colete as biópsias colônicas em um tubo de coleta de amostras contendo 15 mL de meio de coleta de biópsia (Tabela 1) e armazene a 4 ° C até que estejam prontas para processamento.
  4. Remova cuidadosamente o máximo possível de meio de coleta de biópsia usando uma pipeta. Lave as biópsias adicionando 15 mL de DPBS gelada suplementada com 2,5 μg/mL de anfotericina B e 100 μg/mL de gentamicina ao tubo de amostra. Agite o sample tubo vigorosamente para dissociar qualquer muco ou detritos das biópsias. Deixe as biópsias assentarem por gravidade e remova cuidadosamente o máximo de DPBS possível usando uma pipeta.
    1. Repita o procedimento de lavagem da etapa 1.4 duas vezes (2x).
  5. Adicione 10 mL de reagente de dissociação de células livres de enzimas suplementado com 2,5 μg/mL de anfotericina B e 200 μg/mL de gentamicina ao tubo de amostra e incube por 15 min em temperatura ambiente com balanço a 30 rpm.
  6. Após a incubação, agite vigorosamente o tubo de amostra de um lado para o outro com a mão para liberar as criptas colônicas. Inspecione o tubo usando um microscópio de luz de baixa potência e procure as criptas liberadas e fragmentos de cripta em suspensão. Se não estiver visível, agite o tubo e verifique novamente; Repita até que as criptas sejam vistas em suspensão.
  7. Conecte um filtro de células de 70 μm a um tubo de 50 mL e filtre a suspensão da cripta através do filtro. Adicione 10 mL de meio de lavagem organoide gelado (Tabela 1) ao tubo de amostra vazio, remova o meio e passe-o pelo filtro de células.
  8. Transferir as criptas filtradas para dois tubos de 15 ml (10 ml por tubo) e centrifugar a 4 °C durante 5 min a 150 × g.
  9. Remova o sobrenadante cuidadosamente de cada tubo de 15 mL, ressuspenda os grânulos de cripta em 500 μL de meio de lavagem organoide gelado, transfira a solução de cripta de ambos os tubos de 15 mL para um único tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 4 ° C por 3 min a 400 × g.
  10. Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo de microcentrífuga e ressuspenda o pellet de cripta em 70 μL de BME (20 μL por poço e 10 μL de volume morto extra).
  11. Usando a placa pré-incubada de 48 poços (etapa 1.1), semeie 20 μL de suspensão de BME/cripta no centro de cada poço (1 cúpula de BME por poço). Inverter a placa de forma suave e constante e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 20 min.
    NOTA: A inversão da placa evita que as células adiram à superfície plástica do poço e garante sua distribuição dentro do BME.
  12. Remova a placa da incubadora. Certifique-se de que o BME esteja totalmente polimerizado e, em seguida, cubra as cúpulas com 350 μL de meio de proliferação organoide pré-aquecido suplementado com 100 μg/mL de um reagente antimicrobiano de ampla faixa. Incubar a placa a 37 °C, 5% CO2.
    NOTA: O reagente antimicrobiano de ampla gama é para evitar a contaminação por micróbios da mucosa associados às biópsias do cólon. Só é necessário para a primeira semana de cultura após o isolamento da cripta.
  13. Troque o meio 2-3x em uma semana usando meios de proliferação organoide pré-aquecidos, complementando com o reagente antimicrobiano de ampla gama para a primeira semana de cultura; Após este período, remova o reagente.
  14. Assim que a cultura do colonóide estiver totalmente estabelecida (1-2 semanas após o isolamento), dissocie os colonóides usando o reagente de dissociação enzimática suplementado com 10 μM do inibidor ROCK-I/II Y-27632 (consulte a seção 2 para obter detalhes completos sobre a dissociação do colonóide).
    NOTA: Para as duas primeiras passagens (P0-1, P1-2), os colonóides devem ser expandidos usando uma proporção de 1:1/2; após P2, os colonóides podem ser passados usando uma proporção de 1:3/4.
  15. Semeie e mantenha os colonoides seguindo as etapas 1.11-1.13 (não suplemente os meios de proliferação organoide com o reagente antimicrobiano de ampla gama).

2. Preparação de colonóides para ensaio de morte celular

NOTA: O protocolo de ensaio de morte celular leva 4 dias para ser concluído (Figura 1A).

  1. Expanda os colonoides usando um formato de placa de 48 poços, semeando 20 μL de BME/suspensão de cripta por poço, incubando a 37 °C, 5% de CO2 e trocando o meio 2-3x por semana (350 μL por poço).
  2. Passe os colonoides aproximadamente 1 semana antes da colheita para o ensaio de morte celular. Antes de colher os colonoides, certifique-se de que eles sejam propagados a uma alta densidade (Figura 1Bi), que tenham aproximadamente 25-50 μm de diâmetro e estejam proliferando ativamente.
    NOTA: Usamos colonóides para este ensaio da passagem 3 à passagem 14 com resultados consistentes. No entanto, foi demonstrado que a resposta transcricional dos colonoides às citocinas pode mudar dependendo da duração da cultura18. Com base nisso, recomendamos não usar colonóides para este ensaio após a passagem 15.
  3. Pré-incubar placas de microtitulação de 96 poços a 37 °C, 5% de CO2 por um mínimo de 72 h antes da semeadura com células colonoides.
  4. Descongelar o BME em gelo a 4 °C na noite anterior ao início da experiência.
  5. Preparar um volume suficiente do reagente de dissociação enzimática (500 μL por alvéolo de colonóides) suplementando com 10 μM do inibidor ROCK-I/II Y-27632. Remova suavemente o meio dos poços contendo colonóides; pipeta da borda do poço para evitar danificar a cúpula do colonóide. Adicione 300 μL de reagente de dissociação enzimática a cada poço.
    1. Para cada poço, separe a cúpula do colonóide raspando a superfície do poço com a ponta de uma pipeta P1000 e pipetando a suspensão da célula para cima e para baixo; Tente evitar gerar bolhas de ar. Recolha a suspensão celular num tubo de 15 ml.
      NOTA: Este tubo de 15 mL será usado para coletar colonóides de 10 poços da placa de 48 poços.
    2. Lave o mesmo poço com mais 200 μL do reagente de dissociação enzimática para garantir que todo o material colonóide seja coletado e transferido para o mesmo tubo de 15 mL. Repita este processo para cada poço de colonóides expandidos que estão sendo colhidos e colete-os no mesmo tubo único de 15 mL.
      NOTA: Para uma dissociação eficiente, um máximo de 10 poços de colonóides devem ser coletados por tubo. Se estiver coletando >10 poços, divida os colonoides coletados igualmente em vários tubos de 15 mL.
  6. Incubar o tubo de 15 ml com os colonoides recolhidos do passo 2.5.2 em banho-maria a 37 °C durante 5 min. Após a incubação, centrifugue o tubo por 3 min a 400 × g. Remova suavemente o sobrenadante, deixando aproximadamente 1,2 mL para trás no tubo.
    NOTA: A próxima etapa requer a dissociação física dos colonóides usando pipetagem rápida. Para que isso seja eficaz, você deve ter um pequeno volume de suspensão celular no tubo - os 1,2 mL restantes no tubo de 15 mL são suficientes para esse fim.
  7. Ressuspenda o sedimento do colonóide nos 1,2 ml restantes do reagente de dissociação enzimática. Usando uma pipeta P1000 ajustada para 1.000 μL, coloque a ponta da pipeta na suspensão, segurando-a logo acima da parte inferior do tubo de 15 mL e, em seguida, pipete rapidamente a suspensão para dentro e para fora da ponta. Para pipetar rapidamente, pressione rapidamente o botão do êmbolo até a primeira parada, solte o botão até que esteja aproximadamente na metade do caminho para a posição superior e repita. Pipetar rapidamente durante cerca de 10 s (30-40 depressões), depois voltar a suspender totalmente a suspensão e repetir a pipetagem. Execute 2-3 rodadas de pipetagem rápida.
  8. Verifique a amostra ao microscópio para confirmar que não há colonóides inteiros e que a maioria dos fragmentos de colonóides tem aproximadamente 30-40 μm de tamanho (Figura 1Bii).
  9. Se a amostra necessitar de mais dissociação, incubar em banho-maria a 37 °C durante mais 3 minutos, repetir a técnica de pipetagem no passo 2.7 e verificar a amostra ao microscópio. Repita esse processo até que a maioria dos fragmentos de colonóides tenha o tamanho ideal.
    NOTA: Tenha cuidado para não dissociar muito os colonoides, pois isso resultará em morte celular excessiva, baixa eficiência de revestimento e colonóides subdimensionados.
  10. Adicione 10 mL de meio de lavagem organoide gelado (Tabela 1) ao tubo de 15 mL. Centrifugue o tubo por 3 min a 400 × g, remova o sobrenadante, ressuspenda em 1 mL de meio de lavagem organoide gelado e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (conhecido como tubo de fragmento de colonoide).
  11. Misturar o conteúdo do tubo de fragmentos de colonóides pipetando e colher uma amostra de 50 μl; transfira esta amostra de 50 μL para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (referido como tubo de contagem de células). Armazene o tubo de fragmento de colonóide no gelo a partir deste ponto até a conclusão da etapa 2.15.
  12. Centrifugue o tubo de contagem de células por 3 min a 400 × g, remova o sobrenadante e ressuspenda em 500 μL de reagente de dissociação enzimática suplementado com 10 μM do inibidor ROCK-I / II Y-27632.
  13. Incubar o tubo de contagem de células individuais no banho-maria a 37 °C durante 5 min. Usando uma pipeta P1000 ajustada para 400 μL, pipetar a amostra conforme descrito na etapa 2.7 e verificar a amostra ao microscópio para garantir que haja uma suspensão de célula única. Caso contrário, repita esse processo até que os colonóides estejam totalmente dissociados em uma suspensão unicelular.
  14. Adicione 1 mL de Organoid Wash Media ao tubo de contagem de células únicas, centrifugue por 3 min a 400 × g e remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda as células em 50 μL de Organoid Wash Media e, em seguida, adicione 50 μL de azul de tripano.
  15. Conte as células usando um hemocitômetro. Calcule o número de células na amostra de 50 μL e use-o para calcular a concentração de células no tubo de fragmento do colonóide.
  16. Calcule o volume de suspensão celular necessário para o experimento onde 0,5 × 104 células colonóides serão semeadas por poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. Adicione aproximadamente 15% a mais a esse volume calculado para contabilizar o volume morto. Transfira este volume total do tubo de fragmento do colonóide (etapa 2.11) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    1. Centrifugue o novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo fragmentos de colonóides por 3 min a 400 × g, remova o sobrenadante e ressuspenda em BME (use 10 μL de BME por 0,5 × 104 células).
      NOTA: Devido às características físicas do BME (alta viscosidade, polimerização dependente da temperatura), uma quantidade significativa de material pode ser perdida por pipetagem (volume morto).
  17. Coloque o tubo ou reservatório contendo a suspensão de colonóide/BME em gelo em um recipiente estéril dentro do gabinete de biossegurança.
    NOTA: Manter as células no gelo durante a semeadura evita que o substrato celular polimerize prematuramente.
  18. Usando uma placa de microtitulação pré-incubada de 96 poços (da etapa 2.3), pipete reversa 10 μL da solução de colonóide/BME por poço. Certifique-se de posicionar a ponta logo acima da superfície do poço e pipetar no centro para evitar bater na parede do poço. Misture a suspensão de colonóide / BME regularmente para evitar a semeadura irregular.
    NOTA: Não semeie colonóides nos poços da borda externa da placa de microtitulação.
    1. Para reverter a pipeta:
      1. Ajuste a pipeta e pressione o botão do êmbolo após a primeira parada até a segunda parada.
      2. Mantendo esta posição, mergulhe a ponta na suspensão colonóide/BME e solte lentamente o êmbolo para cima.
      3. Dispense a suspensão pressionando o botão do êmbolo suave e firmemente até o primeiro batente. Se semear mais poços, mantenha essa posição e repita as etapas 2.18.1.2-2.18.1.3.
      4. Uma vez terminado, expulse a pequena quantidade de suspensão restante pressionando o botão do êmbolo até a segunda parada.
        NOTA: Recomendamos o uso da técnica de pipetagem reversa devido à alta viscosidade do BME.
  19. Inverter a placa de forma suave e constante e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 20 min.
  20. Remova a placa da incubadora. Certifique-se de que o BME esteja totalmente polimerizado e, em seguida, cubra as cúpulas com 200 μL de meio de proliferação organoide pré-aquecido. Se estiver usando uma placa de microtitulação de 96 poços com um fosso ao redor (que reduz a evaporação), encha cada reservatório com 2 mL de meio de lavagem organoide.
  21. Incubar os colonoides a 37 °C, 5% de CO2 durante 3 dias e inspecionar microscopicamente uma vez por dia para garantir que os colonoides recuperaram e estão a proliferar.

3. Tratamentos colonóides para ensaio de morte celular

  1. Prepare uma solução de 2,5 μM de corante de morte celular fluorescente (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) e solução de DMSO adicionando corante de morte celular fluorescente ou DMSO ao meio de proliferação organoide pré-aquecido (Tabela 2).
    NOTA: Proteja o corante de morte celular fluorescente e a solução diluída da luz. A mancha de ácido nucleico verde SYTOX é solubilizada em DMSO; a solução de DMSO é usada para preparar a condição Sem Corante para controlar os efeitos do solvente.
  2. Use a solução de 2,5 μM de corante de morte celular fluorescente e solução de DMSO da etapa 3.1 para preparar os tratamentos conforme mostrado na Tabela 2.
  3. Remova suavemente o meio da placa de microtitulação de 96 poços semeada com colonóides, inclinando a placa e pipetando a partir da borda dos poços; em seguida, adicione 200 μL de meio de tratamento por poço. Certifique-se de ter poços de controle PBS/BSA extras para a(s) condição(ões) de toxicidade máxima (consulte a Tabela 2 para o mapa da placa).
  4. Incubar os colonoides a 37 °C, 5% de CO2 para os pontos de tempo de tratamento necessários até que estejam prontos para a imagem.
  5. Pelo menos 2 h antes da aquisição de imagens, prepare uma solução a 10% v/v de Triton-X 100 em água estéril para cultura de células e adicione 22 μL de Triton-X 100 a 10% diretamente ao meio dos poços de controle para a(s) condição(ões) de toxicidade máxima até uma concentração final de 1% v/v 1 h antes da imagem.
    NOTA: O uso de uma solução a 10% reduz os erros de pipetagem que podem ocorrer devido à alta viscosidade do surfactante.

4. Aquisição de imagem

  1. Remova a placa de microtitulação de 96 poços semeada com colonóides da incubadora e transfira para o estágio de um microscópio digital de epifluorescência invertida. Deixe a placa atingir a temperatura ambiente.
  2. Confirme se os colonoides da condição de toxicidade máxima estão totalmente lisados, examinando-os ao microscópio (Figura 1Biii).
  3. Selecione uma objetiva adequada, como uma objetiva de fluorescência de 40x de longa distância de trabalho. Otimize as configurações de imagem do microscópio antes de começar.
    1. Usando o canal de transmissão, concentre-se em um colonóide com células positivas para SYTOX, mude para a Proteína Fluorescente Verde (GFP)
      canal (488 nm) e ajuste a intensidade da luz e o tempo de exposição para maximizar o sinal fluorescente enquanto minimiza o fundo. Primeiro, tente uma intensidade de luz baixa e, em seguida, aumente gradualmente o tempo de exposição; Se a duração da exposição for impraticável, aumente ligeiramente a intensidade da luz.
      NOTA: Aumentar o tempo de exposição em vez da intensidade da luz reduzirá a fototoxicidade e o fotobranqueamento das amostras19. Exponha as amostras à luz fluorescente apenas quando necessário.
  4. Usando as configurações de imagem otimizadas para o canal GFP, observe as condições Sem Corante e Toxicidade Máxima para garantir que as amostras não estejam superexpostas ou subexpostas. Uma vez finalizado, mantenha as configurações de imagem consistentes entre as condições.
  5. Adquira imagens usando uma abordagem de amostragem aleatória: faça isso selecionando campos de visão (FOVs) que seguem um padrão de grade fixo que cobre a cúpula do colonoide. Adquira imagens de colonóides de um mínimo de 10 FOVs. Certifique-se de que o plano central do colonoide esteja em foco e adquira imagens nos canais de transmissão e GFP.
    1. Aplique os seguintes critérios de exclusão.
      1. Não adquira imagens se não houver colonóides presentes no FOV.
      2. Não adquira imagens se houver apenas colonoides sobrepostos no mesmo plano focal presente no FOV (Figura 1Biv).
      3. Não adquira imagens se houver apenas detritos colonoides presentes no FOV (Figura 1Bv). Não inclua detritos colonoides na análise.
  6. Salve imagens em formato gráfico de rede portátil e exporte.
  7. Se houver pontos de tempo adicionais, retorne a placa de microtitulação de 96 poços com colonóides para a incubadora a 37 °C, 5% CO2.

5. Análise de imagem

  1. Abra o Fiji ImageJ e importe o conjunto de dados da imagem arrastando e soltando os arquivos na barra de ferramentas do ImageJ ou navegando até Arquivo | Abra e selecione os arquivos. Depois de aberto, combine os arquivos em uma pilha de imagens clicando em Imagem | Pilhas| Imagens para empilhar. Converta a pilha de imagens para o formato de arquivo de 8 bits clicando em Imagem| Tipo| 8 bits.
  2. Para cada conjunto de imagens, clique na ferramenta Seleções à mão livre na barra de ferramentas do ImageJ e selecione manualmente a região de interesse (ROI) na imagem de transmissão usando o mouse do computador; o ROI é o perímetro do colonoide. Em seguida, alterne entre a pilha de imagens e a imagem do canal GFP correspondente.
  3. Clique em Analisar| Definir medidas; na janela de diálogo Definir medidas , marque Valor médio de cinza e deixe todas as outras caixas desmarcadas. Com a imagem GFP selecionada, clique em Analisar | Medir. Repita essa análise para cada colonoide na pilha de imagens. Depois que o conjunto de dados for analisado, copie todos os dados na janela Resultados e cole-os em um aplicativo de software de planilha.

6. % de cálculo da toxicidade máxima

  1. Calcular a média dos valores médios de cinzento (MGV) para cada condição utilizando a equação (1).
    figure-protocol-1 (média do tratamento a) = figure-protocol-2 (1)
  2. Expresse a média de cada condição como uma porcentagem em relação à média da condição de toxicidade máxima (MT) usando a equação (2).
    %MTa = figure-protocol-3 (2)

7. Cálculo do IPC

  1. Normalize (NORM) os dados da seguinte forma, usando os valores médios calculados na etapa 6.1, subtraia a média da condição não tratada (UT) de cada condição de tratamento e da condição de toxicidade máxima (MT) (para remover a morte celular de fundo que ocorre independentemente do tratamento com citocinas). Em seguida, divida cada condição de tratamento pela média subtraída de fundo da condição de toxicidade máxima (MT), conforme mostrado na equação (3).
    NORMAa = figure-protocol-4 (3)
  2. Subtraia os valores normalizados calculados na etapa 7.1 de 1; os valores resultantes representam a viabilidade celular (V) após o tratamento (como na equação (4) abaixo).
    Va = 1 −NORMAa (4)
  3. Calcular o coeficiente de interacção perturbagénica (CPI) utilizando a equação (5):
    IPC = figure-protocol-5 (5)
    Onde a denota o primeiro tratamento; b denota o segundo tratamento; e AB é o tratamento combinado. Os valores de CPI indicam relações sinérgicas (<1), aditivas (=1) ou antagônicas (>1).

Resultados

Usando este protocolo, demonstramos como os colonoides de pacientes com DC podem ser usados para estudar os efeitos citotóxicos das citocinas relevantes para DII IFN-γ e TNF-α no epitélio primário. Usamos um corante de morte celular fluorescente disponível comercialmente (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), que só pode entrar em células que têm uma membrana celular comprometida, onde é ativado pela ligação a ácidos nucléicos. Co-tratamos os colonoides com citocinas e o corante de morte celular fluorescente e realizamos imagens de células vivas em 8 h e 24 h com um microscópio de epifluorescência invertida. Imagens representativas de transmissão/sobreposição fluorescente em 8 h indicam que apenas os colonoides tratados com IFN-γ + TNF-α são positivos para sinal fluorescente; no entanto, há apenas um pequeno número de células fluorescentes (Figura 2A). O blebbing celular, um indicador morfológico de morte celular20, também pode ser observado na condição IFN-γ + TNF-α. Em 24 h, os colonoides tratados com IFN-γ + TNF-α apresentam grandes regiões positivas para sinal fluorescente (Figura 2A). Há também uma clara quebra na morfologia do colonóide - o lúmen central não é mais visível e a barreira epitelial foi completamente rompida.

Para quantificar o sinal do corante de morte celular, usamos um software de análise de imagem de código aberto para calcular a intensidade fluorescente de cada colonoide. Em seguida, normalizamos os dados expressando a média de cada condição como uma porcentagem do tratamento Max Toxicity. Às 8 h, a morte homeostática ou celular de fundo nos colonoides de controle BSA foi relativamente baixa (7,7% da toxicidade máxima) (Figura 2B). Não houve mudanças estatisticamente significativas nos níveis de morte celular neste momento; no entanto, as condições tratadas com TNF-α apresentaram um pequeno aumento na citotoxicidade (Figura 2B). Após 24 h, os níveis de morte celular aumentaram para todas as condições tratadas com citocinas. No entanto, houve uma mudança mínima na morte celular para a condição de controle BSA entre os pontos de tempo (7,5% da toxicidade máxima em 24 h). Os colonoides tratados com IFN-γ + TNF-α tiveram o maior aumento nos níveis de morte celular em comparação com o controle BSA (29,4% de toxicidade máxima). A diferença nos níveis de morte celular entre o tratamento combinado e os tratamentos com citocinas únicas (IFN-γ, TNF-α) foi altamente significativa. Esses resultados sugerem a possibilidade de uma interação sinérgica citotóxica entre IFN-γ e TNF-α em 24 h.

Usamos o CPI para quantificar as interações citotóxicas entre os tratamentos com citocinas e determinar se eles eram sinérgicos. As interações entre citocinas são consideradas sinérgicas quando o valor do CPI é <1, aditivo quando =1 ou antagônico quando >1. Calculamos os valores do IPC por ponto de tempo (Figura 2C). Às 8 h, o valor do IPC indicou ligeiro sinergismo (0,99), com o valor do IPC diminuindo substancialmente às 24 h (0,83). Esta análise confirmou que a interação entre IFN-γ e TNF-α em 24 h foi sinérgica. Além disso, ilustra como, neste contexto, a sinergia entre IFN-γ e TNF-α é dependente do tempo.

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Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho experimental e solução de problemas. (A) Visão geral do esquema do protocolo. (B) Imagens representativas. (Bi) Imagem de microscopia óptica ilustrando a densidade ideal da cultura e o tamanho ideal dos colonóides antes de passar para um ensaio. Barra de escala = 500 μm. (Bii) Imagem de microscopia óptica ilustrando o tamanho ideal dos fragmentos de colonóides após a dissociação; Fragmentos destacados em vermelho. Barra de escala = 100 μm. (Biii) Imagem de microscopia óptica da morfologia do colonóide necrótico após tratamento com MT (com Triton X-100). Barra de escala = 25 μm. (Biv) Imagem de microscopia óptica de dois colonóides sobrepostos no mesmo plano focal. Barra de escala = 25 μm. (Bv) Imagem de microscopia óptica de detritos de células colonóides presentes após a passagem; Detritos destacados em vermelho. Barra de escala = 25 μm. Abreviaturas: ROI = região de interesse; IFM = intensidade média de fluorescência; MT = toxicidade máxima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Análise quantitativa da morte celular induzida por citocinas em colonoides humanos de DC. (A) Imagens representativas de microscopia ao vivo de colonoides de DC tratados com SYTOX Green Nucleic Acid Stain (corante de morte celular fluorescente) e citocinas em 8 h e 24 h; transmissão e canais GFP (cor verde) sobrepostos. Os colonoides foram tratados da seguinte forma: 1) PBS/BSA, 2) 10 ng/mL de IFN-γ, 3) 10 ng/mL de TNF-α, 4) 10 ng/mL de IFN-γ + 10 ng/mL de TNF-α. Barras de escala = 25 μm. (B) Análise quantitativa de colonoides de CD tratados com o corante fluorescente de morte celular e citocinas em 8 e 24 h; os dados são expressos em % da condição MT. N = 2 linhas de colonóides CD, 11-16 colonóides fotografados por condição. (C) CPI calculado por ponto de tempo usando o conjunto de dados de B, N = 2 linhas de colonóides CD. Os dados são expressos como médias ± EP. Em B, foi realizada análise ANOVA de duas vias, seguida de pós-testes de Bonferroni, *P < 0,05, ***P < 0,001, conforme indicado. Abreviaturas: DC = doença de Crohn; GFP = proteína fluorescente verde; CPI = coeficiente de interação perturbagênica; PBS = solução salina tamponada com fosfato; BSA = albumina sérica bovina; TNF-α = fator de necrose tumoral-alfa; IFN-γ = interferon-gama; MT = toxicidade máxima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição dos meios de cultura para protocolo. Para preparar meios de proliferação organoide, combine meios condicionados com L-WRN e meios sem soro 1:1 e, em seguida, adicione suplementos. Os meios de proliferação de organoides devem ser usados dentro de 2 semanas após a preparação. Observe que todas as mídias completas devem ser armazenadas a 4 °C. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Layout experimental da placa de 96 poços e tratamentos com citocinas. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Vários métodos têm sido desenvolvidos para análises quantitativas de morte celular em organoides intestinais. Examinar a ruptura da morfologia organoide intestinal por microscopia óptica é uma abordagem direta para quantificar os efeitos de substâncias citotóxicas11. No entanto, as mudanças morfológicas não são uma medida direta da morte celular, e o método é apenas semiquantitativo. Outro método é avaliar a atividade metabólica organoide usando um ensaio de MTT ou ATP 10,11. É importante observar que esses ensaios só podem determinar alterações na viabilidade celular e devem ser validados com um ensaio de morte celular. Outros ensaios fluorométricos de morte celular usando corantes de ligação ao DNA foram relatados12,13. Uma abordagem sem imagem usando um leitor de microplacas fluorescentes é possível e permite alto rendimento12. No entanto, este método mede o sinal médio de um poço inteiro, tornando-o inadequado para populações heterogêneas. Também requer o uso de um leitor de microplacas com ajuste de altura Z. Técnicas baseadas em imagens fluorescentes podem ser usadas para análise de organoide único e captura de dados celulares/subcelulares e morfológicos. Os sistemas automatizados de imagem confocal de alto conteúdo (HCI) podem gerar grandes quantidades de dados com alto rendimento13. Infelizmente, a HCI confocal precisa de equipamentos especializados, usa protocolos complexos, normalmente requer software comercial de análise de imagens e é cara.

Nosso protocolo para análise quantitativa da morte celular do colonóide em vários pontos de tempo é direto, simples e barato. No entanto, em comparação com os sistemas automatizados de HCI e leitor de placas, é demorado e tem rendimento reduzido. Outra limitação do nosso método é o uso de campo amplo em oposição à microscopia confocal. A microscopia confocal é mais adequada para a aquisição de imagens de amostras 3D espessas, como organoides, pois reduz o sinal fora de foco e pode adquirir seções ópticas seriais (pilhas Z). No entanto, a imagem confocal normalmente requer tempos de aquisição mais longos e lasers de alta intensidade que aumentam a fototoxicidade/fotobranqueamento. É fundamental observar que os corantes fluorescentes de morte celular, como o SYTOX Green, são adequados apenas para medir formas de morte celular onde há perda de integridade da membrana celular, como necrose, necrose secundária associada à apoptose tardia, necroptose e piroptose21. Existem algumas formas de morte celular regulada em que a membrana celular permanece impermeável pelo menos durante as fases iniciais da morte celular, como a apoptose dependente de caspase. No entanto, este protocolo pode ser facilmente modificado para incorporar também imagens de um repórter fluorescente de atividade caspase 3/722. Isso forneceria dados adicionais para ajudar a caracterizar a modalidade específica de morte celular.

Usamos nosso protocolo para demonstrar a interação sinérgica citotóxica entre as citocinas IFN-γ e TNF-α (Figura 2C), que relatamos anteriormente em organoides derivados de pacientes com DC 9,10. A relevância fisiológica dessa forma de sinergismo também foi demonstrada em modelos murinos de linfo-histiocitose hemofagocítica e sepse23. Vários modelos e abordagens matemáticas de referência foram implementados para quantificar a sinergia entre combinações de agentes biológicos24,25. Eles diferem em termos de complexidade, número de fatores que consideram e limiar para considerar uma interação sinérgica24,25. Alguns modelos precisam de conhecimento prévio dos agentes biológicos testados, fazem certas suposições sobre a atividade dos agentes e podem exigir curvas dose-resposta abrangentes para cada tratamento único e combinado25. O método que selecionamos para medir a sinergia é uma modificação do modelo de coeficiente de interação medicamentosa (CDI), que já foi usado anteriormente para medir os efeitos inibitórios de combinações de drogas quimioterápicas na proliferação de linhagens de células cancerígenas26. O CDI é um modelo de independência Bliss; ao calcular o efeito combinado previsto de dois perturbagens, a independência de Bliss assume que eles visam vias separadas e têm mecanismos de ação independentes27. Para que uma interação entre perturbagens seja sinérgica, o efeito combinado real deve ser maior que o efeito previsto. Este modelo é apropriado para nossa configuração experimental, pois o IFN-γ e o TNF-α são conhecidos por terem diferentes receptores e componentes de sinalização a jusante. Além disso, a independência de Bliss permite o cálculo de um coeficiente de interação para quantificar o sinergismo e não requer conjuntos de dados de dose-resposta.

Existem alguns fatores-chave que devem ser considerados para garantir os melhores resultados para este protocolo. É importante que os colonoides sejam propagados a uma alta densidade (Figura 1Bi), que tenham aproximadamente 25-50 μm de diâmetro e proliferem ativamente antes de tentar semear células. O uso de culturas subótimas de colonoides para ensaios pode resultar em número insuficiente de células, baixa recuperação de colonóides e experimentos inconsistentes. Para resultados reprodutíveis, também é importante semear a densidade de colonóides de forma consistente entre os experimentos. Foi demonstrado anteriormente que a resposta in vitro a citocinas inflamatórias pode ser influenciada pela densidade de semeadura celular28,29. Outro problema comum é a formação de bolhas de ar na cúpula do BME, que podem afetar a imagem. Isso pode ser evitado usando a técnica de pipetagem reversa. Essa técnica também resulta em uma semeadura mais consistente.

Além disso, se estiver criando imagens de vários pontos no tempo, prepare uma condição de toxicidade máxima para cada ponto no tempo. O Triton-X 100, um surfactante não iônico, é comumente usado como controle positivo (condição de toxicidade máxima) para ensaios de citotoxicidade. A adição de Triton-X 100 lisa e mata os colonoides, permitindo que o corante de morte celular fluorescente entre nas células. O uso de uma condição de toxicidade máxima de um ponto de tempo anterior resultará em normalização imprecisa e inconsistente dos dados devido ao decaimento do sinal fluorescente ao longo do tempo.

Um último ponto a considerar é a escolha do BME usado para a cultura de colonóides. Existem vários produtores comerciais de BME; no entanto, para o nosso protocolo, testamos apenas a marca incluída na Tabela de Materiais. Um estudo recente usando organoides de câncer de pâncreas derivados de pacientes descobriu que a fonte comercial de BME alterou as taxas de proliferação celular, mas não teve efeito significativo na resposta a drogas quimioterápicas ou na expressão gênica30. Com isso em mente, esperamos que a tendência de resultados seja semelhante entre as marcas BME para nosso protocolo, mas recomendamos usar a mesma marca de forma consistente.

Demonstramos como este protocolo pode ser usado para a análise da morte celular induzida por IFN-γ e TNF-α usando colonoides derivados de pacientes com DC. Os organoides intestinais derivados de pacientes são uma ferramenta poderosa para estudar a DC, pois retêm muitas características da doença, incluindo aumento da sensibilidade aos efeitos citotóxicos do TNF-α31. No entanto, o protocolo pode ser facilmente modificado para investigar os efeitos citotóxicos de outras perturbações além das citocinas ou estados de doença diferentes da DII, como câncer colorretal (testamos com sucesso o protocolo usando colonoides não DII). Acreditamos que este método é útil para qualquer área de pesquisa preocupada com mecanismos de morte celular, função de barreira epitelial ou imunologia da mucosa intestinal.

Divulgações

K.N. recebeu financiamento de pesquisa da AbbVie Inc. durante o tempo em que o trabalho foi concluído. Este financiamento foi no contexto de um prêmio de centro de pesquisa (SFI-14 / SP / 2710) para a APC Microbiome Ireland.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos pacientes por seu consentimento informado e participação no estudo de pesquisa, e ao pessoal clínico por sua excelente assistência. A Figura 1A foi criada com BioRender.com. Este trabalho foi apoiado por doações da Science Foundation Ireland - ou seja, um prêmio de desenvolvimento de carreira (CDA) para KN (SFI-13 / CDA / 2171), uma bolsa do centro de pesquisa (SFI-12 / RC / 2273) e um prêmio do centro de pesquisa (SFI-14 / SP / 2710) para APC Microbiome Ireland. P.F. também recebeu financiamento do SFI/20/RP/9007.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução avançada de DMEM/F12Gibco12634010
anfotericina BSigma-MerckA2942
A-83-01Sigma-MerckSML0788
BioRenderScience Suite Inc.N/ASoftware de ilustração científica
Albumina de soro bovinoSigma-MerckA2058Suplemento B27 essencialmente livre de IgG, com baixa endotoxina
B27Invitrogen17504-044
CHIR-99021Sigma-MerckSML1046
Costar 48 poços transparentes tratados com TC Placas de poços múltiplos, embaladas individualmente, estéreisCorning3548
Extrato de Membrana Porá Cultrex, Tipo 2, PathclearR& D Systems3532-010-02Extrato de membrana de bastão
DimetilsulfóxidoSigma-MerckD2650
Dulbecco′ s Tamponamento de fosfato SalinoSigma-MerckD8537
EVOS FL Microscópio digital de fluorescência invertidaInvitrogenAMF4300Microscópio digital de epifluorescência invertida
EVOS 40x Objetiva, fluorita, LWD, contraste de faseThermoFisher ScientificAMEP4683Longa distância de trabalho 40x objetiva de fluorescência
Fiji/ImageJ (versão Windows)Software de código abertoN/ASoftware de análise de imagem
Soro fetal bovinoSigma-MerckF9665
Solução de gentamicinaSigma-MerckG1397
Reagente de dissociação celular suaveSTEMCELL Technologies100-0485Reagente de dissociação celular livre de enzimas
GlutaMAX-1Gibco35050061L-alanil-L-glutamina dipeptídeo
GraphPad Prism 5 (versão Windows)DotmaticsN/ASoftware de dados gráficos e estatísticos
Greiner 15 mL Tubo de centrífuga de polipropileno, estéril com fundo cônico e Tampa de roscaCruinn188261CI
HEPES 1 MGibco15630080
EGF recombinante humano (livre de animais)PeprotechAF-100-15
N-AcetilcisteínaSigma-MerckA9165
NicotinamidaSigma-MerckN0636
NormocinInvivoGenant-nr-05Ampla gama reagente antimicrobiano
Nunc Edge 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Microplaca de fundo planoSuplemento ThermoFisher Scientific15543115
N2Invitrogen17502-048
Proteína IFN-gama humana recombinanteR& D Systems285-IFPBS/BSA filtrada estéril
R& D Systems210-TARessuspender em PBS/BSA filtrado estéril a 0,1%
Sigma-MerckS7067
Snap CapThermoFisher Scientific3451
SYTOX - Solução de 5 mM em DMSOInvitrogenS7020Corante de morte celular fluorescente, protege da luz
Triton X-100Sigma-Merck93420
Solução azul de tripanoSigma-MerckT8154
Tryple ExpressGibco12604013Reagente de dissociação enzimática
Y-27632MedChemExpressHY-10071Inibidor de ROCK-I e ROCK-II
suplemento Ressuspender em proteína TNF-alfa humana recombinante SB202190 Tubos de microcentrífuga de baixa retenção Coloração de ácido nucleico verde

Referências

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