Artigo de método

Técnica para Isolamento e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea da Mandíbula de Rato

2.1K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/66765

⸱

31 de maio de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Department of Stomatology, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital, 3Department of Stomatology, Fujian People's Armed Police Corps Hospital

Neste artigo

Resumo

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula têm funções significativas em diversas diferenciações, auto-renovação e modulação imunológica. Eles surgiram como um reservatório crucial de células precursoras em terapia genética, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um método único para isolar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula em ratos.

Resumo

As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMMSCs) são um tipo de célula-tronco com potencial de diferenciação multidirecional. Em comparação com as BMMSCs derivadas de ossos apendiculares, as BMMSCs derivadas da mandíbula têm maior capacidade de diferenciação proliferativa e osteogênica, tornando-se gradualmente células sementes importantes para o reparo de defeitos da mandíbula. No entanto, a mandíbula tem uma estrutura óssea complexa e menos conteúdo esponjoso do que os ossos apendiculares. É difícil adquirir um grande número de células-tronco mesenquimais derivadas da medula da mandíbula de alta qualidade usando métodos tradicionais. Este estudo apresenta uma 'abordagem baseada em nicho sobre stemness' para isolar e cultivar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula de rato (JBMMSCs). JBMMSCs primárias de ratos foram isoladas e cultivadas usando o método aderente à medula óssea total combinado com o método de digestão de fatias ósseas. As células isoladas foram identificadas como JBMMSCs por meio de observação da morfologia celular, detecção de marcadores de superfície celular e indução de diferenciação multidirecional. As células extraídas por este método exibem uma forma de fuso 'semelhante a fibroblastos'. As células são longas, fusiformes e semelhantes a fibroblastos. A análise por citometria de fluxo mostra que essas células são positivas para CD29, CD44 e CD90, mas negativas para CD11b/c, CD34 e CD45, o que é congruente com as características das BMMSCs. As células apresentam forte capacidade de proliferação e podem sofrer diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. Este estudo fornece um método eficaz e estável para obter JBMMSCs de alta qualidade suficientes com forte capacidade de diferenciação em um curto espaço de tempo, o que pode facilitar estudos adicionais sobre a exploração da função biológica, medicina regenerativa e aplicações clínicas relacionadas.

Introdução

As células-tronco mesenquimais (CTMs) foram descobertas pela primeira vez na medula óssea, que mostraram a capacidade de formar colônias adesivas em cultura e forte potencial osteogênico1. Pittinger et al.2 encontraram ainda seu potencial de diferenciação multidirecional em relação a ossos, gordura e cartilagem. Embora todas as células-tronco mesenquimais de diferentes fontes tenham potencial para diferenciação multidirecional, as células-tronco mesenquimais da medula óssea têm o maior potencial de diferenciação condrogênica em comparação com as células-tronco mesenquimais derivadas de outros tecidos, tornando-as consideradas as melhores células candidatas para engenharia de tecido ósseo3. No entanto, muitos estudos comprovaram que as BMMSCs de diferentes origens apresentam características e propriedades específicas do local, como capacidade de diferenciação osteogênica e atividade proliferativa celular 4,5. Isso pode ser devido a diferentes camadas germinativas entre a mandíbula e os ossos apendiculares ou a crista ilíaca6.

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula (JBMMSCs) surgem das células da crista neural do neuroectoderma, enquanto as BMMSCs derivadas do fêmur se originam do mesoderma7. Em comparação com as BMMSCs derivadas de ossos longos e da crista ilíaca, as JBMMSCs têm maior taxa de proliferação, atividade de ALP e potencial osteogênico8. Além disso, o efeito de aplicação de BMMSCs em tecidos e órgãos pode variar dependendo de diferentes tipos de células e ambientes9. O reparo de defeitos da mandíbula depende principalmente do recrutamento de células-tronco mesenquimais derivadas da mandíbula. Portanto, o estudo de JBMMSCs pode fornecer uma base experimental para sua aplicação clínica na engenharia de tecidos ósseos da mandíbula10. No entanto, a pesquisa básica e as aplicações clínicas concentram-se principalmente nas BMMSCs derivadas de ossos apendiculares e axiais11. A pesquisa sobre JBMMSCs é limitada, e isso pode ser devido ao baixo teor de osso esponjoso na mandíbula e ao fato de que as mandíbulas dos ratos têm ainda menos conteúdo ósseo esponjoso12. Portanto, é difícil separar as células-tronco mesenquimais derivadas do osso maxilar usando o método comum de lavagem da medula óssea, que é comumente usado no isolamento de BMMSCs dos ossos apendiculares ou da crista ilíaca13. Com base nos métodos de Hong et al.14 e Cheng et al.15, levantamos a hipótese de que a combinação de digestão óssea densa e o método de lavagem da medula óssea poderia isolar eficientemente JBMMSCs de ratos.

Este estudo tem como objetivo estabelecer um método eficiente para isolar JBMMSCs de ratos e fornecer fontes de células-semente suficientes para a engenharia do tecido ósseo da mandíbula.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Animal do Hospital Geral do PLA Chinês. Ratos Wistar machos de treze semanas de idade foram usados para o experimento. Detalhes sobre os animais, reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação experimental

  1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo tesouras oftálmicas, pinças e rongeurs ósseos, em alta temperatura e pressão.
  2. Prepare os meios de cultura com antecedência.
    1. Prepare α-MEM completo contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
    2. Prepare colagenase tipo II a 0,1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    3. Prepare 50 mL de PBS com penicilina-estreptomicina a 1% em um tubo de centrífuga estéril descartável de 50 mL.

2. Isolamento e cultivo de JBMMSCs de ratos

  1. Isole a mandíbula do rato seguindo as etapas abaixo:
    NOTA: Para manter a esterilidade da amostra, todos os instrumentos cirúrgicos de metal devem ser desinfetados em alta temperatura em uma chama de lâmpada de álcool por pelo menos três segundos antes do uso.
    1. Anestesiar o rato com pentobarbital sódico a 2% (2 mL/kg) por injeção intraperitoneal.
    2. Sacrifique o rato anestesiado por luxação das vértebras cervicais (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) depois que sua frequência respiratória diminuir e os músculos relaxarem completamente.
    3. Mergulhe o rato em etanol a 75% por 30 min para desinfetá-lo e depois transfira-o para a mesa ultralimpa.
    4. Coloque o rato em um pano estéril descartável ou em um recipiente estéril e mantenha-o em decúbito dorsal.
    5. Corte e separe a pele e o músculo do ângulo da boca até a articulação ao longo do ramo e, em seguida, separe o côndilo da fossa glenoidal cortando o disco da articulação temporomandibular e os ligamentos periféricos bilaterais horizontalmente com tesoura oftálmica.
      NOTA: Determine a posição da articulação temporomandibular movendo a mandíbula e observando a posição do côndilo externamente.
    6. Corte e separe os músculos e tecidos conjuntivos da mandíbula lateral usando uma tesoura do sulco vestibular no lado vestibular dos incisivos inferiores para os lados esquerdo e direito.
    7. Incise os músculos linguais da mandíbula do frênulo lingual até a região posterior da mandíbula.
    8. Remova a mandíbula do crânio.
    9. Divida a mandíbula em metades cortando a sínfise entre os incisivos inferiores com uma tesoura oftálmica.
    10. Remova os músculos restantes, fáscia e outros tecidos moles da mandíbula cuidadosamente usando tesouras oftálmicas e pinças.
  2. Isole JBMMSCs.
    1. Coloque o bico do rongeur na junção dos incisivos e da parte mesial do primeiro molar, corte a conexão entre os incisivos inferiores e a mandíbula com o rongeur e extraia completamente os incisivos inferiores.
    2. Remova todos os molares com um rongeur ósseo.
    3. Remova o ramo mandibular com um rongeur ósseo e exponha a cavidade medular separando a parte central da mandíbula ao longo da borda distal do último molar16.
    4. Chupar α-MEM meio completo com uma seringa estéril descartável de 1 ml. Insira a agulha na cavidade da medula óssea e lave a medula óssea repetidamente na placa de cultura com meio completo α-MEM até que o osso fique branco.
    5. Colete a solução de lavagem da medula óssea em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue-o a 800 x g por 3 min em temperatura ambiente.
    6. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta, ressuspender as células com 10 ml de meio completo de α-MEM e colocá-las numa nova placa de cultura de 10 cm.
    7. Divida a mandíbula lavada em fatias de osso de 1-3 mm³ com um rongeur e digeri-las com 3 mL de colagenase tipo II a 0,1% por 90 min em um agitador de 200 rpm / min a 37 ° C.
    8. Centrifugue a mandíbula digerida a 800 x g por 3 min à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
    9. Cultivar as células colhidas e as fatias de osso digeridas com meio completo de α-MEM a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 .
    10. Troque metade do meio de cultura por meio fresco após 72 h e, em seguida, troque-o completamente a cada 2 dias.
      NOTA: Não mova a placa de cultura nos primeiros três dias.
    11. Passe as células aderentes na proporção de 1:2 quando atingirem 80%-90% de confluência. Remova as fatias de osso durante a segunda subcultura. Use as células das gerações P2 ou P3 para experimentos.

3. Citometria de fluxo para identificação de marcadores de superfície celular

  1. Ressuspenda JBMMSCs da geração P2 em tampão de citometria de fluxo. Conte as células usando um contador de células automatizado e ajuste a concentração para 3 × 106 células/mL.
  2. Adicione 100 μL de suspensão celular e 2 μL de anticorpos monoclonais (CD11b / c, CD29, CD34, CD44, CD45 e CD90) a cada tubo de microcentrífuga. Incubar durante 30 min a 4 °C17,18.
  3. Lave a amostra duas vezes com 200 μL de tampão de citometria de fluxo e centrifugue-a por 5 min a 250 x g à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante.
  4. Adicione 100 μL de tampão de citometria de fluxo e 2 μL de anticorpo secundário fluorescente marcado com PE a cada tubo. Incubar a 4 °C durante 30 min.
  5. Repita a etapa 3.3.
  6. Ressuspenda JBMMSCs em 300-500 μL de tampão de citometria de fluxo por tubo.
  7. Efectuar a análise por citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo.
    NOTA: Use anticorpos homólogos como controles negativos para eliminar a coloração de fundo causada pela combinação inespecífica de anticorpos.

4. Determinação da proliferação celular

  1. Semear JBMMSCs da geração P3 em uma placa de 96 poços a uma densidade de 5 × 103 células por poço.
  2. Adicione 10 μL de solução de CCK-8 a cada poço.
  3. Coloque a placa de 96 poços na incubadora por 2 h e meça a absorbância (valor OD a 450 nm) usando um leitor de microplacas.
    NOTA: Realize o teste no mesmo horário todos os dias por sete dias consecutivos.

5. Capacidade de formação de colônias

  1. Semear 1000 JBMMSCs da passagem 3 para placas de cultura de 10 cm e cultura a 37 °C com 5% de CO2.
  2. Troque o meio de cultura a cada 3 dias.
  3. Realize a coloração violeta de cristal após cultivo contínuo por 15 dias.
  4. Em seguida, fixe as células com metanol por 5 min e pinte com 2% de cristal violeta por 5 min.

6. Diferenciação multilinhagem de JBMMSCs

NOTA: Use JBMMSCs de geração P3 para diferenciação de várias linhagens. O grupo controle foi cultivado com meio completo de α-MEM.

  1. Realizar diferenciação osteogênica.
    1. Inocular 1 × 105 JBMMSCs por poço em uma placa de seis poços.
    2. Quando a confluência celular atingir 70%, troque o meio por meio de indução osteogênica.
      NOTA: Troque o meio de indução osteogênica a cada 3 dias.
    3. Realize a coloração com fosfatase alcalina (ALP) após 7 dias de indução osteogênica.
    4. Remova o meio da placa de seis poços, fixe as células com paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 30 min e depois lave-as com PBS três vezes.
    5. Pinte as células com solução de coloração ALP à temperatura ambiente por 30 min e proteja-as da luz.
    6. Enxágue as células até que não haja mais solução de coloração e observe as amostras ao microscópio.
    7. Realize a coloração com vermelho de alizarina após 21 dias de indução osteogênica.
    8. Manchar as células com solução de coloração vermelha de alizarina por 5 min após fixar as células com paraformaldeído a 4% por 30 min.
    9. Lave as células com PBS até que não haja solução de coloração vermelha de alizarina.
    10. Observe o número de nódulos de cálcio ao microscópio.
  2. Realizar diferenciação adipogênica.
    1. Inocular 1 × 105 JBMMSCs por alvéolo numa placa de seis poços.
    2. Quando a confluência celular atingir 70%, troque o meio por meio de indução adipogênico.
      NOTA: Troque o meio de indução adipogénica de três em três dias.
    3. Realize a coloração Oil red O após 14 dias de indução adipogênica.
    4. Remova o meio da placa de seis poços, fixe as células com solução fixadora de óleo vermelho O por 20-30 min e depois lave-as com PBS três vezes.
    5. Remova a solução de fixação e lave as células com água destilada duas vezes.
    6. Mergulhe as células em isopropanol a 60% por 20-30 s.
    7. Remova o isopropanol 60% e core as células com coloração Oil red O por 20-30 min.
    8. Remova a solução de coloração, enxágue as células com isopropanol a 60% por 20-30 s e lave-as com água destilada.
    9. Manchar o núcleo com solução de hematoxilina por 1-2 min.
    10. Remova a solução de hematoxilina e lave as células 2-3 vezes com água destilada. Adicione o tampão Oil Red O por 1 min e remova-o.
    11. Observe o número de gotículas lipídicas ao microscópio.
  3. Realize a diferenciação condrogênica.
    1. Inocular 1 × 105 JBMMSCs por alvéolo numa placa de seis poços.
    2. Quando a confluência celular atingir 70%, troque o meio por meio de indução condrogênico.
      NOTA: Troque o meio de indução condrogênico a cada 3 dias.
    3. Realize a coloração com azul de Alcian após 21 dias de indução condrogênica.
    4. Remova o meio da placa de seis poços, fixe as células com paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 30 min e depois lave-as com PBS três vezes.
    5. Manchar as células com coloração azul de Alcian a 37 °C durante 1 h.
    6. Enxágue as células até que não haja mais solução de coloração e observe-as ao microscópio.

7. PCR em tempo real

  1. Extraia o RNA total usando o kit de extração de RNA e meça a concentração de RNA com um marcador enzimático (seguindo as instruções do fabricante).
  2. Sintetizar cDNA usando 500 ng de RNA19.
  3. Realize qRT-PCR em um sistema em tempo real com 10 μL de mistura qRT-PCR contendo 1 μL de cDNA, 3,5 μL de água bidestilada
    NOTA: As sequências de primers estão listadas na Tabela 1. As condições de ciclagem térmica são as seguintes: 50 °C por 2 min, 95 °C por 2 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C por 15 s, 60 °C por 2 min e, em seguida, incrementos de 0,5 °C por 5 s de 60 °C a 95 °C para a curva de fusão.
  4. Use o GAPDH como um controle interno16.

Resultados

Após 72 h de inoculação celular, a maioria das células estava suspensa e de formato redondo, com muito poucas aderidas à parede (Figura 1B). No quinto dia, surgiram colônias de células aderentes, exibindo fusos ou formas semelhantes a fibroblastos (Figura 1C). No sétimo dia, as células aderentes atingiram 90% de confluência, formando uma forma de "cardume de peixes" com um pequeno número de células suspensas intermitentes (Figura 1D). As células passadas cresceram rapidamente e foram passadas a cada 3 dias. A morfologia celular era relativamente homogênea, predominantemente fusiforme e disposta em um padrão semelhante a um vórtice após a confluência (Figura 1E-G).

A análise por citometria de fluxo revelou altos níveis de expressão dos marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais CD90, CD29 e CD44, com taxas positivas de 97,2%, 97,7% e 95,7%, respectivamente. Por outro lado, os marcadores de superfície de células-tronco hematopoiéticas CD45, CD34 e CD11b/c apresentaram baixa expressão, com taxas positivas de 1,37%, 0,66% e 1,49%, respectivamente (Figura 2A). Após 2 semanas de cultura, os JBMMSCs demonstraram colonização, como evidenciado pela coloração com cristal violeta (Figura 2B). Eles exibiram capacidade de expansão estável in vitro, com a curva de crescimento celular seguindo um padrão típico de 'S-like' (Figura 2C). O processo de proliferação celular incluiu um período latente, fase de crescimento logarítmico e fase de platô. O crescimento rápido começou após dois dias, seguido por uma desaceleração após seis dias. As células individuais exibiram características de auto-replicação e proliferação.

As células exibiram partículas de coloração ALP azul-púrpura no7º dia e nódulos mineralizados vermelhos no21º dia. Além disso, após 14 dias de indução adipogênica, as células exibiram gotículas lipídicas vermelhas, enquanto a indução da diferenciação condrogênica resultou na formação de tecido semelhante à cartilagem azul (Figura 3A). Além disso, após 7 dias de indução osteogênica, os níveis de expressão de mRNA de ALP, OCN e Runx2 em JBMMSCs foram elevados15 (Figura 3B).

figure-results-1
Figura 1: Isolamento e cultura de JBMMSCs. (A) Uma visão geral do protocolo. (BD) Imagens de células cultivadas por 3 dias, 5 dias e 7 dias em cultura primária, respectivamente. (E-G) Imagens das células P1, P2 e P3, respectivamente. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Identificação de JBMMSCs. (A) Resultados da análise de citometria de fluxo de JBMMSCs de ratos. A análise de citometria de fluxo revelou que essas células foram positivas para CD29, CD44 e CD90, consistentes com as características das BMMSCs. Por outro lado, eles foram negativos para CD11b/c, CD34 e CD45. (B) Imagens representativas de colônias de JBMMSCs coradas com cristal violeta (barras de escala: 100 μm). (C) A curva de crescimento celular mostrou a taxa de proliferação celular. Os dados e as barras de erro denotam média ± desvio padrão, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Diferenciação multilinhagem (osteogênica, adipogênica e condrogênica) de JBMMSCs. (A) Após 7 dias de indução osteogênica, foi observado aumento da atividade da ALP. Aos 21 dias após a indução osteogênica, numerosos nódulos mineralizados foram corados de vermelho com coloração de vermelho de alizarina. A coloração com O vermelho óleo revelou um número significativo de gotículas lipídicas. A coloração com azul de Alcian destacou as células induzidas nos condrócitos após a indução condrogênica. (B) expressão de mRNA do gene osteogênico ALP, OCN e Runx2 de JBMMSCs após indução osteogênica por 7 dias. (***P < 0,001, vs. o grupo controle). Os dados e as barras de erro denotam média ± desvio padrão, n = 3. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Genesequências de primer (5'-3')
GADPHF: ACCCAGAAGACTGTGGATGG
R: CACATTGGGGGTAGGAACAC
ALPF: CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA
R: CCTTGTAACCAGGCCCGTTG
OCNF: GGTGGTGAATAGACTCCGGC
R: GCAACACATGCCCTAAACGG
Runx2F: GCACCCAGCCCATAATAGA
R: TTGGAGCAAGGAGAACCC

Tabela 1: Primers usados em PCR em tempo real.

Discussão

As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMMSCs) representam um subconjunto de células-tronco não hematopoiéticas que residem na medula óssea, caracterizadas por suas capacidades de auto-renovação, potencial de diferenciação multidirecional e funções de suporte para hematopoiese. Essas células desempenham papéis fundamentais em vários processos fisiológicos, como regeneração tecidual, angiogênese e regulação das atividades celulares20. Consequentemente, as BMMSCs são frequentemente utilizadas no reparo de tecidos e engenharia regenerativa como uma fonte ideal de células de sementes21.

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula (JBMMSCs), inicialmente isoladas de aspirados de medula óssea da mandíbula humana em 2005 por Matsubara et al.22, exibem características de diferenciação distintas atribuíveis às origens únicas e vias de desenvolvimento da mandíbula em comparação com outros locais esqueléticos 4,23. Dados os distintos mecanismos de desenvolvimento e patológicos que regem o osso craniofacial, priorizar as JBMMSCs no reparo de defeitos ósseos craniofaciais parece imperativo, devido às suas características homólogas de desenvolvimento23. Além disso, os JBMMSCs exibem histocompatibilidade aumentada com o microambiente oral devido às suas origens de tecido embrionário compartilhadas24,25. Apesar dessas vantagens, um protocolo de isolamento padronizado e seguro para JBMMSCs permanece indefinido, e a pesquisa sobre JBMMSCs permanece relativamente limitada.

O isolamento e o cultivo de BMMSCs atualmente carecem de padronização, com métodos comumente empregados, incluindo classificação de esferas imunomagnéticas, classificação por citometria de fluxo, centrifugação por gradiente de densidade e cultura aderente à medula óssea total26. Entre estes, o método de esferas imunomagnéticas e o método de classificação por citometria de fluxo isolam as células reconhecendo antígenos específicos na superfície celular. No entanto, esses métodos envolvem operações complicadas, requerem instrumentos especializados e podem afetar a atividade celular, apesar de produzirem células de alta pureza27. O método de centrifugação por gradiente de densidade separa as células por centrifugação e estratificação, o que pode alterar o microambiente celular, levando a um crescimento celular mais lento e aumento do envelhecimento celular28. Por outro lado, o método de cultura aderente à medula óssea inteira separa e purifica as BMMSCs substituindo intermitentemente o meio e passando com base nas habilidades aderentes variáveis entre os diferentes tipos de células na medula óssea. Este método inflige danos mínimos às células e é simples de executar16.

Comparado com o fêmur, a mandíbula é menor em tamanho e tem uma cavidade de medula óssea mais estreita, com interferência de células no dente ou ligamento periodontal. O método de lavagem e adesão da medula óssea requer uma quantidade relativamente maior de medula óssea e é adequado para animais de grande porte e humanos29. JBMMSCs em ratos extraídos pela aplicação do método tradicional de lavagem da medula óssea são raros em número, lentos para proliferar e de baixa qualidade30,31. O conteúdo de JBMMSCs na medula óssea é muito baixo e eles são encontrados principalmente no osso compacto e no endósteo. Bu-Kyu Lee et al.32 usaram os aspirados mandibulares para isolar JBMMSCs, enquanto o tempo total de aspiração de 10 mL de sangue medular para a mandíbula foi cinco vezes maior do que para a crista ilíaca, e o rendimento inicial de MSCs da mandíbula foi três vezes menor do que o da crista ilíaca. A lavagem da medula óssea por si só não pode isolar efetivamente as células do osso compacto e do endósteo.

Nos últimos anos, estudos descobriram que o osso compacto é uma fonte nova e confiável de BMMSCs, e um método relativamente simples de isolamento de BMMSC foi derivado, o método de cultura de digestão de fatia de osso33. As BMMSCs isoladas por este método têm alta pureza34. Guo et al.35isolaram com sucesso células-tronco mesenquimais ósseas de fêmures de camundongos usando o método de cultura de digestão de fatias ósseas. Yamazaet al.12 e Cheng et al.15 aplicaram o método de cultura de digestão de fatias ósseas ao isolamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea mandibular de camundongos e verificaram as propriedades das CTMs por proliferação celular, imunofenótipo e diferenciação de múltiplas linhagens. Este experimento usou uma combinação de adesão de medula óssea inteira lavada e digestão de fatia de osso para isolar e cultivar JBMMSCs primários de ratos. A medula óssea foi completamente lavada da cavidade sem filtração para manter a composição celular original e os fatores de crescimento na medula óssea. Em seguida, as fatias de osso foram cortadas em pequenos pedaços e digeridas usando colagenase tipo II para facilitar a saída das células dos fragmentos ósseos. Finalmente, as fatias de osso foram inoculadas em uma placa de cultura e cultivadas para permitir que as células rastejassem para fora das fatias de osso. O método de combinação faz com que o sistema de cultura da célula primária contenha simultaneamente componentes de células-tronco hematopoiéticas, osso esponjoso e osso cortical, o que pode simular melhor o microambiente das células-tronco mesenquimais da medula óssea no corpo e é mais propício para manter as características biológicas originais das células. Esse método é, portanto, chamado de "uma abordagem baseada em nichos sobre stemness"36. Luet al.37 também enfatizou a importância dos nichos de células-tronco no isolamento das BMMSCs, mas envolviam apenas o microambiente na medula óssea sem osso cortical. Este método foi aplicado com sucesso no isolamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula de camundongos38.

Também isolamos e cultivamos com sucesso JBMMSCs de ratos com essa abordagem baseada em nicho. Primeiro, as células isoladas exibiram uma forma semelhante a fibroblastos e aderiram a placas de cultura plásticas in vitro. Em segundo lugar, as células expressaram positivamente os marcadores de superfície CD90, CD29 e CD44 e expressaram negativamente CD45, CD34 e CD11b / c. Terceiro, as células podem se diferenciar em osteócitos, adipócitos e condrócitos. As células obtidas apresentaram boa morfologia, rápida taxa de proliferação e capacidade de diferenciação, o que atendeu aos critérios mínimos para identificação de células-tronco mesenquimais de origem humana propostos pela Sociedade Internacional de Terapia Celular17.

O isolamento de JBMMSCs foi desenvolvido e usado para isolar células em humanos. Matsubara et al.22 foram os primeiros a isolar JBMMSCs de amostras de medula óssea alveolar humana durante a cirurgia oral. Possíveis complicações podem ocorrer durante o processo de aspiração da mandíbula, incluindo danos ao tecido adjacente, infecção devido à contaminação bacteriana oral, etc. Zong et al.39 lavaram a cavidade da medula óssea dos pedaços de espécimes de osso esponjoso para obter JBMMSCs humanos. Park et al.40 isolaram JBMMSCs humanas de lascas ósseas alveolares obtidas durante a perfuração do implante usando um método de digestão sequencial. Mason et al.41 isolaram diretamente JBMMSCs humanas dos núcleos da medula óssea da mandíbula e aspiraram de pacientes submetidos à colocação de implantes dentários de rotina. Houve uma alta taxa de sucesso de isolamento de células de aspirados ou núcleo e uma maior taxa de sucesso da combinação. No entanto, embora os métodos acima tenham isolado com sucesso os JBMMSCs de humanos, as diferenças de eficácia entre os métodos precisam ser comparadas. Atualmente, este método apresentado tem sido utilizado apenas em camundongos e ratos, e não há pesquisas sobre a aplicação deste método ao isolamento de JBMMSCs humanos. Existem limitações para este método, especialmente quando aplicado a humanos. Primeiro, este método de combinar lavagem da medula óssea e digestão de fatias ósseas é relativamente complicado e requer mais etapas. Em segundo lugar, processos complexos exigem mais da esterilidade das operações, o que é crítico para o protocolo. Terceiro, é impossível lavar toda a cavidade da medula óssea do maxilar humano, portanto, é necessário explorar alguns métodos equivalentes, como lavar fragmentos ósseos esponjosos.

Em resumo, este estudo isolou e cultivou com sucesso JBMMSCs de ratos usando uma combinação de lavagem da medula óssea e digestão de fatias ósseas com base no princípio do "nicho de células-tronco". Os resultados da identificação celular confirmaram que este método pode isolar JBMMSCs suficientes e de alta pureza, fornecendo amplas fontes celulares para engenharia de tecido maxilar, particularmente no reparo de defeitos ósseos, o que é de grande importância.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelos Projetos de Saúde do Departamento de Logística da Comissão Militar (19BJZ22), Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7232154) e Fourth Mil Med Univ. projetos de pesquisa clínica (2021XB025).

Materiais

2
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de Alizarina Vermelha S 0,2%SolarbioG1450
BCIP / NBT Kit de Desenvolvimento de Cor de Fosfatase AlcalinaBeyotimeC3206
Bio-Rad CFX96 Sistema em Tempo RealBio-Rad
CCK8 KitDujindoCK04
Placa de cultura de células 10 cmCorning353003
CentrífugaEppendorf5810R
Tubo de Centrífuga 15 mL Tubo de430790
50 mL dede Corning
Thermo Fisher3111
Oscilador de temperatura constanteShanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.ZWY-100H
Soro fetal bovinoBI04-001-1ACS
Citômetro de fluxoBDFACS C6 
Microscópio de contraste de fase invertidoOlympusCKX41 
Kit de Detecção de Marcadores de Superfície de Células-Tronco Mesenquimais (Rato)OricellRAXMX-09011
Leitor de microplacas multifuncional VermelhasSynergy LX
SolarbioG1262
Paraformaldeído 4%SolarbioP1110
PBSMACGENECC008
penicilina-estreptomicina 0.25%MACGENECC004
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher A25742
PrimeScript RT Master Mix TakaraRR036A
Medula Óssea de Rato Células-tronco mesenquimais Kit de diferenciação adipogênicaOricellRAXMX-90031
Medula Óssea de Rato Células-tronco mesenquimais Kit de diferenciação condrogênicaOricellRAXMX-90041
Células-tronco mesenquimais de medula óssea de rato Kit de diferenciação osteogênicaOricellRAXMD-90021
Kit de extração de RNATIANGENDP419
Bancada super-limpaBeijing Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd.KLCZ-1220A
Tripsina-EDTA  0,25%MACGENECC012
Tipo II colagenaseSolarbioC8150
Wistar ratoPequim Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
&alfa;-MEM meio de cultura GibcoC12571500BT
Centrífuga Corning Incubadora CO 430828 Kit de Manchas de Óleo Multimodo BioTek

Referências

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  3. Shao, J., Zhang, W., Yang, T. Using mesenchymal stem cells as a therapy for bone regeneration and repairing. Biol Res. 48, 62(2015).
  4. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. Long-bone marrow stromal cells. J Dent Res. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  5. Mendi, A., Ulutürk, H., Ataç, M. S., Yılmaz, D. Stem cells for the oromaxillofacial area: Could they be a promising source for regeneration in dentistry. Adv Exp Med Biol. 1144, 101-121 (2019).
  6. Couly, G. F., Coltey, P. M., Le Douarin, N. M. The triple origin of skull in higher vertebrates: A study in quail-chick chimeras. Development. 117 (2), 409-429 (1993).
  7. Leucht, P., et al. Embryonic origin and hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration. Development. 135 (17), 2845-2854 (2008).
  8. Jeyaraman, M., et al. Is mandible derived mesenchymal stromal cells superior in proliferation and regeneration to long bone-derived mesenchymal stromal cells. World J Methodol. 13 (2), 10-17 (2023).
  9. Mouraret, S., et al. The potential for vertical bone regeneration via maxillary periosteal elevation. J Clin Peri.odontol. 41 (12), 1170-1177 (2014).
  10. Li, T. Q., Meng, X. B., Shi, Q., Zhang, T. Research progress in biological characteristics and influencing factors of jaw bone marrow mesenchymal stem cell. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 57 (1), 107-112 (2022).
  11. Arthur, A., Gronthos, S. Clinical application of bone marrow mesenchymal stem/stromal cells to repair skeletal tissue. Int J Mol Sci. 21 (24), 9759(2020).
  12. Yamaza, T., et al. Mouse mandible contains distinctive mesenchymal stem cells. J Dent Res. 90 (3), 317-324 (2011).
  13. Chen, L., et al. Directional homing of glycosylation-modified bone marrow mesenchymal stem cells for bone defect repair. J Nanobiotechnology. 19 (1), 228(2021).
  14. Hong, Y., et al. Isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats. J Vis Exp. (162), e61532(2020).
  15. Cheng, B., et al. Isolation, culture and biological characteristics of high-purity orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells of the rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 25 (1), 67-72 (2021).
  16. Lee, D. J., et al. Osteogenic potential of mesenchymal stem cells from rat mandible to regenerate critical sized calvarial defect. J Tissue Eng. 10, 2041731419830427(2019).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Fathi, E., Mesbah-Namin, S. A., Vietor, I., Farahzadi, R. Mesenchymal stem cells cause induction of granulocyte differentiation of rat bone marrow c-kit(+) hematopoietic stem cells through jak3/stat3, erk, and pi3k signaling pathways. Iran J Basic Med Sci. 25 (10), 1222-1227 (2022).
  19. Xu, W., et al. Exosomes from microglia attenuate photoreceptor injury and neovascularization in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Ther Nucleic Acids. 16, 778-790 (2019).
  20. Chu, D. T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
  21. Liu, Y., et al. Systemic infusion of mesenchymal stem cells improves cell-based bone regeneration via upregulation of regulatory T cells. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 498-509 (2015).
  22. Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: Differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 20 (3), 399-409 (2005).
  23. Zhang, G., Li, Q., Yuan, Q., Zhang, S. Spatial distributions, characteristics, and applications of craniofacial stem cells. Stem Cells Int. 2020, 8868593(2020).
  24. Akintoye, S. O. The distinctive jaw and alveolar bone regeneration. Oral Dis. 24 (1-2), 49-51 (2018).
  25. Park, J. B., Kim, I., Lee, W., Kim, H. Evaluation of the regenerative capacity of stem cells combined with bone graft material and collagen matrix using a rabbit calvarial defect model. J Periodontal Implant Sci. 53 (6), 467-477 (2023).
  26. Ni, X., et al. Isolation, culture and identification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering. Materials Exp. 12, 817-822 (2022).
  27. Abdallah, B. M., Khattab, H. M. Recent approaches to isolating and culturing mouse bone marrowderived mesenchymal stromal stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (5), 599-607 (2021).
  28. Tan, S. L., Ahmad, T. S., Selvaratnam, L., Kamarul, T. Isolation, characterization and the multilineage differentiation potential of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Anat. 222 (4), 437-450 (2013).
  29. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).
  30. Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: Basic science to clinical translation. Int J Biochem Cell Biol. 43 (3), 286-289 (2011).
  31. Liu, J., Watanabe, K., Dabdoub, S. M., Lee, B. S., Kim, D. G. Site-specific characteristics of bone and progenitor cells in control and ovariectomized rats. Bone. 163, 116501(2022).
  32. Lee, B. K., Choi, S. J., Mack, D., Oh, S. H. Isolation of mesenchymal stem cells from the mandibular marrow aspirates. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 112 (6), e86-e93 (2011).
  33. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  34. Short, B. J., Brouard, N., Simmons, P. J. Prospective isolation of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Methods Mol Biol. 482, 259-268 (2009).
  35. Guo, Z., et al. In vitro characteristics and in vivo immunosuppressive activity of compact bone-derived murine mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 24 (4), 992-1000 (2006).
  36. Pal, B., Das, B. In vitro culture of naïve human bone marrow mesenchymal stem cells: A stemness based approach. Front Cell Dev Biol. 5, 69(2017).
  37. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  38. Cao, W., et al. Mir-344d-3p regulates osteogenic and adipogenic differentiation of mouse mandibular bone marrow mesenchymal stem cells. PeerJ. 11, e14838(2023).
  39. Zong, C., Zhao, L., Huang, C., Chen, Y., Tian, L. Isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells from the human mandible. J Vis Exp. (182), e63811(2022).
  40. Park, J. C., et al. Acquisition of human alveolar bone-derived stromal cells using minimally irrigated implant osteotomy: In vitro and in vivo evaluations. J Clin Periodontol. 39 (5), 495-505 (2012).
  41. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Isolamento de Mand bula de RataDigest o de Cortes sseosMedula sseas TotalMarcadores de Superf cie CelularCitometria de FluxoDiferencia o Osteog nicaDiferencia o Adipog nicaDiferencia o Condrog nica
Técnica para Isolamento e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea da Mandíbula de Rato
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.