Avaliação dinâmica da função plaquetária multiparamétrica usando um biossensor capacitivo

Summary

Um protocolo para um novo ensaio funcional de plaquetas multiparâmetro dinâmico usando um biossensor capacitivo é apresentado aqui. Essa abordagem, projetada em um microambiente semirrígido para aumentar a relevância fisiológica, fornece três parâmetros de saída sensíveis à contagem de plaquetas, forças de estimulação e vias de ativação.

Abstract

As plaquetas desempenham um papel fundamental na coagulação do sangue por meio de uma série de respostas reguladas, incluindo adesão, disseminação, secreção granular, agregação e contração do citoesqueleto. No entanto, os ensaios atuais são limitados à análise parcial da função plaquetária em condições não fisiológicas. Assim, é necessário um ensaio aprimorado que reflita a natureza dinâmica e multifacetada da função plaquetária em ambientes fisiológicos. Nesse contexto, uma nova abordagem é introduzida para medir vários parâmetros-chave relacionados à função plaquetária em um microambiente semirrígido ex vivo mais fisiologicamente relevante em comparação com os ensaios tradicionais. Este método utiliza um biossensor elétrico avançado, o sensor de capacitância de membrana (MCS), que fornece informações exclusivas sobre o processo de coagulação por meio de três leituras distintas. Essas leituras são altamente sensíveis a variações na contagem de plaquetas, intensidade de estimulação e vias de ativação específicas. Como uma plataforma de detecção puramente elétrica, o MCS demonstra um potencial significativo como ferramenta de diagnóstico para detectar distúrbios primários da função hemostática, avaliar a eficácia de tratamentos terapêuticos e avançar na compreensão mais ampla dos papéis das plaquetas na hemostasia e trombose.

Introduction

As plaquetas, células sanguíneas especializadas, são fundamentais para orquestrar a resposta hemostática para interromper o sangramento após a lesão e facilitar a cicatrização dos vasos sanguíneos^. Além disso, eles também servem como mediadores cruciais na trombose, uma das principais causas de mortes relacionadas à doença tromboembólica em todo o mundo 2,3,4,5,6. Quando ocorre uma lesão vascular, as plaquetas passam por uma série de processos funcio....

Protocol

A proposta do estudo foi aprovada pela Divisão de Seres Humanos (HSD) do Conselho de Revisão Interna da Universidade de Washington (UW-IRB; ID do estudo: STUDY00005211). Todos os voluntários que participaram do estudo assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Etapas de fabricação do sensor capacitivo de membrana (MCS)

NOTA: O sensor MCS foi fabricado utilizando técnicas tradicionais de microfabricação. Este biossensor era composto po....

Results

Este estudo tem como objetivo realizar uma avaliação dinâmica da função plaquetária. Seguindo o protocolo descrito acima, a solução de c-PRP foi preparada e as plaquetas foram semeadas no eletrodo revestido com Fn em T-MCC. As plaquetas flutuantes foram lavadas pela etapa de lavagem e um agonista foi adicionado para ativar as plaquetas aderidas. Resultados detalhados e discussão podem ser encontrados em nosso relatório anterior²⁸.

A Figura 4A

Discussion

Este estudo foi pioneiro em um novo método baseado em capacitância para avaliar a função plaquetária, que avalia a adesão e a dinâmica plaquetária pós-ativação em um único dispositivo, marcando o primeiro exemplo relatado de tal abordagem. O novo protocolo experimental introduz uma técnica relativamente simples para neutralizar os impactos da formação de fibrina e dos fatores de coagulação plasmática por meio de um procedimento de wash-out. Isso resulta em medições capazes de discernir v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Dodecanethiol	Sigma-Aldrich, MO, EUA	471364-100ML	1 mM
200-proof etanol	Sigma-Aldrich, MO, EUA	EX0276-1
impressora 3D	Shenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.	Ender-3 V3
Material de impressão 3D	HATCHBOX 3D, CA, U.S.A	3D PLA-1KG-1.75
Adenosina 5′-difosfato	Sigma Aldrich, U.S.A	01905-250MG-F
ADP Aspirina	Sigma-Aldrich, MO, EUA	A2093-100G
Gravação de íons reativos profundos	Omega Engineering, Inc.	SPTS Rapier DRIE
Dimetil Sulfóxido	Sigma-Aldrich, MO, EUA	D8418-50ML	DMSO
Sistemas de Deposição de Alto Vácuo	CHA	SEC-600
Fibronectina Humana	Sigma-Aldrich, MO, EUA	CLS356008-1EA	Fn
KOH	Sigma-Aldrich, MO, EUA	P1767-250G
Medidor LCR	Keithley Instruments, Inc., OH, EUA	Keithley EL 4980AL
Suportes de medidores LCR	Signatone Corporation, CA, EUA	SCA-50-4
Sistema de alinhador de máscara	ABM, EUA, Inc.	Micro-posicionadores ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
	Signatone, CA, EUA	S-725
	Signatone Corporation, CA,	EUA SCAT5T-4	12.5 μ m raio
tampolado com fosfato solução salina	Sigma-Aldrich, MO, EUA	P4474-1L	PBS, pH 7,4
Gravura a Ácido de Íons Reativos	Plasma-Therm, EUA	RIE Vision 320
substrato de silício	Wafer World Inc	SKU # 1766
Tubos padrão de citrato de 3,2%	Tiger Medical, NJ, EUA	Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
Thrombin	Enzyme Research Laboratories, EUA	HT 1002a
Ticagrelor	Sigma-Aldrich, MO, EUA	PHR2788-400MG
Tyrode' s buffer	Boston Bioproducts, EUA	BSS-375
UV fotorresistente	AZ materiais eletrônicos, NC, EUA	AZ 9260	15um