Isolamento, purificação e identificação de bacitracina

Resumo

Este protocolo fornece uma descrição completa e abrangente do processo detalhado para o isolamento, purificação e identificação de Bacillus licheniformis produtores de bacitracina a partir de fezes de porcos saudáveis.

Resumo

Bacillus licheniformis e bacitracina têm um enorme mercado de aplicação e valor nas áreas de medicina, química, aquicultura, produtos agrícolas e secundários. Portanto, a seleção de B. licheniformis com alta produção de bacitracina é de grande importância. Neste protocolo experimental, o bacilo com alto rendimento de bacitracina foi isolado, purificado e identificado a partir das fezes frescas de suínos saudáveis. O efeito inibitório do metabólito secundário bacitracina sobre Micrococcus luteus também foi testado. A cromatografia em camada delgada e a cromatografia líquida de alta eficiência foram utilizadas para a detecção qualitativa e quantitativa da bacitracina. As características fisiológicas e bioquímicas de B. licheniformis foram determinadas por kits relevantes. As relações filogenéticas de B. licheniformis foram determinadas e construídas usando detecção de sequência gênica. Este protocolo descreve e apresenta o processo padrão de isolamento, purificação e identificação de B. licheniformis a partir de fezes frescas de animais de várias perspectivas, fornecendo um método para a utilização em larga escala de B. licheniformis e bacitracina em fábricas.

Introdução

Bacillus licheniformis é uma espécie de Bacillus da família Firmicutes, amplamente distribuída em vários ambientes, como água, solo e intestino de animais¹. B. licheniformis tem uma estrutura curta e robusta em forma de bastonete e se move individualmente². A colônia é quase redonda e opaca, com uma protuberância central e bordas limpas de branco acinzentado³. Possui forte capacidade de crescimento e reprodução e pode absorver e utilizar nutrientes de várias fontes de carbono, como monossacarídeos, polissacarídeos, cetose e ácidos orgânicos⁴. No estágio posterior de crescimento e desenvolvimento, B . licheniformis pode existir na forma de esporos dormentes e produzir substâncias antibacterianas, como bacitracina, liquenisina e surfactina. Também pode resistir à deficiência nutricional e ao ambiente externo extremo⁵. Não há preferência óbvia de códons, e o sistema de secreção eficiente determina a secreção proteica heteróloga de B. licheniformis, que é o dobro da de Bacillus subtilis⁶. É frequentemente usado para produzir preparações enzimáticas como protease, amilase e celulase⁷. Devido à sua falta de toxinas endógenas, é certificada como uma estirpe segura para alimentos e listada no QPS pela EFSA⁸. Portanto, existem vários usos potenciais, incluindo a produção de compostos bioativos, que têm uma ampla gama de aplicações nas indústrias de aquicultura, agricultura, alimentos, biomedicina e farmacêutica. Além disso, B. licheniformis é um componente importante da flora intestinal animal, que pode promover os animais a melhorar o desempenho da produção, melhorar o equilíbrio da flora intestinal e prevenir doenças. Todo o genoma de B. licheniformis ATCC14580 foi analisado em 2004, e as informações básicas de tradução da transcrição, dobramento de proteínas e mecanismo de secreção foram gradualmente compreendidas⁹. Essa informação genética o torna propício para a modificação genética em nível molecular, contribuindo para facilitar a produção em larga escala de B. licheniformis.

A bacitracina é um antibiótico peptídico dodecacíclico produzido pela peptídeo sintetase não ribossômica por metabolismo secundário em B. subtilis e B. licheniformis. A bacitracina é uma mistura composta por vários componentes, como bacitracina A, B e C, onde um ou dois aminoácidos diferem entre cada componente; entre estes, a bacitracina A tem a atividade biológica mais forte¹⁰. A bacitracina pode inibir bactérias gram-positivas, como Staphylococcus e Micrococcus luteus , e algumas bactérias gram-negativas, inibindo a formação da parede celular e interagindo com proteínas de ligação à membrana¹¹. Enquanto isso, a bacitracina é segura e estável, não é fácil de produzir resistência aos medicamentos e pode ser compatível com outros medicamentos antibacterianos¹². Portanto, a bacitracina é usada na prática médica e veterinária. Além disso, devido à sua rápida taxa de eliminação e baixa taxa de absorção, também pode ser usado como aditivo para ração animal¹³.

B. licheniformis pode colonizar o intestino e melhorar o microambiente gastrointestinal. A capacidade de adesão e reprodução e as funções fisiológicas relacionadas de Bacillus de diferentes fontes no trato gastrointestinal de diferentes animais são diferentes. O B. licheniformis derivado de porco é mais propício à colonização no intestino de porcos e outros animais. Existe uma estreita relação entre a abundância relativa de probióticos intestinais e o estado de saúde do hospedeiro¹⁴. A suplementação dietética com mistura de B. licheniformis em leitões desmamados melhora o ecossistema intestinal, alterando a composição da microbiota e a atividade metabólica, além de afetar a mucosa intestinal¹⁵. As fezes dos animais podem refletir o tipo e a quantidade da flora intestinal animal. Este protocolo descreve o isolamento e purificação de Bacillus spp. produtores de bacitracina de fezes de suínos saudáveis. As fezes são derivadas de porcas Taihu que não são alimentadas com ração composta e têm excelente desempenho de produção em fazendas de suínos. Os isolados foram identificados como B. licheniformis com base em suas características morfológicas, propriedades físico-químicas e identificação bioquímica.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram documentados e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Tecnológica de Nanjing. As fezes foram derivadas de porcas Taihu com cerca de 2 anos de idade (ver Tabela de Materiais), que foram criadas em fazendas de porcos profissionais e padrão.

1. Preparação de mídia

1. Meio líquido Luria-Bertani (LB): Adicione 10 g de NaCl, 5 g de extrato de levedura em pó e 10 g de triptona em uma garrafa cônica, adicione água destilada a 1 L, mexa e dissolva com uma haste de vidro. Transfira 100 mL de meio para um frasco cônico de 500 mL e amarre-o firmemente com filme de vedação respirável. Esterilize a 121 °C em autoclave por 20 min (consulte a Tabela de Materiais).
2. LB meio sólido: Adicione 10 g de NaCl, 5 g de extrato de levedura em pó, 10 g de triptona, 20 g de ágar pó a uma garrafa cônica, adicione água destilada a 1 L, dissolva com uma haste de vidro e amarre firmemente com um filme de vedação respirável. Esterilizar a 121 °C em autoclave durante 20 min. Quando o meio for resfriado a 50 °C, despeje 20 mL do meio em placas de Petri, deixe-as esfriar e guarde-as de cabeça para baixo.
3. Meio de fermentação de bacitracina: Adicione 8 g de farelo de soja, 4 g de amido solúvel, 0,1 g (NH₄)₂SO₄, 0,6 g de CaCO₃ e 100 mL de água destilada a um frasco cônico de 500 mL, mexa com uma haste de vidro para dissolver completamente e amarre firmemente com um filme de vedação respirável. Esterilize a 121 °C em autoclave por 20 min (consulte a Tabela de Materiais).
4. Suspensão de M. luteus : Selecione um anel de M. luteus e inocule em uma placa de cultura LB, preparada na etapa 1.2 (consulte a Tabela de Materiais). Cultura em estufa a temperatura constante a 37 °C durante 16 h (ver quadro de materiais). Adicione 5 mL de solução salina normal à placa e agite suavemente para eluir as colônias. Meça o OD600 e dilua a solução em um tubo de ensaio para obter uma suspensão com OD600 de 0,3-0,7. Conservar a suspensão de M. luteus a 4 °C para utilização posterior.
5. Meio de ensaio de atividade antibacteriana: Adicione 1 mL de suspensão de M. luteus , preparada na etapa 1.4, a 100 mL de meio sólido LB líquido preparado na etapa 1.2 e agite levemente. Tome imediatamente 5 mL desta solução contendo M. luteus e espalhe-a uniformemente na placa de cultura LB.

2. Isolamento e purificação de Bacillus de fezes frescas de suínos saudáveis

1. Adicione 9 mL de solução salina normal e 1,0 g de fezes frescas de porco em um erlenmeyer de 150 mL. Mexa com um agitador magnético (consulte a Tabela de Materiais) à temperatura ambiente a 60 rpm / min por 15 min.
2. Coloque o extrato fecal em banho-maria com termostato a 80 °C (consulte a Tabela de Materiais) por 20 minutos para matar bactérias não produtoras de esporos.
3. Adicionar a suspensão a 100 ml de LB de meio líquido num balão Erlenmeyer de 250 ml e cultivar num shaker (ver Tabela de Materiais) a 180 rpm/min a 37 °C durante 8 h.
4. Realize a diluição em série da solução bacteriana cultivada com solução salina normal de ^10-1 a ^10-8. Aplique 0,1 mL de diluente bacteriano ^10-6, ^10-7 e ^10-8 em placas de cultura LB individuais e deixe secar. Após 10 min, coloque as placas de cabeça para baixo em uma incubadora de temperatura constante a 37 ° C por 48 h.
5. Use o anel de inoculação para escolher as colônias que se parecem com B. licheniformis (cor branca cremosa, consistência macia, aparência mucóide, elevação convexa e plana e formato irregular)¹⁶e risque-as usando um padrão em zigue-zague no meio de ensaio de atividade antibacteriana preparado na etapa 1.5 (ver Figura 1).
6. Colocar as placas na incubadora a 37 °C durante 48 h e observar se existe uma zona de inibição em redor da colónia.

3. Triagem para inibição da atividade de M. luteus

1. Selecione uma única colônia que gerou uma zona inibitória e adicione a 100 mL de meio líquido LB, cultive no agitador a 37 ° C e 180 rpm / min por 12 h.
2. Inocular 5 ml do meio de cultura no meio de fermentação de bacitracina preparado no passo 1.3 e cultivar a 37 °C durante 48 h.
3. Colete o caldo de fermentação em um tubo de centrífuga e centrifugue a 13.400 x g a 4 ° C por 15 min e, em seguida, filtre usando uma membrana filtrante microporosa de 0,22 μm (consulte a Tabela de Materiais).
4. Adicione uma xícara Oxford a uma placa média de ensaio de atividade antibacteriana fresca e, em seguida, adicione 50 μL de filtrado (sobrenadante de fermentação) à xícara Oxford (consulte a Tabela de Materiais). Cultura em incubadora a 37 °C durante 12 h. Após a incubação, meça o diâmetro da zona inibitória com um paquímetro (consulte a Tabela de Materiais).
5. Selecionar as cepas e o sobrenadante de fermentação correspondente com um diâmetro de zona inibitória superior a 15 mm para experimentos subsequentes.

4. Identificação da bacitracina por cromatografia em camada delgada

1. Adicione 60 mg de bacitracina padrão e dissolva em EDTA-2Na a 1% (ver Tabela de Materiais) em um frasco volumétrico de 10 mL para fazer uma solução de bacitracina de 6,0 mg / mL.
2. Diluir 1 mL do sobrenadante de fermentação para 10 mL com 1% de EDTA-2Na. Localize 5 μL de amostra e 5 μL de solução-padrão de bacitracina na placa de camada fina de sílica gel ativada (consulte a Tabela de Materiais).
3. Adicione 100 mL de ácido n-butanol-acético-água-piridina-etanol (60:15:10:6:5) ao tanque cromatográfico (ver Tabela de Materiais). Colocar a placa de camada fina de sílica-gel na cuba cromatográfica. Cubra e deixe descansar em temperatura ambiente por 30 min.
4. Retire a placa de camada fina de sílica gel, borrife solução de butanol-piridina (99:1) contendo 1% de ninidrina (consulte a Tabela de Materiais) e aqueça a 105 ° C por 5 min até que apareçam manchas vermelhas acastanhadas. Calcular R_f (valor do fator de retenção) para a norma e a amostra de acordo com a seguinte fórmula:
   R_f = Distância de deslocamento do ponto/Distância de deslocamento do solvente.

5. Detecção de bacitracina por HPLC

1. Adicione 0,3 mL de sobrenadante de fermentação e 1,2 mL de etanol a 50% em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, agite por 5 min com a mão e deixe descansar a 4 ° C por 12 h.
2. Centrifugue a 13.400 x g por 15 min e filtre em um sample frasco rotulado como S1 com uma membrana filtrante microporosa de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais).
3. Preparação da solução-mãe de bacitracina: Adicione 0,4 g de bacitracina padrão (60 U / mg; consulte a Tabela de Materiais), 100 mL de 40 g / L de EDTA-2Na (consulte a Tabela de Materiais) em um balão volumétrico de 100 mL para preparar 240 U / mL de solução-mãe de bacitracina.
4. Adicione 3 mL de solução-mãe de bacitracina e 21, 9, 3, 1 e 0 mL de água ultrapura aos tubos de ensaio rotulados como A1, B1, C1, D1 e E1, respectivamente. Após filtração com membrana filtrante microporosa de 0,22 μm, coloque o filtrado em frascos de amostra rotulados como A2, B2, C2, D2 e E2.
   NOTA: As concentrações da solução padrão de bacitracina são 30, 60, 120, 180 e 240 U / mL.
5. Colocar A2, B2, C2, D2, E2 e S1 no tabuleiro de ensaio do instrumento de HPLC. Coloque 1000 mL de 50 mM / L de formiato de amônio e 1000 mL de acetonitrila na bandeja de fase móvel e defina-os como fases móveis A e B, respectivamente.
   NOTA: O pH do formiato de amônio deve ser ajustado para 4,0 com ácido fórmico.
6. Instale a coluna de HPLC C18 (5 μm, 4.6 mm x 250 mm) na direção indicada na coluna (consulte a Tabela de Materiais).
7. Defina os parâmetros da fase móvel como 0 min, 77% A e 23% B; 30 min, 70% A e 30% B; 40 min, 60% A e 40% B; 50 min, 60% A e 40% B; 51 min, 77% A e 23% B; 58 min, 77% A e 23% B. Defina o tamanho da amostra como 100 μL; Vazão, 1,0 mL/min; Temperatura da coluna, 30 °C.
8. Clique no botão Executar para executar o programa.

6. Identificação morfológica

1. Diluir e revestir a estirpe com o título de bacitracina mais elevado numa placa de cultura LB e cultivar numa incubadora a 37 °C durante 48 h. Manchar e observar a morfologia da colônia conforme descrito abaixo.
2. Adicione uma gota de água purificada estéril à lâmina, pegue uma pequena quantidade de colônias e adicione à gota de água. Espalhe uniformemente, deixe a lâmina secar naturalmente e fixe sobre uma chama.
3. Adicione violeta cristal por 1 min para manchar a amostra e depois enxágue com água da torneira. Adicione iodo por 1 min para manchar a amostra e depois enxágue com água destilada.
4. Adicione álcool 95%, agite a lâmina para descolorir por 1 min e depois enxágue com água destilada.
5. Adicione o açafrão por 1 min para manchar a amostra e depois enxágue com água destilada. Deixe a lâmina secar naturalmente e observe a morfologia da colônia sob um microscópio com imersão em óleo (ver Tabela de Materiais).

7. Identificação fisiológica e bioquímica

1. Adicione 2 mL de solução salina estéril no tubo de ensaio e inocule uma única colônia da placa na solução salina estéril usando um anel de inoculação para obter a suspensão bacteriana.
2. Adicione 100 μL da suspensão bacteriana em cada orifício para medir V-P, citrato, gelatina, cloreto de sódio a 7%, pH 5,7, redução de nitrato e hidrólise de amido na tira de identificação bioquímica de Bacillus (ver Tabela de Materiais).
3. Use o anel de inoculação para escolher outra colônia única e risque-as no padrão de zigue-zague no tubo bioquímico de crescimento anaeróbico da tira de identificação bioquímica do Bacilo
4. Use o anel de inoculação para pegar as outras colônias e perfurá-las verticalmente nos poros para identificação de propionato, D-xilose, L-arabinose e D-manitol na tira de identificação bioquímica do Bacillus .

8. Determinação da sequência do gene da estirpe

1. Extraia o DNA da cepa usando um kit de extração de DNA de bactérias (consulte a Tabela de Materiais): Adicione 2 mL de líquido de semente em um tubo de microcentrífuga de 5 mL e centrifugue a 11.500 x g por 1 min. Rejeitar o sobrenadante e adicionar 110 μL de tampão (contendo 20 mM de Tris, pH 8,0; 2 mM de_{Na 2-EDTA} e 1,2% de Triton) e 70 μL de solução de lisozima a 50 mg/ml ao pellet e incubar a 37 °C durante 30 min.
2. Adicione 4 μL de 100 mg / mL de RNase A por 15 s e deixe por 5 min em temperatura ambiente. Adicione 20 μL de solução de proteinase K e misture bem.
3. Adicione 220 μL de tampão GB, agite por 15 s até que o pellet esteja suspenso, coloque a 70 ° C por 10 min para tornar a solução clara e faça uma pequena centrifugação para remover as contas de água na parede do tubo.
4. Adicione 220 μL de etanol anidro, choque totalmente por 15 s, separação curta. Transferir a solução e a precipitação de floculação para a coluna de adsorção CB3 do tubo de recolha, centrifugar a 13,400 x g durante 30 s e rejeitar o sobrenadante.
5. Adicione 500 μL de tampão GD na coluna de adsorção, centrifugue por 30 s a 13.400 x g e descarte o sobrenadante. Adicione 600 μL de PW à coluna, centrifugue por 30 s a 13.400 x g e descarte o sobrenadante.
6. Voltar a colocar a coluna de adsorção no tubo de recolha, centrifugar durante 2 min a 13.400 x g e rejeitar o sobrenadante.
7. Coloque a coluna de adsorção em temperatura ambiente por 10 min para secar. Transferir a coluna para o tubo de centrifugação e adicionar 100 μL de tampão de eluição TE no meio da membrana de adsorção.
8. Deixe em temperatura ambiente por 5 min para coletar o fluxo para o tubo da centrífuga e centrifugue por 2 min a 13.400 x g.
9. Adicione 25 μL de mistura principal 2x (consulte a Tabela de Materiais), 2,5 μL de amostra de DNA obtida na etapa 8.8, 2 μL de primer direto 27F, 2 μL de primer reverso 1492R e 18,5 μL de H₂O destilado duplo a um tubo de PCR de 0,1 mL.
   NOTA: As sequências gênicas dos primers são 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' e 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
10. Coloque o tubo de PCR na máquina de PCR (consulte a Tabela de Materiais) nas seguintes condições: pré-desnaturação a 95 °C por 10 min, desnaturação a 95 °C por 30 s, recozimento a 55 °C por 30 s, extensão a 72 °C por 90 s, extensão a 72 °C por 7 min. Execute o ciclo de três etapas de desnaturação, recozimento e extensão por 32x.
11. Pegue 5 μL do produto e faça eletroforese com gel de agarose a 1% a 120 V por 30 min.
    1. Dissolva 500 mg de agarose em 50 mL de tampão 1x TAE. Aqueça a solução no micro-ondas por 1-2 min até que a agarose esteja completamente dissolvida. Adicione 5 μL de corante de coloração de DNA, despeje em uma bandeja de gel e insira a placa de orifício. Deixe repousar em temperatura ambiente por 30 min até solidificar; coloque o gel no tanque de eletroforese e adicione 1x tampão TAE para submergir o gel. Adicione 2 μL de escada de DNA de 2 kb (10 mg / μL) no primeiro poço e 5 μL de produto de PCR misturado com 1 μL de corante de carga nos poços restantes no gel.
12. Coloque o gel no sistema de imagem de gel e tire uma foto. Corte as tiras de DNA rapidamente sob luz ultravioleta e pese.
13. Adicione tiras a um tubo de microcentrífuga e adicione um volume igual de solução de NP. Manter o tubo em banho-maria a 50 °C até que o gel esteja totalmente dissolvido.
14. Adicionar 500 μL de BL líquido de equilíbrio à coluna de adsorção CA2, centrifugar a 13.400 x g durante 1 min e rejeitar o sobrenadante.
15. Adicione a solução de gel dissolvido à coluna de adsorção CA2 e coloque-a à temperatura ambiente por 2 min, centrifugue-a a 13.400 x g por 30 s e descarte o sobrenadante.
16. Adicionar 600 μL de PW à coluna de adsorção CA2, centrifugar a 13.400 x g durante 1 min, rejeitar o sobrenadante e repetir 1x.
17. Colocar a coluna de adsorção CA2 num tubo de recolha, centrifugar a 13.400 x g durante 2 minutos e rejeitar o sobrenadante.
18. Coloque a coluna de adsorção CA2 em temperatura ambiente por 10 min para secar completamente e, em seguida, coloque-a em um tubo de centrífuga limpo.
19. Adicione 50 μL de tampão eluidor EB ao filme de adsorção suspenso à temperatura ambiente por 2 min e colete a solução de DNA por centrifugação a 13.400 x g por 2 min.
    NOTA: As soluções ou reagentes acima mencionados estão incluídos no Kit de Purificação (consulte a Tabela de Materiais).
    1. Envie a solução de DNA coletada para uma empresa de sequenciamento profissional (consulte a Tabela de Materiais) para sequenciamento. Compare os resultados do sequenciamento por Blast no banco de dados GenBank do NCBI. De acordo com a homologia de sequência, selecione diferentes linhagens e construa árvores filogenéticas pelo método de Máxima Verossimilhança no MEGA-X para determinar as relações entre as espécies das linhagens.

Resultados

Neste experimento, 48 cepas de Bacillus foram isoladas de fezes frescas de suínos saudáveis, numeradas de 1001 a 1048. Dentre elas, 15 cepas apresentaram atividade antibacteriana contra M. luteus. Das 15 cepas, os títulos de bacitracina foram medidos por cromatografia líquida de alta eficiência, conforme mostrado na Tabela 1. Dentre eles, B. licheniformis nº 1026 apresentou o maior título de bacitracina, 456,35 ± 21,75 U/mL, de modo que o nº 1026 foi selecionado para experimentos subsequentes.

Os resultados da identificação por CPT são mostrados na Figura 2A. A posição das manchas principais no caldo de fermentação da cepa nº 1026 e na solução padrão de bacitracina foi a mesma, e o valor de R_f foi de 0,61. Para análise por HPLC, a equação da curva padrão da bacitracina é y = 50,287x - 250,55 e o coeficiente de correlação R² = 0,9968 (Figura 2B). O tempo de pico do sobrenadante de fermentação foi consistente com o padrão de bacitracina (Figura 2C), de modo que a substância bacteriostática foi identificada como bacitracina, e o título de bacitracina foi de 456,35 ± 21,75 U/mL.

A colônia da cepa nº 1026 foi cultivada em meio LB por 12 h, conforme mostrado na Figura 3A. A colônia era redonda e transparente em forma de gotículas de água, com saliências completas e bordas limpas. Das 12 h às 24 h, a bactéria entrou nos estágios posteriores de crescimento. Conforme mostrado na Figura 3B, as colônias se espalharam em forma de ameixa, o centro se formou dobrado e a cor gradualmente se aprofundou para branco leitoso. É consistente com a descrição da morfologia da colônia de B. licheniformis¹⁶. Havia um muco transparente na borda. Após a coloração de Gram, a cepa nº 1026 foi observada ao microscópio, conforme mostrado na Figura 3C. As células eram bastonetes roxos, indicando bactérias Gram-positivas.

Conforme mostrado na Tabela 2, a cepa nº 1026 pode crescer em um ambiente anaeróbico. A cepa foi positiva para teste V-P, utilização de citrato, redução de nitrato e hidrólise de amido. A cepa foi capaz de se decompor e utilizar a maioria das fontes de carbono. Apresentou as mesmas características fisiológicas e bioquímicas de B. licheniformis.

O tamanho do fragmento de rDNA 16S da cepa nº 1026 era de cerca de 1400 pb de tamanho (Figura 4A). Os resultados do sequenciamento da cepa nº 1026 mostraram 99,58% de similaridade com os de B. licheniformis DSM 13 no GenBank. A árvore filogenética foi então construída, conforme mostrado na Figura 4B. O comprimento do ramo evolutivo de B. licheniformis DSM 13 é 0,000, indicando que é B. licheniformis.

Com base nas características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas da cepa nº 1026 e na análise de homologia da sequência do gene 16S rDNA, a cepa nº 1026 foi identificada como B. licheniformis.

Figura 1: Diagrama esquemático de inoculação da cepa. O anel de inoculação foi usado para pegar as colônias e marcá-las em zigue-zague no meio de ensaio de atividade antibacteriana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Identificação de substâncias bacteriostáticas. (A) Cromatografia em camada delgada. (B) Curva padrão de HPLC de bacitracina. C) Cromatograma para HPLC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Características morfológicas e coloração de Gram da cepa nº 1026. Morfologia da colônia em (A) 12 h e (B) 24 h. (C) Coloração de Gram. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Identificação biológica molecular da cepa nº 1026. (A) Amplificação gênica da cepa nº 1026 16S rDNA. (B) Árvore filogenética da cepa nº 1026. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NÃO.	Título de bacitracina (U/mL)	NÃO.	Título de bacitracina (U/mL)
1003	423.57±18.62	1021	317.46±13.46
1004	325.82±13.23	1026	456.35±21.75
1009	326.26±14.52	1027	435.57±19.18
1011	376,65±16,11	1030	382.48±17.64
1015	325.27±12.37	1031	215.37±11.73
1016	256.56±15.37	1039	353.67±16.16
1017	352.47±16.47	1041	342.36±14.36
1018	328.73±16.12

Tabela 1: O título de bacitracina de cepas de atividade antibacteriana.

Itens	Resultados	Itens	Resultados
Teste de crescimento anaeróbico	+	Teste de D-manitol	+
Ensaio V.P	+	Teste de gelatina	+
Teste de utilização de citrato	+	Teste de 7% NaCl	+
Teste de propionato	+	teste de pH 5,7	+
Teste de D-xilose	+	Teste de redução de nitrato	+
L-arabinose	+	Teste de hidrólise do amido	+

Tabela 2: Identificação fisiológica e bioquímica da cepa nº 1026.

Discussão

B. licheniformis cresce rapidamente com condições de cultura simples e consumo rápido de açúcar, e a tecnologia de fermentação madura é útil para economizar custos de produção industrial¹³. A ampla aplicação de B. licheniformis e suas secreções, a bacitracina, determinou seu valor de mercado promissor. Na agricultura, B. licheniformis é empregado como biofertilizante para melhorar o crescimento das plantas e a absorção de nutrientes, aumentando a fertilidade do solo, promovendo o desenvolvimento das raízes e auxiliando na degradação da matéria orgânica¹⁵. Para a produção industrial de enzimas, B. licheniformis produz uma variedade de enzimas, como proteases, amilases, celulases e lipases, o que determina seu valor de mercado insubstituível no processamento de alimentos, fabricação de detergentes, processamento de couro e indústria têxtil¹⁶. Tendo em vista a atividade farmacológica antibacteriana superior de B. licheniformis e bacitracina, tem sido usado na área médica para tratar uma variedade de doenças infecciosas induzidas por bactérias e fungos¹. Enquanto isso, considerando o crescimento de plantas herbáceas, bem como o acúmulo de ingredientes farmacologicamente ativos nas plantas, B. licheniformis é um potencial potencializador do crescimento vegetal, bem como útil para a produção de compostos como o salidrosídeo derivado da Rhodiola ^17,18. As vantagens acima de B. licheniformis e bacitracina os tornam amplamente úteis na indústria, agricultura, aquicultura, biotecnologia e indústrias médicas. Portanto, a separação e purificação de B. licheniformis com alto rendimento de bacitracina é um fator decisivo para garantir a produção e aplicação subsequentes em larga escala.

Embora a bacitracina possa ser preparada por síntese química, as etapas são complicadas e existem muitos subprodutos. Na indústria, a bacitracina é produzida principalmente pelo processo metabólico secundário da farinha de milho e do farelo de soja fermentados por B. licheniformis. Na produção industrial moderna de bacitracina, o alto custo e o baixo rendimento dificultam sua aplicação posterior¹⁰. Portanto, a triagem de cepas de bacitracina de alto rendimento e a melhoria da taxa de utilização de matérias-primas são a chave para melhorar a produção de bacitracina.

Atualmente, o melhoramento de cepas de bacitracina de alto rendimento é principalmente por meio do melhoramento natural do solo e de outros ambientes, melhoramento por mutação usando cepas produtoras de bacitracina existentes ou melhoramento baseado em engenharia genética. A operação de melhoramento natural é simples e as cepas peneiradas têm capacidade de produção estável, mas o processo leva muito tempo e a carga de trabalho é grande. A reprodução por mutação tem uma alta taxa de mutação e encurta o tempo de reprodução, mas a mutação pode não ser capaz de ser herdada de forma estável nas gerações subsequentes¹⁶. O melhoramento genético baseado em engenharia genética é mais direcionado para a obtenção de cepas de alto rendimento¹⁰, mas há preocupações de segurança causadas pela introdução de genes exógenos. Fezes saudáveis de animais adultos contêm recursos probióticos abundantes que podem manter o equilíbrio da flora.

Neste artigo, com base nas características de B. licheniformis para produzir esporos dormentes em ambientes extremos¹⁹, a diluição de fezes de porco saudável foi colocada em um ambiente de alta temperatura para matar as bactérias e fungos não produtores de esporos resistentes ao calor. Como M . luteus é sensível à produção de peptídeos bacteriostáticos por B. licheniformis no estágio final de crescimento e produz um pigmento amarelo para facilitar a observação, ele é usado para rastrear a atividade antibacteriana com base na avaliação da zona de inibição. De acordo com a morfologia da colônia semelhante à morfologia de B. licheniformis, a morfologia celular é curta em forma de bastonete, Gram-positivas, características fisiológicas e bioquímicas de B. licheniformis, o RNA 16 s está intimamente relacionado a B. licheniformis, de modo a determinar que a cepa nº 1026 é B. licheniformis. A substância bacteriostática foi identificada por TLC e HPLC como bacitracina. Assim, B . licheniformis produtor de bacitracina foi obtido. Este método também apresenta deficiências, como o processo de triagem demorar muito e a operação exigir alguma experiência.

Em resumo, este protocolo experimental apresentou de forma abrangente e detalhada o processo de aquisição e identificação laboratorial de rotina de B. licheniformis produtor de bacitracina, que tem uma ampla perspectiva de aplicação e valor de mercado inestimável²⁰. Esses métodos são simples, viáveis e fáceis de implementar e, sem dúvida, serão uma referência eficaz para a produção em larga escala de B. licheniformis. Este artigo também fornece uma ideia de triagem para a produção de cepas para outros peptídeos antimicrobianos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2 &vezes; Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, China	P252-01
2kb Marcador de DNA	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Pequim, China	BM121-01
Acetonitrila	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	A104443
Pó de ágar	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	A800730
Agarose	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	A104062
Sulfato de amônio ((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Xangai, China	10002917
Esterilizador de autoclave	Zealway Instrument Inc., Xiamen, China	GI36DWS
Tira de identificação bioquímica de bacilo	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HBIG14
Bacitracin	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Xangai, China	B65740
	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pequim, China	DP209
Filme de vedação respirável	Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.	BS-QM-01A
Butanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	B433378
C18 (5 μ m, 4,6 &vezes; 250 mm) Coluna de HPLC	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, China	C1805-462510
Carbonato de cálcio (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10005717
Centrifuge	New Brunswick Scientific Co., Inc., UK	5452
Tanque cromatográfico;	Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, China	P-1
	Sichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, China	18012
Incubadora de temperatura constante	Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, China	GH4500
Fosfato dipotássico (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, China	XL0015
EDTA-2Na	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	E397526
Balança eletrônica	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
Álcool etílico	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	Kit de
Gel Midi	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pequim, China	DP302
Haste de vidro	Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.	1294
Glicose	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	Kit de
Gram	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HB8278
Cromatógrafo líquido de alto desempenho	Agilent Technologies, Inc., Califórnia, América	1260
Aparelho	de eletroforese horizontalBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Pequim, China	Anel de inoculação DYCP-31DN BIOMATE
	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Xangai, China	3171026
Agitador magnético	Wiggens GmbH Co., Ltd., Alemanha	WH220 PLUS
Álcool metílico	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	M116115
Tubo de microcentrífuga	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Xangai, China	1351171 Coleção de
Micrococcus luteus	Bena, Suzhou, China	BNCC102589
Membrana filtrante microporosa	Nantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.	PES0.22
Ninhydrin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	N105629
Microscópio óptico	Optical Instrument Factory, Xangai, China	DYS-108
Fezes de porco	Nanjing Quanfu Pig Farm, Nanjing, China
Amplificador de reação em cadeia da polimerase (PCR)	Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, China	ETC811
Empresa de sequenciamento profissional	General Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
Pyridine	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	P111516
Shaker	Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd., Taicang, China	HYL-C
Sílica gel GF254 placa	de camada finaYantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, China	HPT-HSGF5025023
Cloreto de sódio (NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	S805275
Citrato de sódio	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Xangai, China	C39197100001
amido solúvel	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	S817547
Termostato banho-maria	Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Xangai, China	DK-8D
Triptona	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	T139519
Ultra GelRed	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, China	GR501-01
Instrumento de água ultra pura	Merck KGaA Co., Ltd., Alemanha	Milli Limpador Ultrassônico Direct-Q8
	Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, China	Paquímetro Vernier SB-100DT
	Sanfeng Company, Japão	N20P
Extrato de levedura em pó	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., Pequim, China	LP0021