Uma abordagem visual para induzir dolicoectasia em camundongos para modelar disfunção cerebrovascular mediada por grandes vasos

Resumo

Demonstramos a indução química da dilatação de grandes vasos sanguíneos em camundongos como um modelo para investigar a disfunção cerebrovascular, que pode ser usada para modelagem de demência vascular e doença de Alzheimer. Também demonstramos a visualização da vasculatura injetando composto de borracha de silicone e fornecendo orientação visual clara para medir as mudanças no tamanho dos vasos sanguíneos.

Resumo

O sangue-cérebro (BBB) é um sistema crucial que regula a circulação cerebral seletiva com a periferia, por exemplo, permitindo que os nutrientes necessários entrem e expulsem aminoácidos ou toxinas em excesso do cérebro. Para modelar como a BHE pode ser comprometida em doenças como demência vascular (DV) ou doença de Alzheimer (DA), os pesquisadores desenvolveram novos métodos para modelar a dilatação dos vasos. Uma BHE comprometida nesses estados de doença pode ser prejudicial e resultar na desregulação da BHE, levando a consequências adversas e patológicas que afetam a função cerebral. Conseguimos modificar uma técnica existente que nos permitiu injetar diretamente na Cisterna magna (CM) para induzir a dilatação dos vasos sanguíneos usando elastase e interromper as junções apertadas (TJ) da BHE. Com esse método, pudemos ver várias métricas de sucesso em relação às técnicas anteriores, incluindo dilatação consistente dos vasos sanguíneos, redução da mortalidade ou recuperação aprimorada e melhoria do agente de enchimento/opacificação, um composto de borracha de silicone, entrega para rotulagem de vasos sanguíneos para análise de dilatação. Este método minimamente invasivo modificado teve resultados promissores, com um aumento de 19% a 32% na dilatação sustentada de grandes vasos sanguíneos em camundongos de 2 semanas a 3 meses após a injeção. Essa melhora contrasta com estudos anteriores, que mostraram aumento da dilatação apenas na marca de 2 semanas. Dados adicionais sugerem expansão sustentada mesmo após 9,5 meses. Esse aumento foi confirmado comparando o diâmetro dos vasos sanguíneos da elastase e do grupo injetado no veículo. No geral, essa técnica é valiosa para estudar distúrbios patológicos que afetam o sistema nervoso central (SNC) usando modelos animais.

Introdução

As células endoteliais microvasculares que revestem os capilares cerebrais são os principais componentes para a formação da barreira hematoencefálica (BHE)¹, que desempenha um papel crucial na regulação do que entra ou sai da circulação cerebral com a periferia. Os nutrientes essenciais necessários para o tecido nervoso podem entrar na BHE, enquanto alguns aminoácidos essenciais, como o glutamato, são expelidos do cérebro, pois altas concentrações podem causar danos neuroexcitatórios permanentes^{ao tecido cerebral}. Em condições fisiológicas normais, a BHE limita a entrada no cérebro de proteínas plasmáticas como albumina ^3,4 e protrombina, uma vez que podem ter efeitos prejudiciais ^5,6,7. Finalmente, o BBB protege o cérebro de neurotoxinas que circulam na periferia, como xenobióticos de alimentos ou do meio ambiente¹. No geral, os danos aos tecidos cerebrais são irreversíveis, e o envelhecimento que se correlaciona com baixos níveis de neurogênese⁸ destaca a importância da BHE na proteção e prevenção de quaisquer fatores que acelerem o processo neurodegenerativo.

Na dolicoectasia (ou dilatação dos grandes vasos sanguíneos), observa-se uma diminuição na elasticidade dos vasos, o que resulta em alterações morfológicas nos vasos, tornando-os disfuncionais⁹ e levando à redução do fluxo sanguíneo no cérebro. Essa redução no fluxo sanguíneo subsequentemente diminui o suprimento de oxigênio e glicose, desencadeando danos à BHE por meio da ativação de astrócitos reativos¹⁰. Quando a lâmina de elastina interna dos vasos é danificada por dolicoectasia¹¹, a estimulação repetida do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é necessária para a angiogênese. Isso pode levar à formação de vasos permeáveis e, em última instância, resultar em angiogênese patológica, caracterizada pelo desenvolvimento de vasos defeituosos¹². Durante a angiogênese patológica, quando os vasos sanguíneos se tornam defeituosos, um mecanismo compensatório parece restaurar a integridade do vaso regulando positivamente as proteínas da junção apertada. No entanto, esse processo pode inadvertidamente interromper a BHE quando a integridade estrutural de um vaso sanguíneo é perdida¹³. Isso pode ocorrer por meio de uma maior interrupção da BHE e da promoção da produção de placa amilóide¹⁴. Além disso, o vazamento da periferia pode causar neuroinflamação¹⁵, o que resulta em degeneração neuronal e subsequente perda de memória.

Estruturalmente, a proteção que o BBB fornece é através das junções apertadas que impedem que os agentes xenobióticos entrem no sangue no cérebro. Ao permitir que certas substâncias entrem no cérebro, o BBB o faz principalmente por meio de dois processos principais, difusão passiva ou canais específicos (como canais iônicos e transportadores)¹. Na DA, a pesquisa demonstrou que um sistema vascular disfuncional desempenha um papel significativo na progressão da condição^12,13. A formação de placas beta-amiloide (Aβ) e a neurodegeneração podem resultar da quebra da BHE^12,13 e de distúrbios no fluxo sanguíneo cerebral¹⁶. A redução do fluxo sanguíneo cerebral pode ser observada em idosos com diagnóstico de demência vascular e DA^17,18. Danos à barreira hematoencefálica (BHE), juntamente com um fluxo sanguíneo cerebral disfuncional (FSC), podem contribuir para o aumento da produção da concentração de Aβ no cérebro, acompanhada pela infiltração de materiais estranhos da circulação periférica¹⁹.

Para investigar a patogênese de doenças neurológicas como DA e demência vascular (DV), modelos são desenvolvidos para replicar a doença. Os modelos in vitro são amplamente utilizados, mas carecem do ambiente biológico para modelagem extensiva de doenças, como a população de células mistas, necessitando assim da importância dos modelos in vivo. Os camundongos são comumente usados devido à sua facilidade de manipulação genética na geração de propriedades semelhantes às humanas (por exemplo, patologia) na doença. Com a progressão que foi feita até agora, ainda há uma necessidade contínua de modelos aprimorados para emular fenótipos de doenças, como dilatação de grandes vasos e seu papel na DA. Para tanto, vimos uma oportunidade e modificamos uma técnica que envolvia a injeção de elastase na Cisterna magna de camundongos^20,21. A elastase é uma enzima que demonstrou quebrar a elastina no tecido conjuntivo²² e nas junções apertadas circundantes²³. A Cisterna magna foi escolhida como ponto de injeção por estar localizada diretamente acima do círculo de Willis, o maior vaso sanguíneo do cérebro. Ao injetar elastase na Cisterna magna, podemos comprometer a BHE e os vasos sanguíneos, rompendo as junções apertadas e induzindo a dilatação dos vasos sanguíneos (círculo de Willis)^24,25. A combinação dessa técnica com o uso de um modelo de patologia de camundongo com DA, para melhorar a compreensão da patogênese do componente vascular da DA, pode fornecer informações valiosas sobre as complexas interações e influências entre essas duas patologias distintas.

Estudos anteriores demonstraram casos em que os pacientes apresentam características patológicas de DA e DV, uma condição tipicamente referida como demência mista^26,27. Assim, entender os mecanismos interconectados entre as duas condições pode oferecer uma perspectiva mais abrangente sobre a progressão e manifestação desses distúrbios neurodegenerativos, aumenta nossa compreensão dos mecanismos subjacentes e das possíveis estratégias terapêuticas. Para isso, demonstramos a aplicação da elastase em um modelo de camundongo com patologia da DA (APP^NL-F) para identificar alterações vasculares.

Protocolo

Camundongos App^NL-F(3 meses de idade) que expressam placa amilóide humana em nível fisiológico foram usados para este estudo, embora este sistema possa ser usado com qualquer modelo de roedor. Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais do CAMH (Protocolo # 843) e estavam de acordo com os padrões éticos das diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Os camundongos foram criados internamente e mantidos em um ciclo claro-escuro de 12 horas com acesso ad libitum a ração e água.

1. Procedimento para injeção de Cisterna magna (CM)

1. Procedimento cirúrgico
   1. Coloque o mouse (APP^NL-F, ambos os sexos, 3 meses) em uma câmara de indução anestésica por 1 min.
      NOTA: Lave a câmara com isoflurano a 5% misturado com oxigênio a 1% por pelo menos 1 min.
   2. Depois que o camundongo estiver anestesiado, remova o animal da câmara e coloque-o em uma nova cortina cirúrgica e mantenha a anestesia (isoflurano, 2,5% -3%) colocando um cone nasal sobre o nariz.
      NOTA: Verifique a profundidade da anestesia beliscando o dedo do pé para garantir que não haja reflexos.
   3. Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento. Em seguida, injetar por via subcutânea 0,1 mL de bupivacaína (anestésico local; 1-2 mg/kg 0,125%, com uma razão de diluição de 1:2) no local da incisão e Metacam (analgésico; 5 mg/kg, com uma razão de diluição de 1:10). Mantenha o animal hidratado injetando 0,5 mL de solução salina por via subcutânea antes de fazer o procedimento para compensar qualquer perda potencial de sangue durante a cirurgia.
   4. Para um local de incisão claro, raspe o pescoço na base do osso occipital, limpe a superfície com PBS estéril e transfira o sujeito para a estrutura estereotáxica na posição prona.
      NOTA: Certifique-se de que a anestesia seja mantida através do cone estereotáxico do nariz.
   5. Coloque a barra nasal da estrutura estereotáxica na parte superior do mouse para fornecer estabilidade e garantir que os dentes superiores estejam presos.
   6. Posicione a cabeça do animal em um ângulo de 120° em relação ao corpo para elevar e distender a nuca para expor a área cirúrgica de interesse.
   7. Limpe o local da cirurgia com esfoliante Betadine 3x, etanol 70% 3x e solução betadine 1x com gaze estéril de 2 polegadas x 2 polegadas.
   8. Dobre a pele suavemente com a ajuda de uma pinça e faça uma pequena incisão (1 cm) usando uma tesoura cirúrgica.
      NOTA: Isso deve revelar a linha média da nuca.
   9. Passe cuidadosamente o bisturi ao longo da linha média para cortar os músculos. Em seguida, usando uma pinça, separe suavemente os músculos, separando-os para a esquerda e para a direita.
      NOTA: Isso deve revelar a Cisterna magna (triângulo invertido) que está localizada abaixo da base do crânio (Figura 1).
2. Preparação de elastase
   NOTA: O pacote de elastase (forma de pó) que foi encomendado continha 250 unidades (U). A quantidade de elastase a injetar em cada animal é de 2,5 μL. A quantidade de elastase que deve estar em 2,5 μL deve ser de 15 miliunidades mU.
   1. Primeiro calcule a concentração da solução a ser injetada.
      Concentração = massa/volume
      = 15 mU/2,5 μL
      = 6 mU/μL
      Portanto, a concentração necessária é de 6 mU/μL.
   2. A quantidade de elastase é de 250 U e o estudo trabalha com miliUnits, então converta as unidades em miliUnits, o que dá 250000 mU.
   3. Depois de ter uma massa de 250000 mU e concentração de 6 mU/uL, descubra o volume (PBS) que exigiria diluir a elastase e manter uma concentração de 6 mU/uL.
   4. Usando a mesma fórmula acima, reorganize para resolver o volume:
      Volume = massa/Conc.
      = 250000 mU/ 6 mU/μL
      = 41666.67 μL
   5. Como é difícil pipetar 41666,67 μL, basta convertê-lo em mililitros dividindo-o por 1000 para obter 41,66667 mL para obter uma solução 1x.
      1. Para tornar a solução mais concentrada, aumente-a em 10x ou 100x.
      2. Crie uma solução 10x, pois é mais simples de trabalhar (veja abaixo).
         Solução 10x ---------- 4,166667 mL (conc.)
   6. Coloque os 250 U em um tubo de alíquota de 5 mL e adicione 4,167 mL de PBS estéril no tubo de alíquota para fazer a solução estoque 10x.
   7. Pipetar 10 μL de solução-mãe e colocar em 100 tubos alíquotas dando 1000 μL da solução-mãe de 4,167 ml. Armazene os tubos a -20 °C.
   8. Conservar o resto da solução-mãe em tubos alíquotas a 100 μl por tubo e conservar no congelador a -20 °C.
      NOTA: As soluções são estáveis a -20 °C por até 6 meses, sem perda significativa de atividade. Além disso, é importante observar que o congelamento e descongelamento excessivos da elastase podem reduzir a estabilidade. Portanto, para evitar que isso aconteça, a solução estoque pode ser dividida antes do congelamento, de modo que apenas uma amostra precise ser descongelada por vez para injeção.
   9. Depois de descongelar um dos tubos de alíquota que contém 10 μL de uma solução 10x, adicione 90 μL de PBS estéril para obter uma solução 1x de 100 μL.
   10. Se o tubo alíquota que contém 100 μL de uma solução 10x foi descongelado, basta adicionar 900 μL de PBS para obter 1000 μL, que é uma solução 1x. Conservar qualquer uma das soluções a 4 °C durante 1 semana.
3. Injetando na Cisterna Magna
   NOTA: Limpe a seringa Hamilton antes de carregar com elastase, carregando e aspirando com água destilada 5x, depois etanol 5x e, finalmente, água destilada 5x.
   1. Carregue a seringa Hamilton com 2.5 μL de elastase (concentração de 15 mU) e certifique-se de que não haja bolhas de ar.
   2. Insira lentamente a seringa com o chanfro voltado para cima no centro da Cisterna magna.
      NOTA: Evite perfurar quaisquer vasos sanguíneos que atravessem a Cisterna magna.
   3. Após a perfuração, remova o chanfro. Isso facilitará a liberação de uma pequena quantidade de líquido cefalorraquidiano (LCR). Use um cotonete estéril para absorver o excesso de LCR.
   4. Reinsira o chanfro no local da punção, injete lentamente elastase ou veículo por mais de 1 min na Cisterna magna e deixe a agulha no lugar por 1 min para evitar qualquer vazamento de elastase.
   5. Após a remoção do chanfro, feche o local da incisão com uma sutura cirúrgica não absorvível (#4-0 com agulha de 3/8") e desligue o anestésico.
   6. Retirar o animal da estrutura estereotáxica e colocá-lo sobre uma almofada térmica quente regulada para 37 °C até que o sujeito recupere.
      NOTA: Outra dose de Metacam é recomendada após a cirurgia para ajudar com a dor durante a recuperação pós-cirúrgica.

2. Injeção de composto de borracha de silicone e colheita de tecido

1. Anestesifique o animal com uma overdose de avertin (1 mL, 125-250 mg / kg).
   NOTA: Aperte o dedo do pé para garantir que os reflexos cessem.
2. Coloque o animal em uma fralda e prenda todos os membros com fita cirúrgica com a cavidade torácica voltada para cima
3. Abra a cavidade torácica usando uma pinça e uma tesoura para expor o coração.
4. Insira uma agulha romba de 23 G no ventrículo esquerdo do coração e perfunda com PBS infundido com heparina (100 U / mL) por 4 min para limpar os vasos sanguíneos usando uma bomba de microperfusão.
5. Substitua o frasco tampão por um contendo 4% de paraformaldeído (PFA) (feito em PBS) e perfunda por mais 4 min.
6. Prepare a solução de composto de borracha de silicone (amarelo) combinando 5 mL de composto com 5 mL do diluente em um tubo de 50 mL. Misture bem antes de usar.
7. Encha uma seringa de 10 mL com 10 mL de composto de borracha de silicone. Conecte a seringa à mangueira conectada a uma agulha cega de 23 G e injete cuidadosamente a solução manualmente no coração.
   NOTA: Devido à alta viscosidade do composto de borracha de silicone, é importante usar uma seringa de cilindro maior ou a pressão será muito grande para empurrar o êmbolo.
8. Remova a cabeça do mouse após a injeção e armazene a 4 °C durante a noite, permitindo que o composto de borracha de silicone cure nos recipientes.
9. No dia seguinte, remova suavemente o crânio do camundongo (de preferência usando uma pinça fina), extraia o cérebro e incube em PFA a 4% durante a noite em temperatura ambiente (TR).
10. Após uma incubação de 24 horas em PFA, lave o cérebro em PBS 3x, coloque em sacarose a 30% e armazene a 4 ° C.

3. Análise quantitativa

1. Para capturar imagens de alta qualidade do Círculo de Willis em todo o cérebro (Figura 3):
   1. Remova o cérebro da solução de sacarose. Seque bem o cérebro usando uma toalha de papel para absorver a umidade da superfície.
   2. Posicione o cérebro em um cortador de cérebro. Coloque o cortador de cérebro sob um microscópio de luz equipado com uma câmera.
   3. Focalize o microscópio em uma resolução clara e de alta resolução do Círculo de Willis.
2. Use um software de análise de imagem com uma referência de régua de 10 cm para medir aproximadamente 1 cm e anotar a contagem de pixels. Defina a escala de 1 cm com base nessa medida e, em seguida, meça a espessura da artéria basilar horizontalmente para encontrar seu diâmetro.
3. Use um software de densitometria de pixel padrão para analisar a imagem. Meça (em centímetros) cinco leituras separadas da artéria basilar usando um software de análise de imagem e calcule a média para obter uma representação precisa do diâmetro da artéria basilar.
4. Use uma análise de variância (ANOVA) de 2 vias para comparar a mudança média no diâmetro entre a elastase e o grupo controle.
   1. Calcule a variação percentual no diâmetro usando a fórmula abaixo ²¹:
      
      C = variação relativa
      X₁ = Valor inicial (Veículo)
      X₂ = Valor final (elastase)
      Considere valores de P menores que 0,05 estatisticamente significativos. Realize todas as análises estatísticas usando um software de análise estatística.

4. Remoção do composto de borracha de silicone usando desidratação com álcool

NOTA: É importante desidratar o cérebro para ajudar a remover o excesso de composto de borracha de silicone do vaso sanguíneo, o que pode potencialmente melhorar a qualidade da imunocoloração.

1. Lave os cérebros 3x com PBS para remover a sacarose.
2. Coloque o cérebro em etanol a 25%, 50%, 75%, 95% e absoluto por 24 h em cada concentração, por um tempo total de 5 dias.
3. Após a desidratação do tecido, coloque o tecido em salicilato de metila (conc. ≤100%) por 12-24 h. O etanol e o salicilato de metila permitirão a remoção do excesso de silicone no tecido.
4. Lave o cérebro em PBS 3x para remover produtos químicos residuais e deixe durante a noite em um balancim a 4 ° C em PBS fresco.
5. Colocar o cérebro em sacarose e conservá-lo a 4 °C antes da secção e imunocoloração.

5. Coloração imuno-histoquímica

1. Seccionamento de cérebros
   1. Antes da imunosecção, permita que o cérebro se acomode no fundo do tubo cheio de sacarose.
   2. Congele o cérebro na plataforma de micrótomo usando o composto de temperatura de corte ideal (OCT) cercado por gelo seco. Corte o cérebro em seções de 40 μm usando a lâmina do micrótomo.
   3. Transfira cada seção para uma placa de 96 poços contendo crioprotetor para evitar o congelamento usando um pincel de ponta fina.
   4. Sele firmemente a placa de 96 poços com filme plástico. Armazene a placa selada em um freezer a -20 °C.
2. Coloração por imunofluorescência (usando NeuN como exemplo)
   1. Coloque as seções em uma placa de 24 poços. Realize três lavagens com PBS para eliminar o crioprotetor.
   2. Para evitar a ligação inespecífica, incubar por 1 h em RT usando uma solução de bloqueio contendo 2% de soro de cabra, 0,1% de Triton-X 100 e 1% de BSA.
   3. Prepare todos os componentes no PBS.
      NOTA: O anticorpo primário usado incluiu anti-NeuN monoclonal de camundongo com diluição de 1: 500. O anticorpo secundário usado incluiu o anti-camundongo policlonal de cabra 568 com diluição de 1:200.
   4. Diluir o anti-NeuN monoclonal de ratinho na solução de bloqueio acima mencionada.
   5. Adicione o anticorpo diluído a cada poço. Incubar durante a noite a 4 °C, protegido da luz por papel alumínio.
   6. Após a incubação primária, lave as seções 3x com PBS. Diluir o anti-rato de cabra policlonal 568 na mesma solução de bloqueio.
   7. Adicione o anticorpo diluído a cada poço. Incubar durante 2 h à temperatura ambiente, protegido da luz por papel alumínio.
   8. Lave as seções 3x com PBS após a incubação secundária.
   9. Prepare-se para a montagem transferindo lentamente as seções para os slides usando pincéis finos. Deixe todas as seções secarem.
   10. Aplique 125-150 μL de mídia de montagem anti-desbotamento assim que as seções estiverem secas. Coloque delicadamente as lamínulas.
   11. Deixe as lâminas secarem por 24 h em RT no escuro, selando as bordas com esmalte. Capture imagens fluorescentes usando software de imagem.

Resultados

Conseguimos localizar a Cisterna magna abaixo da região occipital do crânio depois de posicionar cuidadosamente o camundongo na estrutura estereotáxica e dissecar os músculos. Essa estrutura anatômica, semelhante a um triângulo invertido e destacada em amarelo, está situada abaixo da base do crânio (Figura 1). Para garantir a precisão e evitar qualquer dano ao tecido cerebral, 1-2 mm do bisel da seringa Hamilton foram inseridos suavemente na Cisterna magna.

Após a injeção de elastase, os animais foram perfundidos com PBS e PFA a 4% em três intervalos de tempo distintos: 2 semanas, 1 mês e 3 meses. Posteriormente, seus vasos sanguíneos foram fixados com um composto de borracha de silicone para melhorar a visualização dos vasos sanguíneos, conforme ilustrado na Figura 2. Qualitativamente, a dilatação induzida pela elastase revela um aumento da visibilidade dos pequenos vasos sanguíneos ao redor do Círculo de Willis e uma artéria basilar aumentada e tortuosa, em comparação com o grupo controle que recebeu uma injeção de veículo (Figura 3).

A análise quantitativa revelou uma diferença significativa entre os grupos elastase e controle, com aumento dos vasos sanguíneos no grupo elastase observado em 2 semanas (aumento de 32%; valor de p = 0,019), 1 mês (aumento de 19%; valor de p = 0,020) e 3 meses (aumento de 20%; valor de p = 0,020) após a injeção (Figura 4). A desidratação subsequente do cérebro por meio de um aumento gradual na concentração de etanol, seguida de imersão em salicilato de metila, facilitou a remoção do excesso de composto de borracha de silicone e contribuiu para uma melhor qualidade da coloração histológica (Figura 5).

Figura 1: Localização da Cisterna magna. A visualização aprimorada revela a Cisterna magna isolada dos músculos adjacentes do pescoço, mostrando sua posição em relação ao cérebro e à estrutura craniana, particularmente o osso occipital. Destacada por um triângulo amarelo, a Cisterna magna se assemelha a um triângulo invertido, oferecendo clareza na representação anatômica. Barras de escala: 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Injeção de corante amarelo. A perfusão transcárdica foi utilizada para preparar o tecido para a coloração histológica. (A) A configuração de perfusão para camundongos envolveu o bombeamento de PBS para o corpo por 4 minutos para remover o sangue, seguido de PFA por mais 4 minutos para fixação de proteínas. (B) A injeção de corante no ventrículo esquerdo de um camundongo após a perfusão aumenta a visibilidade dos vasos sanguíneos no cérebro, facilitando a observação a olho nu. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Pictograma de cérebros injetados com elastase e PBS. A visualização ilustra o aumento do AB e o aumento da tortuosidade ao redor do CW após a injeção de elastase, em comparação com o grupo controle (PBS). CW, círculo de Willis; BA, artéria basilar. Barras de escala: 3 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Dilatação dos vasos sanguíneos induzida por elastase e sustentada por 3 meses. Em comparação com o grupo controle tratado com PBS, observamos dilatação significativa dos vasos sanguíneos após uma única injeção de elastase na Cisterna magna de camundongos de 3 meses de idade, que durou 3 meses. A artéria basilar foi medida em 2 semanas, 1 mês e 3 meses após a injeção de elastase. Os dados são ± média DP; Anova de 2 vias, Sidak (teste post hoc); *p < 0,019 (2 semanas), *p < 0,020 (1 mês) e *p < 0,020 (3 meses). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Coloração NeuN do cérebro desidratado após a remoção do corante amarelo excessivo. Depois de colocar o cérebro em concentrações crescentes de etanol e salicilato de metila por 24 h cada, o cérebro foi seccionado usando um micrótomo e corado para o marcador neuronal NeuN. No diagrama, é evidente que o (A) cérebro não desidratado exibe maiores vasos sanguíneos visíveis em comparação com o (B) cérebro desidratado, conforme indicado pela seta branca. Isso facilita uma análise mais precisa dessas seções, pois reduz a interferência de fundo relacionada aos vasos sanguíneos. Barras de escala: 3 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este artigo demonstra um protocolo aprimorado para dilatação cerebrovascular, fornecendo uma abordagem precisa e direta para injeção de elastase na Cisterna magna de camundongos. Este ponto anatômico serve como uma porta de entrada direta para o líquido cefalorraquidiano, oferecendo um caminho valioso para a investigação de diferentes doenças neurológicas. Uma das principais vantagens desta técnica modificada é que a injeção de uma dose única de elastase na Cisterna magna de camundongos foi capaz de causar e sustentar a dilatação de grandes vasos sanguíneos por pelo menos 3 meses sem a necessidade de injeção repetível ou implantação de cânula. A abordagem de administração de elastase em um modelo de camundongo com DA é outra vantagem notável, particularmente para acelerar a deposição de placas amilóides no cérebro. Normalmente, modelos de DA, como camundongos App^NL-F (utilizados neste estudo), mostraram formação de placa aos 6 meses de idade²⁸. Este modelo foi selecionado porque esses camundongos exibem naturalmente deposição de amilóide semelhante à humana em condições normais de envelhecimento. A injeção de elastase na Cisterna magna aos 3 meses de idade pode exacerbar a patologia da DA, reduzindo o fluxo sanguíneo cerebral¹⁶ e aumentando as rupturas da barreira hematoencefálica^12,13.

É importante notar que a injeção de substâncias na Cisterna magna pode ser impedida pela pressão do LCR. Abordamos essa limitação desenvolvendo um método destinado a minimizar seu impacto, reconhecendo que não podemos eliminar a interferência potencial do líquido cefalorraquidiano (LCR) na entrega de elastase ao cérebro. A capacidade da elastase de digerir a elastina resulta em redução da rigidez arterial, enfraquecendo as artérias e fazendo com que os vasos sanguíneos se alonguem e se tornem tortuosos^29,30, tornando-se uma intervenção adequada para causar dolicoectasia.

Normalmente, leva cerca de 20 minutos para completar a injeção cirúrgica na Cisterna magna por camundongo. Durante o processo, os camundongos são anestesiados com isoflurano a 1,5% a 2% usado como anestesia geral. Recomenda-se implantar o uso de uma estrutura estereotáxica com uma barra de dente e barras auriculares para garantir a estabilidade e firmeza da cabeça do mouse durante a operação, que é uma etapa delicada e crucial. O posicionamento incorreto na estrutura estereotáxica pode resultar em uma cabeça inclinada e entrega imprecisa, bem como o potencial de atingir um vaso sanguíneo. Em vez de cortar a pele com um bisturi, que pode ser bagunçado, apertamos a pele com uma pinça fina e fazemos um corte limpo com uma tesoura cirúrgica para revelar a linha média da nuca. O bisturi então correu ao longo da linha média para fazer um corte perfeito, e pinças finas foram usadas para separar os músculos. No geral, isso minimiza o sangramento, o que ajuda o mouse a se recuperar muito mais rápido.

Optou-se por uma dosagem de elastase de 15 mU com base nos achados de trabalhos anteriores²⁰, que demonstraram que não houve diferença entre as dosagens de 15 mU e 25 mU. Além disso, eles observaram que concentrações mais altas levaram ao aumento das taxas de mortalidade. Embora uma taxa de mortalidade de 28% tenha sido relatada com a dosagem de 15 mU²⁰, o método usado neste estudo não produziu mortes entre a coorte. Tivemos zero mortalidade durante todo o processo cirúrgico de todos os camundongos e uma mortalidade de 5-10% pós-cirurgia até 3 meses depois. No entanto, o foco principal deste estudo está na compreensão da dolicoectasia, a dilatação de grandes vasos sanguíneos. Essa ênfase nos levou a nos concentrar na artéria basilar como referência primária para medir a dilatação. Além disso, a injeção de elastase na Cisterna magna de camundongos induz um efeito amplo, dilatando vasos sanguíneos grandes e pequenos.

Ao injetar na cisterna magna de qualquer animal, é crucial considerar a distância entre o tecido cerebral e o espaço da cisterna magna para evitar danificar o cérebro com a agulha. Devido aos camundongos terem uma distância relativamente pequena, inserimos apenas o chanfro da seringa na Cisterna magna. Para minimizar o risco de infecção, o procedimento deve ser realizado com equipamento cirúrgico estéril, com o camundongo anestesiado. A administração de bupivacaína e Metacam antes do procedimento pode ajudar a reduzir o desconforto pós-operatório e promover uma recuperação mais rápida para os animais. A cisterna magna, localizada na base do crânio, torna-se visível secando completamente o local da cirurgia com um cotonete estéril. Para a presente investigação, a região cirúrgica tem cerca de 1 cm de tamanho, que é a área máxima que pode ser usada para obter uma visão clara da Cisterna magna. Além disso, o pequeno local da incisão ajuda o animal a cicatrizar mais rapidamente.

É crucial maximizar a retenção de drogas dentro do espaço Cisterna magna. Pesquisas anteriores tentaram prevenir o vazamento do medicamento colocando um cotonete no local da injeção após a administração de elastase²¹. No entanto, temos preocupações sobre a eficácia desse método, pois a natureza absorvente do algodão no local da injeção pode comprometer a eficácia da elastase, reabsorvendo-a após a injeção. Da mesma forma, em outro estudo²⁰, a agulha foi rapidamente removida após a injeção de elastase na Cisterna magna, representando outro desafio potencial para garantir que o medicamento ideal entre no espaço da Cisterna magna, potencialmente levando ao vazamento de elastase no líquido cefalorraquidiano. Portanto, o método proposto aqui começa com a punção da Cisterna magna para liberar líquido cefalorraquidiano (LCR), seguido pela colocação de um cotonete estéril no local da punção para absorver o excesso de LCR e aliviar a pressão dentro do espaço. Posteriormente, o cotonete é removido e a agulha é reinserida no mesmo local para injeção de elastase no espaço da cisterna sem reaplicar o cotonete. Além disso, optamos por manter a agulha no lugar por 1-2 min após a injeção, permitindo que a elastase se difundisse adequadamente por toda a Cisterna magna antes de retirá-la suavemente. No entanto, deve-se notar que esta técnica requer a realização da mão sem injeção e ancoragem constante da agulha enquanto punciona a Cisterna magna e injeta a elastase lentamente. Além disso, é importante evitar danificar os grandes vasos sanguíneos da Cisterna magna ao injetar, pois pode resultar em complicações como circular após a cirurgia, que é um ponto final e requer eutanásia. No geral, o método demonstra dilatação com duração de até 3 meses a partir de uma única injeção de elastase na Cisterna magna, superando a dilatação de 2 semanas observada nos métodos anteriores^20,21. Em conclusão, essa abordagem estende a duração da dilatação, mas também fornece consistentemente substâncias, como a elastase, diretamente ao cérebro. Este método é preferido por sua abordagem minimamente invasiva para o transporte de substâncias através da barreira hematoencefálica, oferecendo uma vantagem adicional, pois pode ser expandido ainda mais para a administração de medicamentos ao sistema nervoso central.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cateter 23 G	University Medstore	2546-CABD305145	Necessário para perfusão  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Etanol absoluto	University Medstore	https://www.uoftmedstore.com/index.sz	Para remover o microfil
Betadine scrub	#	https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrub	Solução de esterilização
Betadine	Amazon	https://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHW	Esterilização
Bupivacaína	Fornecido por biotério	N/A	Analgésicos
Clippers	BrainTree Scientific Inc	CLP-41590	Pele de barbear
Algodão Q-tip	University Medstore	1962	Para cirurgia (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Elastase	Sigma-aldrich	E7885	Usado para a dilatação do vaso sanguíneo
Ethanol	University Medstore	39752-P016-EAAN	Esterilização (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Cabra anti-rato 568	Invitrogen	A11004	Para coloração de neurônios maduros
Prisma Graphpad 10	Prisma Graphpad 10	https://www.graphpad.com/	Software de análise estatística
Seringa de Hamilton	Sigma-aldrich	28614-U	Injeção de elastase
Almofada de calor	Amazon	https://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZ	Manter a temperatura corporal
Software ImageJ	Fiji Software Imagej	imagej.net (EUA)	Software de análise de imagem
Câmara de indução	Fornecido pelo biotério	N/A	Anestesia
indução Metacam	Fornecido pela instalação animal	N/A	Analgésico
Salicilato de Metila	Sigma-aldrich	M6752	Para remover o
microfil Microfil	Flow Tech, Carver, Massachusetts	https://www.flowtech-inc.com/order/	Corante (amarelo)
Mouse monoclonal anti-NeuN	Millipore Sigma	MAB377	Para coloração de neurônios maduros
Olympus VS200 scanner de slides e software VSI.	Olympus Life Science	https://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104	Software de imagem
Paraformaldeído	University Medstore	PAR070.1	Para fixação de proteínas  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Bomba de perfusão	VWR International	https://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumps	Necessária para perfusão
Bisturi	University Medstore	2580-M90-10	Para cirurgia (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Estereotáxica	Fornecida pelo biotério	N/A	Portanto, proteja o animal para a cirurgia
Tesoura	cirúrgicaUniversity Medstore	22751-A9-240	Para cirurgia (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Fita cirúrgica	University Medstore	https://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2	Prenda o animal na fralda
Suturas	University Medstore	2297-VS881	Para cirurgia (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
X2 pinças	University Medstore	7731-A10-612	Para cirurgia (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)