Este artigo fornece um protocolo e um vídeo de acompanhamento para a injeção de seio retrobulbar de até um volume total de 150 μL para camundongos adultos pós-natais, juvenis e runados. Este procedimento é particularmente adequado para a injeção de camundongos pequenos (15 g) quando a injeção da veia da cauda não é viável.
Artigo de método
Tratamento sistêmico para camundongos adultos pós-natais, juvenis e runados por injeção de seio retrobulbar
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embora as injeções na veia da cauda sejam frequentemente usadas como uma via sistêmica de entrega em camundongos adultos, as injeções retrobulbares são um método alternativo para entrega sistêmica com menos limitações. Primeiro, as injeções de veias da cauda (TVIs) são limitadas a camundongos adultos, onde o tamanho da veia da cauda é adequado para acesso. Ficar restrito ao tratamento de camundongos adultos pode ser problemático ao lidar com modelos de camundongos que não sobrevivem até a idade adulta. Em segundo lugar, os TVIs não são viáveis para modelos de camundongos com fenótipos de retardo de crescimento, onde os camundongos nunca atingem o tamanho de camundongos adultos do tipo selvagem. Portanto, as injeções retrobulbares podem ser usadas com sucesso para tratar camundongos adultos jovens e pequenos. Por fim, as injeções retrobulbares são realizadas sob anestesia, o que é menos estressante para os camundongos do que as TVIs que são comumente realizadas sem anestesia. Este artigo apresenta um protocolo e instruções detalhadas para injeções retrobulbares que podem ser usadas para entrega sistêmica a camundongos pequenos e jovens.
Introdução
Modelos murinos de doenças genéticas são comumente usados para demonstrar a eficácia de terapias de pequenas moléculas, genéticas e celulares1. Em camundongos, o método mais amplamente utilizado para replicar a entrega sistêmica a humanos é a injeção na veia da cauda (TVI), que normalmente é realizada em camundongos adultos com aproximadamente 6-8 semanas de idade para garantir que a veia seja grande o suficiente para acessar. A TVI tem sido usada com sucesso em vários estudos pré-clínicos de prova de princípio de doenças genéticas, como hemofilia, que apoiaram ensaios clínicos em humanos para terapia gênica2. No entanto, muitos modelos murinos de doenças genéticas têm fenótipos de crescimento e/ou letalidade precoce, o que os impede de atingir a idade ou o tamanho de um camundongo adulto (Figura 1). Tratar esses camundongos via TVI pode ser extremamente difícil, se não impossível, dependendo da idade de letalidade e / ou do tamanho máximo que os animais podem atingir.
Em contraste, a administração sistêmica de um agente terapêutico por injeção de seio retrobulbar (freqüente e incorretamente chamada de retro-orbital) pode ser feita prontamente em camundongos, independentemente da idade ou tamanho3. Injeções retrobulbares de vírus adeno-associado (AAV) têm sido usadas com sucesso em modelos murinos jovens com retardo de crescimento de doenças genéticas, como acidemia metilmalônica (MMA) e doença de Niemann-Pick tipo C 4,5,6,7,8. (Este procedimento também pode ser usado para injetar neonatos 3,4,9,10; no entanto, esta técnica não é detalhada neste protocolo ou no vídeo que o acompanha.) Mesmo substâncias altamente tóxicas como a doxorrubicina podem ser administradas com segurança por injeção retrobulbar11,12. Ao contrário do TVI, os camundongos são anestesiados durante as injeções do seio retrobulbar, o que torna o procedimento menos estressante para o camundongo e mais fácil para o operador, que não precisa conter fisicamente o camundongo13,14. Uma preocupação adicional é que o TVI freqüentemente usa uma lâmpada de calor para dilatar a veia da cauda, o que poderia causar desidratação em camundongos jovens e pode ser problemático em modelos murinos de doenças genéticas que são mais suspeitas de estresse relacionado ao calor. Outro problema que pode surgir ao usar o TVI é que a veia da cauda pode ser particularmente difícil de visualizar em camundongos altamente pigmentados. No entanto, assim como o TVI, as injeções de seios retrobulbares resultam em uma ampla biodistribuição sistêmica15,16.
Protocolo
Este protocolo e o vídeo que o acompanha são para o espaço de injeção retrobulbar de camundongos adultos pós-natais, juvenis e runados por injeção de seio retrobulbar; o protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano sob o número de protocolo G-03-4. Outras instituições podem ter requisitos e restrições diferentes, e este protocolo pode precisar ser modificado para aprovação em seu instituto. Obtenha a aprovação do ACUC da sua instituição antes de realizar este ou qualquer outro procedimento em animais.
1. Preparação pré-injeção
- Dilua o AAV até o volume e concentração de injeção desejados com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL para cada injeção. Adicione um volume extra de 50% para cada injeção para permitir o enchimento preciso da seringa estéril de uso único.
NOTA: Aqui estamos diluindo um repórter AAV8-CAG-eGFP para fornecer uma dose de 1 × 1013genomas virais por kg de massa corporal (vg / kg) em um volume de 50 μL. A quantidade de AAV nos 50 μL a injetar é calculada utilizando o peso do animal no momento da injeção. Neste vídeo, o AAV está sendo injetado por via retrobulbar para replicar a entrega sistêmica em humanos. Outros vetores de terapia gênica (ou seja, lentivírus, adenovírus), terapias de RNA e pequenas moléculas podem ser administrados sistemicamente usando este procedimento. - Certifique-se de que o sistema de anestesia para animais de laboratório (LAAS) de mesa esteja configurado corretamente e funcionando corretamente de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Se um método de anestesia alternativo for usado, certifique-se de que a anestesia seja preparada antes de iniciar as injeções. O procedimento de injeção retrobulbar deve ser compatível com a maioria das anestesias (por exemplo, uma restrição química injetável como cetamina e xilazina). - Antes de encher a seringa estéril de uso único (aqui, uma seringa de insulina, 31 G, 8 mm de comprimento, capacidade de 3/10 mL), mova o êmbolo para cima e para baixo várias vezes para garantir que o êmbolo possa ser pressionado suavemente. Em seguida, encha a seringa até o volume desejado, garantindo que não haja bolhas de ar.
NOTA: Volumes de até 150 μL podem ser injetados; nosso laboratório normalmente injeta um volume de 50 μL.
2. Sedação de camundongos por meio da administração de gás isoflurano com um sistema de anestesia em animais de laboratório (LAAS)
- Certifique-se de que o gás esteja fluindo apenas para a câmara de indução. Feche a torneira bidirecional para o circuito sem reinalação (NRB).
- Ligue o botão verde de fluxo de oxigênio na frente do medidor de vazão para que haja uma vazão de 1 L/min.
- Gire o isoflurano para ≤4% pressionando a alavanca na parte superior do vaporizador e girando o botão para a concentração desejada.
- Coloque o mouse na câmara de indução transparente. Observe a respiração e o movimento do animal com cuidado. Quando o animal estiver deitado, gire o botão do vaporizador para baixo para 2-2,5% de isoflurano.
- Abra a torneira bidirecional para o circuito NRB conectado à máscara facial e feche o fluxo de gás para a caixa de indução.
- Retire o animal e coloque-o na máscara facial do circuito NRB.
- Diminua a configuração de concentração de isoflurano para 1,5% -1,75%, conforme determinado pela reação a estímulos (por exemplo, beliscar o dedo do pé ou apertar a pata).
- Sempre monitore continuamente a respiração do mouse e a cor da membrana mucosa (se possível). Se a respiração do animal ficar difícil ou a cor da membrana mucosa não for rosa, diminua a concentração do anestésico.
- Mantenha o animal aquecido durante todo o procedimento. Use um aquecedor de mãos embrulhado em uma toalha de papel que é colocada embaixo da almofada e localizada diretamente embaixo do mouse.
- Desligue o oxigênio e o vaporizador após a conclusão do procedimento.
3. Injeção do animal
- Se for destro, injete o olho direito do mouse e posicione-o do lado esquerdo com o focinho apontando para a mão direita. Se for canhoto, injete o olho esquerdo do mouse e posicione-o do lado direito com o focinho apontando para a mão esquerda.
- Aplique uma ou duas gotas de anestésico oftálmico no globo ocular, que deve ser injetado. Em seguida, remova qualquer excesso de solução anestésica oftálmica usando uma gaze absorvente estéril. Aplique uma leve pressão com as pontas dos dedos na pele, dorsal e ventral ao olho para projetar parcialmente o globo ocular do camundongo da cavidade (Figura 2A, B).
NOTA: Tenha cuidado para não aplicar pressão excessiva nos vasos cervicais circundantes ao projetar o olho, pois isso impedirá o fluxo sanguíneo e a injeção. Além disso, aplicar pressão na traqueia pode impedir o camundongo de respirar. Certifique-se de que o mouse possa respirar durante todo o procedimento. - Mantenha a agulha em uma posição chanfrada para baixo em um ângulo de aproximadamente 30 ° e colocada no canto medial ( Figura 2C ).
NOTA: A profundidade da colocação da agulha para alcançar o seio retrobulbar varia de acordo com o tamanho do animal. Ter a agulha na posição de chanfro para baixo durante a injeção diminui o risco de danos oculares. Tenha cuidado para não colocar a agulha muito fundo e perfurar a órbita ocular. A injeção deve demorar menos de um minuto. - Aplique pressão lenta e suavemente no êmbolo da seringa para administrar o injetado. Isso reduzirá a chance de extravasamento.
- Remova a agulha lenta e suavemente.
- Remova a máscara facial do mouse para permitir a recuperação da anestesia.
4. Pós-injeção
- Desligue o oxigênio e o vaporizador após a conclusão do procedimento.
- Use gaze estéril para remover o sangue se ocorrer sangramento residual.
- Certifique-se de que o mouse esteja em uma área quente (aproximadamente 37 ° C), mas não excessivamente quente, para evitar hipotermia durante a recuperação da anestesia.
- Observe o mouse isoladamente até que esteja completamente recuperado antes de retornar o mouse à gaiola e ao rack.
NOTA: Isolar o mouse durante a recuperação evita que os companheiros de gaiola machuquem o mouse sedado durante a recuperação.
Resultados
A injeção do seio retrobulbar tem sido usada com sucesso para fornecer sistemicamente pequenas moléculas, anticorpos e vírus adeno-associados (AAV)4,5,9,15,16. Na Figura 3, o fígado de um camundongo tratado com PBS (veículo) e um fígado de camundongo tratado com AAV8 são mostrados como um exemplo de injeção e expressão de AAV após uma injeção retrobulbar. AAV8, como muitos vetores AAV de ocorrência natural, é trófico hepático. Portanto, espera-se uma transdução hepática substancial em um camundongo que recebeu uma dose sistêmica de 5 × 1012vg / kg17. O grande número de hepatócitos expressando RNA de metilmalonil-CoA mutase (MMUT) visto na Figura 3, que está sendo expresso pelo transgene AAV, indica uma injeção retroorbital bem-sucedida.
Figura 1: Um camundongo com retardo de crescimento com acidemia propiônica. Este é um exemplo do retardo extremo de crescimento que pode ocorrer em modelos murinos de doenças genéticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens e diagrama da injeção do seio retrobulbar. (A) Imagem da colocação do dedo no pelo para o globo ocular saliente (indicado pela seta branca). (B) Imagem da protrusão do globo ocular (indicada pela seta branca) após a aplicação de pressão para baixo no pelo antes da colocação da agulha e injeção. (C) Diagrama da orientação do chanfro da agulha (chanfro para baixo em relação ao globo ocular), ângulo da agulha (30°) e colocação da agulha do seio retrobulbar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Hibridização in situ de RNA após injeção de seio retrobulbar com AAV8. Imagens de (A) 10x fígado tratado com veículo, (B) 10x fígado tratado com AAV8, (C) 20x fígado tratado com veículo e (D) 20x fígado tratado com AAV8 corado para RNA MMUT. Camundongos com acidemia metilmalônica foram tratados com uma dose de 5 × 1012 vg/kg de AAV8-LPS-MMUT ou um veículo controle (PBS) com 1 mês de idade. O tecido hepático foi coletado 1 mês após o tratamento. MMUT RNA corado marrom (setas pretas indicam áreas de coloração positiva). Fígado contracorado com hematoxilina. Barras de escala = 100 μm 10x para imagens, 50 μm para imagens 20x (B). Abreviaturas: AAV = vírus adeno-associado; LPS = Promotor específico do fígado; MMUT = metilmalonil-CoA mutase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussão
Embora a injeção retrobulbar seja um método confiável para fornecer pequenas moléculas, proteínas e terapias genômicas, é necessário praticar a técnica com um corante para garantir que a entrega sistêmica confiável e replicável seja alcançada. O uso de um corante é altamente recomendado para a prática de injeções retrobulbares em camundongos antes de usar essa via de entrega em experimentos. Os corantes podem ser verificados visualmente nos tecidos do camundongo para garantir uma entrega sistêmica consistente.
Em nossa demonstração da técnica de injeção retrobulbar, o gás isoflurano foi usado para anestesiar os camundongos antes do procedimento. Outras formas de anestesia podem ser usadas antes do procedimento, mas é importante garantir que o camundongo não se recupere da sedação antes que a injeção seja concluída. Felizmente, a injeção real geralmente leva menos de um minuto e o tempo pelo qual o mouse precisa ser totalmente anestesiado é breve. O camundongo deve ser completamente sedado durante a injeção e a anestesia deve ser readministrada se o camundongo ficar consciente antes da injeção. Como existem riscos associados ao uso de anestesia, a duração do tempo em que o camundongo fica sedado deve ser minimizada. Não tivemos problemas com o uso de isoflurano para sedar pequenos camundongos doentes com acidemia metilmalônica e propiônica. No entanto, alguns modelos de camundongos podem ser mais sensíveis à sedação e a certas anestesias. Esse problema potencial deve ser considerado antes de tentar usar sedação em um estudo. Por fim, o uso de sedação em combinação com a injeção retrobulbar reduz muito o sofrimento aparente que o camundongo exibe durante o processo de injeção em comparação com o TVI, onde a sedação não é comumente usada.
Não observamos nenhum problema relacionado à pós-injeção, embora a infecção seja um risco potencial com qualquer injeção. Para reduzir a chance de infecção, uma seringa descartável estéril de uso único e PBS estéril para diluir o AAV purificado são usados. Todos os ratos em nossas instalações para animais são verificados diariamente quanto a sinais de possíveis problemas de saúde e recebem cuidados veterinários para resolver quaisquer problemas de saúde quando necessário.
A alternativa à injeção do seio retrobulbar e o método mais amplamente utilizado de entrega sistêmica a camundongos jovens e adultos é o TVI. A TVI e a injeção do seio retrobulbar resultam em uma biodistribuição semelhante no caso de pequenas moléculas e anticorpos, e por extrapolação, o mesmo seria esperado para vetores virais15,16. No entanto, não foram encontrados na literatura exemplos comparando a entrega sistêmica de vetores de terapia gênica por TVI e injeção de seio retrobulbar. Em nossa opinião, as injeções de seios retrobulbares são mais fáceis de realizar em camundongos com fenótipo de crescimento diminuído e/ou letalidade precoce.
A TVI é frequentemente considerada mais análoga ao parto sistêmico em humanos, apesar de os humanos terem um seio retrobulbar, mas não terem cauda. Em um aspecto, a injeção do seio retrobulbar é como a administração sistêmica humana, pois o injetante entra no sistema venoso superior da mesma forma que se um injetante fosse administrado a um ser humano por um cateter central inserido perifericamente (PICC Line) ou um cateter intravenoso colocado no braço. Por outro lado, o injetante entra no sistema venoso inferior de um camundongo após a injeção na veia da cauda. Infelizmente, nenhum desses métodos replica exatamente o(s) método(s) usado(s) para entrega sistêmica em humanos, mas ambos são métodos eficazes de entrega sistêmica em camundongos.
Divulgações
Os autores não têm nada relevante para esta publicação a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a assistência da equipe da instalação de camundongos do NHGRI, do Laboratório de Patologia Molecular do NCI e, especialmente, de Andrew Warner. O R.J.C. é apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NHGRI por meio de 1ZIAHG200318-16 e este trabalho foi parcialmente financiado pelo Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais (NCATS). A Figura 2C foi criada com o BioRender.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AAV8-CAG-eGFP | Univ. Penn. Vector Core | ordem especial | de repórteres AAV e repórteres AAV alternativos estão disponíveis |
| Barreiras (Filtro) Dicas, 20 μ Tamanho L | ThermoFisher | AM12645 | para diluir AAV para disire volume de injeção e concentração |
| Pontas de Barreira (Filtro), 100 μ Tamanho L (estéril) | ThermoFisher | AM12648 | para diluir AAV para desejar o volume e a concentração de injeção |
| Circuito de Duplo Prodedure | VetEquip | 921400 | método alternativo de anestesia pode ser usado |
| Pipeta Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 | Gilson | F123600 | para diluir AAV para disire o volume e a concentração da injeção |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic Pipeta P100 | Gilson | F123615 | para diluir AAV para disire volume e concentração de injeção |
| Aquecedores de mãos (HOTHANDS) | ULINE | S-1497B | para manter o mouse aquecido enquanto anestesiado |
| Seringas de insulina, 31 G, 8 mm de comprimento, capacidade de 3/10 mL | Becton Dickson | 328438 | usado em vídeo; uma seringa por injeção |
| Isoflurano (Fluriso) | VETONE | 502017 | anestesia alternativa pode ser usada |
| Medline Protection Plus Underpads descartáveis | ThermoFisher | 23-666-062 | para colocar o mouse durante a injeção |
| Recipiente para Objetos Cortantes de Flebotomia Oak Ridge com Tampa Transparente | ThermoFisher | 22-730-434 | para descarte de agulhas |
| Fosfato tamponado com solução salina PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010023 | Para diluir o AAV até a concentração e volume desejados |
| Tubos de Microcentrífuga de Baixa Retenção Snap Cap (estéreis) | ThermoFisher | 3451 | para diluir AAV para desejar o volume de injeção e a conentração |
| Esponja de gaze estéril 4"x"4 | Cloridrato | 3033 | |
| Oftálmico (0,5%) | Ocenanside Pharmaceuticals | AK102D5DS | seringa Tuberculina anestésica local |
| com 27,0 G (ou menor) | Qualquer | N/A | alternativa à seringa de insulina usada no vídeo |
| VetEquip' s Guia do Usuário e Manual de Operação para Sistema de Anestesia de Animais de Laboratório de mesa e móvel. | VetEquip | chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf | link para o guia do usuário e manual |
Referências
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Reimpressões e permissões
