Method Article

Pipeline para estudo anatômico tridimensional em várias escalas do coração humano

DOI:

10.3791/66817

⸱

June 28th, 2024

 ,  ,  , 
1University of California Los Angeles (UCLA) Cardiac Arrhythmia Center, UCLA Health System, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Neurocardiology Program of Excellence, UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, David Geffen School of Medicine at UCLA

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta um pipeline abrangente para analisar amostras obtidas de corações humanos que abrangem as escalas microscópica e macroscópica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estudo detalhado de corações humanos sem falha rejeitados para transplante oferece uma oportunidade única de realizar análises estruturais em escalas microscópicas e macroscópicas. Essas técnicas incluem limpeza de tecido (imagem tridimensional (3D) habilitada para imunomarcação modificada de órgãos limpos com solvente) e coloração imuno-histoquímica. Os procedimentos de exame mesoscópico incluem dissecção estereoscópica e tomografia computadorizada (TC). Os procedimentos de exame macroscópico incluem dissecção macroscópica, fotografia (incluindo anáglifos e fotogrametria), tomografia computadorizada e impressão 3D do coração dissecado física ou virtualmente ou inteiro. Antes do exame macroscópico, a fixação por pressão-perfusão pode ser realizada para manter a arquitetura 3D e a morfologia fisiologicamente relevante do coração. A aplicação dessas técnicas em combinação para estudar o coração humano é única e crucial para entender a relação entre características anatômicas distintas, como vasculatura coronária e inervação miocárdica, no contexto da arquitetura 3D do coração. Este protocolo descreve as metodologias em detalhes e inclui resultados representativos para ilustrar o progresso na pesquisa da anatomia cardíaca humana.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como a função segue a forma, entender a arquitetura do coração é fundamental para a apreciação de sua fisiologia. Embora inúmeras investigações tenham revelado a anatomia cardíaca de micro a macroescalas 1,2,3, várias questões permanecem sem solução, especialmente aquelas relacionadas à anatomia cardíaca humana. Isso ocorre em parte porque os estudos básicos com foco na anatomia funcional geralmente utilizaram corações de animais 4,5,6, que muitas vezes são distintos dos corações humanos 1,7,8. Além disso, cada estudo individual, mesmo aqueles que usam amostras de coração humano, tende a se concentrar em estruturas muito específicas, o que dificulta a aplicação dos achados no contexto de todo o coração. Isso é ainda mais verdade se as estruturas focadas estiverem em micro ou mesoescalas, como o perínexo9 e os plexos ganglionares10.

Nesse contexto, o estudo estrutural sistêmico do coração humano rejeitado para transplante oferece uma oportunidade única e rara de obter um atlas abrangente das estruturas cardíacas em foco em escalas microscópicas e macroscópicas11. Os protocolos de exame microscópico incluem limpeza de tecido (imagem tridimensional (3D) habilitada para imunomarcação modificada de órgãos eliminados com solvente, iDISCO+)12,13 e coloração imuno-histoquímica. Os protocolos de exame mesoscópico incluem dissecção estereoscópica, macrofotografia e tomografia computadorizada (TC). Os protocolos de exame macroscópico incluem dissecção macroscópica14, fotografia (incluindo anáglifos e fotogrametria) 15 , 16 , 17 , tomografia computadorizada , dissecção virtual18 e impressão 3D do coração dissecado física ou virtualmente ou inteiro17. Na preparação para o exame macroscópico, a fixação por pressão-perfusão é realizada para manter a arquitetura 3D e a morfologia fisiologicamente relevante do coração 14,19,20,21. A aplicação combinada dessas técnicas é única e crucial para correlacionar características anatômicas distintas no contexto da arquitetura 3D do coração humano.

Como a oportunidade de obter uma amostra de coração humano não patológico é extremamente limitada, uma abordagem multiescala descrita aqui maximiza o uso da amostra. Ao aplicar vários procedimentos descritos abaixo, os resultados representativos ilustrarão ao leitor como os achados podem ser utilizados para múltiplos propósitos, incluindo descoberta em pesquisa científica11 (análises abrangentes da inervação cardíaca, distribuição dos plexos ganglionares), melhoria dos procedimentos clínicos (simulação para abordagens cirúrgicas e intervencionistas) e educação anatômica (demonstração 3D real da anatomia cardíaca).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo usou amostras de tecido não identificadas coletadas de corações humanos de doadores sem falha e foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA). As amostras foram obtidas de corações sem falha que foram rejeitados para transplante. Os corações foram perfundidos por pressão, fixados em paraformaldeído a 4% (PFA) e fotografados antes do processamento do tecido pelos seguintes métodos. A Figura 1 resume o fluxograma da ordem do estudo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Exame em microescala

  1. Limpeza de tecido usando imagem 3D habilitada para imunomarcação modificada de órgãos limpos com solvente (iDISCO+) protocolo.
    1. Disseque o tecido fixado com PFA a 4% com um bisturi para caber na câmara de 3 mm × 16 mm × 25 mm para microscopia confocal. Para obter imagens de tecidos mais espessos, câmaras e/ou espaçadores adicionais podem ser empilhados na lâmina.
    2. Desidratar amostras usando séries graduadas de metanol (MeOH) (20%, 40%, 60%, 80% e 100% MeOH em H2O deionizado [vol/vol]) por 1 h cada à temperatura ambiente (RT) com agitação.
    3. Lave com 100% MeOH por 1 h em RT e mergulhe em 66% de diclorometano/33% de MeOH em RT com agitação durante a noite.
    4. No dia seguinte, lave duas vezes em MeOH (100%) por 1 h em RT, leve à geladeira a 4 ° C e trate com 5% H2O2 em MeOH (vol / vol) durante a noite a 4 ° C.
    5. Reidrate com séries graduadas de MeOH (80%, 60%, 40% e 20% de MeOH) e lave em 0,01 mol/L PBS por 1 h cada em RT com agitação.
    6. Lave os tecidos duas vezes em 0,01 mol / L PBS com 0,2% de Triton X-100 por 1 h em RT.
    7. Prepare-se para a imunomarcação permeabilizando em PBS 0,01 mol/L, 20% de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,2% de Triton X-100 e 0,3 mol/L de glicina por 2 dias a 37 °C com agitação.
    8. Bloqueie em PBS 0.01 mol/L com 10% de DMSO, 0.2% de Triton X-100 e 5% de soro de burro normal por mais 2 dias a 37 °C com agitação.
    9. Marcação com um anticorpo primário compatível com MeOH conjugado a fluoróforos diluídos em PBS 0,01 mol/L com 10 mg/mL de heparina (PTwH), Tween-20 a 0,2%, DMSO a 5% e soro de burro normal a 3% por 3-4 dias a 37 °C com agitação.
    10. Reabastecer a solução de anticorpos e incubar por mais 3-4 dias a 37 °C com agitação.
    11. Após 1 semana de incubação em solução primária de anticorpos, lave 4 a 5 vezes em PTwH durante a noite em RT.
    12. Incubar com anticorpo secundário conjugado a fluoróforos diluídos em PTwH, soro de burro normal a 3% por 3 dias a 37 °C com agitação.
    13. Reabastecer a solução de anticorpos secundários e incubar durante mais 3 dias a 37 °C com agitação.
    14. Após 6 dias de incubação em solução de anticorpos secundários, lave em PTwH 4-5 vezes durante a noite em RT.
    15. Desidratar com uma série graduada de MeOH (20%, 40%, 60%, 80%, 100% e 100% MeOH). A amostra pode ser armazenada durante a noite em RT.
    16. Incubar em diclorometano a 66% / MeOH a 33% por 3 h em RT com agitação.
    17. Lave duas vezes em diclorometano a 100% por 15 min em RT com agitação.
    18. Incubar e armazenar amostras em éter benzílico. Encha o tubo para minimizar o ar de oxidação da amostra.
  2. Imagem da amostra limpa de tecido
    1. Fixe uma câmara contendo adesivo em uma lâmina e aplique esmalte ao redor do perímetro da câmara. Para tecidos mais espessos, câmaras e/ou espaçadores adicionais podem ser empilhados na lâmina.
    2. Coloque o tecido limpo na câmara, encha com éter benzílico e aplique uma lamínula.
    3. Aplique esmalte ao redor da lamínula para criar uma vedação.
    4. Obtenha imagens de tilescan e pilha Z usando um microscópio confocal de varredura a laser vertical com uma lente de 5x ou 10x para obter imagens em uma profundidade até a distância de trabalho da lente.
    5. Imagem com resolução de 1024 x 1024 usando linhas de laser apropriadas para espectros de emissão de fluoróforos usados. A autofluorescência muscular é visível usando a linha de laser de 488 nm.
    6. Certifique-se de que o tamanho do passo do eixo z seja compatível com a amostragem de Nyquist com base na abertura numérica da objetiva especificada11.
    7. Costure imagens e use software para visualização 3D.
    8. Crie figuras usando imagens de projeção de intensidade máxima (MIP) de pilhas Z para canais individuais e mesclados (Figura 2).
  3. Imuno-histoquímica
    NOTA: Depois que o tecido é embebido em parafina22, o procedimento a seguir é usado para criar lâminas para estudo imuno-histoquímico.
    1. Preparação da solução de correspondência do índice de refração (RIMS).
      1. Prepare o tampão fosfato 0,1 mol / L adicionando 10,9 g de Na2HPO4 (anidro) e 3,1 g de NaH2PO4 (monohidratado) ao H2O deionizado a um volume total de 1 L (pH 7,4). Filtre a solução e guarde-a em RT.
      2. Dilua o tampão fosfato para 0,02 mol/L.
      3. Dissolva o Histodenz em 30 mL de tampão fosfato 0,02 mol / L agitando a solução por 10 min com uma barra de agitação magnética no frasco de armazenamento final que pode ser lacrado para minimizar a evaporação e a contaminação.
      4. Adicione azida de sódio a uma concentração total de 0,01% (p / v) e ajuste o pH para 7,5 com NaOH.
      5. Ajuste o RI variando a concentração final de Histodenz.
      6. Armazene o RIMS no RT por meses. Descarte se for observada contaminação microbiana.
        NOTA: NÃO autoclave nenhuma solução que contenha azida sódica.
    2. Preparação de lâminas para estudo imuno-histoquímico
      1. Crie seções de 5 μm de espessura com micrótomo. Aplique a seção de tecido nas lâminas carregadas.
      2. Remova a parafina incubando as lâminas em xileno >75% por 10 min. Mova as lâminas para um segundo recipiente com xileno por mais 10 min.
      3. Remova o xileno imergindo as lâminas em 100% de EtOH por 10 min, depois em 95% de EtOH por 5 min e 70% de EtOH por 5 min.
      4. Enxágue as lâminas com H2O deionizado por 5 min.
      5. Mergulhe as lâminas em tampão de recuperação de antígeno por 25 min a 90-95 ° C.
      6. Deixe o recipiente esfriar até RT por 1 h com agitação.
      7. Mergulhe as lâminas em tampão de imersão (0.01 mol/L PBS + 0.4% Triton X-100) por 30 min a 4°C.
      8. Circunde o tecido com uma caneta PAP. Adicione PBS a cada lâmina e coloque-a em uma câmara umidificada para evitar a dessecação.
      9. Lave as lâminas com PBS em RT com agitação por 5 min.
      10. Bloqueie com tampão de bloqueio (0,01 mol / L PBS + 10% de soro de burro + 0,1% de TX-100) por 1 h com agitação.
      11. Incubar com um anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C.
      12. No dia seguinte, deixe os slides aquecerem até o RT por 15 min.
      13. Lave as lâminas 3 vezes com 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 por 5 min.
      14. Incubar com um anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 1 h em RT com agitação.
      15. Lave as lâminas 3 vezes com 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 por 5 min.
      16. Lave as lâminas 3 vezes com 0,01 mol/L PBS por 5 min.
      17. Coloque 1 gota de RIMS com um conta-gotas e aplique uma lamínula.
      18. Aplique esmalte ao redor da lamínula para criar a vedação.
      19. Como controlo negativo, executar uma amostra sem o anticorpo primário para demonstrar a ausência de coloração específica.
    3. Lâminas imunocoradas por imagem
      1. Visualize as lâminas com um microscópio confocal de varredura a laser com lentes objetivas de 10x, 20x e 40x.
      2. Imagem com resolução de 1024 x 1024 usando linhas de laser apropriadas para os espectros de emissão dos anticorpos secundários usados.
      3. Crie figuras usando imagens de projeção de intensidade máxima (MIP) de pilhas Z para canais individuais e mesclados (Figura 3).

2. Exame em mesoescala

  1. Dissecção estereoscópica
    1. Realize dissecções delicadas com foco em estruturas minúsculas ou finas, como nó atrioventricular, artéria do nó atrioventricular e plexo nervoso cardíaco (escala submilimétrica a milimétrica) com uma lâmpada de mesa de aumento com pinça, telescópios cirúrgicos ou estereomicroscópio.
  2. Microtomografia computadorizada
    NOTA: A tomografia computadorizada é realizada após perfusão e fixação por pressão e em qualquer estágio da dissecção usando uma tomografia por emissão de micropósitrons (PET)/tomografia computadorizada (Figura 4).
    1. Aqueça a fonte de raios-X da TC por 25 minutos antes da imagem da amostra.
    2. Coloque a amostra de coração na base do scanner.
    3. Mova a base do scanner para uma posição horizontal de 544 mm e uma posição vertical de 14 mm para centralizar o coração no campo de visão (FOV) da TC.
    4. Adquira a imagem de TC a 80 kVp, 150 μA, com 720 projeções durante o tempo de varredura de 1 minuto a uma resolução espacial de 200 μm.
    5. Reconstrua os dados de TC com um campo de visão de 12 cm x 12 cm x 10 cm e uma matriz de 600 x 600 x 500 voxels e salve como um arquivo DICOM.

3. Exame em escala macro

  1. Perfusão e fixação por pressão
    NOTA: Os autores modificam as técnicas de perfusão e fixação por pressão descritas anteriormente e as aplicam aos corações humanos sem falha rejeitados para transplante 14,19,20,21.
    1. Use bombas de alto fluxo para fixação de perfusão. Use 100% de etanol14, 4% de PFA ou 10% de formalina para o fixador.
      NOTA: O coração é recuperado com a aorta ascendente, o tronco pulmonar e ambas as veias cavas e as veias pulmonares ressecadas o mais distalmente possível e entregues na solução23 da Universidade de Wisconsin.
    2. Use duas cânulas cirúrgicas 20-24 Fr para perfusão cardíaca direita e esquerda. Para perfusão cardíaca direita, canule a veia cava superior e coloque uma ventilação no tronco pulmonar ou na artéria pulmonar com seringas plásticas de 12 a 30 mL cortadas pela metade com pontas Luer-Lock presas a torneiras de três vias.
    3. Oclua a veia cava inferior e a outra artéria pulmonar com barbante depois de colocar uma seringa de plástico meio cortada de tamanho apropriado ou tubo de centrífuga de 1,5-5,0 mL.
      1. Para perfusão anterógrada do coração esquerdo, canule uma das veias pulmonares e coloque uma abertura na extremidade distal cortada da aorta com as seringas plásticas de 12 a 30 mL meio cortadas com pontas Luer-Lock presas a torneiras de três vias.
      2. Para a perfusão retrógrada do coração esquerdo, canule um dos ramos do arco aórtico e coloque uma abertura em outro ramo do arco aórtico. Coloque as pontas das cânulas em ambos os ventrículos.
    4. Ocluir outros orifícios do recipiente com barbante depois de inserir uma seringa de plástico meio cortada de tamanho apropriado ou um tubo de microcentrífuga de 1,5-5,0 mL. Use uma gaze fina para cobrir a parte de inserção das seringas/tubos/cânulas para evitar vazamentos e deslizamentos. Corrija grandes vazamentos usando sutura, bandagem ou aglomeração. Pequenos vazamentos são permitidos.
    5. Suspenda o coração em um recipiente de plástico.
    6. Conecte o tubo de plástico macio 22-24 Fr a cada cânula e insira a outra extremidade do tubo no recipiente cheio de fixador.
    7. Circule o fixador pelos circuitos do coração direito e esquerdo usando uma bomba de alto fluxo ajustada em aproximadamente 100-300 mL / min para o coração direito e 200-400 mL / min para o coração esquerdo para atingir aproximadamente 20 mmHg no ventrículo direito e 80 mmHg no ventrículo esquerdo, respectivamente.
    8. Manter a perfusão a 4 °C durante 24 h.
    9. Lave o coração com 0,01 mol / L PBS por 30 min com agitação quatro vezes.
    10. Armazene o coração em 0,01 mol / L PBS / 0,02% de azida de sódio a 4 ° C.
      NOTA: A fixação por pressão-perfusão só é eficaz para um coração fresco, não para um coração recuperado de um cadáver embalsamado.
  2. Dissecção macroscópica
    1. Realize a dissecção progressiva com registros fotográficos em cada estágio da dissecação.
    2. Para manter a relevância clínica, preste atenção especial para evitar distorcer/deformar quaisquer estruturas para manter a morfologia fisiológica do coração.
    3. Estruturas alvo de imagens usando orientação clinicamente relevante, como orientação oblíqua anterior direita.
  3. Fotografia
    1. Coloque o coração fixo e perfundido sob pressão em um tripé com uma plataforma montada com vários pinos e a capacidade de girar 360o.
    2. Fotografe o coração usando uma câmera reflex digital de lente única (Figura 5)24 enquanto usa vários painéis de luz de diodo emissor de luz colocados nos suportes C e um amplo pano de fundo preto de edredom.
    3. Fotografe usando a lente com uma distância focal longa (200 mm) para uma distância de trabalho de 4-6 pés para minimizar a distorção do assunto14.
  4. Anaglyphs
    1. Para exibir imagens anaglíficas, reconstrua um par de fotografias ou imagens renderizadas em volume a partir de conjuntos de dados de TC com uma diferença de 10° no ângulo de rotação no plano horizontal.
    2. Converta um conjunto dessas imagens bidimensionais (2D), chamadas de estereograma, em anáglifos usando freeware16.
    3. Para visualizar um anáglifo, use óculos vermelhos/cianos.
  5. Fotogrametria
    NOTA: A fotogrametria é a ciência aplicada de gerar uma reconstrução tridimensional renderizada na superfície a partir de várias fotografias bidimensionais tiradas em ângulos variados17.
    1. Suspenda a amostra em C-Stands ou coloque-a na mesa giratória para obter centenas de fotografias multidirecionais com um smartphone.
    2. Gere o modelo 3D no formato FBX usando software disponível comercialmente.
  6. Tomografia computadorizada (TC)
    NOTA: A tomografia computadorizada pode ser realizada após perfusão e fixação por pressão e em qualquer estágio da dissecção.
    1. Suspenda a amostra de coração de uma barra colocada na parte superior do recipiente. Para evitar que o coração balance durante o exame, apoie a base do coração com pinos de plástico fixados no fundo do recipiente. Assim, o ar servirá como um contraste negativo.
    2. Realize a tomografia computadorizada usando um tomógrafo de linha multidetectores disponível comercialmente com os seguintes parâmetros: tensão do tubo de 120 kV, corrente do tubo de 800-900 mA e rotação do pórtico de 280 ms. O produto de duração da dose é geralmente 500-1200 mGy.cm.
    3. Reconstrua os dados da imagem axial usando os seguintes parâmetros: uma espessura de seção, 0,6 mm; um intervalo incremental, 0,3 mm; um campo de visão, o menor possível (geralmente 100-200 mm); e uma matriz, 512 × 512.
  7. Dissecação virtual
    1. Analise as imagens de tomografia computadorizada usando software disponível comercialmente para gerar imagens de dissecção virtual.
      NOTA: A dissecção virtual é uma modificação do processo de renderização de volume em que o foco é deslocado para as paredes das câmaras e vasos cardíacos18. Nesse processo, o limite manual praticamente remove a câmara aprimorada dos conjuntos de dados originais.
    2. Visualize as paredes, septos e válvulas sem realce com dissecção virtual para produzir imagens semelhantes à dissecção macroscópica. Ao contrário da dissecção macroscópica das amostras cardíacas, os planos de corte durante a dissecção virtual são praticamente ilimitados. Quase qualquer visualização pode ser recriada para visualizar as estruturas de interesse conforme necessário.
  8. Impressão 3D
    1. Abra o arquivo compatível da amostra de coração no software da impressora 3D.
    2. Use o perfil de 0,10 mm Fast DETAIL para as configurações de impressão na impressora 3D e reduza a velocidade de impressão para 20 mm/s. Ative Gerar material de suporte.
    3. Use o perfil de filamento TPU para "Configurações de filamento" na impressora 3D.
    4. Use o profile do bocal Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 para "Configurações da impressora" na impressora.
    5. Após a conclusão do fatiamento, salve o arquivo BGCODE em uma unidade flash USB para impressão 3D.
    6. Use o filamento TPU de 1,75 mm para imprimir em 3D a amostra do coração humano. Antes da impressão 3D, secar o filamento TPU durante 6 h com um secador de filamentos.
    7. Para reduzir a tensão do filamento durante a impressão 3D, coloque o carretel de filamento em um suporte de carretel com um rolamento embutido para facilitar a rotação do carretel de filamento. Realize a impressão 3D usando uma impressora 3D disponível comercialmente com uma chapa de aço revestida a pó texturizada.
    8. Remova cuidadosamente os materiais de suporte quando a impressão 3D estiver concluída.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exames em microescala
A aplicação de limpeza de tecido permite a aquisição de imagens de grandes volumes de tecido em 3D usando microscopia confocal. No coração, podem ser visualizados gânglios contendo neurônios cardíacos e o padrão neural da inervação miocárdica (Figura 2). A Figura 3 mostra uma imagem confocal do miocárdio do ventrículo esquerdo humano imunomarcado para nervos e células musculares lisas. Observa-se que os vasos sanguíneos atravessam o miocárdio e numerosas fibras nervosas são identificadas, tanto em associação com os vasos sanguíneos quanto independentemente deles.

Exames de meso e macroescala
Ao usar etanol absoluto para perfusão e fixação por pressão de 24 horas, a cor natural da amostra é branqueada, o tecido é desidratado25 e a elasticidade é significativamente reduzida. Por outro lado, após a fixação com PFA e formalina, a cor natural e a elasticidade são notavelmente mantidas. Por essas razões, o PFA ou formalina é usado principalmente como fixador preferido.

A Figura 6 mostra imagens representativas da dissecção macroscópica, dissecção virtual, modelo de polígono STL e impressão tridimensional. A Figura 7 mostra imagens representativas dos anáglifos criados a partir de imagens de dissecação bruta e virtual. A percepção de profundidade pode ser obtida com óculos anaglíficos. O modelo fotogramétrico único capturado pode ser observado de quase todas as direções usando software disponível comercialmente e demonstra características anatômicas complexas relevantes para procedimentos cardíacos transcateter de rotina. Ao aplicar essas técnicas ao coração preparado com perfusão e fixação por pressão, as informações tridimensionais sobre o coração podem ser quase eternamente retidas digital ou fisicamente e compartilhadas sem limites. A Figura 8 mostra as impressões 3D em escala de 50% replicadas dos corações dissecados rejeitados para transplante.

figure-results-1
Figura 1: Fluxograma do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Seção desobstruída do átrio direito humano. (A) Visão oblíqua posterior direita de um átrio direito humano com o plexo ganglionar do átrio direito (RAGP) dissecado para limpeza do tecido. (B) Amostra RAGP antes e depois da limpeza do tecido. (C) Projeção de intensidade máxima de uma porção limpa com iDISCO+ de RAGP humano demonstrando gânglios (pontas de setas) imunocorados com o produto gênico da proteína marcadora pan-neuronal 9.5 (PGP9.5). As barras de escala são 1 cm (A), 5 mm (B) e 500 μm (C). Essa figura é adaptada de Hanna et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Lâminas imunomarcadas do ventrículo esquerdo humano. Imagem confocal da fatia do miocárdio do ventrículo esquerdo humano imunocorada com o produto do gene da proteína marcadora pan-neuronal 9.5 (PGP9.5) e o marcador de células musculares lisas α actina de músculo liso (αSMA). A autofluorescência muscular é visível usando a linha de laser de 488 nm (verde). A barra de escala é de 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Imagem microtomografia computadorizada de amostras cardíacas. (A) Configuração de microtomografia computadorizada para imagens de amostras cardíacas. (B) Interface do usuário para imagens de microtomografia computadorizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Configuração de estúdio fotográfico no UCLA Cardiac Arrhythmia Center. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Dissecção macroscópica (canto superior esquerdo), dissecção virtual (canto superior direito), modelo de polígono STL (canto inferior esquerdo) e imagens de impressão tridimensional (canto inferior direito) do complexo valvar aórtico e mitral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-7
Figura 7: Anaglifos de dissecção macroscópica (esquerda) e dissecção virtual (direita) do complexo valvar aórtico e mitral. Óculos anaglíficos (vermelho/ciano) são necessários para obter a percepção de profundidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-8
Figura 8: Impressão tridimensional de amostras de coração. (A) Configuração de impressora tridimensional (3D) para impressão 3D de amostra de coração com um filamento TPU. (B) Impressões 3D representativas do coração produzidas usando os métodos descritos neste estudo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente estudo demonstra o pipeline abrangente para analisar amostras obtidas de corações humanos inteiros. Os resultados representativos mostram exames anatômicos em micro a macroescala realizados rotineiramente em um único coração. Como uma amostra de coração humano é extremamente preciosa, uma abordagem em várias escalas é ideal e eficaz para não desperdiçar nenhuma parte da amostra aplicando vários protocolos para vários fins, incluindo descoberta em pesquisa científica, melhoria de procedimentos clínicos e educação anatômica com manutenção de correlação anatômica no contexto de todo o coração.

Em relação ao exame em microescala, a imunomarcação e a microscopia podem ser aplicadas para entender a citoarquitetura de espécimes cardíacos humanos. Aqui, é demonstrada a aplicação da limpeza tecidual e da imuno-histoquímica para estudar a neuroanatomia cardíaca em escala celular. O uso dessas técnicas é útil na caracterização do sistema nervoso cardíaco e dos padrões de inervação miocárdica em relação a estruturas de interesse, como o sistema de condução cardíaco e as câmaras cardíacas. Embora seja alcançada uma excelente resolução espacial, o uso da microscopia confocal, particularmente para espécimes com limpeza de tecido, é demorado. A microscopia Lightsheet pode ser usada para reduzir o tempo de aquisição de imagens em detrimento da resolução espacial.

Em relação ao exame em meso a macroescala, a resolução espacial dos microtomógrafos em nossa instituição varia de 10 a 200 μm. O tamanho da amostra é limitado a 20 mm para uma varredura de 10 μm e 120 mm para uma varredura de 100-200 μm. Os scanners de microtomografia computadorizada na instituição dos autores não podem acomodar todo o coração. Assim, na instituição dos autores, uma tomografia de todo o coração requer o uso de um tomógrafo clínico com resolução espacial de 600 μm, embora os avanços tenham permitido o desenvolvimento de microtomógrafos que podem obter imagens de todo o coração2. O desenvolvimento tecnológico, como a TC de contagem de fótons, certamente expandirá outras possibilidades. A melhoria da resolução espacial do arquivo STL deve ser o primeiro passo para melhorar ainda mais a qualidade da impressão 3D. O custo mais alto da impressão 3D limita a aplicação da técnica à prática clínica de rotina. As imagens de fotogrametria geradas a partir de qualquer aplicativo de smartphone são fáceis de desenvolver e de qualidade aceitável, mas exigirão sistemas mais sofisticados, mas caros e demorados para melhorar a resolução26. Para visualizar em 3D, a realidade estendida com capacete dedicado27,28 e monitores holográficos29 são ferramentas adicionais, mas também são limitadas pelo custo mais alto.

Em resumo, por meio de análises estruturais abrangentes em escalas microscópicas e macroscópicas, a anatomia em microescala de cada estrutura e sua contribuição funcional podem ser compreendidas no contexto de todo o coração. Junto com o desenvolvimento de imagens de alta resolução, a distância entre a anatomia em micro e macroescala está se expandindo drasticamente. Especialistas em análise microscópica eletrônica de cardiomiócitos podem não estar familiarizados com o número de folhetos mitrais e vice-versa. Para facilitar a compreensão abrangente da morfologia cardíaca, os cientistas devem continuar explorando mais detalhes de cada árvore, mantendo a visão panorâmica de toda a floresta.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos às pessoas que doaram seus corpos para o avanço da educação e da pesquisa. Somos gratos à Fundação OneLegacy, que formou a base para a obtenção de corações de doadores para pesquisa. Também somos gratos a Anthony A. Smithson e Arvin Roque-Verdeflor, do Centro de Imagens de Pesquisa Translacional da UCLA (Departamento de Radiologia), por seu apoio na aquisição de dados de TC. Este projeto foi apoiado pelo Projeto UCLA Amara Yad. Somos gratos aos Drs. Kalyanam Shivkumar e Olujimi A. Ajijola por estabelecer e manter um pipeline do coração humano para pesquisa. Agradecemos à nossa Gerente de Operações de Pesquisa, Amiksha S. Gandhi, por sua dedicação em apoiar nossos projetos. Este trabalho foi possível graças ao apoio das bolsas do NIH OT2OD023848 & P01 HL164311 e Leducq 23CVD04 para Kalyanam Shivkumar, o Prêmio de Desenvolvimento de Carreira da American Heart Association 23CDA1039446 para PH e o Projeto UCLA Amara-Yad (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project). O scanner GNEXT microPET/CT usado neste estudo foi financiado por uma bolsa de instrumentação compartilhada do NIH para pesquisa animal (1 S10 OD026917-01A1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x Solução salina tamponada com fosfatoSigma-AldrichP3813
3D ViewerMicrosoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgGJackson ImmunoResearch Laboratories713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lenteNikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Anticorpo Cy3Sigma-AldrichC6198
(100x EDTA Buffer, pH 8.0)Abcamab93680
Anti-PGP9.5 (produto gênico de proteína 9.5)Abcamab108986
Anti-TH (tirosina hidroxiilase)Abcamab1542
Anti-VAChT (transportador vesicular de acetilcolina)Sistemas sinápticos139 103
Éter benzílicoSigma-Aldrich108014
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA4503-10G
NinjaTekde 1,75 mm
, 22 mm x 30 mm, n.º 1.5VWR48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-165-152
DiclorometanoSigma-Aldrich270997-100ML
DimetilsulfóxidoSigma-AldrichD8418-500ML
Etanol, 100%Decon laboratórios2701
GlicinaSigma-AldrichG7126-500G
GNEXT PET/CTSOFIE Biosciences
Sal de heparina sódica da mucosa intestinal suínaSigma-AldrichH3149-50KU
HistodenzSigma-AldrichD2158-100G
Solução de peróxido de hidrogênioSigma-AldrichH1009-500ML
Software de imagemZeissZEN (edição preta)
Software de imagemOxford InstrumentsImaris 10
iSpacerSunjin LabsiSpacer 3mm
KIRI EngineKIRI Innovation
Microscópio confocal de varredura a laserZeissLSM 880
LEAD-2 - Vertical & Bomba Peristáltica Multi-canaisLONGER
Lightview XL Brightech
Metanol (Certificado ACS)Fischer ScientificA412-4
Nikon D850Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4NinjaTek
Soro de burro normalJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Original Prusa MK4 impressora 3DPrusa Research
Caneta PAPAbcamab2601
Paraformaldeído, 32%Microscopia Eletrônica Ciências15714-S
Polycam Polycam
Anticorpo
PrusaSlicer 2.7.1Prusa Research
SARA-Enginepita4 mobile LLC
Anticorpo secundário ScaniverseNiantic
SlowFade Gold Antiface MountantInvitrogenS36936
Azida de sódio, 5% (p/v)Ricca Chemical Company7144.8-32
SOMATOM Definição ASTelescópios Siemens Healthcare
Designs para
SZ61OLYMPUS
StereoPhoto MakerFree ware desenvolvido por Masuji Suto
Superfrost Plus Lâminas de Microscópio, Pré-limpasFisher Scientific12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ML
XyleneSigma-Aldrich534056-4L
Ziostation2Ziosoft, AMIN
Tampão de recuperação de antígeno Filamento de impressora 3D Cheetah (95A), lamínula primário Standard Field Surgi-Spec,  Sistema de Estereomicroscópio de Visão

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tawara, S. Das reizleitungssystem des säugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie über das atrioventrikularbündel und die purkinjeschen fäden. Jena: Gustav fischer. , https://wellcomecollection.org/works/gnxjxg9e (1906).
  2. Stephenson, R. S., et al. High-resolution 3-dimensional imaging of the human cardiac conduction system from microanatomy to mathematical modeling. Sci Rep. 7 (1), 7188(2017).
  3. Kawashima, T., Sato, F. First in situ 3D visualization of the human cardiac conduction system and its transformation associated with heart contour and inclination. Sci Rep. 11 (1), 8636(2021).
  4. Bojsen-Moller, F., Tranum-Jensen, J. Whole-mount demonstration of cholinesterase-containing nerves in the right atrial wall, nodal tissue, and atrioventricular bundle of the pig heart. J Anat. 108, Pt 3 375-386 (1971).
  5. Zhao, Y., et al. Ganglionated plexi and ligament of marshall ablation reduces atrial vulnerability and causes stellate ganglion remodeling in ambulatory dogs. Heart Rhythm. 13 (10), 2083-2090 (2016).
  6. Chung, W. H., et al. Ischemia-induced ventricular proarrhythmia and cardiovascular autonomic dysreflexia after cardioneuroablation. Heart Rhythm. 20 (11), 1534-1545 (2023).
  7. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: Comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  8. Saburkina, I., Pauziene, N., Solomon, O. I., Rysevaite-Kyguoliene, K., Pauza, D. H. Comparative gross anatomy of epicardiac ganglionated nerve plexi on the human and sheep cardiac ventricles. Anat Rec (Hoboken). 306 (9), 2302-2312 (2023).
  9. Hoagland, D. T., Santos, W., Poelzing, S., Gourdie, R. G. The role of the gap junction perinexus in cardiac conduction: Potential as a novel anti-arrhythmic drug target. Prog Biophys Mol Biol. 144, 41-50 (2019).
  10. Aksu, T., Gopinathannair, R., Gupta, D., Pauza, D. H. Intrinsic cardiac autonomic nervous system: What do clinical electrophysiologists need to know about the "heart brain". J Cardiovasc Electrophysiol. 32 (6), 1737-1747 (2021).
  11. Hanna, P., et al. Innervation and neuronal control of the mammalian sinoatrial node a comprehensive atlas. Circ Res. 128 (9), 1279-1296 (2021).
  12. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10, 1944(2019).
  13. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Mcalpine, W. Heart and coronary arteries: An anatomical atlas for clinical diagnosis, radiological investigation, and surgical treatment. Springer-verlag. , ISBN 13: 9783540069850 (1975).
  15. Mori, S., Shivkumar, K. Stereoscopic three-dimensional anatomy of the heart: Another legacy of dr. Wallace a. Mcalpine. Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).
  16. Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures. Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).
  17. Sato, T., Hanna, P., Ajijola, O. A., Shivkumar, K., Mori, S. Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy. JACC Case Rep. 21, 101937(2023).
  18. Tretter, J. T., Gupta, S. K., Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy. J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30(2020).
  19. Thomas, A. C., Davies, M. J. The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation. Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).
  20. Glagov, S., Eckner, F. A., Lev, M. Controlled pressure fixation apparatus for hearts. Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).
  21. Iaizzo, P. A. The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy. Europace. 18, suppl 4 163-172 (2016).
  22. Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue. J Vis Exp. (201), e65850(2023).
  23. Tripathy, S., Das, S. K. Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges. Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).
  24. Mori, S., Shivkumar, K. Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1). Cardiotext. , (2022).
  25. Crosado, B., et al. Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand. Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).
  26. Titmus, M., et al. A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry. J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).
  27. Silva, J. N. A., Southworth, M., Raptis, C., Silva, J. Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine. JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).
  28. Maresky, H. S., et al. Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education. Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).
  29. Mori, S., Shivkumar, K. Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display. Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Heart AnatomyThree Dimensional ImagingTissue ClearingConfocal MicroscopyMicro CT ScanningPressure Perfusion FixationImmunohistochemical StainingGross DissectionCardiac Innervation3D Heart Model

Related Articles