Dissociação de amostras de tecido tumoral humano e de camundongo para sequenciamento de RNA de célula única

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento para dissociar rapidamente amostras de tumores humanos e de camundongos para sequenciamento de RNA de célula única.

Resumo

As amostras de tumores humanos contêm uma infinidade de informações sobre seu microambiente e repertório imunológico. A dissociação efetiva de amostras de tecido humano em suspensões de células viáveis é uma entrada necessária para o pipeline de sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq). Ao contrário das abordagens de sequenciamento de RNA em massa, o scRNAseq nos permite inferir a heterogeneidade transcricional em amostras de tumor no nível de célula única. A incorporação dessa abordagem nos últimos anos levou a muitas descobertas, como a identificação de estados e programas celulares imunes e tumorais associados a respostas clínicas a imunoterapias e outros tipos de tratamentos. Além disso, tecnologias de célula única aplicadas a tecidos dissociados podem ser usadas para identificar o repertório de receptores de células T e B das regiões de cromatina acessíveis e a expressão de proteínas, usando anticorpos com código de barras de DNA (CITEseq).

A viabilidade e a qualidade da amostra dissociada são variáveis críticas ao usar essas tecnologias, pois podem afetar drasticamente a contaminação cruzada de células individuais com RNA ambiente, a qualidade dos dados e a interpretação. Além disso, protocolos de dissociação longos podem levar à eliminação de populações de células sensíveis e à regulação positiva de uma assinatura gênica de resposta ao estresse. Para superar essas limitações, criamos um protocolo de dissociação universal rápida, que foi validado em vários tipos de tumores humanos e murinos. O processo começa com a dissociação mecânica e enzimática, seguida de filtração, lise de sangue vermelho e enriquecimento de mortos-vivos, adequado para amostras com baixa entrada de células (por exemplo, biópsias por agulha). Este protocolo garante uma suspensão de célula única limpa e viável, fundamental para a geração bem-sucedida de emulsões de esferas de gel (GEMs), código de barras e sequenciamento.

Introdução

Embora muitos avanços na pesquisa do câncer tenham levado ao desenvolvimento e à aprovação da FDA de agentes direcionados a receptores inibitórios expressos em células imunes e tumorais, conhecidos como inibidores de bloqueio de checkpoint, a resistência à terapia e a identificação de mecanismos que impulsionam a resposta do paciente permanecem desafiadores¹. O complexo desafio de caracterizar a heterogeneidade do tumor em sua diversidade molecular e a intrincada interação entre as células tumorais e o microambiente imunológico requer novas abordagens para dissecar esse ecossistema complexo na resolução de uma única célula. Compreender as complexidades moleculares dentro dos tumores e seus microambientes é fundamental para o avanço das estratégias terapêuticas e decifrar a complexa biologia subjacente à progressão do câncer². O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) tornou-se cada vez mais popular porque fornece análise de alta resolução de células individuais em amostras complexas^de tumores ^3,4.

A heterogeneidade do tumor, abrangendo diversidades genéticas, epigenéticas e fenotípicas, representa um desafio para descobrir os meandros da biologia do câncer⁵. Os métodos convencionais de sequenciamento de RNA em massa tendem a obscurecer os perfis de expressão únicos e fenótipos de populações de células heterogêneas presentes nos tumores, pois esses métodos calculam a média dos sinais em populações de células inteiras⁴. Em contraste, o scRNA-seq permite a dissecação de tipos de células individuais, revelando diversas expressões gênicas, padrões de repressão e estados celulares negligenciados ^4,6. A premissa do scRNA-seq reside em sua capacidade de decodificar assinaturas genéticas e moleculares de células individuais, sendo imensamente promissora na descoberta de novas terapias contra o câncer⁷.

Ao decifrar os perfis de expressão gênica das células tumorais e das células estromais e imunes circundantes, os pesquisadores podem identificar novos alvos terapêuticos e desenvolver estratégias de medicina genética de precisão adaptadas a pacientes individuais⁶. Além disso, dissecar o repertório imunológico dentro do microambiente tumoral fornece informações cruciais sobre a interação entre células tumorais e efetores imunológicos, abrindo caminho para intervenções imunoterapêuticas³. Apesar dos avanços no uso de scRNAseq em amostras clínicas, vários desafios durante as etapas de processamento podem prejudicar a integridade, a viabilidade e a qualidade do RNA da célula dos dados gerados. Além disso, o processamento de tecido com baixa viabilidade celular pode aumentar os níveis de RNA ambiente nas gotículas geradas durante o encapsulamento de células individuais, resultando em contaminação cruzada e anotação incorreta de tipos de células, enquanto protocolos de dissociação longos realizados a 37 ° C podem levar à regulação positiva de uma assinatura gênica de resposta ao estresse em vários tipos de células ^{8,9, 10}. Agosto

O procedimento gradual (Figura 1A) descrito neste protocolo começa com a rápida dissociação mecânica e enzimática dos tumores, seguida pela filtração e remoção de células mortas, dependendo da viabilidade de cada amostra de tumor. Atualmente, esse procedimento tem sido verificado em amostras de melanoma¹¹, colorretal¹², carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço¹³, tumor pancreático e pulmonar (dados não publicados). Essas técnicas garantem a geração de suspensões celulares viáveis de alta qualidade, cruciais para análises a jusante¹⁴. Notavelmente, a remoção de glóbulos vermelhos, desprovidos de RNA sintetizado, torna-se imperativa para purificar a amostra¹⁵. A avaliação subsequente da contagem de células e a eliminação de células mortas servem como pré-requisito para a geração bem-sucedida de 10x Genomics Gel bead-in Emulsion (GEM), código de barras e aumento da recuperação de transcritos e células sequenciadas sem comprometer a exclusão de populações sensíveis (por exemplo, neutrófilos e células epiteliais)¹⁶. Essas etapas são fundamentais para desbloquear o potencial da análise de resolução de célula única em amostras de tumor ^9,10, descobrindo novos perfis de expressão gênica e assinaturas imunológicas necessárias para conduzir intervenções terapêuticas inovadoras e identificar novas vulnerabilidades tumorais.

Protocolo

Este estudo cumpriu todas as diretrizes institucionais relativas à amostragem de tecido humano. O consentimento informado foi recebido dos pacientes e os dados identificáveis da amostra foram anonimizados. As amostras são coletadas na sala de cirurgia, colocadas em uma solução de RPMI, solução salina ou PBS e confirmadas como cancerígenas pelo departamento de patologia antes do uso em pesquisa. Todas as etapas, exceto quando indicadas, devem ser realizadas a 4 °C ou no gelo. Trabalhe dentro de uma capa de biossegurança ao processar tecido humano. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Obtenção da amostra

1. Obtenha uma amostra de tumor sólido em um tubo de meio e coloque-a no gelo.
   1. Instrua a equipe da sala de cirurgia a transportar a amostra em um tubo contendo RPMI, solução salina ou PBS suficiente para submergir completamente o tecido e evitar a desidratação da amostra.
      NOTA: Garantir que a amostra não esteja desidratada é importante, pois isso diminuirá a viabilidade.
2. Arrefecer todas as centrifugadoras a 4 °C e levar o misturador térmico a 37 °C.
3. Retire as enzimas de dissociação de tumores humanos ou de camundongos preparadas (Tabela de Materiais), descongele no misturador térmico a 37 ° C e passe para o gelo depois de descongelado.
4. Recupere uma alíquota de 20 mL de RPMI.
5. Registre informações relevantes da amostra (por exemplo, ID do paciente, desidentificador, tipo de amostra).
6. Transferir a amostra para uma placa de cultura de tecidos de 60 mm (colocada sobre gelo) invertendo o tubo várias vezes e deitando o conteúdo na cápsula para garantir que todo o material da amostra é transferido. Se a amostra não foi entregue em mídia na chegada, adicione mídia RPMI fresca ao prato.
   1. Se a amostra estiver fragmentada, girar o tubo que contém a amostra a 450 × g, 4 °C por 5 min, descartar o sobrenadante, ressuspender a amostra em 420 μL de RPMI e passar para a seção 2.

2. Digestão mecânica e enzimática

1. Pipete 420 μL de meio do prato de amostra de 60 mm para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Tente incluir quaisquer fragmentos de amostra suspensos na mídia.
2. Transferir o tecido da amostra da placa de 60 mm para o tubo de 1,5 ml contendo o meio utilizando uma pinça. Corte a amostra com uma tesoura limpa dentro do tubo para que as peças tenham no máximo 2-3 mm de diâmetro.
3. Adicione enzimas de digestão, preparadas de acordo com as especificações do fabricante (Tabela de Materiais), à amostra nos seguintes volumes: 42 μL de Enzima H (proteases inespecíficas) para amostras humanas, Enzima D (proteases não específicas) para amostras murinas, 21 μL de enzima R (proteases inespecíficas) e 5 μL de enzima A (nuclease).
4. Adicione mais 420 μL de meio do prato ou até a marca de 1 mL no tubo. Não exceda 420 μL de meio.
5. Vortex o tubo por 5 s e coloque-o em um misturador térmico posicionado verticalmente de lado (Figura 1B). Incubar a 37 °C, 450 rpm, durante 15 min.
   NOTA: Durante a incubação, retire todos os materiais genômicos 10x necessários para a geração de GEM, pois eles requerem 30 minutos para equilibrar a temperatura ambiente

3. Filtragem de amostras

1. Coloque um filtro de célula de 50 μm em cima de um novo tubo cônico de 15 mL e prepare o filtro passando 1 mL de meio RPMI fresco através dele para o tubo.
2. Após a digestão, transfira a amostra para o tubo de 15 mL usando uma ponta de pipeta larga de baixa retenção de 1.000 μL. Lave o tubo de 1,5 mL com 1 mL de meio fresco e transfira o meio para o filtro para garantir que todo o material da amostra passe pelo filtro.
3. Obtenha uma seringa de plástico de 1 ml e retire apenas o êmbolo (elimine o resto da seringa). Usando a parte de trás do êmbolo da seringa, triture e empurre a amostra no filtro em um movimento de torção.
4. Lave o filtro com 5 mL de meio e qualquer meio restante do prato que continha a amostra (seção 1) para coletar quaisquer células que possam ter se desprendido do tecido.
5. Coloque um filtro de célula de 30 μm em cima de um novo tubo cônico de 15 mL, prepare o filtro com 1 mL de meio e transfira o conteúdo do tubo contendo a amostra dissociada através do filtro.
   NOTA: Esta etapa removerá detritos grandes que podem entupir ou causar uma falha de umedecimento ao executar a amostra usando os chips microfluídicos 10x Genomics.

4. Lise de glóbulos vermelhos

1. Centrifugar a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspire a mídia, tomando cuidado para não mexer no pellet.
2. Ressuspenda no tampão ACK Lysis para remover os glóbulos vermelhos (RBCs) e registre o volume usado. O volume dependerá do tamanho do pellet e da extensão das hemácias no pellet.
   NOTA: A solução de amostra ACK ressuspensa deve ser incolor quando tampão de lise ACK suficiente for adicionado, pois isso limpará os glóbulos vermelhos da amostra.
3. Centrifugar o tubo de recolha a 450 × g, 4 °C, durante 5 min, e aspirar o sobrenadante.
4. Repita as etapas 4.2-4.3 conforme necessário até que o pellet de amostra não tenha cor vermelha visível após a centrifugação (Figura 2). Registre todos os volumes extras do buffer de lise ACK usados nesta etapa.
5. Ressuspenda o pellet de amostra em meio fresco em preparação para a contagem.

5. Contagem de células

1. Coloque 10 μL de azul de tripano em um tubo de 1,5 mL. Misture suavemente as células dissociadas, pegue 10 μL de amostra e misture (1:1) com o azul de tripano. Carregue 10 μL em cada lado de um hemocitômetro e conte as células.
2. Registre a concentração de células, contagem total de células vivas, porcentagem de viabilidade e volume final do meio após a contagem.
3. Certifique-se de que a contagem de células esteja entre 700 e 1.200 células/μL (7 ×^{10 5}- 1,2 × 10⁶/mL) para uma execução genômica ideal de 10x.
   1. Se a amostra estiver muito concentrada, dilua-a com meio e reconte-a.
   2. Se a amostra estiver demasiado diluída, centrifugar a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min, e ressuspender num volume menor de meios.
   3. Se a viabilidade celular estiver abaixo de 80%, execute um procedimento de mortos-vivos para remover as células mortas.
   4. Se houver menos de um milhão de células, consulte a seção 6.
   5. Se houver mais de um milhão de células e a viabilidade > 10%, consulte a seção 6.
   6. Se houver mais de um milhão de células e a viabilidade < 10%, consulte a seção 7.
   7. Se a viabilidade celular for superior a 80%, mantenha as células processadas no gelo e prossiga imediatamente para a geração de GEM de acordo com as instruções do fabricante.

6. Remoção de células mortas - Kit 1

NOTA: Trabalhe dentro de uma capa de biossegurança ao usar os reagentes de remoção de células mortas, pois eles podem ser facilmente contaminados.

1. Centrifugar a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min.
2. Prepare o meio de isolamento em um tubo cônico de 15 mL e mantenha-o em temperatura ambiente: 9.8 mL de PBS, 10 μL de CaCl₂ e 200 μL de FCS inativado por calor (adicionado em uma capa de biossegurança).
3. Após centrifugação, aspirar o meio do pellet e ressuspender em 1 ml do meio de isolamento.
4. Centrifugar novamente o tubo a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 μl de meios de isolamento.
5. Transfira 100 μL de amostra em meio de isolamento para um poço de um tubo de tira de PCR de 0,2 mL.
6. Em uma coifa de biossegurança, adicione 10 μL de coquetel de anexina V e 10 μL de coquetel de seleção de biotina ao poço contendo 100 μL da amostra em meio isolado. Pipetar misturar a solução e deixá-la repousar à temperatura ambiente durante 4 min.
7. Após 4 min, vórtice as partículas magnéticas revestidas com dextrana por 30 s. Adicione 20 μL dos grânulos e 60 μL de meio de isolamento à amostra (um volume total de 200 μL). Se a viabilidade for inferior a 40%, dimensione a quantidade de grânulos até 40 μL enquanto ajusta o volume do meio de isolamento (até 40 μL), mantendo um volume total de 200 μL. Pipete a mistura e deixe a solução descansar em temperatura ambiente por 3 min.
8. Coloque o tubo de tira em um separador magnético genômico 10x (na configuração alta) por 5 min em temperatura ambiente.
9. Transfira o líquido do tubo de tira sem perturbar os grânulos para um novo tubo de microcentrífuga lo-bind de 1,5 mL. Não remova o tubo de tira do ímã.
10. Centrifugar o tubo de 1,5 ml que contém a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento num volume adequado de meios RPMI com base na dimensão do sedimento e na contagem de células, conforme descrito na secção 5. Repita o procedimento de remoção de células mortas se a viabilidade permanecer abaixo de 80% (Figura 3 e Figura 4).
    NOTA: Não ressuspenda as células em meios isolados para geração de GEM a jusante, pois o cloreto de cálcio interferirá no processo de encapsulamento e na etapa de transcrição reversa (RT).
11. Mantenha as células processadas no gelo se a viabilidade celular estiver acima de 80% e prossiga imediatamente para a geração de GEM de acordo com as instruções do fabricante.

7. Remoção de células mortas - Kit 2

NOTA: Trabalhe dentro de uma capa de biossegurança ao usar os reagentes do kit.

1. Coloque as microesferas e a solução de estoque 20x Binding Buffer dentro de uma capa de biossegurança.
2. Centrifugar a suspensão da amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min.
3. Prepare 1x solução tampão em condições estéreis usando 1 mL da solução de estoque tampão de ligação 20x pipetada em 19 mL de água destilada livre de DNAse e RNAse.
4. Uma vez concluída a centrifugação, aspire o sobrenadante, adicione as microesferas, misture suavemente a amostra e incube em temperatura ambiente por 15 min.
   1. Quando a contagem de células for 10,⁷ ou menos, adicione 100 μL das microesferas.
   2. Para contagens superiores a 10⁷ células totais, ajuste as microesferas para uma concentração final de 100 μL por 10⁷ células vivas.
5. Durante a incubação, obtenha uma coluna de seleção positiva MACS, MACS multistand e o separador magnético correspondente. Certifique-se de que o separador esteja nivelado no suporte múltiplo e que nenhum outro objeto metálico ou magnético esteja próximo ao suporte, pois a força magnética é poderosa e pode afetar a eficiência da remoção de células mortas. Coloque a coluna confortavelmente em um suporte separador com as asas voltadas para fora.
6. Após a incubação da amostra, se o volume total de ressuspensão for inferior a 500 μL, adicione 1x Binding Buffer até que o volume total seja de 500 μL.
7. Coloque um tubo cônico de 15 mL abaixo da coluna e prepare a coluna com 3 mL de 1x tampão de ligação.
8. Substitua o tubo cônico por um novo cônico de 15 mL para coleta de amostras de células e adicione a amostra à coluna, permitindo que ela flua completamente através da coluna.
9. Lave a coluna 4 x 3 mL de 1x Binding Buffer, adicionando apenas uma lavagem de cada vez após a lavagem anterior ter fluído inteiramente pela coluna.
10. Após a quarta lavagem, centrifugar o tubo cónico contendo as células isoladas durante 5 min a 450 × g, 4 °C. Descarte a coluna e o buffer de associação 1x restante.
11. Ressuspenda a solução da amostra na quantidade apropriada de meio RPMI com base no tamanho do pellet e conte as células isoladas usando o método descrito na seção 5 (Figura 3 e Figura 5).
    1. Se a viabilidade permanecer abaixo de 80% e o número total de células for 10⁶ ou menos, repita a seção 6.
    2. Se a viabilidade celular estiver acima de 80%, mantenha as células processadas no gelo e prossiga imediatamente para a geração de GEM de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

Uma biópsia de melanoma suspensa em RPMI foi obtida e imediatamente colocada em gelo. A amostra foi transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 420 μL de RPMI e enzimas de digestão, picada em pequenos pedaços usando tesoura e submetida à digestão enzimática subsequente por 15 min em um misturador térmico a 37 °C posicionado verticalmente (Figura 1). Após a digestão, a amostra foi filtrada através de um filtro descartável estéril de 50 μm e o filtro foi lavado com RPMI fresco para aumentar o rendimento celular (Figura 1). As partes restantes do tecido deixadas após as lavagens foram descartadas, pois são materiais biológicos indesejados (por exemplo, tecido adiposo).

Com base na cor do pellet celular resultante, foram necessários 15 mL de tampão de lise ACK para remover os glóbulos vermelhos (Figura 2). Após a ressuspensão em 3 mL de meio RPMI, a contagem total de células foi de 1 × 10⁶/mL, com viabilidade de <80% (Figura 3A). Isso indicou que um ciclo de enriquecimento de células vivas usando o Kit 1 (seção 6 do protocolo) era necessário antes de prosseguir para o carregamento genômico de 10x (Figura 4). Se essa amostra tivesse mais de 1 milhão de células e tivesse uma viabilidade inferior a 10%, a remoção de células mortas - Kit 2 teria sido utilizada (Figura 5). A amostra foi lavada com meio de isolamento e foram adicionados 10 μL de Anexina V e coquetel de seleção de biotina, seguidos de 20 μL de esferas magnéticas e 60 μL de meio de isolamento, conforme descrito na seção 6 do protocolo (Figura 4). Após esse procedimento, a amostra foi ressuspensa em 500 μL de meio e recontada. A contagem de células vivas foi de 4,9 × 10⁵/mL com viabilidade acima de 90% (Figura 3B), e a amostra seguiu imediatamente para a geração de GEM de acordo com as instruções do fabricante.

Figura 1: Visão geral do processamento de amostras de tumor. (A) Ilustração do processo passo a passo do protocolo de dissociação de tecidos. (B) A digestão de uma amostra usando um misturador térmico posicionado verticalmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Tratamento pré-ACK e pós-ACK de uma amostra de melanoma levemente pigmentada. (A) A imagem mostra uma amostra de melanoma que foi filtrada e peletizada após a etapa de digestão antes da lise dos glóbulos vermelhos (RBC) usando ACK. (B) A imagem mostra a mesma amostra de melanoma após a remoção de hemácias usando tampão ACK. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Visão das células no hemocitômetro sob azul de tripano ampliado com aumento de 200x. (A) Imagem mostrando o aparecimento de células azuis antes do enriquecimento de células vivas, representando células mortas, com viabilidade inferior a 80%. (B) Imagem mostrando a amostra após enriquecimento de células vivas usando o protocolo do Kit 1 (etapa 6 do protocolo), mostrando aumento da viabilidade acima de 90%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Visão geral do isolamento de células de amostra de mortos-vivos usando o Kit 1. Esta etapa é realizada quando menos de um milhão ou mais de um milhão de células com viabilidade >10% são detectadas após a contagem de células (etapa 5 do protocolo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Visão geral do isolamento de células mortas vivas usando as microesferas de remoção de células mortas no Kit 2. Esta etapa é realizada quando há mais de um milhão de células e uma viabilidade de <10%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Validação da análise de célula única de uma amostra não manipulada após um ciclo de enriquecimento de células vivas usando o protocolo modificado do Kit 1. A parte superior mostra uma análise UMAP demonstrando consistência em grupos e tipos de células antes e depois do enriquecimento de células vivas. A parte inferior resume as saídas de sequenciamento geradas pelo Cell Ranger. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo descreve a dissociação de amostras de tumores humanos ou murinos em uma suspensão de célula única para sequenciamento de scRNA usando o sistema microfluídico 10x Genomics. No processamento de tecidos que geralmente vêm de cânceres raros ou fazem parte de ensaios clínicos em andamento ou experimentos longos para tumores murinos, a amostra deve ser preservada de maneira ideal e cuidadosa entre todas as etapas. Todas as etapas devem ser realizadas rapidamente no gelo ou a 4 °C para manter os perfis de RNA celular nativo e evitar a degradação, pois trabalhar à temperatura ambiente por longos períodos afetará a qualidade transcriptômica ^17,18.

Várias medidas devem ser tomadas para garantir que a perda de células durante todo o procedimento seja mínima, especialmente ao processar biópsias por agulha grossa pequena¹⁷. Garantir que todos os fragmentos da amostra do tumor sejam incluídos na digestão levará ao resultado mais bem-sucedido, pois mais células extraídas da amostra melhorarão o encapsulamento e sequenciamento futuros da 10x Genomics e o número total de células e transcritos recuperados para análise. Se a amostra ficar alojada no tubo em que chega, o meio pode ser adicionado, o tubo invertido e transferido para o prato para processamento. Se a amostra inicial estiver fragmentada ou a solução estiver turva, indicando a presença de células em suspensão, certifique-se de que toda a amostra seja coletada para digestão enzimática, centrifugando a amostra com a solução em que chegou e ressuspendendo-a em volume de meio para digestão (seção 1 do protocolo).

Ao aspirar, certifique-se de que o pellet não seja perturbado durante todo o procedimento. Deixe volume extra ao aspirar, que pode ser removido com uma pipeta P200. Se o pellet for perturbado, o volume pode ser dispensado de volta ao tubo e centrifugado novamente. Após a lise ACK ou após a remoção de mortos-vivos, a amostra pode estar em volumes tão baixos quanto 25 μL. Assim, é fundamental não perder nenhum sobrenadante contendo as células. A digestão mecânica adequada é essencial para garantir que as células de interesse sejam expostas à digestão enzimática. Uma digestão enzimática mais longa usando as enzimas apropriadas e misturador térmico pode ser necessária para amostras maiores ^9,19,20. Embora os nomes específicos das enzimas sejam proprietários, o fabricante observa a enzima A como nuclease e as enzimas H, D e R como proteases inespecíficas. Passar o máximo possível da amostra do tumor pelo filtro é vital para garantir o maior rendimento celular possível. A filtragem bem-sucedida fará com que o filtro não tenha nenhuma ou apenas uma pequena amostra visível capturada nele. Algumas partes da amostra podem não ser filtradas se tiverem grandes quantidades de tecido adiposo ou conjuntivo. Se houver pedaços visíveis da amostra na parte superior do filtro, continue usando a parte de trás do êmbolo da seringa para moer e empurrar toda a amostra usando o movimento de torção enquanto lava também a parte superior do filtro com mais mídia.

O sucesso da etapa de lise dos glóbulos vermelhos é determinado pela visualização da amostra ao microscópio, uma vez que a amostra é carregada no hemocitômetro para contagem e viabilidade ^15,21. Se ACK suficiente for adicionado à amostra para limpar os glóbulos vermelhos, não haverá glóbulos vermelhos ou vermelhidão visível no pellet. Se os glóbulos vermelhos forem visíveis na amostra, ACK adicional deve ser adicionado e a amostra deve ser centrifugada novamente a 450 × g, 4 °C por 5 min. Uma vez feito, o sobrenadante deve ser aspirado e o pellet de células pode ser ressuspenso em meio RPMI para visualização e contagem.

Para garantir uma execução ideal de 10x Genomics, a contagem de células deve estar entre 700 e 1.200 células/μL (7 × 10⁵- 1,2 × 10⁶/mL). Uma alta concentração aumentará a taxa de duplicação (duas células em uma gota) durante a formação de gotículas. Se a contagem for muito alta, uma quantidade apropriada de meio pode ser adicionada à amostra e recarregada em um hemocitômetro para recontagem. Se a concentração for demasiado baixa, a amostra pode ser centrifugada novamente a 450 × g, 4 °C durante 5 min, aspirando o sobrenadante e ressuspendendo-o num volume de meio inferior antes da recontagem. A amostra está pronta para ser carregada para 10x Genomics se a viabilidade da célula viva estiver acima de 80% (Figura 3).

Se a viabilidade da amostra estiver abaixo de 80%, um procedimento de morto-vivo é necessário antes do carregamento de 10x Genomics¹⁶. Se uma rodada de remoção de mortos-vivos não tiver trazido a porcentagem de viabilidade acima de 80%, outra rodada deve ser realizada se houver mais de 1 × 10⁵ células no total. Maior viabilidade evitará entupimentos no protocolo 10x Genomics subsequente, aumentará a recuperação celular e reduzirá a presença de RNA ambiente. O protocolo do Kit 1 foi otimizado e miniaturizado para dissociar rapidamente amostras de tecido menores com contagens de células mais baixas. O volume reduzido de reagentes e os tempos de incubação reduzidos aumentam o rendimento celular e evitam uma assinatura gênica de resposta ao estresse (FOS, JUN e JUNB) em várias células ^9,22. Métodos alternativos para enriquecer células vivas incluem coloração e classificação. No entanto, isso resultaria em redução do rendimento celular, incubação prolongada de coloração, o que poderia afetar os estados celulares (por exemplo, anticorpos aCD3e ativarão as células T) e estresse induzido pela pressão da máquina sobre as células durante a classificação ^9,22. O exemplo mostrado na Figura 6 ilustra um UMAP gerado após o sequenciamento 10X Genomics Gene Expression (GEX) e a conversão dos códigos de barras das células geradas em arquivos FASTQ que foram então concatenados e alinhados via CellRanger. Os resultados subsequentes do sequenciamento e as comparações de remoção de mortos-vivos foram plotados, demonstrando populações de células em uma amostra antes e depois da remoção de mortos-vivos e melhor qualidade do sequenciamento. A amostra de pulmão mostrada na Figura 6 indicou um problema com a fração de leituras, pois estava abaixo de 70%. Este aviso foi gerado devido ao alto RNA ambiente em uma população de células lisadas ou mortas. No entanto, após a remoção das células mortas, esse erro não estava mais presente e resultou em uma porcentagem maior de leituras de fração nas células²³.

O sequenciamento de RNA de célula única é um processo caro e precário que avançou drasticamente no campo da imunologia do câncer e da pesquisa do câncer. Ele permite um interrogatório adicional de genes, estados celulares e programas expressos e reprimidos em tipos específicos de células, divulgando mais sobre o comportamento e a heterogeneidade dos cânceres. O tecido abaixo do ideal ou de baixa viabilidade tem maior probabilidade de gerar dados de baixa qualidade que podem criar artefatos que afastam a realidade da biologia do tumor, enfatizando a importância crítica da dissociação adequada do tumor e da preparação da amostra.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL pipeta sorológica	Corning	357551
1000 μ L ponteiras de pipeta de baixa retenção	Rainin	30389213
1000 μ L ponteiras de pipeta largas de baixa retenção	Rainin	30389218
1000 μ Pontas de pipeta L	Rainin	30389212
10x Separador Magnético	10x Genômica	120250
Tubos cônicos de 15 mL	Pipeta de aspiração Corning	430052
2 mL Pipeta de aspiração	Corning	357558
20 μ L ponteiras de pipeta de baixa retenção	Rainin	30389226
20 μ Ponteiras de pipeta L	Rainin	30389225
200 μ L ponteiras de pipeta de baixa retenção	Rainin	30389240
200 μ Ponteiras de pipeta L	Rainin	30389239
50 mL Tubo cônico de polipropileno	Falcon	352098
60 x 15 mm Placa de cultura de tecidos	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD Seringa de 1 mL	Becton, Dickinson and Company	3090659
Hemocitômetro Bright-Line	Hausser Scientific	551660
Solução de Cloreto de Cálcio	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Lâminas de contagem de células Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
para contador de células TC20	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μ m filtros descartáveis estéreis	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μ m filtros descartáveis estéreis	Sysmex	04-004-2327
Kit de remoção de células mortas	Miltenyi Biotec	130-090-101	Loja a -20 ° C; kit 2
Pinças de Dissecação, Ponta Fina	VWR	82027-386
Tubos de Microcentrífuga DNA LoBind, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Armazene em 4 ° C; Kit 1
Eppendorf centrífuga 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrífuga 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Controlador de pipeta eletrônico	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Modelo 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Armazene a 4 ° C, use em um capuz biológico
Tesoura de aço inoxidável alemã	Ferramentas de ciência fina	14568-12
Microscópio Leica Dmi1	Coluna 454793		Leica
	Microsystems Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipeta Pipet-Lite LTS L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+	Ímã Quadro	17014392
	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Loja em 4 ° C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Mancha azul de tripano 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Kit de Dissociação de Tumor, Humano	Miltenyi Biotec	130-095-929	Armazene em -20 ° C, prepare as enzimas de acordo com as instruções do kit: Reconstitua o frasco da Enzima H liofilizada em 3 mL de RPMI 1640 Reconstitua o frasco da Enzima R liofilizada em 2.7 mL de RPMI 1640 Reconstitua o frasco da Enzima A liofilizada em 1 mL do Tampão A fornecido com o kit.
Kit de Dissociação de Tumor, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Loja em -20 ° C, prepare as enzimas de acordo com as instruções do kit: Reconstitua o frasco da Enzima D liofilizada em 3 mL de RPMI 1640 Reconstitua o frasco da Enzima R liofilizada em 2.7 mL de RPMI 1640 Reconstitua o frasco da Enzima A liofilizada em 1 mL do Tampão A fornecido com o kit.
Água Destilada UltraPura	Invitrogen	10977-015	Armazene a 4 ° O