Chanfro úmido de agulhas de microinjeção utilizando pressão de ar constante para feedback sobre a abertura da agulha

Resumo

Este protocolo descreve a montagem de um sistema pneumático para o fornecimento de ar pressurizado a uma agulha durante o processo de biselamento da agulha. O protocolo descreve ainda o processo de chanfro para criar agulhas de microinjeção afiadas e como medir o tamanho relativo da abertura da agulha.

Resumo

As agulhas de microinjeção são uma ferramenta crítica na entrega de reagentes de modificação do genoma, componentes CRISPR (RNAs guia, proteína Cas9 e modelo de doador) e componentes do sistema de transposons (plasmídeos e mRNA de transposase) em embriões de insetos em desenvolvimento. Agulhas afiadas de microinjeção são particularmente importantes durante a administração desses agentes modificadores, pois ajudam a minimizar os danos ao embrião que está sendo injetado, aumentando assim a sobrevivência desses embriões em comparação com a injeção com agulhas não chanfradas. Além disso, o chanfro de agulhas produz agulhas que são mais consistentes de agulha para agulha em comparação com agulhas abertas quebrando aleatoriamente a ponta da agulha escovando a ponta contra um objeto (lado de uma lamínula, a superfície do embrião a ser injetado, etc.). O processo de chanfro úmido de agulhas de microinjeção com ar de pressão constante entregue à agulha permite que a pessoa que chanfra a agulha saiba quando a agulha está aberta (presença de bolhas) e também dá uma indicação relativa de quão grande foi a abertura da agulha. O tamanho relativo da abertura na agulha pode ser determinado ajustando a pressão do ar fornecida à agulha até que um equilíbrio seja alcançado e as bolhas parem de fluir da ponta da agulha. Quanto menor a pressão na qual o equilíbrio é alcançado, maior o tamanho da agulha; e, inversamente, quanto maior a pressão, menor o tamanho da agulha.

Introdução

A modificação genética de insetos é um processo originalmente desenvolvido em Drosophila por Rubin e Spradling e, ao longo dos anos, esse processo foi modificado para criar modificações genéticas em outras espécies¹. O processo depende da entrega precisa de componentes de modificação microinjetados em embriões em uma janela específica de tempo e local dentro do embrião em desenvolvimento ^2,3,4. Agulhas afiadas de microinjeção são uma ferramenta crítica no processo de modificação genética de alguns insetos, como mosquitos 4,5,6,7,8,9 e flebotomíneos ¹⁰, embora não sejam tão críticas para outros insetos, como bichos-da-seda¹¹. Agulhas afiadas costumam ser um fator chave entre o sucesso e o fracasso ao tentar criar um inseto geneticamente modificado ^2,4. Normalmente, as agulhas de vidro microcapilar são puxadas aquecendo o vidro até o ponto em que o vidro se torna elástico, permitindo que o capilar seja puxado para dentro de uma agulha de ponta fechada afilada. Antes que a agulha possa ser usada, ela precisa ser aberta de uma maneira que crie uma ponta afiada para injeção. Tradicionalmente, as agulhas são abertas escovando a ponta da agulha suavemente contra algo (a borda de uma lâmina / lamínula, ou o embrião, etc.) que faz com que uma pequena quantidade de vidro se solte da ponta, criando aleatoriamente uma ponta afiada ^2,3. Um processo um pouco menos aleatório é o chanfro a seco, onde a agulha é rapidamente abaixada em uma placa abrasiva giratória opticamente plana por um curto período de tempo, fazendo com que uma pequena quantidade de vidro seja desgastada da ponta da agulha, criando uma ponta afiada. O chanfro seco é um pouco menos aleatório do que roçar a ponta da agulha contra algo. O protocolo descrito abaixo leva o processo de chanfro um passo adiante, fornecendo ar comprimido para a agulha que está sendo chanfrada e chanfrando-a sob uma camada líquida para que as bolhas sejam visíveis assim que a agulha for aberta. Este protocolo detalha um método para produzir agulhas de microinjeção afiadas de forma confiável. O chanfro sob uma camada líquida é uma melhoria em relação à quebra aleatória da agulha, conforme descrito acima, e o chanfro a seco porque o usuário recebe feedback sobre o processo de chanfro, permitindo que a pessoa que chanfra saiba quando a agulha está aberta e relativamente quão grande é a abertura da agulha. Saber o tamanho relativo da abertura da ponta da agulha pode permitir que a pessoa que está chanfrando crie agulhas com diferentes tamanhos de abertura. Vários tamanhos de abertura da agulha têm vantagens diferentes; Por exemplo, tamanhos maiores de abertura da agulha podem acomodar misturas de injeção de alta viscosidade, enquanto agulhas de abertura menores causam menos danos ao embrião que está sendo injetado.

O ar é fornecido à agulha usando um regulador e um sistema de tubulação de uretano baseado em um sistema de injeção regulado por pressão de ar modificado². Enquanto o ar é fornecido à agulha a uma pressão constante, a agulha é chanfrada sob uma camada de líquido. O processo de chanfro é composto por um processo repetido de cinco etapas: 1) abaixar a agulha até a superfície abrasiva, 2) permitir que a agulha chanfre por um curto período de tempo, 3) levantar a agulha para longe da placa abrasiva, mantendo-a abaixo da superfície da camada líquida, 4) parar a rotação da placa abrasiva para verificar o aparecimento de bolhas. Se nenhuma bolha estiver presente, as etapas 1 a 4 serão repetidas até que as bolhas apareçam; 5) Uma vez que as bolhas estejam presentes, a pressão do ar pode ser ajustada para determinar o tamanho relativo da abertura da agulha. Quanto menor a pressão necessária para impedir a formação de bolhas, maior a abertura na ponta da agulha.

Protocolo

NOTA: O protocolo descrito abaixo usa o microcapilar chanfrado Sutter BV-10. No entanto, este protocolo pode ser modificado para uso com qualquer modelo de chanfro microcapilar.

1. Montagem do regulador, manômetro e tubulação de suprimento de ar

1. Corte uma seção da tubulação de uretano para a conexão do suprimento de ar à base do regulador (R; Seção 1, Figura 1). O comprimento desta seção dependerá da distância do suprimento de ar ao regulador, que estará localizado próximo ao chanfro.
2. Deslize uma mangueira clamp na tubulação de uretano e, em seguida, empurre um conector de mangueira na extremidade da tubulação. Certifique-se de que o conector da mangueira esteja totalmente inserido, colocando-o contra uma superfície dura. Enquanto segura a tubulação perto do conector da mangueira, pressione a tubulação firmemente na mangueira até que o conector da mangueira esteja totalmente inserido. Juntos, a braçadeira da mangueira e o conector da mangueira formam a conexão HC (Figura 1).
3. Deslize a mangueira clamp até a extremidade da tubulação onde o conector da mangueira está inserido. Gire a mangueira clamp sobre a extremidade da farpa inserida para que ela forme uma conexão hermética.
4. Aparafuse o conector da mangueira na base do regulador (R) manualmente e, em seguida, termine de apertar a conexão com uma pequena chave. Certifique-se de que a conexão seja hermética, mas não muito apertada.
5. Na porta lateral do regulador, aparafuse um conector T (T) manualmente e, em seguida, use uma pequena chave inglesa para terminar de apertar.
6. Corte um pequeno pedaço de tubo de uretano (Figura 1, Seção 2), com aproximadamente 3-5 cm de comprimento. Coloque duas mangueiras clamps no pedaço de tubo, em seguida, insira um conector de mangueira em cada extremidade da tubulação e termine as conexões (HC) conforme descrito nas etapas 1.2-1.4 para cada extremidade do tubo.
7. Aparafuse uma extremidade do tubo curto na base do manômetro e, em seguida, termine de apertar com uma chave inglesa como na etapa 1.5.
8. Aparafuse a outra extremidade do tubo curto em uma das portas do conector T (T) conectado ao regulador na etapa 1.5.
9. Corte uma seção do tubo de uretano (Figura 1, Seção 3) para a conexão entre o regulador e o porta-agulha (NH). O tamanho desta seção dependerá da distância do chanfrador até a localização do regulador.
10. Coloque uma mangueira clamp na seção da tubulação e, em seguida, insira um conector de mangueira conforme descrito nas etapas 1.2-1.4.
11. Do outro lado desta seção da tubulação, coloque o conector luer fêmea (LC) que é fornecido com o porta-agulha (NH).
12. Remova o grampo de retenção e a arruela de náilon (Figura 2, f) do manipulador. A braçadeira de retenção e a arruela são projetadas para segurar apenas um microcapilar de vidro, elas não são projetadas para suportar o peso adicional de um suporte microcapilar, haste roscada e tubulação de suprimento de ar.
13. Corte um pedaço retangular de folha de borracha de 1,5 cm x 2 cm para enrolar a haste roscada na braçadeira do para-lama da bicicleta. Isso ajudará a segurar a haste rosqueada e o porta-agulha com mais segurança no grampo do para-lama da bicicleta. Usando um alicate de bico fino, abra o clipe do para-lama da bicicleta, dobre o pedaço retangular da folha de borracha sobre a haste roscada a 3,5 cm de uma extremidade da haste para formar um U sobre a haste. Insira a haste rosqueada coberta de folha de borracha no para-lama aberto da bicicleta clamp e use o alicate para fechar o clamp ao redor da haste e da folha de borracha. Instale a bicicleta clamp e o conjunto da haste rosqueada no parafuso do manipulador, substitua o clamp de retenção sem a arruela de náilon e aperte o clamp de retenção até que ele segure firmemente o conjunto da haste rosqueada.
14. Passe o porta-agulha na haste roscada. Certifique-se de que o conector luer termine em uma posição que não prenda a tubulação de uretano quando estiver conectada (Figura 2, g).
15. Conecte o conector luer fêmea ao conector luer macho (Figura 2, g) do porta-agulha (Figura 2, d).
16. Conecte a extremidade livre do tubo da Figura 1, Seção 1 ao suprimento de ar (essa conexão varia de acordo com o suprimento de ar usado). O suprimento de ar deve ser limpo, seco e livre de resíduos de óleo. O suprimento de ar pode ser de uma fonte de ar doméstica ou cilindro de gás, seja ar comprimido ou nitrogênio.

2. Agulhas de borossilicato de chanfro

1. Puxe as agulhas de microinjeção usando microcapilares de vidro borossilicato com as seguintes configurações no instrumento: Calor: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, com tempo de loop de 12.24.
2. Monte o conjunto de retificação de acordo com as instruções do fabricante, consistindo na placa abrasiva e no anel de retenção com ímãs¹².
   NOTA: A placa abrasiva pode precisar ser envolvida com uma tira fina de filme transparente para evitar vazamento prematuro de Photo-Flo (agente umectante) da placa abrasiva. Isso só é necessário se a solução do agente umectante vazar prematuramente para o óleo do pedestal, fazendo com que a placa de moagem pare de girar. O agente umectante reduz o risco de marcas de secagem nas agulhas de vidro após o chanfro. O uso de um agente umectante não é crítico para o processo de chanfro, e a água pode ser substituída.
3. Coloque 10 gotas de óleo de pedestal na superfície opticamente plana do pedestal e coloque o conjunto de moagem por cima. Inicie o conjunto de moagem.
4. Ligue a fonte de luz para iluminar a superfície. Certifique-se de que a fonte de luz esteja posicionada atrás do chanfro e brilhe em um ângulo de 45° em relação à placa abrasiva e à agulha. O ângulo de iluminação é necessário para que uma sombra da agulha seja facilmente vista. Com ampliação de 90x, gire a cabeça do microscópio no lugar. Pare brevemente a rotação da placa abrasiva e concentre o microscópio na superfície da placa abrasiva.
5. Adicione 1% de agente umectante ao pavio até que o pavio esteja completamente molhado. Adicione 1% de agente umectante à superfície da placa abrasiva. Certifique-se de que o agente umectante cubra a superfície abrasiva, mas não vaze para o anel de retenção preto.
6. Coloque o pavio pré-molhado na superfície da placa abrasiva enquanto ela está girando. Certifique-se de que o pavio esteja no lado esquerdo da placa abrasiva (ao olhar de cima para baixo) e se estenda das 11 horas às 6 horas (com a placa como um relógio). Certifique-se de que o pavio não ande na parte preta do anel de retenção.
7. Insira uma agulha no porta-agulha (Figura 2, d) e aperte o anel de retenção para manter a agulha no lugar. Abra o regulador (Figura 1, R) e aumente a pressão para 24 psi.
8. Levante o porta-agulha girando o botão de ajuste de curso (Figura 2, a) Certifique-se de que a agulha esteja levantada o suficiente para ficar mais alta do que a superfície da placa abrasiva rotativa e, em seguida, gire todo o manipulador para que a agulha se encaixe acima da placa abrasiva rotativa. A agulha a ser chanfrada deve ser colocada na placa abrasiva rotativa orientada de forma que a rotação da placa se afaste da ponta da agulha (Figura 3A)
9. Observando de lado, use o botão de ajuste grosso (Figura 2, a) para abaixar a agulha em direção à superfície da placa abrasiva. Pare quando a agulha estiver quase tocando a superfície do líquido.
10. Use o zoom para diminuir a ampliação do microscópio e, em seguida, mova o microscópio para que a agulha fique no centro do campo de visão. Uma vez no centro da visão, aumente a ampliação, ajustando a posição do manipulador para que a ponta da agulha permaneça no centro da visão. Uma vez na ampliação máxima, pare a placa de moagem e concentre o microscópio na superfície da placa abrasiva e, em seguida, reinicie imediatamente a rotação da placa assim que a superfície estiver em foco. A agulha pode não estar à vista neste momento.
11. Usando o botão de ajuste grosso do manipulador, abaixe a agulha em direção à placa abrasiva. No campo de view, uma imagem da agulha e uma(s) sombra(s) da agulha serão visíveis. Quando a agulha e a(s) sombra(s) da agulha estiverem perto de se tocar, mude para o botão de ajuste fino do manipulador e continue a abaixar a agulha até que a agulha e sua(s) sombra(s) pareçam se tocar. Neste ponto, leia o paquímetro (Figura 2, c) e anote a leitura. A superfície da placa abrasiva está igual ou abaixo dessa leitura do paquímetro.
    NOTA: É difícil ver quando a agulha toca a superfície da placa abrasiva rotativa, portanto, a agulha pode não estar realmente tocando a placa abrasiva neste momento.
12. Deixe a agulha permanecer neste nível de leitura do paquímetro por 5 a 10 s.
13. Usando o botão de ajuste fino do manipulador, levante a agulha, certificando-se de que ela fique embaixo da superfície do agente umectante. Pare a rotação da placa abrasiva por alguns segundos e observe se as bolhas escapam da ponta da agulha. Se houver bolhas, vá para a etapa 2.15. Se não houver bolhas, vá para a etapa 2.14.
14. Mova a agulha de volta para a leitura do paquímetro usando o botão de ajuste fino do manipulador, depois mova-a um pouco para baixo e faça uma nova leitura do paquímetro e repita as etapas 2.12-2.13.
15. Inicie a placa abrasiva novamente para ver se a formação de bolhas é observável enquanto a placa está girando. Se a evidência de formação de bolhas for visível durante a rotação da placa, a abertura da ponta da agulha provavelmente é muito grande para microinjeções de embriões sensíveis, como injeções de embriões de mosquito. Se a formação de bolhas não for visível durante a rotação da placa abrasiva, a abertura da agulha é ideal para uso em procedimentos que exigem uma agulha de abertura pequena e afiada.
16. Use o botão de ajuste do curso do manipulador para elevar a agulha acima da placa abrasiva para uma posição alta o suficiente acima da placa para que a agulha não atinja nada, pois todo o manipulador é girado para afastar a agulha da placa abrasiva e do microscópio.
17. Quando a agulha estiver em uma posição em que possa ser removida sem bater em nada, abaixe a pressão do ar para zero, remova a agulha e coloque-a em uma caixa de armazenamento de agulhas (uma placa de Petri com fita adesiva dupla ou massa de modelar para segurar as agulhas chanfradas) até o uso.

3. Determinando o tamanho relativo da abertura da agulha chanfrada

NOTA: A determinação dos tamanhos relativos de abertura da agulha chanfrada é feita na etapa 2.13. As etapas abaixo descrevem melhor esse processo.

1. Uma vez observadas bolhas na etapa 2.13, com a placa abrasiva sem girar, diminua lentamente a pressão do ar girando o botão de ajuste do regulador (Figura 1, R) até que as bolhas parem de fluir da ponta da agulha. Observe a pressão na qual as bolhas param de fluir da ponta.
2. Aumente a pressão do ar até que as bolhas fluam novamente da ponta da agulha. Quanto maior a pressão, menor a abertura da agulha.
3. Prossiga movendo a agulha para uma posição onde possa ser removida com segurança as etapas 2.16-2.17.

Resultados

O procedimento descrito acima produz agulhas de microinjeção consistentemente afiadas. Agulhas afiadas são caracterizadas por serem capazes de se inserir em embriões de insetos coriões moles, como embriões de mosquitos, com pouca ou nenhuma resistência da membrana embrionária. Quando os embriões de mosquito são microinjetados para modificação genética, a membrana do embrião é relativamente elástica. Empurrar uma agulha cega contra a membrana do embrião fará com que ela recue (Figura 4B). Quando a agulha é puxada para trás, a membrana recupera sua forma. Com pressão suficiente, a agulha cega acabará rasgando a membrana e o embrioplasma provavelmente vazará. Quanto mais afiada a agulha, menos recuo ocorre quando a agulha é pressionada contra a membrana do embrião (Figura 4E). Em vez de rasgar a membrana, uma agulha afiada deslizará através da membrana, causando pouco ou nenhum dano ao embrião. Com uma agulha ideal, quase não haverá recuo da membrana do embrião à medida que a agulha desliza para dentro do embrião.

A Instalação de Transformação de Insetos da Universidade de Maryland (UM-ITF) é uma instalação de serviços que cria insetos geneticamente modificados para clientes na academia e na indústria. A instalação usa agulhas chanfradas para a microinjeção de embriões de mosquitos. Durante o período entre janeiro de 2023 e dezembro de 2023, a UM-ITF injetou 12.795 embriões de Aedes em 56 projetos de clientes (Tabela 1). O uso de agulhas chanfradas ajudou a UM-ITF a manter uma eclosão média pós-injeção de 31% em todos os projetos (Tabela 2). Além disso, o UM-ITF conseguiu manter uma taxa de sucesso de injeção de 96%, conforme determinado pelo acompanhamento pós-projeto com os clientes (Tabela 2). O sucesso da injeção é uma medida de se os materiais de injeção (guias CRISPR, proteína Cas9, plasmídeos de vetor de transposon, etc.) injetados foram entregues aos embriões do projeto de uma maneira em que esses materiais foram capazes de criar uma modificação genética, basicamente, havia evidência de criação de CRISPR Indel, inserção do vetor baseado em transposon do cliente ou inserção de um vetor de controle de qualidade de injeção (o transposon termina com um promotor mais marcador). Em outras palavras, as injeções eram boas o suficiente para produzir modificação genética, se os componentes injetados estivessem funcionando corretamente. Existem muitos fatores que contribuem para o sucesso de um projeto de modificação genética, e microinjeções de qualidade com agulhas afiadas são um fator chave de sucesso. A biselagem de agulhas utilizando o procedimento descrito no protocolo acima permite que a UM-ITF produza agulhas de microinjecção afiadas de qualidade de forma consistente, permitindo assim que a UM-ITF dê injecções consistentemente bem sucedidas.

Figura 1: Diagrama esquemático dos componentes do sistema de ar e conexão ao microcapilar. O ar é fornecido à agulha capilar através de um sistema de tubos de uretano a partir de um suprimento de ar (ar doméstico ou cilindro de ar). Os tubos de uretano são conectados ao regulador (R) e ao manômetro por conexões de mangueira (HC), que consistem em um conector de mangueira e uma braçadeira de mangueira. A conexão da mangueira é aparafusada em uma conexão fêmea de 10-32 roscas na base do regulador (R) e do manômetro. Um conector T (T) é conectado ao regulador (R) para derramar ar entre o manômetro e o porta-agulha (NH). A tubulação de uretano é conectada ao porta-agulha por um conector luer (LC) que é fornecido com o porta-agulha (NH). A conexão com o suprimento de ar varia de acordo com o suprimento de ar usado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Peças do manipulador e configuração de ar. Peças do manipulador: a. botão de ajuste grosso, b. botão de ajuste fino, c. Pinça, d. porta-agulha WPI, e. medidor de ângulo, f. braçadeira de retenção e clipe de pára-choque de bicicleta, g. adaptador luer e conector de mangueira luer e h. tubulação de uretano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Colocação da agulha em relação à rotação da placa abrasiva. (A) Colocação adequada da agulha durante o chanfro. A agulha a ser chanfrada deve ser colocada na placa abrasiva rotativa orientada em algum lugar entre perpendicular à rotação e alinhada com a rotação, onde a rotação se afasta da ponta da agulha. (B) Colocação inadequada da agulha. A rotação da placa abrasiva nesta orientação faz com que a superfície da placa abrasiva empurre a ponta da agulha em vez de passar por baixo e além da ponta. Nesta orientação, o chanfro pode não ocorrer suavemente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação da inserção da agulha por agulhas não perfurocortantes e perfurocortantes. (A-C) Agulha não perfurocortante e (D-F) Agulha perfurocortante. (A) e (D) foram capturados antes que a agulha entrasse em contato com o embrião; (B) e (E) estão no ponto imediatamente anterior à agulha perfurar a membrana embrionária, e (C) e (F) estão logo após a perfuração da agulha. A seta branca em (B) indica o recuo da membrana do embrião porque uma pressão maior deve ser aplicada para que uma agulha não afiada perfure. A seta preta em (E) indica a falta de recuo devido ao piercing da agulha feito facilmente por causa de uma agulha afiada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Projetos de Aedes da UM-ITF de janeiro de 2023 a dezembro de 2023. Lista dos projetos de microinjeção de Aedes da UM-ITF com o número de embriões injetados para cada projeto, o número de larvas que eclodiram desses embriões injetados e a porcentagem de larvas que eclodiram por embrião injetado total. Clique aqui para baixar esta tabela.

Quadro 2: Resultados do projecto Aedes da UM-ITF. A UM-ITF é uma instalação de serviços que fornece serviços de microinjeção para modificação genética de insetos. A tabela lista o número de projetos de Aedes injetados pela ITF de janeiro de 2023 a dezembro de 2023. O número de clientes que responderam a solicitações de acompanhamento do projeto nas quais a resposta indicava sucesso ou falha do projeto de injeção. O número de projetos bem-sucedidos, em que um projeto bem-sucedido foi aquele em que os materiais de injeção foram microinjetados em um momento e local no embrião em desenvolvimento, de modo que as injeções foram capazes de produzir uma modificação genética, e o número de projetos que foram considerados não bem-sucedidos devido à falta de modificação genética. A taxa média de eclosão para projetos de microinjeção de Aedes durante o período de janeiro de 2023 a dezembro de 2023. A taxa de sucesso do projeto e a taxa de resposta do cliente. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

A modificação genética de mosquitos depende da microinjeção precisa dos materiais de modificação (plasmídeos, RNAs guia ou proteínas) em embriões pré-blastoderma 3,4,5,6,7,8. Cruciais para esse processo são agulhas afiadas que perfuram facilmente o embrião durante a injeção ^2,4. Uma agulha afiada é capaz de deslizar através da membrana, entregar os materiais de modificação e ser retirada do embrião sem que nenhum embrião vaze no local da injeção após a microinjeção (observação pessoal).

As agulhas de microinjeção são fechadas quando são puxadas pela primeira vez e precisam ser abertas antes da injeção². Tradicionalmente, as agulhas para microinjeção foram abertas escovando suavemente a agulha contra algo como a borda da lamínula ou lâmina de vidro que segura os embriões, contra o próprio embrião ou algum outro material². No entanto, abrir a agulha escovando-a contra um objeto fornece um resultado inconsistente (observação pessoal). Às vezes, a agulha quebra de uma forma que a torna afiada, enquanto outras vezes, a agulha fica muito cega, o que, como mencionado anteriormente, pode danificar os embriões que estão sendo injetados, fazendo com que não sejam modificados ou, na pior das hipóteses, matando o embrião. Alternativamente, as agulhas também podem ser abertas inserindo a agulha em um embrião. Este processo pode abrir a agulha, deixando-a pronta para injeção. No entanto, também produz resultados aleatórios que ocasionalmente criam uma agulha muito afiada, mas mais frequentemente obstruem a agulha com material embrionário antes que ela possa ser usada para injeção. Embora as agulhas de chanfro exijam mais tempo e esforço, o processo produz agulhas afiadas de forma mais consistente.

A modificação genética de mosquitos também é um processo dependente do tempo que requer que os embriões sejam microinjetados antes que o embrião em desenvolvimento celularize 4,5,6,7,8. Ao abrir agulhas roçando a agulha contra algo ou inserindo a agulha em um embrião, o tempo necessário para abrir e encontrar uma agulha afiada é gasto quando os embriões já estão preparados para injeção e continuam a se desenvolver. Na melhor das hipóteses, o processo de abrir uma agulha e produzir uma agulha afiada leva apenas um ou dois minutos, mas outras vezes, pode demorar o suficiente para que os óvulos preparados para essa rodada de injeção estejam muito velhos no momento em que uma boa agulha é feita. A vantagem do chanfro é que ele é feito com antecedência e as agulhas estão prontas para uso assim que os embriões são preparados para injeção, garantindo que os embriões estejam no estágio de desenvolvimento perfeito para injeção.

Embora o protocolo acima tenha sido desenvolvido e use o chanfrador Sutter BV-10, o protocolo pode ser modificado para uso com qualquer chanfro. O principal fator é que a superfície de chanfro deve ser capaz de conter um pequeno volume de líquido sob o qual a agulha é chanfrada.

Chanfrar agulhas de microinjeção enquanto uma fonte de ar fornece ar comprimido para a parte de trás da agulha tem duas vantagens. Primeiro, a pressão do ar ajuda a produzir agulhas consistentes. Agulhas consistentemente afiadas são produzidas quando o processo de chanfro é iniciado com a mesma pressão de ar fornecida, e o chanfro é interrompido quando as bolhas aparecem pela primeira vez. É fundamental que, para observar a formação inicial de bolhas, a placa abrasiva seja interrompida momentaneamente para que a rotação da placa abrasiva não mascare a formação inicial de bolhas. Se a evidência de bolhas só for visível quando a placa abrasiva estiver em movimento, a abertura da agulha pode ser muito grande. É fundamental que a pressão do ar fornecido seja a mesma cada vez que o chanfro é iniciado, que o chanfro seja interrompido assim que as bolhas começarem a escapar (visualizadas quando a placa não está em movimento) e que as bolhas não sejam visíveis quando a placa está em movimento. O tamanho da abertura pode ser medido relativamente diminuindo a pressão do ar fornecido até que as bolhas parem de escapar da ponta da agulha. Ao observar a pressão na qual as bolhas param de fluir da ponta, um tamanho relativo de abertura pode ser inferido. Quanto menor a pressão na qual as bolhas param de fluir, maior a abertura na ponta da agulha e quanto maior a pressão, menor o tamanho da abertura da ponta. Saber o tamanho relativo da abertura pode ser útil ao usar uma mistura de injeção mais viscosa e, portanto, mais propensa a entupir a agulha de injeção. O uso dessa medição de tamanho de abertura relativa permite a criação de agulhas que podem fornecer misturas de injeção de maior viscosidade. Claro, existem algumas compensações feitas ao usar agulhas com tamanhos de abertura maiores. Especificamente, os embriões injetados podem ter maior probabilidade de vazar após a injeção, e as taxas de sobrevivência dos embriões injetados podem ser menores.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microcapilares de 1,0 mm de diâmetro externo	World Precision Instruments
	Sutter Instruments	008
Clipe de para-lama de bicicleta	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscópio	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Microscópio Estéreo ou Chanfrador equivalente
BV-10	Sutter Instruments	BV-10
Placa abrasiva de diamante	Sutter Instruments	104F	Placa abrasiva de diamante - extra fina (0.2 µ a 1.0 µ tamanhos de ponta)
Junta, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Usado para selar a conexão em conectores T  ou L, se ainda não estiver incluído com estas peças
Braçadeira	Mangueira Clippard Instrument Laboratory, Inc.	Conector de mangueira de 5000-2 pacotes
	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Precisa de 5 conectores de mangueira Suporte
de microinjeção	World Precision Instruments	MPH3-10 Porta-agulha	para microcapilares de diâmetro externo de 1 mm
P-2000	Sutter Instruments		Qualquer extrator
de agulha Photo-Flo 200 Solução	B& H Foto, Vídeo e Áudio	BH #KOPF200P  Agente	umectante
Manômetro	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi medidor
pavio de referência	Sutter Instruments	X050300
suporte de pavio de referência	Sutter Instruments	M100019
Regulador	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Precisa de portas #10-32 para conexões
Folha de Embalagem de Borracha 6 inx 6 in	Danco	Modelo # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Barra			Uma haste roscada ou barra com extremidade roscada. Os fios devem ser 10-32.
Tubo de uretano	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050