Este protocolo descreve o procedimento para dissociar rapidamente amostras de tumores humanos e de camundongos para sequenciamento de RNA de célula única.
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Artigo de método
Dissociação de amostras de tecido tumoral humano e de camundongo para sequenciamento de RNA de célula única
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Neste artigo
Resumo
Resumo
As amostras de tumores humanos contêm uma infinidade de informações sobre seu microambiente e repertório imunológico. A dissociação efetiva de amostras de tecido humano em suspensões de células viáveis é uma entrada necessária para o pipeline de sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq). Ao contrário das abordagens de sequenciamento de RNA em massa, o scRNAseq nos permite inferir a heterogeneidade transcricional em amostras de tumor no nível de célula única. A incorporação dessa abordagem nos últimos anos levou a muitas descobertas, como a identificação de estados e programas celulares imunes e tumorais associados a respostas clínicas a imunoterapias e outros tipos de tratamentos. Além disso, tecnologias de célula única aplicadas a tecidos dissociados podem ser usadas para identificar o repertório de receptores de células T e B das regiões de cromatina acessíveis e a expressão de proteínas, usando anticorpos com código de barras de DNA (CITEseq).
A viabilidade e a qualidade da amostra dissociada são variáveis críticas ao usar essas tecnologias, pois podem afetar drasticamente a contaminação cruzada de células individuais com RNA ambiente, a qualidade dos dados e a interpretação. Além disso, protocolos de dissociação longos podem levar à eliminação de populações de células sensíveis e à regulação positiva de uma assinatura gênica de resposta ao estresse. Para superar essas limitações, criamos um protocolo de dissociação universal rápida, que foi validado em vários tipos de tumores humanos e murinos. O processo começa com a dissociação mecânica e enzimática, seguida de filtração, lise de sangue vermelho e enriquecimento de mortos-vivos, adequado para amostras com baixa entrada de células (por exemplo, biópsias por agulha). Este protocolo garante uma suspensão de célula única limpa e viável, fundamental para a geração bem-sucedida de emulsões de esferas de gel (GEMs), código de barras e sequenciamento.
Introdução
Embora muitos avanços na pesquisa do câncer tenham levado ao desenvolvimento e à aprovação da FDA de agentes direcionados a receptores inibitórios expressos em células imunes e tumorais, conhecidos como inibidores de bloqueio de checkpoint, a resistência à terapia e a identificação de mecanismos que impulsionam a resposta do paciente permanecem desafiadores1. O complexo desafio de caracterizar a heterogeneidade do tumor em sua diversidade molecular e a intrincada interação entre as células tumorais e o microambiente imunológico requer novas abordagens para dissecar esse ecossistema complexo na resolução de uma única célula. Compreender as complexidades moleculares dentro dos tumores e seus microambientes é fundamental para o avanço das estratégias terapêuticas e decifrar a complexa biologia subjacente à progressão do câncer2. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) tornou-se cada vez mais popular porque fornece análise de alta resolução de células individuais em amostras complexasde tumores 3,4.
A heterogeneidade do tumor, abrangendo diversidades genéticas, epigenéticas e fenotípicas, representa um desafio para descobrir os meandros da biologia do câncer5. Os métodos convencionais de sequenciamento de RNA em massa tendem a obscurecer os perfis de expressão únicos e fenótipos de populações de células heterogêneas presentes nos tumores, pois esses métodos calculam a média dos sinais em populações de células inteiras4. Em contraste, o scRNA-seq permite a dissecação de tipos de células individuais, revelando diversas expressões gênicas, padrões de repressão e estados celulares negligenciados 4,6. A premissa do scRNA-seq reside em sua capacidade de decodificar assinaturas genéticas e moleculares de células individuais, sendo imensamente promissora na descoberta de novas terapias contra o câncer7.
Ao decifrar os perfis de expressão gênica das células tumorais e das células estromais e imunes circundantes, os pesquisadores podem identificar novos alvos terapêuticos e desenvolver estratégias de medicina genética de precisão adaptadas a pacientes individuais6. Além disso, dissecar o repertório imunológico dentro do microambiente tumoral fornece informações cruciais sobre a interação entre células tumorais e efetores imunológicos, abrindo caminho para intervenções imunoterapêuticas3. Apesar dos avanços no uso de scRNAseq em amostras clínicas, vários desafios durante as etapas de processamento podem prejudicar a integridade, a viabilidade e a qualidade do RNA da célula dos dados gerados. Além disso, o processamento de tecido com baixa viabilidade celular pode aumentar os níveis de RNA ambiente nas gotículas geradas durante o encapsulamento de células individuais, resultando em contaminação cruzada e anotação incorreta de tipos de células, enquanto protocolos de dissociação longos realizados a 37 ° C podem levar à regulação positiva de uma assinatura gênica de resposta ao estresse em vários tipos de células 8,9, 10. Agosto
O procedimento gradual (Figura 1A) descrito neste protocolo começa com a rápida dissociação mecânica e enzimática dos tumores, seguida pela filtração e remoção de células mortas, dependendo da viabilidade de cada amostra de tumor. Atualmente, esse procedimento tem sido verificado em amostras de melanoma11, colorretal12, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço13, tumor pancreático e pulmonar (dados não publicados). Essas técnicas garantem a geração de suspensões celulares viáveis de alta qualidade, cruciais para análises a jusante14. Notavelmente, a remoção de glóbulos vermelhos, desprovidos de RNA sintetizado, torna-se imperativa para purificar a amostra15. A avaliação subsequente da contagem de células e a eliminação de células mortas servem como pré-requisito para a geração bem-sucedida de 10x Genomics Gel bead-in Emulsion (GEM), código de barras e aumento da recuperação de transcritos e células sequenciadas sem comprometer a exclusão de populações sensíveis (por exemplo, neutrófilos e células epiteliais)16. Essas etapas são fundamentais para desbloquear o potencial da análise de resolução de célula única em amostras de tumor 9,10, descobrindo novos perfis de expressão gênica e assinaturas imunológicas necessárias para conduzir intervenções terapêuticas inovadoras e identificar novas vulnerabilidades tumorais.
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Protocolo
Este estudo cumpriu todas as diretrizes institucionais relativas à amostragem de tecido humano. O consentimento informado foi recebido dos pacientes e os dados identificáveis da amostra foram anonimizados. As amostras são coletadas na sala de cirurgia, colocadas em uma solução de RPMI, solução salina ou PBS e confirmadas como cancerígenas pelo departamento de patologia antes do uso em pesquisa. Todas as etapas, exceto quando indicadas, devem ser realizadas a 4 °C ou no gelo. Trabalhe dentro de uma capa de biossegurança ao processar tecido humano. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Obtenção da amostra
- Obtenha uma amostra de tumor sólido em um tubo de meio e coloque-a no gelo.
- Instrua a equipe da sala de cirurgia a transportar a amostra em um tubo contendo RPMI, solução salina ou PBS suficiente para submergir completamente o tecido e evitar a desidratação da amostra.
NOTA: Garantir que a amostra não esteja desidratada é importante, pois isso diminuirá a viabilidade.
- Instrua a equipe da sala de cirurgia a transportar a amostra em um tubo contendo RPMI, solução salina ou PBS suficiente para submergir completamente o tecido e evitar a desidratação da amostra.
- Arrefecer todas as centrifugadoras a 4 °C e levar o misturador térmico a 37 °C.
- Retire as enzimas de dissociação de tumores humanos ou de camundongos preparadas (Tabela de Materiais), descongele no misturador térmico a 37 ° C e passe para o gelo depois de descongelado.
- Recupere uma alíquota de 20 mL de RPMI.
- Registre informações relevantes da amostra (por exemplo, ID do paciente, desidentificador, tipo de amostra).
- Transferir a amostra para uma placa de cultura de tecidos de 60 mm (colocada sobre gelo) invertendo o tubo várias vezes e deitando o conteúdo na cápsula para garantir que todo o material da amostra é transferido. Se a amostra não foi entregue em mídia na chegada, adicione mídia RPMI fresca ao prato.
- Se a amostra estiver fragmentada, girar o tubo que contém a amostra a 450 × g, 4 °C por 5 min, descartar o sobrenadante, ressuspender a amostra em 420 μL de RPMI e passar para a seção 2.
2. Digestão mecânica e enzimática
- Pipete 420 μL de meio do prato de amostra de 60 mm para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Tente incluir quaisquer fragmentos de amostra suspensos na mídia.
- Transferir o tecido da amostra da placa de 60 mm para o tubo de 1,5 ml contendo o meio utilizando uma pinça. Corte a amostra com uma tesoura limpa dentro do tubo para que as peças tenham no máximo 2-3 mm de diâmetro.
- Adicione enzimas de digestão, preparadas de acordo com as especificações do fabricante (Tabela de Materiais), à amostra nos seguintes volumes: 42 μL de Enzima H (proteases inespecíficas) para amostras humanas, Enzima D (proteases não específicas) para amostras murinas, 21 μL de enzima R (proteases inespecíficas) e 5 μL de enzima A (nuclease).
- Adicione mais 420 μL de meio do prato ou até a marca de 1 mL no tubo. Não exceda 420 μL de meio.
- Vortex o tubo por 5 s e coloque-o em um misturador térmico posicionado verticalmente de lado (Figura 1B). Incubar a 37 °C, 450 rpm, durante 15 min.
NOTA: Durante a incubação, retire todos os materiais genômicos 10x necessários para a geração de GEM, pois eles requerem 30 minutos para equilibrar a temperatura ambiente
3. Filtragem de amostras
- Coloque um filtro de célula de 50 μm em cima de um novo tubo cônico de 15 mL e prepare o filtro passando 1 mL de meio RPMI fresco através dele para o tubo.
- Após a digestão, transfira a amostra para o tubo de 15 mL usando uma ponta de pipeta larga de baixa retenção de 1.000 μL. Lave o tubo de 1,5 mL com 1 mL de meio fresco e transfira o meio para o filtro para garantir que todo o material da amostra passe pelo filtro.
- Obtenha uma seringa de plástico de 1 ml e retire apenas o êmbolo (elimine o resto da seringa). Usando a parte de trás do êmbolo da seringa, triture e empurre a amostra no filtro em um movimento de torção.
- Lave o filtro com 5 mL de meio e qualquer meio restante do prato que continha a amostra (seção 1) para coletar quaisquer células que possam ter se desprendido do tecido.
- Coloque um filtro de célula de 30 μm em cima de um novo tubo cônico de 15 mL, prepare o filtro com 1 mL de meio e transfira o conteúdo do tubo contendo a amostra dissociada através do filtro.
NOTA: Esta etapa removerá detritos grandes que podem entupir ou causar uma falha de umedecimento ao executar a amostra usando os chips microfluídicos 10x Genomics.
4. Lise de glóbulos vermelhos
- Centrifugar a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspire a mídia, tomando cuidado para não mexer no pellet.
- Ressuspenda no tampão ACK Lysis para remover os glóbulos vermelhos (RBCs) e registre o volume usado. O volume dependerá do tamanho do pellet e da extensão das hemácias no pellet.
NOTA: A solução de amostra ACK ressuspensa deve ser incolor quando tampão de lise ACK suficiente for adicionado, pois isso limpará os glóbulos vermelhos da amostra. - Centrifugar o tubo de recolha a 450 × g, 4 °C, durante 5 min, e aspirar o sobrenadante.
- Repita as etapas 4.2-4.3 conforme necessário até que o pellet de amostra não tenha cor vermelha visível após a centrifugação (Figura 2). Registre todos os volumes extras do buffer de lise ACK usados nesta etapa.
- Ressuspenda o pellet de amostra em meio fresco em preparação para a contagem.
5. Contagem de células
- Coloque 10 μL de azul de tripano em um tubo de 1,5 mL. Misture suavemente as células dissociadas, pegue 10 μL de amostra e misture (1:1) com o azul de tripano. Carregue 10 μL em cada lado de um hemocitômetro e conte as células.
- Registre a concentração de células, contagem total de células vivas, porcentagem de viabilidade e volume final do meio após a contagem.
- Certifique-se de que a contagem de células esteja entre 700 e 1.200 células/μL (7 ×10 5- 1,2 × 106/mL) para uma execução genômica ideal de 10x.
- Se a amostra estiver muito concentrada, dilua-a com meio e reconte-a.
- Se a amostra estiver demasiado diluída, centrifugar a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min, e ressuspender num volume menor de meios.
- Se a viabilidade celular estiver abaixo de 80%, execute um procedimento de mortos-vivos para remover as células mortas.
- Se houver menos de um milhão de células, consulte a seção 6.
- Se houver mais de um milhão de células e a viabilidade > 10%, consulte a seção 6.
- Se houver mais de um milhão de células e a viabilidade < 10%, consulte a seção 7.
- Se a viabilidade celular for superior a 80%, mantenha as células processadas no gelo e prossiga imediatamente para a geração de GEM de acordo com as instruções do fabricante.
6. Remoção de células mortas - Kit 1
NOTA: Trabalhe dentro de uma capa de biossegurança ao usar os reagentes de remoção de células mortas, pois eles podem ser facilmente contaminados.
- Centrifugar a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min.
- Prepare o meio de isolamento em um tubo cônico de 15 mL e mantenha-o em temperatura ambiente: 9.8 mL de PBS, 10 μL de CaCl2 e 200 μL de FCS inativado por calor (adicionado em uma capa de biossegurança).
- Após centrifugação, aspirar o meio do pellet e ressuspender em 1 ml do meio de isolamento.
- Centrifugar novamente o tubo a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 μl de meios de isolamento.
- Transfira 100 μL de amostra em meio de isolamento para um poço de um tubo de tira de PCR de 0,2 mL.
- Em uma coifa de biossegurança, adicione 10 μL de coquetel de anexina V e 10 μL de coquetel de seleção de biotina ao poço contendo 100 μL da amostra em meio isolado. Pipetar misturar a solução e deixá-la repousar à temperatura ambiente durante 4 min.
- Após 4 min, vórtice as partículas magnéticas revestidas com dextrana por 30 s. Adicione 20 μL dos grânulos e 60 μL de meio de isolamento à amostra (um volume total de 200 μL). Se a viabilidade for inferior a 40%, dimensione a quantidade de grânulos até 40 μL enquanto ajusta o volume do meio de isolamento (até 40 μL), mantendo um volume total de 200 μL. Pipete a mistura e deixe a solução descansar em temperatura ambiente por 3 min.
- Coloque o tubo de tira em um separador magnético genômico 10x (na configuração alta) por 5 min em temperatura ambiente.
- Transfira o líquido do tubo de tira sem perturbar os grânulos para um novo tubo de microcentrífuga lo-bind de 1,5 mL. Não remova o tubo de tira do ímã.
- Centrifugar o tubo de 1,5 ml que contém a amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento num volume adequado de meios RPMI com base na dimensão do sedimento e na contagem de células, conforme descrito na secção 5. Repita o procedimento de remoção de células mortas se a viabilidade permanecer abaixo de 80% (Figura 3 e Figura 4).
NOTA: Não ressuspenda as células em meios isolados para geração de GEM a jusante, pois o cloreto de cálcio interferirá no processo de encapsulamento e na etapa de transcrição reversa (RT). - Mantenha as células processadas no gelo se a viabilidade celular estiver acima de 80% e prossiga imediatamente para a geração de GEM de acordo com as instruções do fabricante.
7. Remoção de células mortas - Kit 2
NOTA: Trabalhe dentro de uma capa de biossegurança ao usar os reagentes do kit.
- Coloque as microesferas e a solução de estoque 20x Binding Buffer dentro de uma capa de biossegurança.
- Centrifugar a suspensão da amostra a 450 × g, 4 °C durante 5 min.
- Prepare 1x solução tampão em condições estéreis usando 1 mL da solução de estoque tampão de ligação 20x pipetada em 19 mL de água destilada livre de DNAse e RNAse.
- Uma vez concluída a centrifugação, aspire o sobrenadante, adicione as microesferas, misture suavemente a amostra e incube em temperatura ambiente por 15 min.
- Quando a contagem de células for 10,7 ou menos, adicione 100 μL das microesferas.
- Para contagens superiores a 107 células totais, ajuste as microesferas para uma concentração final de 100 μL por 107 células vivas.
- Durante a incubação, obtenha uma coluna de seleção positiva MACS, MACS multistand e o separador magnético correspondente. Certifique-se de que o separador esteja nivelado no suporte múltiplo e que nenhum outro objeto metálico ou magnético esteja próximo ao suporte, pois a força magnética é poderosa e pode afetar a eficiência da remoção de células mortas. Coloque a coluna confortavelmente em um suporte separador com as asas voltadas para fora.
- Após a incubação da amostra, se o volume total de ressuspensão for inferior a 500 μL, adicione 1x Binding Buffer até que o volume total seja de 500 μL.
- Coloque um tubo cônico de 15 mL abaixo da coluna e prepare a coluna com 3 mL de 1x tampão de ligação.
- Substitua o tubo cônico por um novo cônico de 15 mL para coleta de amostras de células e adicione a amostra à coluna, permitindo que ela flua completamente através da coluna.
- Lave a coluna 4 x 3 mL de 1x Binding Buffer, adicionando apenas uma lavagem de cada vez após a lavagem anterior ter fluído inteiramente pela coluna.
- Após a quarta lavagem, centrifugar o tubo cónico contendo as células isoladas durante 5 min a 450 × g, 4 °C. Descarte a coluna e o buffer de associação 1x restante.
- Ressuspenda a solução da amostra na quantidade apropriada de meio RPMI com base no tamanho do pellet e conte as células isoladas usando o método descrito na seção 5 (Figura 3 e Figura 5).
- Se a viabilidade permanecer abaixo de 80% e o número total de células for 106 ou menos, repita a seção 6.
- Se a viabilidade celular estiver acima de 80%, mantenha as células processadas no gelo e prossiga imediatamente para a geração de GEM de acordo com as instruções do fabricante.
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Resultados
Uma biópsia de melanoma suspensa em RPMI foi obtida e imediatamente colocada em gelo. A amostra foi transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 420 μL de RPMI e enzimas de digestão, picada em pequenos pedaços usando tesoura e submetida à digestão enzimática subsequente por 15 min em um misturador térmico a 37 °C posicionado verticalmente (Figura 1). Após a digestão, a amostra foi filtrada através de um filtro descartável estéril de 50 μm e o filtro foi lavado com RPMI fres...
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Discussão
Este protocolo descreve a dissociação de amostras de tumores humanos ou murinos em uma suspensão de célula única para sequenciamento de scRNA usando o sistema microfluídico 10x Genomics. No processamento de tecidos que geralmente vêm de cânceres raros ou fazem parte de ensaios clínicos em andamento ou experimentos longos para tumores murinos, a amostra deve ser preservada de maneira ideal e cuidadosa entre todas as etapas. Todas as etapas devem ser realizadas rapidamente no gelo ou a 4 °C para manter os perfis de RNA cel...
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Divulgações
M.S-F. recebeu financiamento da Bristol Myers-Squibb, Istari Oncology e foi consultor da Galvazine Therapeutics.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pela Adelson Medical Research Foundation (AMRF), pela Melanoma Research Alliance (MRA) e U54CA224068. A Figura 1, a Figura 4 e a Figura 5 foram criadas com BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10 mL pipeta sorológica | Corning | 357551 | |
| 1000 μ L ponteiras de pipeta de baixa retenção | Rainin | 30389213 | |
| 1000 μ L ponteiras de pipeta largas de baixa retenção | Rainin | 30389218 | |
| 1000 μ Pontas de pipeta L | Rainin | 30389212 | |
| 10x Separador Magnético | 10x Genômica | 120250 | |
| Tubos cônicos de 15 mL | Pipeta de aspiração Corning | 430052 | |
| 2 mL Pipeta de aspiração | Corning | 357558 | |
| 20 μ L ponteiras de pipeta de baixa retenção | Rainin | 30389226 | |
| 20 μ Ponteiras de pipeta L | Rainin | 30389225 | |
| 200 μ L ponteiras de pipeta de baixa retenção | Rainin | 30389240 | |
| 200 μ Ponteiras de pipeta L | Rainin | 30389239 | |
| 50 mL Tubo cônico de polipropileno | Falcon | 352098 | |
| 60 x 15 mm Placa de cultura de tecidos | Falcon | 353004 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-1 | |
| BD Seringa de 1 mL | Becton, Dickinson and Company | 3090659 | |
| Hemocitômetro Bright-Line | Hausser Scientific | 551660 | |
| Solução de Cloreto de Cálcio | Sigma Aldrich | 2115-100ML | |
| Cell Ranger | 10x Lâminas de contagem de células Genomics | N/A | https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest |
| para contador de células TC20 | Bio-Rad | 1450015 | |
| CellTrics 30μ m filtros descartáveis estéreis | Sysmex | 04-004-2326 | |
| CellTrics 50μ m filtros descartáveis estéreis | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Kit de remoção de células mortas | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | Loja a -20 ° C; kit 2 |
| Pinças de Dissecação, Ponta Fina | VWR | 82027-386 | |
| Tubos de Microcentrífuga DNA LoBind, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit | STEMCELL Technologies | 17899 | Armazene em 4 ° C; Kit 1 |
| Eppendorf centrífuga 5425R | Eppendorf | 5406000640 | |
| Eppendorf centrífuga 5910R | Eppendorf | 2231000657 | |
| Eppendorf Easypet 3 Controlador de pipeta eletrônico | Eppendorf | EP4430000018 | |
| Eppendorf Thermomixer F1.5 Modelo 5384 | Eppendorf | EP5384000012 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | Armazene a 4 ° C, use em um capuz biológico |
| Tesoura de aço inoxidável alemã | Ferramentas de ciência fina | 14568-12 | |
| Microscópio Leica Dmi1 | Coluna 454793 | Leica | |
| Microsystems Miltenyi Biotec | 130-042-401 | ||
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+ | Rainin | 17014382 | |
| Pipeta Pipet-Lite LTS L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | |
| Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+ | Ímã Quadro | 17014392 | |
| Miltenyi Biotec | 130-091-051 | ||
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 21870-076 | Loja em 4 ° C |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Mancha azul de tripano 0.4% | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Kit de Dissociação de Tumor, Humano | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | Armazene em -20 ° C, prepare as enzimas de acordo com as instruções do kit: Reconstitua o frasco da Enzima H liofilizada em 3 mL de RPMI 1640 Reconstitua o frasco da Enzima R liofilizada em 2.7 mL de RPMI 1640 Reconstitua o frasco da Enzima A liofilizada em 1 mL do Tampão A fornecido com o kit. |
| Kit de Dissociação de Tumor, Mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Loja em -20 ° C, prepare as enzimas de acordo com as instruções do kit: Reconstitua o frasco da Enzima D liofilizada em 3 mL de RPMI 1640 Reconstitua o frasco da Enzima R liofilizada em 2.7 mL de RPMI 1640 Reconstitua o frasco da Enzima A liofilizada em 1 mL do Tampão A fornecido com o kit. |
| Água Destilada UltraPura | Invitrogen | 10977-015 | Armazene a 4 ° O |
Referências
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Reimpressões e permissões
