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Artigo de método

Isolamento de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton e seus exossomos derivados/pequenas vesículas extracelulares

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DOI:

10.3791/66778

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11 de novembro de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

Neste artigo

Resumo

O tecido do cordão umbilical é uma fonte rica, prontamente disponível e não invasiva de células-tronco mesenquimais (MSCs). Neste protocolo, são fornecidas etapas detalhadas para o isolamento e caracterização de MSCs de geléia de Wharton humanas (WJ-MSCs), seguidas por um protocolo curto simples para isolar seus exossomos derivados ou pequenas vesículas extracelulares.

Resumo

No campo da medicina regenerativa, as células-tronco mesenquimais (MSCs) têm despertado atenção especial. As MSCs do tecido do cordão umbilical (UC), conhecidas como geléia de Wharton, foram particularmente bem estabelecidas em uma variedade de aplicações. Em comparação com outras fontes de MSC, as MSCs de geléia da Wharton (WJ-MSCs) oferecem vários benefícios e são isoladas da UC, que normalmente é descartada como lixo médico. As WJ-MSCs, portanto, não levantam nenhuma questão ética semelhante àquelas relativas às células-tronco embrionárias. Uma técnica de explante simples e reprodutível foi usada para isolar WJ-MSCs do tecido UC. Dentro de cinco a dez dias de isolamento, as WJ-MSCs emergem como células aderentes com uma forma fibroblástica. Depois de isoladas, as células atingem cerca de 80% de confluência em 14-18 dias. Em seguida, na passagem 3, as WJ-MSCs isoladas foram totalmente caracterizadas por induzi-las a se diferenciar ao longo das linhagens mesenquimais adipogênica, osteogênica e condrogênica. Além disso, a imunofenotipagem para marcadores de superfície de cluster de diferenciação (CD) negativos, incluindo CD34, CD14 e HLA-DR, bem como marcadores de superfície MSC distintos como CD105, CD90, CD73 e CD44 foram testados. Além disso, o reagente precipitante foi usado em uma abordagem direta para isolar exossomos / pequenas vesículas extracelulares (sEVs) do meio condicionado dessas WJ-MSCs. Após o isolamento, os exossomos/sEVs foram observados em microscópio eletrônico de transmissão, e a análise de tamanho de partícula foi utilizada para calcular seu tamanho médio. Em resumo, as WJ-MSCs fornecem um suprimento renovável, não invasivo e prontamente disponível de células-tronco que podem ser usadas como fábricas para produzir exossomos / sEVs. Essas WJ-MSCs e seus exossomos/sEVs derivados podem ser usados em uma ampla gama de aplicações terapêuticas e de pesquisa a jusante.

Introdução

Apenas alguns anos atrás, acreditava-se que as células-tronco assumiam a liderança na medicina 1,2. No entanto, a preocupação ética representada pelas células-tronco embrionárias (CTEs) foi um grande obstáculo que impediu o rápido progresso no campo3. Isso despertou muito interesse em explorar fontes renováveis alternativas para células-tronco, especialmente aquelas que podem ser isoladas pós-natal do cordão umbilical ()4. A UC se une naturalmente à placenta e ao feto dentro de uma mãe grávida. O papel inato da UC é nutrir o feto em crescimento com um suprimento sanguíneo contínuo e suficiente através dos vasos sanguíneos e garantir a proteção desses vasos, evitando qualquer possível torção, compressão ou torção do feto durante seu movimento5. Anatomicamente, a UC humana consiste em duas artérias e uma veia que estão embutidas em um tecido conjuntivo mucoide e encerradas em uma camada externa de epitélio amniótico6. A matriz UC, ou o tecido conjuntivo mucoide que envolve os três vasos umbilicais, é conhecida como "geléia de Wharton" (WJ) e é composta principalmente de proteoglicanos e colágeno7.

Recentemente, as células-tronco mesenquimais (CTMs) têm chamado muita atenção por serem uma nova modalidade terapêutica eficaz para uma ampla gama de aplicações da medicina regenerativa 7,8,9,10,11,12. O que é mais intrigante sobre as CTMs é sua facilidade de isolamento, bem como atividades imunomoduladoras demonstradas e multipotência 13,14,15. Outras vantagens superiores das CTMs em geral e daquelas derivadas da WJ em particular são que nenhum teratoma se manifesta após o transplante, ao contrário das CTEs, e o fato de manterem sua propriedade de stemness mesmo após várias passagens celulares16,17. Assim, acredita-se agora que as CTMs poderiam de fato fornecer intervenções terapêuticas revolucionárias para várias doenças 8,18,19. É importante ressaltar que, em 2006, a International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) definiu critérios mínimos específicos para a caracterização adequada dasCTM20. Primeiro, quando cultivadas / cultivadas em condições de cultura padrão, as MSCs devem ser aderentes ao plástico. Em segundo lugar, as MSCs devem expressar algum conjunto característico de marcadores de superfície de diferenciação (CD) como CD90, CD105 e CD73, e não devem mostrar expressão de outros como CD14, CD34 e CD45. Em terceiro lugar, as MSCs devem se diferenciar em linhagens osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas in vitro20. Até hoje, as CTMs foram isoladas de múltiplas fontes, incluindo tecidos adultos, como medula óssea (MO), tecido adiposo21, bem como fontes fetais/perinatais como placenta, sangue UC (UCB) e matriz UC22,23. Vale ressaltar aqui que, ao comparar a taxa de sucesso da colheita de MSCs, foi relatado que ela atinge quase 100% do tecido WJ em comparação com apenas cerca de 6% do UCB 24,25. Assim, embora o SCU seja de fato uma rica fonte de células-tronco hematopoiéticas, também é considerado uma boa fonte de CTMs, porém significativamente menor que o WJ 26,27,28.

As WJ-MSCs são excepcionais quando comparadas a outros tipos de MSCs porque, embora sejam MSCs genuínas (típicas), possuindo propriedades semelhantes às de suas contrapartes adultas, elas também possuem a expressão de vários marcadores de pluripotência/ESCs17,29. Assim, acredita-se que as WJ-MSCs estejam em algum lugar entre as células-tronco adultas e embrionárias17. Curiosamente, descobriu-se que as WJ-MSCs expressam MSCs humanas e marcadores ESCs e são capazes de manter a estaminalidade por várias passagens16. Felizmente, após o transplante, eles não formam teratomas17. Isso pode ser elucidado por seu perfil transcriptômico único em comparação com ESCs, bem como outras MSCs29,30. As WJ-MSCs apresentam várias vantagens sobre as MSCs adultas e até mesmo sobre outros tipos de células-tronco em geral. Seus meios de isolamento estão prontamente disponíveis, por meio da UC que é rotineiramente descartada no nascimento e, portanto, é considerada lixo médico. Portanto, ao contrário das CTEs, as CTMs-WJ não têm preocupações éticas e, ao contrário das CTMs-BM, que são isoladas por meio de uma técnica invasiva31. Além disso, como outros tipos de MSC, as WJ-MSCs não têm a expressão do antígeno D de leucócitos humanos (HLA-DR) e, particularmente, expressam o antígeno G de leucócitos humanos (HLA-G), o que lhes confere um privilégio imunológico extra32. Isso sugere que as WJ-MSCs exibem um papel imunossupressor simulando o que geralmente ocorre na interface feto-mãe in vivo 33,34,35. Finalmente, como seus análogos isolados do UCB, as WJ-MSCs têm grande potencial para o banco36. Dadas todas essas vantagens, as WJ-MSCs são, portanto, defendidas como o novo padrão ouro para terapias baseadas em MSC30.

Curiosamente, uma grande quantidade de pesquisas revelou que as MSCs exibem seus efeitos terapêuticos principalmente por meio da sinalização parácrina. Em muitos casos, tais efeitos têm sido relatados em resposta a exossomos/pequenas vesículas extracelulares (sEVs) secretadas por MSCs37. Os exossomos/sEVs são conhecidos como vesículas bioativas de tamanho nanométrico que são adquiridas do sistema endomembranar da célula. Eles atuam como transportadores transferindo cargas específicas de proteínas, mRNA, bem como RNAs não codificantes, como microRNAs e RNA não codificante longo (LncRNAs), como uma mensagem em uma garrafa38. Como consequência, eles podem reprogramar as células receptoras e são denotados como "sinalizossomos" manipulando funções celulares essenciais39. Os exossomos/sEVs derivados de MSCs demonstraram sua superioridade às terapias com MSCs por serem uma possível alternativa livre de células. Semelhante às MSCs parentais, descobriu-se que os exossomos / sEVs provocam efeitos terapêuticos e regeneração celular em várias doenças. No entanto, ao contrário de suas células-mãe, eles podem atravessar barreiras biológicas com mais facilidade. Além disso, eles são desprovidos de preocupações críticas de segurança; eles não conferem risco de rejeição imunológica ou formação de tumor a longo prazo40. Além disso, exossomos / sEVs podem ser empregados para aplicações de terapia gênica como um meio de um sistema de entrega de medicamentos, sendo naturalmente equipados para transferir informações genéticas41. Assim, os exossomos / sEVs realmente abriram novos caminhos empolgantes para novas intervenções terapêuticas de várias doenças42 , 43 , 44 .

Neste protocolo, é apresentado um protocolo completo baseado em explante passo a passo para o isolamento e caracterização de WJ-MSCs de tecido UC. Isso será seguido por um protocolo conciso para o isolamento de exossomos/sEVs de meios condicionados desses WJ-MSCs.

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Protocolo

Todos os experimentos e procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas e foram aprovados pelos Comitês de Ética da Faculdade de Farmácia da Universidade Ain Shams, Cairo, Egito (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC # 220) e da Faculdade de Farmácia da Universidade Britânica no Egito, Cairo, Egito (CL-2309). As UCs foram obtidas após a obtenção do consentimento informado assinado pelo(s) pai(s).

1. Isolamento de WJ-MSCs do cordão umbilical humano

  1. Coloque cerca de 30-40 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um recipiente (saco coletor lacrado) para coletar o cordão umbilical (UC) (cerca de 15 cm de comprimento) imediatamente após o parto. Mantenha a UC coletada no gelo e processe-a dentro de no máximo 4-5 h após a coleta.
    NOTA: A amostra não pode ser processada após 4-5 h, pois isso diminuirá muito o rendimento das MSCs. Certifique-se de que o PBS e o recipiente sejam estéreis.
  2. Prepare meios de cultura completos para WJ-MSCs compostos por meio de Eagle modificado com baixo teor de glicose Dulbecco (LG-DMEM) complementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 0,25 μg/mL de anfotericina B.
  3. Coloque 3 mL de meio completo por poço em placas de 6 poços e, em seguida, coloque essas placas de 6 poços com meio em uma incubadora de CO2 ajustada a 37 °C e 5% de CO2 para aquecer e se preparar.
  4. Na cabine de biossegurança, prepare oito placas de cultura de células de 10 cm, cada uma delas preenchida com 10 mL de PBS estéril.
  5. Cuidadosamente, usando uma pinça esterilizada, transfira o UC do saco plástico lacrado para a primeira placa de Petri contendo PBS para lavar o sangue (repita esta etapa até que todo o sangue seja lavado da amostra).
  6. Pulverize etanol 70% em um cotonete estéril e use-o para limpar o UC por 30 s.
  7. Transfira o UC para uma nova placa de Petri cheia de PBS estéril para remover qualquer etanol residual.
  8. Transfira o UC para outra placa de Petri previamente preenchida com PBS estéril e, usando uma tesoura estéril, corte o UC em pedaços menores (cerca de 3 cm cada). Em seguida, mova esses pedaços de 3 cm de comprimento para outra placa de Petri com PBS estéril fresco para evitar que o sangue seja liberado durante o processo de corte.
    NOTA: A partir deste ponto, as peças UC devem ser mantidas no gelo, bem como todas as etapas de processamento subsequentes. Isso é muito importante para evitar a liberação de matéria gelatinosa e garantir o sucesso do procedimento de isolamento de WJ-MSCs do tecido UC. O processamento da UC coletada dentro de 4-5 h no máximo é crucial para o sucesso do processo de isolamento. Anteriormente, o era processado em períodos mais longos após a coleta e, infelizmente, o procedimento não apresentava resultados bem-sucedidos (dados não mostrados).
  9. Comece a processar as peças UC uma a uma (no gelo) em uma placa de Petri cheia de PBS estéril. Use tesouras e fórceps estéreis para cortar os vasos sanguíneos e isolar o tecido gelatinoso de Wharton (WJ). Em seguida, coloque os pedaços WJ transparentes em outra placa de Petri cheia de PBS estéril no gelo.
    NOTA: Durante o isolamento do tecido WJ da peça UC, a primeira incisão é feita no lado transparente da peça UC, longe dos vasos sanguíneos, para evitar cortar o vaso. Depois, os vasos sanguíneos são pinçados, cortados e afastados.
  10. Repita a etapa anterior em todas as peças de UC para obter tecido WJ claro sem vasos sanguíneos.
    NOTA: Troque a placa de Petri PBS, se necessário, durante o processamento das peças de UC e remoção dos vasos sanguíneos, se a solução de PBS ficar sangrenta ou incerta durante o isolamento do tecido WJ.
  11. Lave os pedaços de WJ coletados com PBS, transferindo-os para uma placa de cultura de células fresca de 10 cm cheia de PBS estéril.
  12. Use um bisturi estéril e afiado e uma pinça para cortar os tecidos WJ coletados em pequenos pedaços de 10 mm de comprimento.
  13. Transfira as peças WJ para as placas de 6 poços previamente preparadas na etapa 1.3. Coloque 5-6 pedaços de WJ por poço e, em seguida, incube as placas de 6 poços contendo explantes de tecido WJ em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37 ° C na incubadora de CO2 e deixe sem perturbação por 3 dias.
  14. No4º dia após a colocação dos explantes de tecido WJ, adicione cuidadosamente 1 mL de meio por poço, tomando cuidado para não perturbar os explantes.
    NOTA: Evite tocar ou arranhar a parte inferior da placa onde as peças WJ estão fixadas.
  15. Repita o passo anterior no6º dia após a colocação dos explantes de tecido WJ.
  16. No8º dia após a colocação dos explantes de tecido WJ (ou seja, quase 1 semana após a colocação do explante), comece a trocar metade do meio por poço em dias alternados até o 12ºa 14º dia após a colocação do explante. Substitua metade do meio de cultura de cada poço removendo cerca de 2,5 mL de cada poço e adicionando 2,5 mL de meio quente completo (37 ° C).
    NOTA: Retire a mídia da superfície do poço e evite tocar ou arranhar o fundo da placa onde as peças WJ estão fixadas. As WJ-MSCs geralmente aparecem abaixo e ao redor dos explantes de tecido WJ dentro de 5 a 10 dias após a colocação dos explantes.
  17. Observe as placas de 6 poços rotineiramente sob um microscópio invertido (aumento de 10x) e, se as células liberadas estiverem proliferando e sua confluência estiver aumentando, chegando a 50-60%, prossiga para a próxima etapa; caso contrário, repita a etapa 1.16. outra vez. As peças WJ diminuem significativamente de tamanho ao longo do tempo.
  18. Remova suavemente os explantes WJ presos ao fundo dos poços e remova todos os meios. A remoção de pedaços de explante WJ geralmente é feita no 12ºao 14º dia após a colocação inicial.
    NOTA: Incline ligeiramente as placas em um ângulo de 45° enquanto remove a mídia para garantir que toda a mídia seja removida.
  19. Lave cada poço com 2 mL de PBS, gire suavemente a placa e descarte o PBS. Repita esta etapa de lavagem duas vezes.
    NOTA: Adicione PBS suavemente à parede do poço e evite tocar no fundo dos poços para garantir que não haja perturbação das células.
  20. Adicione 2 mL de meio completo quente por poço suavemente (meio com composição exata como a descrita na etapa 1.2) e incube as placas de 6 poços sob condições umidificadas com 5% de CO2 a 37 ° C.
  21. Troque o meio completamente a cada dois dias (2 mL de meio completo por poço) até que as células atinjam cerca de 80% de confluência.
  22. Quando as células atingirem cerca de 80% de confluência, passe as células usando tripsina-EDTA para frascos de cultura de células T25 (o total de células obtidas de uma placa de 6 poços pode ser passado para um frasco de cultura T25, use 8-9 mL de meio completo por frasco T25). Essas WJ-MSCs são denotadas como células P1.
    NOTA: Não deixe as células por muito tempo com tripsina-EDTA para evitar efeitos tóxicos; Normalmente, 3 min são suficientes para o descolamento das células. Diferentes fornecedores podem fornecer tripsina-EDTA com potência variável. Consequentemente, isso precisa ser considerado ao especificar o tempo de incubação.
  23. Mude a mídia a cada dois dias. Uma vez que as células tenham atingido cerca de 80% de confluência, passar as células usando tripsina-EDTA para frascos de cultura de células T75 (o total de células obtidas de um frasco de cultura T25 pode ser passado para um frasco de cultura T75; use 15-18 mL de meio completo por frasco T75); essas WJ-MSCs são denotadas como células P2.
  24. Mude a mídia a cada dois dias. Uma vez que as células tenham atingido cerca de 80% de confluência, separe-as usando tripsina-EDTA e, em seguida, semeie WJ-MSCs a uma densidade de cerca de 0,75 x 106-1 x 106 células por frasco T75. Essas WJ-MSCs são denotadas como células P3.
    NOTA: Use células entre P3-P5 para experimentos futuros descritos neste protocolo.
  25. Criopreservar as WJ-MSCs isoladas em nitrogênio líquido usando meio de criopreservação composto por 80% de FBS, 10% de meio completo (conforme descrito na etapa 1.2) e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
    NOTA: Uma apresentação esquemática de todas as etapas para o isolamento de WJ-MSCs é fornecida na Figura 1.

2. Caracterização de WJ-MSCs isoladas por imunofenotipagem usando análise de citometria de fluxo para vários marcadores de superfície de CD

  1. Separar as células utilizando tripsina-EDTA na passagem 4. Lave as células com PBS duas vezes e conte seu número usando um hemocitômetro.
    NOTA: O tempo mínimo de incubação (por 3 min) durante a tripsinização é fundamental para separar as células com sucesso sem causar nenhum dano. A incubação prolongada com tripsina-EDTA pode resultar em danos aos marcadores da superfície celular e afetar negativamente os resultados do ensaio de imunofenotipagem.
  2. Incube cerca de 100.000 células (em condições escuras) por 20 min a 4 °C com anticorpos monoclonais humanos marcados com ficoeritrina (PE) ou isotiocianato de fluoresceína (FITC) da seguinte forma: Anti-CD90 PE, Anti-CD73 PE, Anti-CD105 FITC, Anti-CD44 PE, Anti-CD34 PE, Anti-CD14 PE e Anti-HLA-DR FITC, e use células não coradas como controles
  3. Enxágue as células com PBS e ressuspenda-as posteriormente em 500 μL de tampão FACS; analisar usando citometria de fluxo45.

3. Avaliação do potencial de diferenciação de WJ-MSCs isoladas em relação a várias linhagens mesenquimais

  1. Diferenciação adipogênica
    1. Ressuspenda as células em meios de proliferação completos (conforme descrito na etapa 1.2). Em seguida, cultive as células a uma densidade de 3,7 x 104 células/poço (0,5 mL de meio/poço) em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Em seguida, incubar em condições umidificadas de 5% de CO2 a 37 °C. Em seguida, em seguida, a cada dois dias, troque o meio até que as células atinjam quase 100% de confluência; Isso geralmente leva cerca de 3-4 dias.
    2. Remova o meio de proliferação e substitua-o por meios de diferenciação adipogênica para induzir a adipogênese. Complemente o meio LG-DMEM com 100 μg/mL de estreptomicina, 100 U/mL de penicilina, 0,25 μg/mL de anfotericina B e o suplemento adipogênico fornecido no kit de identificação funcional de células-tronco mesenquimais. Em seguida, troque o meio suavemente (0,5 mL/poço) a cada 3 dias e evite a ruptura dos vacúolos lipídicos.
    3. Após cerca de 21 dias, usando exame microscópico, corar os vacúolos lipídicos com Oil Red para avaliar a diferenciação adipogênica.
    4. Prepare uma solução de estoque fresca de Oil Red; dissolva 30 mg de Oil Red em 10 mL de isopropanol e descanse por pelo menos 30 min em temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma solução de trabalho misturando 2 partes de água bidestilada (ddH2O) com 3 partes de solução estoque, misturando-as bem e deixando descansar por 10 min em temperatura ambiente. Em seguida, filtre usando um filtro de 0,22 ou 0,45 μm.
      NOTA: Para obter melhores resultados de coloração, prepare a mancha Oil Red.
    5. Para uma documentação bem-sucedida da diferenciação adipogênica, lave as células duas vezes com PBS e fixe-as com formalina a 10% tamponada neutra (0,75 mL / poço) por 15 min. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS usando 1 mL/poço (antes de descartar o PBS após cada lavagem, incube as células por cerca de 5 min).
      NOTA: As células mantidas em meios de proliferação (descritas na etapa 1.2) são usadas como células de controle não induzidas. Adicione formalina tamponada neutra lentamente nas paredes, não diretamente nas células, para evitar danos celulares. Após a lavagem final com PBS, a aspiração completa de PBS é crucial antes de adicionar a solução de trabalho de coloração Vermelho Óleo para evitar coloração ineficiente.
    6. Após a lavagem final, corar as células (1 mL/poço) com solução de trabalho Oil Red e incubá-las por 60 min a 37 °C. Em seguida, retire e descarte a solução de coloração e enxágue suavemente as células duas vezes com PBS. Em seguida, ao microscópio, observe as gotículas lipídicas coradas.
  2. Diferenciação osteogênica
    1. Ressuspenda as células em meios de proliferação completos (conforme descrito na etapa 1.2). Em seguida, em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços, semeie 7,4 x103 células/poço (adicione 0,5 mL de meio/poço) e incube-as por 3 dias em condições úmidas a 5% de CO2 a 37 °C para atingir quase 70% de confluência.
    2. Com cerca de 70% de confluência, substitua os meios de proliferação por meios de diferenciação-indução incorporando o suplemento osteogênico - fornecido no kit de identificação funcional de células-tronco mesenquimais - em meio LG-DMEM complementado com 10% de FBS, juntamente com 100 U/mL de Penicilina, 100 μg/mL de Estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 0,25 μg/mL de Anfotericina B.
    3. Substitua os meios de diferenciação uma vez a cada 3 dias e continue a indução osteogênica por cerca de 21 dias.
    4. Prepare uma solução de trabalho de coloração Alizarin Red S; traga 9 mL de ddH2O e dissolva 200 mg de corante com vermelho de alizarina S e, em seguida, use hidróxido de amônio e HCl para ajustar o pH para 4,1-4,3. Em seguida, complete o volume para 10 mL com ddH2O. Em seguida, filtre a solução usando um filtro (0,22 ou 0,45 μm) para remover quaisquer precipitados.
    5. No final do período de indução, enxágue as células duas vezes com PBS e, em seguida, fixe-as com formalina a 10% tamponada neutra (0,75 mL / poço) e deixe-as descansar por 15 min. Em seguida, enxágue as células duas vezes com PBS (1 mL / poço) e certifique-se de incubar as células por 5 min a cada enxágue.
      NOTA: As células mantidas em meios de proliferação (descritas na etapa 1.2) são usadas como células de controle não induzidas.
    6. Adicione a solução de trabalho de 2% de Alizarina-Vermelho S preparada na etapa 3.2.4 às células fixas da etapa anterior e incube no escuro por cerca de 45-60 min em temperatura ambiente.
    7. Em seguida, descarte a solução de coloração e lave as células com ddH2O duas vezes e depois com PBS uma vez, depois avalie a diferenciação osteogênica bem-sucedida ao microscópio observando a matriz extracelular rica em cálcio corada.
  3. Diferenciação condrogênica
    1. Ressuspenda as células em meios de proliferação completos (conforme descrito na etapa 1.2). Em seguida, em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços, semeie 7,4 x 103 células/poço (adicione 0,5 mL de meio/poço) e incube-as em condições úmidas a 5% de CO2 a 37 °C por 3 dias para atingir quase 90% de confluência.
    2. Em cerca de 90% de confluência, iniciar a indução da diferenciação condrogênica usando DMEM/F12 sem soro suplementado com insulina-transferrina selênio (ITS) e suplemento condrogênico - fornecido com o kit de identificação funcional de células-tronco mesenquimais - juntamente com 0,25 μg/mL de anfotericina B, 100 U/mL de penicilina, 2 mM de L-glutamina e 100 μg/mL de estreptomicina46.
      NOTA: O meio de indução de diferenciação condrogênica completo é mantido no escuro a 2-8 °C.
    3. Continuar a indução da diferenciação condrogênica por cerca de 21 dias; Enquanto isso, mude a mídia a cada 3 dias.
    4. Prepare a solução de trabalho da coloração Alcian Blue da seguinte forma: Primeiro, prepare ácido acético glacial a 3% em ddH2O (adicione 3 mL de ácido acético glacial e encha até 100 mL com ddH2O). Em seguida, prepare uma solução de trabalho para a coloração Alcian Blue adicionando 20 mg a 20 mL de solução de ácido glacial a 3%, mantendo-a em repouso por cerca de 30 min e, posteriormente, filtrando usando um filtro de 0,22 μm ou 0,45 μm para remover quaisquer precipitados.
    5. No final do período de indução, enxágue as células duas vezes com PBS, fixe-as com formalina tamponada neutra a 10% (0,75 mL / poço) e deixe-as descansar por 15 min. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS (1 mL/poço). Certifique-se de incubar as células por 5 minutos de cada vez.
      NOTA: As células mantidas em meios de proliferação (conforme descrito na etapa 1.2) são usadas como células de controle não induzidas.
    6. Incubar as células fixas na solução de trabalho preparada com azul de Alcian a 0,1% durante cerca de 60 min a 37 °C. Enxágue as células com ddH2O duas vezes e com PBS uma vez para remover a mancha residual. Em seguida, por meio de exame microscópico, observar os proteoglicanos sulfatados corados.

4. Isolamento de exossomos/sEVs de meios condicionados a WJ-MSCs

  1. Ressuspenda as WJ-MSCs em meios de proliferação completa (conforme descrito na etapa 1.2) e semeie placas de cultura de tecidos de 6 poços com essas WJ-MSCs a uma densidade de 150.000 células/poço (2 mL de meio/poço) e incube-as a 37 °C em condições úmidas a 5% de CO2.
  2. Prepare meios de coleta de exossomos sem soro (SF) da seguinte forma: Meio de Eagle Modificado de Dulbecco com baixa glicose (LG-DMEM) suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina e 0,25 μg / mL de anfotericina B.
    NOTA: O meio de coleta de exossomos tem a mesma composição que o meio de proliferação completa (descrito na etapa 1.2), mas sem FBS.
  3. Siga as placas de 6 poços (preparadas na etapa 4.1) e substitua o meio em dias alternados usando o meio de proliferação (conforme descrito na etapa 1.2). Observe as células ao microscópio até atingirem cerca de 75-80% de confluência.
  4. Quando 70% de confluência for atingida, lave as células duas vezes com PBS (1 mL / poço), adicione meios de coleta de exossomos sem soro (SF) (1,5 mL / poço) (descrito na etapa 4.2) e incube por 48 h a 37 ° C em condições úmidas a 5% de CO2.
  5. Após 48 h, colete os meios condicionados WJ-MSCs das placas de cultura de tecidos de 6 poços colocadas na etapa anterior em tubos de coleta por centrifugação de 15 mL. Em seguida, execute as seguintes etapas sequenciais de centrifugação e filtração para limpar o meio condicionado coletado47.
    NOTA: Usando corante de exclusão de azul de tripano seguido de contagem de células usando o hemocitômetro, avalie a porcentagem de viabilidade das células inicialmente usadas para derivar o meio condicionado coletado; as células viáveis devem ser idealmente superiores a 90%. Em seguida, conservar o sedimento de células recolhidas a -80 °C, caso seja necessário para futuras investigações.
    1. Centrifugue o meio condicionado coletado a 300 x g por 10 min a 4 ° C para se livrar de quaisquer células suspensas. Em seguida, colete o sobrenadante e execute a próxima etapa de centrifugação para este sobrenadante coletado (meio condicionado).
    2. Centrifugar os meios condicionados obtidos na etapa 4.5.1 a 3000 x g por 15 min a 4 °C para eliminar as células necróticas e os detritos celulares.
      NOTA: As etapas de centrifugação são feitas preferencialmente a 4 °C, mas também podem ser feitas à temperatura ambiente com resultados semelhantes.
    3. Filtre o sobrenadante obtido na etapa anterior, passando-o por um filtro de 0,22 μm para um novo tubo de polipropileno de 50 mL de coleta para se livrar de quaisquer detritos celulares residuais e EVs grandes.
      NOTA: O meio condicionado filtrado pode ser usado imediatamente para etapas subsequentes para isolar exossomos/sEVs, armazenado na geladeira a 4 °C e usado por não mais de 3 dias, ou armazenado a -80 °C para armazenamento de longo prazo até que seja necessário isolar exossomos/sEVs. É preferível que os meios condicionados limpos armazenados a -80 °C sejam processados dentro de um período máximo de 1-3 meses; quanto mais cedo melhor.
  6. Coloque 7,5 mL de meio condicionado limpo (obtido na etapa 4.5) em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione 1,5 mL de reagente. Adicione o reagente ao meio na proporção de 1:5 (ou seja, 1 mL de reagente precipitante Exoquick-TC para cada 5 mL de meio). Em seguida, inverta o tubo para cima e para baixo e agite-o várias vezes para garantir a mistura adequada do reagente precipitante com o meio.
    NOTA: O reagente precipitante é um reagente pesado e viscoso. Assim, o volume necessário deve ser retirado lenta e cuidadosamente para garantir que o volume pretendido seja transferido completamente.
  7. Conservar o tubo com o meio com o reagente precipitante a 4 °C na posição vertical durante a noite durante cerca de 16 h (pelo menos 12 h).
  8. No dia seguinte, centrifugue a mistura meio/reagente precipitante a 1500 x g durante 30 min a 4 °C. Após a centrifugação, o pellet de exossomos/sEVs aparece como um pellet branco ou bege muito pequeno que se depositou no fundo do tubo.
    NOTA: Esta etapa de centrifugação também pode ser feita à temperatura ambiente com resultados semelhantes. Caso o pellet de exossomo/sEVs não seja visível no final desta etapa de centrifugação, pode-se adicionar tempo de centrifugação adicional a 3000 x g por mais 20-30 min a 4 °C. Às vezes, o pellet de exossomos/EVs permanece invisível mesmo após o tempo de centrifugação prolongado, o que significa que há uma pequena quantidade de exossomos/sEVs. Nesse caso, prossiga com o protocolo deixando os 5-10 μL inferiores do tubo.
  9. Aspirar o sobrenadante e centrifugar a mistura de meios residuais/reagentes precipitantes a 1500 x g durante 5 min a 4 °C. Em seguida, com muito cuidado, aspire os vestígios restantes de fluido sem perturbar o pellet de exossomos / sEVs precipitados.
  10. Suspenda o pellet de exossomos/sEVs em 100-300 μL de PBS estéril de acordo com o tamanho e a visibilidade do pellet. Posteriormente, esses exossomos / sEVs podem ser imediatamente utilizados ou armazenados em um ultrafreezer a -80 ° C para experimentos subsequentes.
    NOTA: No caso de começar com mais de um tubo de centrífuga para o mesmo meio (descrito na etapa 4.9), e os pellets de exossomos/sEVs (obtidos na etapa 4.10) são invisíveis, os pellets de exossomos/sEVs coletados de todos eles podem ser agrupados usando cerca de 100-300 μL de PBS estéril para suspender todos eles agrupados.
  11. Quantifique os exossomos/sEVs coletados em relação ao seu conteúdo de proteína usando um kit de quantificação de proteína de ácido bicinchonínico (BCA) disponível comercialmente, conforme declarado pelo fabricante.
    NOTA: Uma apresentação esquemática de todas as etapas de isolamento de exossomos / sEVs derivados de WJ-MSCs é fornecida na Figura 2.

5. Imagem de exossomos/sEVs isolados usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

  1. Suspenda exossomos/sEVs recém-isolados em 100-300 μL de PBS estéril de acordo com o tamanho e a visibilidade do pellet (conforme descrito anteriormente na etapa 4.11).
    NOTA: É muito preferível usar exossomos / sEVs recém-isolados em vez de congelados para imagens TEM
  2. Pipetar 20 μL de suspensão de exossomos/sEVs em uma grade revestida de carbono e deixar secar por 10 min.
  3. Fixe os exossomos/sEVs colocados usando solução de glutaraldeído (2% em água destilada) por cerca de 15 min.
  4. Em seguida, core os exossomos / sEVs fixos com acetato de uranila a 2% e deixe por cerca de 3 minutos no escuro, depois examine-os em um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) (ampliação de 20000) usando as configurações padrão do MET.

6. Determinação da dimensão média dos exossomas/sEV isolados utilizando um analisador granulométrico

  1. Diluir exossomos/sEVs recém-isolados com PBS estéril pH 7,4 na proporção de 1:250.
  2. Medir a distribuição granulométrica média dos exossomas/sEV isolados utilizando um analisador granulométrico a 25 °C.

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Resultados

Isolamento e caracterização de WJ-MSCs

Conforme demonstrado na Figura 3, pequenas células semelhantes a fibroblastos apareceram inicialmente abaixo e ao redor dos tecidos do explante WJ dentro de 5 a 10 dias após a semeadura desses explantes (Figura 3A). Essas WJ-MSCs liberadas continuam a proliferar e geralmente atinge...

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Discussão

Neste protocolo, pudemos apresentar etapas detalhadas para isolar WJ-MSCs de tecido UC humano e também para isolar seus exossomos / sEVs derivados. A UC é uma fonte não invasiva inexplorada facilmente alcançável para obter MSCs, e nenhum equipamento especial para coleta ou processamento é necessário 11,15,30,32,48. Vários pro...

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Divulgações

Todos os coautores declaram não haver conflito de interesses associado a este trabalho.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente financiado pela Universidade Ain Shams - Bolsa de Apoio à Pesquisa do Plano Estratégico (2024/2025), Egito, e pelo Centro de Pesquisa em Nanotecnologia (NTRC) - Prêmio de Acesso (2019/2020), Universidade Britânica no Egito (BUE), Cairo, Egito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, EUAA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, EUAA5533
Hidróxido de amônioFisher Scientific, Alemanha1336-21-6
Anticorpo para CD-105 humano, FITCR& D systems Inc., MN, EUAFAB10971F
Anticorpo para CD-14 e PE humanoBeckman Coulter, EUAIM0650U
Anticorpo para CD-34 humano, PEBeckman Coulter, EUAIM1420
Anticorpo para CD-44 e PE humanoBeckman Coulter, EUAA32537
Anticorpo para CD-73 e PE humanoR& D systems Inc., MN, EUAFAB5795P
Anticorpo para CD-90 humano e PER& D systems Inc., MN, EUAFAB2067P
Anticorpo para HLA-DR humano, FITCBeckman Coulter, EUAIM1638U
Kit de quantificação de proteínas do ácido bicinconínico (BCA)Thermofisher23227
Gabinete de biossegurança, Fluxo laminar, MSC AdvantageThermo Scientific, EUA
Incubadora CO2 Incubadora, Forma DiretaThermo Scientific, EUA
Centrífuga de ResfriamentoSigma, Alemanha
Centrífuga de ResfriamentoEppendorf, Alemanha
CytoFLEX Flow CytoMetrô  Beckman Coulter, FL, EUA
Dimetil sulfóxido (DMSO)Fisher Scientific, AlemanhaBP231-100
DMEM - Glicose baixa 1 g/LLonza, Suíça12-707F
DMEM/F12 Lonza, Suíça12-719F
Água livre de DNAse/RNAseGibco Thermo Fisher, EUA10977-035
Etanol absoluto, grau em biologia molecularSigma-Aldrich, Alemanha24103
ExoQuick-TCBiociências do Sistema (SBI), EUAEXOTC50A-1Agente precipitante
Soro Bovino Fetal (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brasil10270-106
Formaldeído 37%Fisher ScientificBP531-500
Ácido acético glacialSigma Aldrich, AlemanhaA38S-500
Solução de glutaraldeído & nbsp;SigmaG7776
Ácido clorídrico (HCl)Fisher Scientific, AlemanhaA144-212
Microscópio invertidoOlympus, Japão
L-GlutaminaGibco Thermo Fisher, EUA25030-024
Kit de identificação funcional de células-tronco mesenquimais  R& D systems Inc., MN, EUASC006
Leitor de microplacasCromate, Awareness Technologies, EUA
Mancha Vermelha de ÓleoSigma-Aldrich, EUAO0625
Penicilina-Estreptomicina-AnfotericinaGibco Thermo Fisher, EUA15240062
Salo tamponado com fosfato, 1x, sem Ca/MgLonza, SuíçaBE17-516F
Banho-maria agitadoDaihan Wisebath, Coreia
Filtro de seringa, 0,2 micrômetrosCorning, EUA431224
Microscópio eletrônico de transmissãoJEM-1200EX II, Jeol, Alemanha
Azul de tripan & nbsp;Gibco Thermo Fisher, EUA15250061
Tripsina-Versene-EDTA, 1xLonza, SuíçaCC-5012
Solução de acetato de uranila (2%)Ciências da Microscopia Eletrônica, EUA22400-2
Espectrofotômetro UV-VisívelShimadzu, Japão
VórticeSciLogex
Zeta-sizer Nano ZNMalvern Panalytical Ltd, Reino Unido & nbsp;Analisador de tamanho de partículas

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