Uma metodologia detalhada para estabelecer um modelo minimamente invasivo de embolia pulmonar em ratos usando coágulos sanguíneos autólogos é descrita. Métodos adicionais para quantificar a área infartada e visualizar a árvore arterial pulmonar também são fornecidos.
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Artigo de método
Estabelecimento de um modelo minimamente invasivo de embolia pulmonar em ratos usando coágulos sanguíneos autólogos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A embolia pulmonar (EP) é uma das principais causas de morte cardiovascular, resultando em um ônus socioeconômico significativo. Embora os tratamentos atuais se concentrem principalmente na anticoagulação e na trombólise, há uma necessidade urgente de uma melhor compreensão de sua fisiopatologia e do desenvolvimento de novas estratégias de tratamento. Os modelos animais desempenham um papel crucial na compreensão da EP e no desenvolvimento de novas terapias para a doença, com roedores comumente usados devido a considerações éticas e de custo. No entanto, os modelos de roedores existentes para EP são limitados pela falta de procedimentos padronizados, o que dificulta a reprodutibilidade e as comparações entre estudos. Este estudo tem como objetivo estabelecer um modelo minimamente invasivo de EP em ratos usando coágulos sanguíneos autólogos. O modelo apresenta uma técnica de amostragem de sangue minimamente invasiva, um procedimento padronizado de geração de trombo e acesso venoso minimamente invasivo. Além disso, são fornecidos protocolos para quantificação de áreas infartadas e visualização da árvore arterial pulmonar. Esses procedimentos visam melhorar a confiabilidade dos modelos de roedores para estudar a progressão da PE e facilitar o desenvolvimento de novos tratamentos.
Introdução
A embolia pulmonar (EP) é uma das principais causas de morte intra-hospitalar e a terceira causa mais frequente de morte cardiovascular. Apesar de sua alta incidência, a prevenção e o diagnóstico imediato continuam sendo desafiadores 1,2. A anticoagulação e as terapias trombolíticas são essenciais no tratamento da EP, mas uma compreensão mais profunda da progressão da doença e novas abordagens terapêuticas são essenciais para melhorar o manejo da doença3.
Na pesquisa biomédica moderna, os modelos animais desempenham um papel fundamental na elucidação dos mecanismos das doenças humanas e no desenvolvimento de novas terapias 4,5. Camundongos, ratos, hamsters e coelhos são frequentemente usados na modelagem de EP devido a considerações éticas e custo-efetividade 6,7,8,9,10. As abordagens de modelagem de PE geralmente se enquadram em três categorias: formação de trombos in vivo, injeção de coágulos sanguíneos in vitro e administração de partículas não trombóticas. A escolha das espécies animais e da técnica de modelagem é determinada pelos objetivos específicos da pesquisa, pois nenhum modelo único atende a todos os propósitos. Por exemplo, estudos focados na exploração de novas terapias trombolíticas geralmente empregam modelos envolvendo coágulos sanguíneos autólogos em vez de partículas não trombóticas.
Os métodos atuais para modelagem de PE em roedores enfrentam desafios devido à falta de metodologias detalhadas e padronizadas. Isso afeta processos-chave, como amostragem de sangue, formação de coágulos sanguíneos e embolização subsequente, todos cruciais para garantir resultados reprodutíveis em todos os estudos. Além disso, há uma lacuna significativa na capacidade de quantificar a área embolizada e mapear com precisão a distribuição dos êmbolos pós-embolização. Abordar essas deficiências é essencial para promover a confiabilidade e a utilidade dos modelos de roedores na pesquisa de PE.
Neste estudo, são descritos protocolos detalhados para estabelecer um modelo de PE em ratos usando coágulos sanguíneos autólogos. Este modelo apresenta uma técnica de amostragem de sangue minimamente invasiva, um procedimento padronizado de geração de trombo e acesso venoso minimamente invasivo. Além disso, são fornecidos protocolos para quantificar as áreas infartadas nos pulmões e visualizar a árvore arterial pulmonar, o que pode facilitar novas descobertas de pesquisas.
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram conduzidos com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Academia Chinesa de Ciências Médicas e do Peking Union Medical College (número de aprovação: IRM / 2-1ACUC-2311-015). Ratos Sprague-Dawley machos, com 6 semanas de idade e pesando cerca de 250 g, foram utilizados neste estudo. Os animais foram alojados em um ambiente específico livre de patógenos com acesso ad libitum a uma dieta balanceada de ração e água. Eles foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h a uma temperatura ambiente de 22 °C ± 2 °C. Os animais foram autorizados a se adaptar ao ambiente por 1 semana antes de serem submetidos a qualquer procedimento cirúrgico. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Equipamentos e materiais
- Equipamento de anestesia: Use uma máquina de anestesia a gás para pequenos animais e isoflurano.
- Materiais cirúrgicos: Preparar cotonetes, desinfetante iodóforo, estereomicroscópio, barbeador, fita adesiva, seringa de 1 mL com agulha de 27 G, seringa de 5 mL, seringa de 10 mL, soro fisiológico, gaze, 8-0 fios de nylon, fio de nylon 6-0 com agulha de sutura, micro pinças hemostáticas, micropinças e tesouras finas.
- Outros materiais: Obtenha agulhas dispensadoras de 19 G e 18 G compatíveis com seringas médicas, um tubo de silicone com diâmetro interno de 1,2 mm e comprimento de 10 cm, um tubo de infusão com diâmetro interno de 3,0 mm e comprimento de 20 cm, tubo de centrífuga de 1,5 mL, pipeta e pontas de pipeta.
- Gerador de trombo de fabricação própria e injetor de coágulo sanguíneo (Figura 1): Conecte o tubo de silicone à agulha dispensadora de 19 G conectada a uma seringa de 1 mL para criar o gerador de trombo. Conecte uma extremidade do tubo de infusão à agulha dispensadora de 18 G e conecte a outra extremidade a uma seringa de 5 mL para criar o injetor de coágulo.
2. Preparação autóloga de coágulos sanguíneos
- Anestesia
- Coloque o animal dentro da câmara de indução anestésica e administre uma mistura de isoflurano a 4% com ar ambiente a uma taxa de fluxo de 2 L/min por 2-3 min (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
- Posicione o animal na plataforma de operação em decúbito dorsal. Mantenha a anestesia administrando isoflurano a 2,5% a uma taxa de fluxo de 0,4 L / min. Teste o reflexo pedal para garantir que a anestesia adequada seja alcançada.
- Estenda os dois membros anteriores horizontalmente do corpo e estenda os membros posteriores para expor adequadamente a região da virilha. Prenda o animal nesta posição usando fita adesiva (Figura 2A).
- Amostragem de sangue através da veia cava craniana (CVC)
- Remova os pelos ao redor do manúbrio usando um barbeador e creme depilatório. Desinfete a pele com iodóforo.
- Insira a agulha de 27 G conectada à seringa de 1 mL verticalmente a uma profundidade de 8 mm para perfurar o CVC esquerdo ou direito, conforme mostrado na Figura 2A.
NOTA: A projeção da superfície corporal do CVC é de 5 mm lateral ao manúbrio. Ambos os lados podem ser usados e a escolha não afeta as etapas a seguir. - Segure a seringa e puxe suavemente o êmbolo para trás para criar pressão negativa dentro do cilindro. Retire gradualmente a agulha até que o sangue flua e, em seguida, mantenha essa posição até que 0,3 mL de sangue seja coletado (Figura 2B).
- Preparação de coágulos sanguíneos
- Empurre o sangue coletado para um tubo de centrífuga de 1,5 mL, tomando cuidado para não produzir bolhas.
- Puxe o sangue para o tubo de silicone do gerador de trombo de fabricação própria até que a coluna de sangue tenha 10 cm de comprimento.
NOTA: Execute essas duas etapas rapidamente, pois a coagulação começará e se propagará no tubo da centrífuga, diminuindo a qualidade dos coágulos sanguíneos colhidos. - Aguarde 30 minutos até que o sangue esteja totalmente trombosado. Durante esse período, prepare colunas de sangue para outros animais da mesma maneira.
- Lave a coluna de sangue trombosada em uma placa de Petri contendo solução salina normal e lave a coluna de trombo com solução salina normal três vezes ( Figura 2C ).
- Use uma tesoura fina para cortar a coluna do trombo em coágulos sanguíneos uniformes, cada um com 4 mm de comprimento (Figura 2D). Puxe 10-20 coágulos para o injetor de fabricação própria pré-preenchido com 2 mL de solução salina normal.
NOTA: O comprimento dos coágulos sanguíneos não deve exceder 1 cm, ou eles ficarão presos no ventrículo direito.
3. Preparação do acesso à veia
- Exposição dos vasos epigástricos superficiais
- Anestesiar e fixar o animal conforme descrito no passo 2.1.
- Raspe o cabelo ao redor da região da virilha esquerda. Aplique o creme depilatório nessas áreas, aguarde 1 minuto e limpe o creme com gaze. Desinfete a pele com iodóforo.
- Faça uma incisão na pele de 5 mm acima da origem dos vasos epigástricos superficiais na região da virilha. Normalmente, a origem dos vasos epigástricos superficiais pode ser rastreada pela observação de uma pequena pulsação na região da virilha.
- Usando um microscópio estéreo com ampliação de 10x, separe uma fina camada de gordura subcutânea para expor os vasos epigástricos superficiais (Figura 3A).
- Isolando a veia epigástrica superficial
- Isole cuidadosamente a veia epigástrica superficial da artéria, nervo e tecido adiposo. Faça isso proximalmente, até o ponto em que drena para a veia femoral, e distalmente, até a primeira bifurcação da veia.
- Ligue o lado distal com 8-0 rosqueie e prenda a rosca com um micro-clamp. Controle o lado proximal com um 8-0 laço de rosca preso a outro micro-clamp (Figura 3B).
- Faça uma pequena incisão transversal no lado distal da veia isolada. Controle o lado proximal para evitar sangramento. Lave o sangue restante no lúmen da veia com solução salina normal. Quando a veia estiver limpa, use uma micropinça para aumentar a incisão venosa.
4. Embolização
- Canulação da veia
- Insira suavemente a agulha do injetor de fabricação própria na veia através da incisão da veia. Prenda a agulha com um terceiro grampo para evitar que escorregue para fora da veia.
- Procedimento de embolização
- Empurre lentamente o êmbolo para administrar uma pequena quantidade de solução salina normal. A plenitude da veia sem resistência indica acesso desobstruído da veia (Figura 3D).
- Continue empurrando o êmbolo para administrar coágulos na veia femoral através do acesso superficial à veia epigástrica. Controle a velocidade de embolização em 5 êmbolos por minuto. Monitore a respiração do animal; dispneia emergente e exacerbada indica embolização bem-sucedida.
- Depois de injetar a quantidade predefinida de coágulos sanguíneos, retire a agulha e ligue o lado proximal da veia epigástrica superficial.
- Suture a incisão e coloque o animal em uma caixa quente. Transfira o animal para sua gaiola assim que ele acordar.
5. Quantificação da área infartada
- Eutanásia e perfusão cardíaca
- Adicione 25.000 U de heparina sódica a 250 mL de solução salina normal e misture bem. Ligue o frasco a um dispositivo de perfusão e pendure-o ao contrário a uma altura de 80 cm. Feche a válvula do dispositivo de infusão.
- Eutanásia dos animais com overdose de isoflurano (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
- Corte as costelas com uma tesoura grande e abra o peito, evitando danos aos pulmões e vasos grandes.
- Insira a agulha do dispositivo de perfusão no ventrículo esquerdo. Abra a válvula do dispositivo de infusão para permitir a infusão de solução salina heparinizada. Use uma tesoura para cortar a veia cava inferior e o apêndice esquerdo para permitir a drenagem. Controle a velocidade de perfusão em 50 mL / min.
NOTA: Durante este procedimento, o tecido pulmonar normal ficará branco, enquanto a zona embolizada permanece enferrujada. - Após completar a perfusão com solução salina heparinizada, puncionar o tronco da artéria pulmonar através do ventrículo direito com uma seringa de 10 mL preenchida com solução de paraformaldeído a 4%. Fixe o tecido pulmonar realizando perfusão de paraformaldeído a 4% através dos pulmões para um volume total de 30 mL.
- Apresentando um índice chamado Razão de Infarto
- Após a fixação, extirpar os pulmões, coração, traqueia, esôfago, timo e grandes vasos como um todo da coluna vertebral e do diafragma11.
- Remova cuidadosamente o esôfago, o timo e o tecido adiposo da massa inicial, deixando apenas o coração, os pulmões e os grandes vasos.
- Mergulhe a parte restante em um volume adequado de solução de paraformaldeído a 4% por pelo menos 48 h.
- Use uma balança analítica para pesar todos os pulmões. Use uma tesoura fina para separar a parte infartada dos pulmões e pesar o tecido infartado com a mesma balança. Calcule a taxa de infarto usando a seguinte equação:
i é o peso do tecido infartado, w é o peso de todos os pulmões, I representa a taxa de infarto. - Depois de quantificar a área infartada, corte o tecido pulmonar fixado em paraformaldeído para inclusão em parafina11.
6. Visualização da árvore arterial pulmonar
- Gesso da artéria pulmonar
- Eutanásia do animal e realizar a perfusão cardíaca conforme descrito na etapa 5.1.
- Adicione uma quantidade igual (em peso) de diluente ao composto de fundição de silicone, misture a mistura e, em seguida, adicione 5% (em peso ou volume) do agente de cura. Bata a mistura novamente.
- Retire 1 mL da mistura em uma seringa de 1 mL, exaura o ar e insira a agulha no tronco da artéria pulmonar através do ventrículo direito. Prenda a agulha à artéria pulmonar para evitar deslizamento e refluxo.
- Pressione suavemente o êmbolo para permitir que a mistura de silicone preencha a árvore arterial pulmonar. As áreas pulmonares normais serão tingidas pela mistura de fundição, enquanto as áreas infartadas permanecerão vermelhas enferrujadas.
NOTA: A gesso da artéria pulmonar só deve ser aplicada ao tecido pulmonar intacto. Normalmente, 0,6-0,8 mL da mistura de fundição é suficiente para preencher a árvore arterial pulmonar. A injeção excessiva da mistura de gesso pode levar ao gesso da veia pulmonar, o que afeta a visualização da árvore arterial pulmonar. A mistura de fundição deve ser usada dentro de 20 minutos após a adição do agente de cura, pois cristalizará além desse tempo. - Retire a seringa após a perfusão de moldagem, ligue o tronco da artéria pulmonar e retire os pulmões, coração e grandes vasos, conforme descrito na etapa 5.2. Coloque toda a massa em uma placa de Petri e armazene-a em uma geladeira a 4 ° C durante a noite para permitir que a mistura de fundição cristalize.
- Limpeza e visualização
- Remova o coração e os grandes vasos dos pulmões com uma tesoura e, em seguida, limpe os detritos da mistura de cura da superfície pulmonar.
- Mergulhe os pulmões sequencialmente em soluções de álcool etílico a 25%, 50%, 75%, 95% e 100%, cada uma por 24 h. Este procedimento irá desidratar completamente os pulmões.
- Mergulhe os pulmões desidratados em salicilato de metila por 24 h. Após esse processo de limpeza, a árvore arterial pulmonar ficará visível e os êmbolos também poderão ser vistos, pois o salicilato de metila não elimina a hemoglobina (Figura 4B,D).
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Resultados
Sintomas e patologia do modelo PE
Durante a embolização, os ratos apresentaram falta de ar e o tórax apresentou flutuações alargadas. Quase todos os animais sobreviveram ao episódio de embolia pulmonar quando menos de 10 cm de coágulos sanguíneos foram administrados (14 de 15 animais modelados). Depois de serem devolvidos às suas gaiolas, os animais se enrolaram nos cantos e mostraram interesse reduzido por comida e água. No entanto, esses sintomas desapareceram rapidamente e, em algumas horas, os ani...
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Discussão
Neste estudo, um modelo de rato minimamente invasivo de EP usando coágulos sanguíneos autólogos foi estabelecido com sucesso. Uma vez dominado, este procedimento de modelagem pode ser concluído em 30 minutos. O modelo captura efetivamente as principais características da EP clínica, conforme confirmado por exames patológicos. Consequentemente, oferece uma ferramenta valiosa para elucidar as alterações hemodinâmicas e patogênese das complicações após a EP, desenvolver novos biomarcadores ...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Este estudo é apoiado por uma bolsa da Wu Jieping Medical Foundation (320.6750.19089-36).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Balança analítica | METTLER TOLEDO | MA55/A | Nenhum |
| Agulha dispensadora | Jinrong electronics | Nenhum | 19 G e 18 G |
| Tesouras finas | Mais forte | XGJ1300 | Nenhum |
| Sal de heparina sódica | Solarbio | 01-08-9041 | 140U/mg |
| Isoflurano | RWD | R510-22-10 | Nenhum |
| Salicilato de metila | Macklin | M813577 | AR, 99% |
| Micro clamp | JZ | W40160 | Nenhum |
| Micro pinças | Mais forte | XGN1310 | Nenhum |
| Composto de fundição de silicone | Flow Tech | MV-130 | Nenhum |
| Ratos Sprague-Dawley | Vital River | SD-IGS | Nenhum |
| Microscópio estéreo | Murzider | MSD204 | Nenhum |
Referências
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Reimpressões e permissões
