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Artigo de método

Avaliação dinâmica da função plaquetária multiparamétrica usando um biossensor capacitivo

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DOI:

10.3791/66783

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2 de maio de 2025

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1Department of Mechanical Engineering, University of Washington

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Um protocolo para um novo ensaio funcional de plaquetas multiparâmetro dinâmico usando um biossensor capacitivo é apresentado aqui. Essa abordagem, projetada em um microambiente semirrígido para aumentar a relevância fisiológica, fornece três parâmetros de saída sensíveis à contagem de plaquetas, forças de estimulação e vias de ativação.

Resumo

As plaquetas desempenham um papel fundamental na coagulação do sangue por meio de uma série de respostas reguladas, incluindo adesão, disseminação, secreção granular, agregação e contração do citoesqueleto. No entanto, os ensaios atuais são limitados à análise parcial da função plaquetária em condições não fisiológicas. Assim, é necessário um ensaio aprimorado que reflita a natureza dinâmica e multifacetada da função plaquetária em ambientes fisiológicos. Nesse contexto, uma nova abordagem é introduzida para medir vários parâmetros-chave relacionados à função plaquetária em um microambiente semirrígido ex vivo mais fisiologicamente relevante em comparação com os ensaios tradicionais. Este método utiliza um biossensor elétrico avançado, o sensor de capacitância de membrana (MCS), que fornece informações exclusivas sobre o processo de coagulação por meio de três leituras distintas. Essas leituras são altamente sensíveis a variações na contagem de plaquetas, intensidade de estimulação e vias de ativação específicas. Como uma plataforma de detecção puramente elétrica, o MCS demonstra um potencial significativo como ferramenta de diagnóstico para detectar distúrbios primários da função hemostática, avaliar a eficácia de tratamentos terapêuticos e avançar na compreensão mais ampla dos papéis das plaquetas na hemostasia e trombose.

Introdução

As plaquetas, células sanguíneas especializadas, são fundamentais para orquestrar a resposta hemostática para interromper o sangramento após a lesão e facilitar a cicatrização dos vasos sanguíneos. Além disso, eles também servem como mediadores cruciais na trombose, uma das principais causas de mortes relacionadas à doença tromboembólica em todo o mundo 2,3,4,5,6. Quando ocorre uma lesão vascular, as plaquetas passam por uma série de processos funcionais complexos, regulados e em vários estágios. Estes incluem adesão à matriz intimal, um influxo de cálcio intracelular desencadeando alterações conformacionais plaquetárias, ativação, secreção de grânulos, agregação e contração do citoesqueleto, formando e estabilizando tampões hemostáticos para selar os locais danificados e prevenir sangramento 7,8. Apesar dos avanços significativos nas drogas antiplaquetárias e estratégias terapêuticas 9,10,11, o risco de trombose persiste. O manejo da terapia antiplaquetária apresenta desafios, incluindo o risco de sangramento iatrogênico, dificuldade em alcançar eficácia antitrombótica mantendo a hemostasia e variabilidade na capacidade de resposta do paciente, incluindo resistência aos medicamentos12,13.

Embora os mecanismos moleculares que governam as fases de resposta plaquetária estejam bem documentados, os métodos atuais para testar a função plaquetária permanecem abaixo do ideal. Os testes laboratoriais tradicionais geralmente ficam aquém, pois avaliam apenas aspectos limitados da atividade plaquetária em estágio inicial a intermediário, como adesão, agregação ou viscosidade do coágulo 7,14,15,16,17,18. Essa análise parcial pode levar a informações insuficientes. Além disso, esses testes não oferecem avaliação simultânea, contínua e rápida de vários elementos funcionais plaquetários cruciais em um único ensaio. Consequentemente, essa limitação dificulta os avanços na hematologia clínica e experimental. Ao longo do tempo, uma infinidade de sensores impedimétricos ou capacitivos foram desenvolvidos para várias aplicações biomédicas 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28.

Aqui, apresentamos o protocolo para uma avaliação da função plaquetária multiplexada usando um biossensor capacitivo. A abordagem proposta oferece um recurso atraente ao monitorar sensivelmente as mudanças dinâmicas em um amplo espectro de funções plaquetárias no nível celular. A abordagem apresentada utiliza um biossensor composto por dois microchips: um chip de silicone superior, que é descartável, apresentando um poço de amostra para plasma rico em plaquetas citrato e um eletrodo sensor revestido com fibronectina humana para facilitar a adesão plaquetária, juntamente com um chip de silício inferior reutilizável que abriga um eletrodo de referência. A medição contínua das mudanças dinâmicas de capacitância durante todo o processo de coagulação, abrangendo adesão, ativação e pós-ativação plaquetária, permite análises sensíveis ligadas a variações na contagem de plaquetas, níveis de ativação plaquetária e inibição das vias de ativação. A viabilidade clínica e a utilidade desse método foram demonstradas usando amostras de plasma humano pertinentes, ressaltando seu potencial para uma avaliação robusta da função plaquetária em ambientes clínicos.

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Protocolo

A proposta do estudo foi aprovada pela Divisão de Seres Humanos (HSD) do Conselho de Revisão Interna da Universidade de Washington (UW-IRB; ID do estudo: STUDY00005211). Todos os voluntários que participaram do estudo assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Etapas de fabricação do sensor capacitivo de membrana (MCS)

NOTA: O sensor MCS foi fabricado utilizando técnicas tradicionais de microfabricação. Este biossensor era composto por um chip de capacitância de membrana superior (T-) e inferior (B-) (MCC). Resumidamente, as etapas de fabricação são mostradas na Figura 1.

  1. Etapas de microfabricação para T-MCC (Figura 1A)
    1. Projete o layout do T-MCC usando o software de layout CAD padrão para um substrato de wafer de silício de 4 polegadas.
    2. Transfira o desenho para uma fotomáscara de vidro de cromo usando o processo de fabricação de máscara padrão29,30.
    3. Em um substrato de silício polido de dupla face limpo (400 μm de espessura), deposite 500 nm de espessura de Si3N4 usando a técnica padrão de deposição de vapor químico de baixa pressão (LPCVD)31. Revestimento de rotação de 12 μm de fotorresistente AZ 9260 a 2000 rpm por 25 s usando um revestidor de rotação manual.
    4. Usando a técnica padrão de fotolitografia UV32, padronize o fotorresistente, que envolve expor o fotorresistente com a fotomáscara de vidro cromado em um alinhador UV e desenvolver a resistência em uma solução reveladora para remover a região exposta aos raios UV da resistência.
    5. Padronize a camada subjacente de nitreto de silício de 500 nm de espessura usando um processo de gravação de íons reativos, que expõe o substrato de silício.
    6. Remova o substrato de silício exposto de 400 μm de espessura usando um processo padrão da Bosch: processo Deep Reactive Ion Si Etch33.
    7. Calcule o número desejado de ciclos de gravação para remover 400 μm de silício.
      NOTA: Isso varia de acordo com a ferramenta utilizada para o processo, pois influenciará a taxa de gravação (neste caso, foi de 1,8 μm/ciclo).
    8. Para evitar a corrosão acidental da camada Si3N4 , pare a corrosão seca pelo menos 10 μm antes (ou seja, a 390 μm). Remova o silício restante usando o KOH altamente seletivo tradicional a 80 ° C por 5 min.
    9. Depositar 20 nm de Cr e 150 nm de camadas metálicas de Au consecutivamente usando um processo de evaporação de feixe E34 e uma máscara de sombra para fabricar o eletrodo sensor no T-MCC.
    10. Nesta fase, os T-MCCs no wafer serão conectados por minúsculos suportes de silício. Separe os T-MCCs perfurando cuidadosamente os suportes minúsculos.
  2. Etapas de microfabricação para B-MCC (Figura 1B)
    1. Em um substrato de silício limpo termicamente oxidado (400 μm de espessura), deposite camadas de metal Cr/Au (20 nm, 150 nm) usando uma máscara de sombra, semelhante à etapa 1.1.9.
    2. Use fotolitografia padrão32 com alinhamento traseiro, seguido por uma etapa de gravação úmida KOH para liberar os B-MCCs.
      NOTA: O T- e o B-MCC têm almofadas de contato de 2.5 x 1.5 cm.

2. Biofuncionalização do sensor capacitivo

NOTA: Resumidamente, esta etapa é sobre o revestimento do eletrodo T-MCC com fibronectina humana (Fn) para facilitar a fixação de plaquetas no sensor.

  1. Antes dos revestimentos biomoleculares, limpe o eletrodo sensor com plasma de oxigênio por 45 s a 100 W.
  2. Adicione 1-Dodecanetiol (1 mM) em etanol à prova de 200 ao poço da amostra em T-MCCs.
  3. Coloque os T-MCCs em um recipiente cheio de nitrogênio seco, selado e envolto em parafilme por 24-48 h.
  4. Enxágue a superfície dourada com água deionizada e etanol à prova de 200, seguido de secagem com nitrogênio em temperatura ambiente. Nesta fase, armazene os sensores a 2-8 °C em uma atmosfera seca de nitrogênio até as próximas etapas.
  5. Adicionar solução salina tamponada com fosfato (PBS, 50 μg/ml) ao poço 12 h antes da medição e incubar a 37 °C durante 2-8 h.

3. Configuração do sensor de capacitância

NOTA: A Figura 2 representa a fotografia da configuração experimental.

  1. Use um medidor LCR com microposicionadores e sondas de agulha para fazer contato elétrico com o sensor.
  2. Empregue acessórios de plástico impressos em 3D (consulte a Tabela de Materiais) para colocar com segurança o T- e o B-MCC. O acessório inferior é equipado com rolhas no eixo xy para garantir o alinhamento preciso do T-MCC sobre o B-MCC para formar um capacitor.
    NOTA: Todas as impressoras 3D utilizadas eram da Universidade de Washington.
  3. Aplique um sinal senoidal (0.5 V) a 100 kHz e uma taxa de amostragem de 8 Hz.

4. Preparação de plasma rico em plaquetas citrato (c-PRP)

NOTA: Todas as amostras de sangue foram de voluntários que participaram desta pesquisa. Nenhum dos participantes tinha uma anormalidade plaquetária ou distúrbio de coagulação previamente conhecido, e eles não haviam tomado nenhum medicamento plaquetário, incluindo anti-inflamatórios não esteróides (AINEs), nas duas semanas que antecederam a coleta da amostra. Um flebotomista licenciado realizou uma coleta de sangue usando uma agulha de 21 G para tubos padrão de citrato a 3,2%. O primeiro 1 mL foi descartado para evitar contaminação do fator tecidual. As amostras foram transportadas em um recipiente de poliestireno e todas as medidas foram realizadas dentro de 6 h após a coleta de sangue.

  1. Centrifugue a amostra de sangue total a 200 x g por 10 min a 20 ° C para obter c-PRP.
  2. Transfira o c-PRP para um recipiente estéril e conduza a contagem de plaquetas. Para estudos de inibidores, incube o c-PRP com uma concentração predefinida do medicamento no tampão de Tyrode (consulte a seção Resultados para obter detalhes).

5. Ensaio funcional de plaquetas

NOTA: O esquema para o ensaio funcional de plaquetas apresentado é mostrado na Figura 3.

  1. Monte o T- e o B-MCC nos acessórios impressos em 3D.
  2. Meça a medição da capacitância da linha de base por 5 min e, em seguida, adicione 45 μL de c-PRP ao poço da amostra no T-MCC.
  3. Aguarde 30 minutos para que as plaquetas adiram ao eletrodo revestido com Fn no T-MCC.
  4. Remova 30 μL do c-PRP com cuidado, sem tocar nas plaquetas presas à membrana, e reabasteça imediatamente com o tampão de Tyrode. Repita a lavagem pelo menos 5 vezes com um intervalo de 20 s para garantir que nenhuma plaqueta ou macroagregado adicional caia no eletrodo sensor após a ativação.
  5. Adicione 10 μL da solução agonista (trombina ou ADP) na concentração desejada. Aguarde 80 minutos de tempo de equilíbrio.

6. Dados e análise estatística para os marcadores de sinal

NOTA: A capacitância é medida continuamente a partir das etapas 5.2-5.5.

  1. Para o sinal de capacitância durante a fase de adesão (etapa 5.3), meça a mudança máxima na capacitância após o tempo de equilíbrio de 30 min, que é chamado de ΔCadh.
  2. Da mesma forma, para a fase de ativação (etapa 5.5), meça a mudança máxima na capacitância, que é chamada de ato Δ C, e a inclinação da curva entre 200-300 s após a ativação, que é chamada de ato S.
  3. Use a análise de variância (ANOVA) com o post-hoc de Tukey para comparar os resultados entre os grupos. Use a qualidade de ajuste de Shapiro-Wilk para análise de distribuição normal.

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Resultados

Este estudo tem como objetivo realizar uma avaliação dinâmica da função plaquetária. Seguindo o protocolo descrito acima, a solução de c-PRP foi preparada e as plaquetas foram semeadas no eletrodo revestido com Fn em T-MCC. As plaquetas flutuantes foram lavadas pela etapa de lavagem e um agonista foi adicionado para ativar as plaquetas aderidas. Resultados detalhados e discussão podem ser encontrados em nosso relatório anterior28.

A Figura 4A

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Discussão

Este estudo foi pioneiro em um novo método baseado em capacitância para avaliar a função plaquetária, que avalia a adesão e a dinâmica plaquetária pós-ativação em um único dispositivo, marcando o primeiro exemplo relatado de tal abordagem. O novo protocolo experimental introduz uma técnica relativamente simples para neutralizar os impactos da formação de fibrina e dos fatores de coagulação plasmática por meio de um procedimento de wash-out. Isso resulta em medições capazes de discernir v...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Os autores expressam sua gratidão ao Dr. Moritz Stolla e ao Dr. Jason Acker por suas valiosas discussões e assistência técnica. Eles também reconhecem o Biology Imaging Facility da Universidade de Washington por sua infraestrutura e suporte. Este trabalho recebeu financiamento parcial do Fundo de Inovação CoMotion da Universidade de Washington (Grant No. 682548, D.Y.G.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-DodecanethiolSigma-Aldrich, MO, EUA471364-100ML1 mM
200-proof etanolSigma-Aldrich, MO, EUAEX0276-1
impressora 3DShenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.Ender-3 V3
Material de impressão 3DHATCHBOX 3D, CA, U.S.A3D PLA-1KG-1.75
Adenosina 5′-difosfatoSigma Aldrich, U.S.A01905-250MG-F
ADP Aspirina Sigma-Aldrich, MO, EUAA2093-100G
Gravação de íons reativos profundosOmega Engineering, Inc.SPTS Rapier DRIE
Dimetil SulfóxidoSigma-Aldrich, MO, EUAD8418-50MLDMSO
Sistemas de Deposição de Alto VácuoCHA SEC-600
Fibronectina HumanaSigma-Aldrich, MO, EUACLS356008-1EAFn
KOHSigma-Aldrich, MO, EUAP1767-250G
Medidor LCR Keithley Instruments, Inc., OH, EUAKeithley EL 4980AL
Suportes de medidores LCRSignatone Corporation, CA, EUASCA-50-4
Sistema de alinhador de máscaraABM, EUA, Inc.Micro-posicionadores ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
Signatone, CA, EUAS-725
Signatone Corporation, CA,EUA SCAT5T-412.5 μ m raio
tampolado com fosfato solução salinaSigma-Aldrich, MO, EUAP4474-1LPBS, pH 7,4
Gravura a Ácido de Íons ReativosPlasma-Therm, EUARIE Vision 320
substrato de silícioWafer World IncSKU # 1766
Tubos padrão de citrato de 3,2%Tiger Medical, NJ, EUACovidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
ThrombinEnzyme Research Laboratories, EUAHT 1002a
TicagrelorSigma-Aldrich, MO, EUAPHR2788-400MG
Tyrode' s bufferBoston Bioproducts, EUABSS-375
UV fotorresistenteAZ materiais eletrônicos, NC, EUAAZ 926015um
Sonda de agulha

Referências

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