Artigo de método

Bioimpressão Incorporada de Estruturas Semelhantes a Tecidos Usando Meio Submicrogel κ-Carragenana

DOI:

10.3791/66806

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3 de maio de 2024

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1Research Institute of Smart Medicine and Biological Engineering, Ningbo University, 2Health Science Center, Ningbo University, 3Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases of Zhejiang Province, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 4The First Affiliated Hospital of Ningbo University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo apresenta um novo banho de suspensão de submicrogel de κ-carragenina, exibindo notáveis propriedades reversíveis de transição de interferência-desobstrução. Esses atributos contribuem para a construção de tecidos e órgãos biomiméticos em bioimpressão 3D embarcada. A impressão bem-sucedida de tecidos semelhantes ao coração/esôfago com alta resolução e crescimento celular demonstra aplicações de bioimpressão e engenharia de tecidos de alta qualidade.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A bioimpressão tridimensional (3D) incorporada utilizando um banho de suporte de hidrogel granular surgiu como uma técnica crítica para a criação de andaimes biomiméticos. No entanto, a engenharia de um meio de suspensão de gel adequado que equilibre a deposição precisa de bioink com a viabilidade e função celular apresenta vários desafios, particularmente na obtenção das propriedades viscoelásticas desejadas. Aqui, um novo banho de suporte de gel de κ-carragenina é fabricado por meio de um processo de moagem mecânica fácil de operar, produzindo partículas homogêneas em submicroescala. Esses submicrogéis exibem comportamento típico de fluxo de Bingham com pequena tensão de escoamento e propriedades de afinamento rápido por cisalhamento, que facilitam a deposição suave de bioinks. Além disso, a transição gel-sol reversível e as capacidades de autocura da rede de microgel κ-carragenina garantem a integridade estrutural das construções impressas, permitindo a criação de estruturas de tecido complexas e multicamadas com características arquitetônicas definidas. Após a impressão, os submicrogéis de κ-carragenina podem ser facilmente removidos por uma simples lavagem salina tamponada com fosfato. A bioimpressão adicional com biotintas carregadas de células demonstra que as células dentro das construções biomiméticas têm uma alta viabilidade de 92% e estendem rapidamente os pseudópodes, além de manter uma proliferação robusta, indicando o potencial dessa estratégia de bioimpressão para a fabricação de tecidos e órgãos. Em resumo, este novo meio submicrogel de κ-carragenina surge como um caminho promissor para a bioimpressão incorporada de qualidade excepcional, com profundas implicações para o desenvolvimento in vitro de tecidos e órgãos projetados.

Introdução

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Os andaimes de engenharia de tecidos, incluindo fibras eletrofiadas, esponjas porosas e hidrogéis poliméricos, desempenham um papel fundamental no reparo e reconstrução de tecidos e órgãos danificados, fornecendo uma estrutura estrutural que apoia o crescimento celular, a regeneração de tecidos e a restauração da função do órgão 1,2,3. No entanto, os andaimes tradicionais encontram desafios na replicação precisa das estruturas de tecidos nativos, levando a uma incompatibilidade entre os tecidos projetados e naturais. Essa limitação dificulta a cicatrização eficiente de tecidos defeituosos, enfatizando a necessidade urgente de avanços no design de andaimes para obter uma biomimética mais precisa. A bioimpressão tridimensional (3D) é uma técnica de fabricação inovadora que constrói com precisão estruturas complexas de tecidos biológicos camada por camada usando tintas e células de biomateriais4. Entre vários biomateriais, os hidrogéis poliméricos surgem como biotintas ideais com sua rede distinta que facilita o encapsulamento in situ das células e auxilia crucialmente seu crescimento 5,6. No entanto, muitos hidrogéis macios e altamente hidratados tendem a induzir o desfoque ou o rápido colapso das estruturas de andaimes impressas durante o processo de impressão quando usados como biotintas. Para enfrentar esse desafio, a tecnologia de bioimpressão 3D incorporada emprega um banho de microgel como material de suporte, permitindo a deposição precisa de biotinta macia. Após a gelificação das biotintas de hidrogel, andaimes biônicos refinados com estruturas intrincadas são obtidos removendo o banho de microgel. Materiais como gelatina 7,8, agarose9 e goma gelana10,11 foram empregados para criar banhos de microgel para bioimpressão 3D incorporada, avançando significativamente a aplicação de hidrogéis macios na engenharia de tecidos. No entanto, o tamanho de partícula não uniforme e em nível de mícron desses géis particulados afeta negativamente a resolução e a fidelidade da impressão 3D 12,13,14. Há uma necessidade urgente de fabricar um flutuador de suspensão semelhante a gel com partículas pequenas e uniformemente dispersas, oferecendo vantagens na obtenção de bioimpressão de alta fidelidade.

Neste protocolo, um novo banho de suspensão de κ-carragenina granulado sacrificial com um nível uniforme de submícrons é apresentado para impressão 3D incorporada. Este comportamento inovador de banho de submicrogel de transição rápida de interferência-desobstrução facilita a fabricação precisa de andaimes de hidrogel biomiméticos com alta fidelidade estrutural15. Utilizando este novo meio de suspensão, uma série de tecidos biomiméticos e construções de órgãos com estruturas de tecido multicamadas são impressas com sucesso, empregando uma biotinta composta de metacrilato de gelatina e fibrometacrilato de seda. Neste estudo, escolhemos o esôfago como objeto biomimético de bioimpressão 3D principalmente porque o esôfago não apenas possui uma estrutura de tecido multicamadas, mas também sua camada muscular exibe uma estrutura de camadas complexas circulares circulares internas e longitudinais externas. Garantir o alinhamento e a organização adequados dessas camadas é essencial para a regeneração funcional do tecido. Portanto, desejamos muito replicar a arquitetura multicamadas do esôfago. Mais importante, utilizamos submicrogéis de κ-carragenina como banho de suspensão e GelMA / SFMA como biotinta para projetar e construir um andaime biomimético para engenharia de tecidos. O esôfago impresso pode ser facilmente liberado por lavagem salina tamponada com fosfato repetida. Além disso, o banho de κ-carragenina submicrogel é isento de substâncias citotóxicas, garantindo alta citocompatibilidade15. As células musculares lisas carregadas dentro de andaimes anisotrópicos exibem uma notável atividade de disseminação. Este meio de suspensão submicrogel uniforme oferece um novo caminho para a fabricação de tecidos e órgãos complexos por meio de bioimpressão 3D incorporada.

Protocolo

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1. Preparação do banho de suspensão de submicrogel κ-carragenina

  1. Prepare 500 mL de banho de suspensão de κ-carragenina (0,35% em peso / vol) adicionando 1,75 g de pó de κ-carragenina em 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) dentro de um frasco de vidro de 1.000 mL.
  2. Introduzir uma barra de agitação magnética de 70 mm no frasco de vidro para agitar a mistura aquosa. Aperte a tampa da garrafa de vidro e afrouxe-a meia volta.
  3. Coloque a garrafa de vidro em banho-maria a 70 °C e aqueça-a. Ligue o agitador magnético a uma velocidade de 300 rpm, coloque o frasco e mexa até que o polímero esteja completamente dissolvido.
  4. Pegue outro frasco de vidro e coloque-o em uma autoclave para esterilização, funcionando a 121 ° C por 30 min.
  5. Depois que o esterilizador de alta pressão esfriar a 80 °C, remova o frasco do esterilizador e transfira-o para a bancada ultralimpa para manuseio posterior.
  6. Filtrar a solução de κ-carragenina completamente dissolvida para o frasco de vidro esterilizado utilizando um filtro de 0,22 μm.
    NOTA: Execute a filtragem rapidamente enquanto a solução estiver quente para evitar que a κ-carragenina esfrie e obstrua o filtro.
  7. Conservar a solução de κ-carragenina a 4 °C para induzir uma gelificação reticulada de catiões durante 12 h.
  8. Triturar mecanicamente os hidrogéis de κ-carragenina utilizando um agitador magnético de 60 mm com uma velocidade de agitação de 1200 rpm a 25 °C até que se transforme com sucesso para o estado líquido, demorando cerca de 60 min.
    NOTA: Armazene os hidrogéis de κ-carragenina entre 25-37 °C para evitar gelificação em baixas temperaturas ou dissolução em altas temperaturas.

2. Preparação de biotintas compostas de metacrilato de gelatina / fibroína de seda

  1. Prepare biotintas compostas combinando 10% (peso/vol) de metacrilato de gelatina (GelMA) e 6% (peso/vol) de metacrilato de fibroína de seda (SFMA) em solução PBS (pH 7,4). Pese 2,0 g de GelMA e 1,2 g de pós de SFMA separadamente.
  2. Adicione lentamente os pós em dois tubos de centrífuga de 50 mL. Adicione 10 mL de solução de PBS separadamente nos tubos de centrífuga de 50 mL.
  3. Adicione um agitador magnético de 10 mm a cada um e mexa e aqueça constantemente em banho-maria a 45 °C. Deixe os pós GelMA e SFMA se dissolverem completamente, levando aproximadamente 30 min.
  4. Misturar as soluções de GelMA e SFMA num volume igual sob agitação contínua a 45 °C. Filtrar as biotintas compostas utilizando um filtro de poros de 100 μm.
  5. Esterilize as biotintas compostas GelMA/SFMA por meio de irradiação UV em um gabinete de biossegurança por 12 h.
    NOTA: Prepare e use as biotintas imediatamente para evitar a gelificação prematura do SFMA por meio da automontagem.

3. Caracterização reológica do banho de suspensão de κ-carragenina submicrogel

  1. Inicie e prepare equipamentos relacionados à reologia.
    1. Ligue o compressor de ar por 30 min e certifique-se de que a pressão atinja 30 psi. Remova o rolamento clamp girando a haste de tração no sentido anti-horário. Fixe a tampa preta abaixo e gire o eixo do botão na parte superior do instrumento no sentido horário.
    2. Ligue o reômetro e permita que ele inicialize. Ligue o interruptor de circulação de água e deixe a temperatura atingir 15 °C.
    3. Abra o software de controle do reômetro para estabelecer a conexão online.
  2. Calibre o reômetro e instale a geometria da placa paralela.
    1. Realize a calibração do instrumento no software de controle, que envolve principalmente o ajuste do caminho de inércia do instrumento de calibração. Encaixe uma geometria de placa paralela de 40 mm de diâmetro na extremidade da haste de tração. Segure o botão Lock por 3 s para mover o eixo do motor para a posição inicial para um posicionamento consistente da geometria.
    2. Selecione o Gerenciador de calibração no software de controle e, em seguida, clique em Inércia, Calibração de atrito e Mapeamento rotacional para calibrar a geometria da placa paralela.
  3. Zere a altura da folga do reômetro realizando um procedimento padrão de zeragem da folga para garantir uma medição precisa.
  4. Configure as etapas experimentais, incluindo uma rampa de fluxo variando de 0,01 a 1000 1/s de taxa de cisalhamento, uma varredura de amplitude variando de 0,1% a 100% de deformação a 10 rad/s, uma varredura de tempo de oscilação de várias etapas com duração de 60 s com deformações alternadas de 1% e 100% a 10 rad/s e uma varredura de retenção de pico de várias etapas com duração de 120 s com taxa de cisalhamento alternada de 0,1 1/s e 10 1/s.
  5. Coloque 2 mL de suspensões de κ-carragenina a 0,35% na placa de Peltier do reômetro.
  6. Posicione a folga da geometria em 510 μm e remova qualquer excesso de transbordamento na borda do dispositivo de fixação. Defina o espaço de amostra para 500 μm para permitir que a amostra se estenda um pouco além da borda do grampo.
  7. Realize um experimento de fluxo selecionando a Rampa de Fluxo nas opções de projeto experimental.
    1. Escolha o teste de rampa de fluxo no projeto experimental. Defina as taxas de cisalhamento de 0.001 a 10 1/s a uma temperatura de 25 °C.
    2. Execute a etapa 3.5 e o experimento de Rampa de Fluxo na amostra adicionada.
  8. Realize um teste cíclico de Peak Hold para avaliar o desempenho de recuperação do material.
    1. Escolha a varredura Peak Hold no projeto experimental e defina 5 experimentos consecutivos com um tempo de 120 s a 25 °C.
    2. Defina a taxa de cisalhamento para 0,01 1/s para o primeiro, terceiro e quinto passos e para 10 1/s para o segundo e quarto passos.
    3. Adicione uma nova amostra de 2 mL. Execute a etapa 3.5 e o teste de recuperação cíclica.
  9. Realize a análise de viscoelasticidade para avaliar a potencial transição gel-sol do banho de suspensão κ-carragenina.
    1. Escolha o teste de varredura de amplitude no projeto experimental. Defina a tensão de oscilação de 0,1% a 100% a uma temperatura de 25 °C. Clique em Iniciar para executar o experimento de varredura de amplitude na amostra adicionada.
  10. Realize análises de deformação alternativas para avaliar o desempenho de recuperação elástica do material.
    1. Escolha Oscillation Time Sweep no projeto experimental e defina 5 experimentos consecutivos com um tempo de 60 s a 25 °C.
    2. Defina a tensão para 1% para a primeira, terceira e quinta etapas e para 100% para a segunda e quarta etapas.
    3. Adicione uma nova amostra de 2 mL. Execute a etapa 3.5 e o teste de recuperação cíclica contínua.
      NOTA: Limpe a placa de geometria e a placa de Peltier após cada teste de experimento e adicione uma nova amostra de 2 mL.

4. Impressão de andaimes de hidrogel biomiméticos usando uma bioimpressora de microextrusão personalizada

  1. Projete cubos no formato STL usando um software gráfico 3D e baixe modelos semelhantes a tecidos do banco de dados 3D (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.).
    1. Importe os modelos no formato STL para o software PANGO e insira os parâmetros de impressão. Defina as coordenadas X, Y e Z específicas do modelo no espaço 3D, insira o tamanho de escala esperado do modelo em milímetros (mm), ajuste o tamanho e a taxa de escala do objeto nos eixos X, Y e Z e ajuste o ângulo de rotação do modelo no espaço conforme necessário.
    2. Insira o diâmetro estimado do filamento (normalmente em torno de 200-500 μm para a maioria das biotintas) no campo de espessura da camada para determinar a espessura do eixo Z de cada camada. Defina a velocidade de impressão de acordo com a espessura da linha esperada (aproximadamente 10-90 mm/s) e defina a densidade de preenchimento para 30%-80%.
    3. Exporte os parâmetros finais como código G para um cartão SD.
  2. Execute a bioimpressora e a bomba de microextrusão.
    1. Ligue o controlador da bomba de microextrusão, selecione a seringa de volume correspondente (5 mL) e defina a taxa de extrusão em 0.08 mL/min e a duração da extrusão em coordenação com o tempo de impressão desejado obtido dividindo o volume de hidrogel pela taxa de extrusão.
    2. Encaixe a seringa com uma agulha com um diâmetro interno de 210 μm no slot da seringa da bioimpressora.
    3. Ajuste o controlador da seringa para garantir que o êmbolo da seringa esteja em contato próximo com o parafuso.
    4. Colocar 3 ml de banho de suspensão numa placa de cultura celular de 35 mm. Posicione o prato na plataforma com base nas configurações de código e confirme se o cabeçote de impressão está 1 mm acima do fundo do prato.
      NOTA: Realize um pré-teste para garantir a precisão das posições dos pratos na plataforma de impressão durante a impressão.
    5. Insira o cartão SD que contém o código na bioimpressora 3D, ative o código file, inicie a bioimpressora e clique no botão Iniciar no controlador.
  3. Processamento dos construtos
    1. Exponha a construção impressa à luz azul de 405 nm por 1 min para iniciar a fotoreticulação.
    2. Remover o gel de κ-carragenina com uma pipeta de 1 ml, seguido da adição de 3 ml de PBS (pH 7,4) para lavagem e posterior remoção. Repita este processo para uma lavagem completa.
      NOTA: Execute o processo de lavagem com cuidado para evitar danificar as construções impressas.

5. Bioimpressão 3D incorporada de análogos da camada muscular esofágica

  1. Cultura de células musculares lisas esofágicas de coelhos (eSMCs).
    1. Iniciar a cultura em frascos T75 com 2 x 106 células usando 15 mL de meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina.
    2. Mantenha os eSMCs a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar até atingirem 80% de confluência.
  2. Preparação de bioink da camada muscular esofágica
    1. Aspire o meio ao atingir a confluência e lave os eSMCs com 5 mL de 1x PBS.
    2. Adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,2% ao frasco e incube por 2 min para digerir as células. Bata no frasco para separar as células da parede.
    3. Termine a digestão adicionando 2 mL de DMEM e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL. Meça a densidade celular usando um contador de células com 10 μL de suspensão celular.
    4. Centrifugue a 675 x g durante 3 min, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular nas biotintas compostas GelMA/SFMA (conforme preparado no passo 2.1). Ajuste a concentração final da célula para atingir uma densidade de 10 x 106 células/mL na bioink, otimizando assim as condições para aplicações subsequentes de bioimpressão 3D.
  3. Preparação da bioimpressora 3D e materiais associados
    1. Autoclave os instrumentos de impressão essenciais, incluindo agulhas de seringa, fórceps, um agitador magnético e um frasco de vidro de silicato de 1000 mL, sob condições de esterilização padrão (121 °C por 30 min) para garantir um ambiente asséptico para o processo de impressão.
    2. Coloque a bioimpressora dentro de um gabinete de biossegurança e esterilize-a com luz ultravioleta (UV) por um período de 30 min para manter a esterilidade.
    3. Prepare 50 mL de κ-carragenina estéril e 5 mL de biotintas compostas estéreis GelMA / SFMA, conforme descrito na etapa 1 e na etapa 2, respectivamente.
    4. Projete o modelo, defina os parâmetros desejados e prepare a bioimpressora conforme descrito na etapa 4.1.
  4. Início do processo de bioimpressão
    1. Execute os procedimentos descritos nas etapas 4.2 e 4.3 para bioimprimir a camada muscular esofágica 3D, seguida de lavagem e substituição do PBS.
    2. Realize a impressão celular com técnicas estéreis durante todo o processo de impressão para minimizar o risco de contaminação celular na estrutura impressa.
  5. Substituição do meio de cultura de células pós-impressão
    1. Aspire cuidadosamente o PBS e substitua-o por 3 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina. Certifique-se de que as construções impressas estejam totalmente submersas para fornecer condições ideais de crescimento celular.
    2. Incubar a placa de cultura de células contendo as construções impressas numa incubadora regulada para 37 °C com 5% de CO2. Substitua o meio de cultura celular por meio fresco diariamente, usando 3 mL de cada vez, e monitore o estado das células dentro das construções usando microscopia de luz.

6. Avaliação da viabilidade de eSMCs dentro das construções impressas via coloração de ensaio Vivo / Morto

  1. Remover o meio de cultura celular após 5 h de incubação e lavar as construções carregadas de células com PBS.
  2. Adicione 2 mL da solução padrão de calceína-AM/iodeto de propídio (1:1000) às construções impressas carregadas de células e incuba.
  3. Lave as construções 3x com PBS após uma incubação de 45 minutos e, em seguida, adicione meio de cultura de células frescas.
  4. Observe células vivas e mortas e capture imagens fluorescentes usando microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).

7. Observação dos eSMCs dentro das construções impressas via coloração FITC-Faloidin/DAPI

  1. Pintar as construções impressas usando isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado com faloidina (verde) para F-actina e 4',6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul) para nuclear após 5 dias de incubação.
  2. Preparação da solução de fixação
    1. Combine 4 mL de 1x PBS com 0,16 mL de paraformaldeído (PFA) em um tubo de polietileno (PE) de 5 mL, atingindo uma concentração final de 4%.
    2. Coloque a placa de cultura contendo as construções bioimpressas em uma superfície limpa. Remova o meio e cubra suavemente as construções com a solução PFA, garantindo sua imersão total. Deixe a fixação prosseguir à temperatura ambiente por 20 minutos antes de descartar a solução.
      NOTA: Manuseie líquidos com cuidado durante os processos de adição e remoção para preservar a integridade estrutural das construções bioimpressas.
    3. Introduza 2,5 mL de 1x PBS na placa de cultura, submergindo totalmente as construções para remover quaisquer reagentes de coloração residuais.
  3. Permeabilização da membrana celular
    1. Formule uma solução de Triton X-100 a 0,5% adicionando 20 μL de Triton X-100 a 4 mL de 1x PBS em um tubo de PE de 5 mL.
    2. Administre a solução Triton X-100 nas construções por 30 min em temperatura ambiente para permear as membranas celulares e, em seguida, remova a solução.
    3. Introduza 2,5 mL de 1x PBS na placa de cultura, submergindo totalmente as construções para remover quaisquer reagentes de coloração residuais.
  4. Bloqueando a associação não específica
    1. Crie uma solução de bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) a 3% em um tubo de PE de 5 mL adicionando 0,12 mL de BSA a 4 mL de 1x PBS.
    2. Introduza a solução BSA nas construções por 30 minutos em temperatura ambiente para bloquear locais não específicos e, em seguida, descarte a solução.
  5. Coloração de actina com FITC-Faloidina
    1. Prepare a solução de FITC-faloidina a 0,2% em um tubo PE de 5 mL com 4 mL de 1x PBS e 8 μL de reagente de coloração.
    2. Mergulhe as construções nesta solução por 60 min em temperatura ambiente no escuro e depois descarte a solução.
    3. Adicione 2,5 mL de 1x PBS à placa de cultura, submergindo totalmente as construções para remover os reagentes de coloração residuais.
  6. Coloração nuclear com DAPI
    1. Aplique 4 mL de solução de coloração DAPI nas construções, garantindo uma cobertura completa.
    2. Incube no escuro à temperatura ambiente por 20 min antes de remover a solução de DAPI.
  7. Lavagem final e submersão de PBS: Adicione 2,5 mL de 1x PBS à placa de cultura, submergindo totalmente as construções para remover os reagentes de coloração residuais.
    NOTA: Prepare as soluções de coloração com antecedência e manuseie-as com cuidado. Em nenhum momento as células devem sofrer dessecação dentro do vaso de cultura.
  8. Observe usando um microscópio confocal: Inspecione e visualize as construções coradas usando microscopia confocal para avaliar o crescimento celular, garantindo uma documentação abrangente dos resultados.

8. Avaliação da proliferação de eSMCs dentro dos construtos impressos usando o ensaio CCK-8

  1. Remova o meio de cultura das construções nos dias 7 e 14. Lave as construções com PBS para remover o meio residual e as células destacadas.
  2. Adicione a solução CCK-8 a cada construção seguindo as instruções do fabricante. Certifique-se de que o volume da solução CCK-8 seja adequado para cobrir cada construção completamente.
  3. Incubar as construções com a solução CCK-8 a 37 °C durante 2 h. Após a incubação, transfira cuidadosamente o sobrenadante para uma nova placa de 96 poços.
  4. Medir a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O banho de gel granular de κ-carragenina foi gerado pela quebra mecânica dos hidrogéis a granel em uma pasta de gel particulado. O estudo mais recente demonstrou que as partículas de κ-carragenina exibiram um diâmetro médio de aproximadamente 642 ± 65 nm com morfologias uniformes a 1000 rpm de mistura mecânica15, significativamente menores do que as dimensões dos microgéis previamente relatadas na literatura 16,17,18. Tempos de quebra mais longos e velocidades maiores resultam em tamanhos de micropartículas menores, com um tempo de mistura de 60 min a 1200 rpm, produzindo submicropartículas com diâmetro médio de 565 ± 86 nm neste estudo (Figura Suplementar 1). Prevê-se que esse tamanho de partícula pequeno melhore a resolução dos processos de impressão. Essas partículas se montam em um gel granular por meio da formação de ligações de hidrogênio e interações catiônicas ( Figura 1A ). Quando submetido ao estresse, o meio submicrogel κ-carragenina exibe comportamentos característicos, como escoamento, afinamento por cisalhamento e uma transição reversível de interferência-desobstrução, todos essenciais para o sucesso da bioimpressão 3D incorporada. A Figura 1B mostra o comportamento representativo do rendimento e o afinamento por cisalhamento de géis granulares de κ-carragenina em um teste de rampa de fluxo. Com o aumento da taxa de cisalhamento de 0,001 para 10 s-1, as tensões de cisalhamento para géis de κ-carragenina granular de 0,35% (peso / vol) permanecem relativamente inalteradas em taxas de cisalhamento abaixo de 0,3 s-1, indicando uma baixa tensão de escoamento de 3,5 Pa. Posteriormente, observa-se que as tensões de cisalhamento aumentam linearmente com as taxas de cisalhamento, sugerindo um comportamento de escoamento semelhante ao de um fluido de Bingham. Além disso, as medições reológicas de varredura de tensão dos submicrogéis κ-carragenina revelam uma transição distinta do gel para o sol. Esses géis cedem em cepas superiores a 10% e sofrem uma transição gel-sol em uma deformação de 35% (Figura 1C). A cepa de pequeno rendimento dos géis de submicropartículas é atribuída à rede física estabelecida por meio de ligações de hidrogênio e interações catiônicas. Esse comportamento de transição gel-sol é reversível. Conforme mostrado na Figura 1D, a uma deformação de 100%, o módulo de armazenamento dos submicrogéis κ-carragenina despenca de 38 Pa para 6 Pa, menor que o módulo de perda, indicando um estado solar. Por outro lado, após uma redução repentina na deformação para 1%, o módulo de armazenamento reverte rapidamente para aproximadamente 38 Pa. Ele ultrapassa o módulo de perda em 5 s, sugerindo que os submicrogéis de κ-carragenina são capazes de restabelecer rapidamente as ligações cruzadas físicas entre as partículas.

Os géis granulares de κ-carragenina, caracterizados por suas morfologias pequenas e homogêneas, exibem propriedades de afinamento por cisalhamento, rápida auto-recuperação e comportamento de tensão de escoamento, o que é vantajoso para seu uso em aplicações de bioimpressão 3D incorporadas. Para avaliar a eficácia da suspensão de submicrogel de κ-carragenina como banho de suporte para impressão embutida, uma biotinta amplamente utilizada composta por 10% (peso / volume) de metacrilato de gelatina e 6% (peso / volume) de compósitos de metacrilato de fibroína de seda (GelMA / SFMA) é empregada para os testes de impressão no meio κ-carragenina 19,20. O GelMA foi marcado com rodamina para melhor visualização21. Conforme ilustrado na Figura 2A, o banho de gel granular de κ-carragenina é altamente transparente, facilitando o monitoramento em tempo real do processo de impressão. As taxas de cisalhamento geradas pelo bico variam de 0,66 a 6 s-1 quando as velocidades do bico variam dentro da faixa de 10-90 mm/s. O banho de submicrogel de κ-carragenina ainda exibe comportamento de autocura dentro de 20 s após cisalhamento cíclico contínuo em taxas alternadas de 6 s-1 e 0,01 s-1 (Figura Suplementar 2). Uma estrutura de grade medindo 15 x 15 x 2 mm3, com espessura de camada de 150 μm, foi sustentada dentro do banho de submicrogel de κ-carragenina. Notavelmente, a grade demonstrou notável integridade e resolução, com filamentos individuais medindo aproximadamente 200 μm de largura e espaçamento entre filamentos de cerca de 350 μm, conforme verificado por imagens de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) (Figura 2B, C). Além disso, a estrutura da grade 3D apresentava uma rede porosa com poros interconectados. Esses são atributos vitais que influenciam a capacidade de impressão e, em última análise, afetam os comportamentos celulares, como sobrevivência celular, proliferação e potencial de diferenciação.

Para confirmar ainda mais a adequação do meio submicrogel κ-carragenina para gerar estruturas complexas de tecidos e órgãos, um modelo de coração humano e uma válvula cardíaca de três folhetos foram fabricados usando a tinta GelMA / SFMA em uma alta densidade de preenchimento de 80%. O modelo de coração impresso replica com precisão a forma anatômica 3D, incluindo as principais veias e artérias (Figura 2D), e exibe estabilidade mecânica após a remoção da água (Figura 2E). A valva cardíaca de três folhetos mostra folhetos valvares e estruturas de suporte distintos (Figura 2F). Além disso, os filamentos dentro das construções são facilmente removidos (Figura 2G). Além disso, um modelo cíclico hierárquico como o esôfago é recriado com precisão. Conforme mostrado nas Figuras 2H e 2I, o esôfago impresso exibe uma estratificação clara, com demarcações distintas entre as camadas individuais para replicar as camadas de tecido esofágico correspondentes, sugerindo que o meio submicrogel κ-carragenina suporta a complexidade estrutural necessária para a engenharia de tecidos. Embora o modelo atual não seja capaz de replicar a funcionalidade total de tecidos e órgãos humanos autênticos, o banho de submicrogel de κ-carragenina oferece potencialmente uma estratégia viável e promissora para a fabricação in vitro de tecidos e órgãos intrincados, com aplicações potenciais em pesquisa, terapia e diagnóstico.

Andaimes de grade com anisotropia longitudinal e transversal imitam a camada muscular do esôfago (Figura 3A, B), consistindo em uma camada muscular circular interna distinta e uma camada muscular longitudinal externa. Para replicar essa arquitetura anisotrópica in vitro, células musculares lisas esofágicas de coelho (eSMCs) foram cuidadosamente incorporadas nas biotintas GelMA / SFMA. Ao utilizar o meio submicrogel κ-carragenina, um andaime biomimético com eSMCs que se assemelhava muito à estrutura muscular de camada dupla do esôfago foi alcançado com sucesso. A viabilidade das células encapsuladas em hidrogéis foi avaliada com a coloração Viva/Morta após 5 h de cultivo. Revelou uma presença predominante de células vivas (coradas de verde) e uma proporção mínima de células mortas (coradas de vermelho) dentro das redes de hidrogel, indicando alta viabilidade celular (Figura 3C). A análise quantitativa mostrou uma taxa de sobrevivência notavelmente alta de até 92% (Figura 3D). Esses resultados indicam a biocompatibilidade do material hidrogel, bem como a eficácia das metodologias de impressão e reticulação na preservação da integridade celular. Para examinar melhor a morfologia celular dentro das construções GelMA / SFMA, imagens de faloidina (verde) / DAPI (azul) foram capturadas após 3 dias de cultura celular. Conforme mostrado na Figura 3E, um número significativo de eSMCs dentro das construções biomiméticas projetou uma abundância de pseudópodes e exibiu um alinhamento ao longo das microfibras, conforme mostrado após 3 dias de cultivo. A reconstrução 3D confirma ainda mais a replicação precisa das camadas musculares do esôfago (Figura Suplementar 3). Além disso, a proliferação de eSMC foi avaliada usando o ensaio CCK-8 nos dias 1, 7 e 14. Os valores do grau de absorbância a 450 nm aumentaram acentuadamente do dia 1 ao 7 e 14, refletindo um comportamento proliferativo robusto (Figura Suplementar 4). Esses resultados indicam o potencial significativo do meio submicrogel κ-carragenina em facilitar a bioimpressão biomimética de alta qualidade.

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Figura 1: Meio submicrogel κ-carragenina auto-montado e sua análise reológica. (A) Ilustração esquemática do flutuador de submicrogel κ-carragenina formado por meio de ligações de hidrogênio e interações catiônicas para bioimpressão 3D incorporada. (B) Rampa de fluxo em submicrogéis de κ-carragenina com 0,35% (peso / vol) a 25 ° C. (C) Medições da transição gel-sol em submicrogéis de κ-carragenina por meio de uma varredura de amplitude variando de 0,1% a 100% a 25 ° C. (D) Análise de autocura em submicrogéis de κ-carragenina a 0,35% (peso / vol) após cisalhamento cíclico contínuo em cepas alternadas de 1% e 100% a 25 ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Bioimpressão 3D incorporada de alta fidelidade de tintas GelMA/SFMA marcadas com rodamina usando o banho de suspensão submicrogel κ-carragenina. (A) Observação em tempo real da impressão 3D incorporada no banho de suspensão submicrogel κ-carragenina. (B, C) Imagens de microscópio confocal de varredura a laser ilustrando a (B) reconstrução 3D e (C) estrutura interna das grades impressas. (D, E) Fotografias de modelo cardíaco impresso em 3D em solução aquosa (D) e em seu estado natural (E). (F) Fotos de uma válvula cardíaca de três folhetos e (G) os filamentos sendo retirados das construções. (H) Fotografias de vista superior e (I) frontal capturando um modelo de esôfago impresso com a tinta GelMA / SFMA, mostrando estruturas hierárquicas de quatro camadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Bioimpressão carregada de células incorporadas usando o banho de suspensão de submicrogel κ-carragenina. (A, B) Diagramas esquemáticos de (A) a estrutura muscular circular interna e longitudinal externa do esôfago e (B) um andaime biomimético da camada muscular esofágica anisotrópica produzido por bioimpressão 3D incorporada. (C) Imagens de coloração viva/morta e (D) viabilidade quantitativa de eSMCs cultivados em andaime GelMA/SFMA às 5 h. (E) Imagens de projeção de eSMCs cultivados em andaimes GelMA/SFMA no dia 3. Da esquerda para a direita: o núcleo, a F-actina e a visão de mesclagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: (A) Imagem de microscopia eletrônica de varredura mostrando a morfologia homogênea dos submicrogéis de κ-carragenina. (B) A distribuição do diâmetro das micropartículas de κ-carragenina foi medida por um analisador de tamanho de partícula nanométrico a laser. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Análise de auto-recuperação em submicrogéis de κ-carragenina de 0,35% (wt/vol) após cisalhamento continuamente cíclico em taxas alternadas de 0,01 s-1 e 6 s-1 a 25 °C. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Imagem de reconstrução 3D das grades impressas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: A atividade de proliferação de eSMCs encapsulados no hidrogel GelMA/SFMA após 1, 7 e 14 dias foi avaliada usando o ensaio CCK-8 (n = 3). A significância estatística foi analisada por ANOVA one-way seguida de análise post hoc de Tukey entre três grupos, **p<0,01, ****p < 0,0001. Os dados são mostrados como a média ± desvio padrão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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A preparação de banhos de suspensão de submicrogel de κ-carragenina para uso em bioimpressão é um processo cuidadosamente orquestrado que envolve várias etapas críticas para garantir que o meio resultante exiba as propriedades desejadas para suportar biotintas. Inicialmente, uma solução de κ-carragenina é preparada dissolvendo o pó de κ-carragenina em água deionizada a temperaturas elevadas, criando uma mistura homogênea. A concentração da solução é fundamental e deve ser otimizada para gelificação subsequente. 0,3-0,6% (peso / volume) κ-carragenina demonstrou excelente desempenho em bioimpressão 3D incorporada15. Após o resfriamento, esta solução faz a transição para um gel a granel.

O gel a granel é então submetido a uma estratégia de moagem mecânica para produzir partículas de submicrogel. Isso envolve forças mecânicas de alto cisalhamento que quebram o gel em partículas de tamanho uniforme. Os parâmetros do processo de retificação, incluindo intensidade de cisalhamento, tempo e temperatura, são controlados com precisão para atingir a distribuição de tamanho de partícula desejada. Após a moagem, as partículas de submicrogel são armazenadas a 25-37 °C para evitar agregação ou dissolução, o que é essencial para manter uma suspensão uniforme que suporte tarefas complexas de bioimpressão. Recomenda-se que o gel seja preparado e usado imediatamente.

A produção de banhos de suspensão de submicrogel κ-carragenina é fácil de operar, garantindo o alinhamento com aplicações industriais e a crescente demanda por engenharia de tecidos em larga escala e empreendimentos de medicina regenerativa. Além disso, os banhos de suspensão de submicrogel de κ-carragenina empregam PBS ou meio de cultura compatível com células como solvente, o que garante excelente biocompatibilidade e o torna um meio ideal para apoiar células em construções bioimpressas. A vida útil do gel granular é de cerca de 1 mês em condições de preparação asséptica.

Caracterizado por seu comportamento de fluxo de plástico Bingham (Figura 1B), o banho de submicrogel κ-carragenina demonstra excelentes propriedades de afinamento por cisalhamento, juntamente com habilidades rápidas de autocura (Figura 1C, D), que são fundamentais para aumentar a precisão das construções impressas. A aplicação deste banho de submicrogel tem se mostrado eficaz na criação de tecidos com arquiteturas multicamadas (Figura 2), garantindo a produção de estruturas com alta fidelidade e resolução. Vale ressaltar que a capacidade de rápida extensão de pseudópodes em células incorporadas em biotintas carregadas de células (Figura 3), ressaltando a compatibilidade do banho com os processos celulares. Consequentemente, este banho de submicrogel de κ-carragenina é uma promessa transformadora para o campo da fabricação de tecidos e órgãos in vitro. Ele tem um impacto profundo na engenharia de tecidos e na medicina regenerativa, permitindo o desenvolvimento de construções de tecidos mais complexas, viáveis e funcionalmente integrativas.

Apesar do potencial considerável do banho de submicrogel de κ-carragenina para aplicações em bioimpressão e engenharia de tecidos, ainda existem vários desafios e limitações. Uma preocupação primária é que sua composição se assemelhe muito ao meio de cultura de células, o que é crucial para manter a viabilidade celular durante a impressão prolongada de grandes órgãos. Os submicrogéis de κ-carragenina são predominantemente produzidos usando PBS como solvente, o que requer a incorporação de vários meios de cultura celular para dissolver o material. Além do PBS, a κ-carragenina também é gelatinizada usando uma solução de cloreto de cálcio. No entanto, a solução de cloreto de cálcio pode causar toxicidade às células ou criar um desequilíbrio de pressão osmótica. Portanto, o uso de um meio de cultura celular seria ideal para solventes κ-carragenina e agentes de reticulação. Além disso, alcançar a produção estéril de microgéis de alto rendimento apresenta um desafio significativo. A esterilização de soluções de κ-carragenina requer filtração através de um filtro de 0,22 μm em temperaturas elevadas. No entanto, o rendimento da κ-carragenina estéril é frequentemente prejudicado por vários fatores, incluindo a qualidade da solução de PBS e o resfriamento da κ-carragenina durante o processo de filtração. Cada lote de filtração normalmente resulta em apenas 20-50 mL de κ-carragenina estéril, o que representa uma barreira significativa para a produção de microgéis de κ-carragenina de alto rendimento. Consequentemente, pesquisas futuras se concentrarão na otimização do processo de biofabricação, avaliando a viabilidade e função celular a longo prazo e explorando a integração de tecidos impressos em sistemas vivos.

Divulgações

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Os autores não têm interesse financeiro nos produtos descritos neste manuscrito.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação de Ciências Naturais de Ningbo (2022J121, 2023J159), projeto-chave da Fundação de Ciências Naturais da cidade de Ningbo (2021J256), Fundação Aberta do Laboratório Estadual de Engenharia Molecular de Polímeros (Universidade de Fudan) (K2024-35) e Laboratório Chave de Medicina de Precisão para Doenças Ateroscleróticas da Província de Zhejiang, China (2022E10026). Obrigado pelo suporte técnico das Instalações Principais, Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Ningbo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bioimpressora 3DPersonalizado
4 ', 6-Diamidino-2-PhenylindoleSolarbio Life ScienceC0065Pronto para uso
405 nm luz UVEFLXY-WJ01
Contador de célulasCorningCyto smart 6749
Microscópio confocal de varredura a laserLeicaSTELLARIS 5
DMEM glicose altaVivaCellC3113-0500Glicose alta, com piruvato de sódio e L-glutamina
Reômetro rotacional dinâmicoTA InstrumentDiscovery HR-20
Células musculares lisas esofágicasFornecido pelo Departamento de Biologia Celular e Medicina Regenerativa, Centro de Ciências da Saúde, UniversidadeCélulas primárias do esôfago de coelho
Soro fetal bovinoUEF9070L
Fluoresceína isotiocianato marcado com faloidinaSolarbio Life ScienceCA1610300T
Gelatina metacrilatoEFLEFL-GM-6060% substituição
k-carrageninaAladdinC121013-100gReagente grau
Lítio Fenil (2,4,6-trimetilbenzoil) fosfinatoAladdinL157759-1g365 ~ 405 nm
Kit de mortos-vivosbeyotimeC2015M
Leitor de microplacasPotenovPT-3502B
ParaformaldeídoSolarbio Life ScienceP1110 4% de sucesso
Penicilina/estreptomicinaSolarbio Life ScienceMA0110100 &agudo;
Solução salina tamponada com fosfatoVivaCellC3580-0500pH 7,2-7,4
Metacrilato de fibroína de sedaEFLEFL-SilMA-001Substituição de 39%
Triton X-100Solarbio Life ScienceT8200
Tripsina-EDTAVivaCellC100C10,25%, sem vermelho de fenol
de Ningbo

Referências

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