Artigo de método

Estudando os efeitos de poluentes ambientais inalados na função olfativa em camundongos

DOI:

10.3791/66818

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13 de setembro de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, Qingdao University

Neste artigo

Resumo

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Este artigo fornece uma descrição detalhada do teste de alimentos enterrados e do experimento de discriminação de odor social para avaliar os efeitos da exposição a poluentes ambientais inalados na função olfativa em camundongos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O comprometimento olfatório é um problema significativo de saúde pública e prediz de forma independente o risco de doenças neurodegenerativas. A exposição a poluentes ambientais inalados pode prejudicar o olfato; Assim, há uma necessidade urgente de métodos para avaliar os efeitos da exposição a poluentes ambientais inalados sobre o olfato. Os camundongos são modelos ideais para experimentos olfativos devido ao seu sistema olfativo altamente desenvolvido e características comportamentais. Para avaliar os efeitos da exposição a poluentes ambientais inalados na função olfativa em camundongos, é fornecido um teste detalhado de alimentos enterrados e um experimento de discriminação de odor social, incluindo a preparação do experimento, a seleção e construção de instalações experimentais, o processo de teste e índices de tempo. Enquanto isso, equipamentos de cronometragem, detalhes operacionais e o ambiente experimental são discutidos para garantir o sucesso do ensaio. O sulfato de zinco é usado como tratamento para demonstrar a viabilidade da abordagem experimental. O protocolo fornece um processo operacional simples e claro para avaliar os efeitos dos poluentes ambientais inalados na função olfativa em camundongos.

Introdução

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O comprometimento olfatório emergiu como uma preocupação de saúde pública notável e está independentemente associado a um risco aumentado de doenças neurodegenerativas. Essa condição pode afetar adversamente o bem-estar geral, contribuir para o desenvolvimento de sintomas depressivos e resultar em uma diminuição da qualidade de vida. Seu impacto é observado de forma proeminente na percepção alterada da comida, impedimento na comunicação social e aumento de sentimentos negativos1. Vários fatores, incluindo doença nasossinusal, infecção do trato respiratório superior e lesão cerebral traumática, têm sido considerados contribuintes para o comprometimento olfativo em humanos2. Notavelmente, poluentes ambientais inaláveis, como PM2.5, estimados em 2% a 16%, entram no corpo através do ar inspirado, atravessam a cavidade nasal e atingem regiões específicas dedicadas ao olfato, onde são depositados 3,4,5,6,7. Descobertas recentes indicam que poluentes ambientais inaláveis, incluindo PM2.5 e amônia, podem de fato prejudicar os neurônios sensoriais olfativos 8,9,10. No entanto, é necessária uma validação adicional para verificar se esse dano leva diretamente à disfunção olfativa. Portanto, uma avaliação meticulosa dos efeitos dos poluentes ambientais inaláveis na função olfativa é de particular importância.

Atualmente, vários laboratórios de pesquisa empregam camundongos como um modelo alternativo de vertebrados para experimentos comportamentais destinados a compreender mudanças na função olfativa11 , 12 , 13 , 14 . Os camundongos foram escolhidos como o sistema modelo preferido para investigar a comunicação química dos vertebrados e exibem uma notável sensibilidade olfativa crucial para o forrageamento e a comunicação social15. Além disso, a variedade de ferramentas em constante evolução para observar e influenciar o comportamento do camundongo tornou esta espécie excepcionalmente atraente para pesquisas sobre a função olfativa16.

Neste estudo, empregamos o teste de alimentos enterrados e o experimento de discriminação de odor social para avaliar o comprometimento olfativo em um modelo de camundongo exposto a poluentes ambientais inaláveis. Para aumentar a precisão da avaliação, optou-se pelo método mais representativo para avaliar a função olfativa. Refinamos sistematicamente esse método para garantir simplicidade e clareza, permitindo-nos avaliar a extensão da disfunção olfativa induzida por poluentes ambientais inaláveis de forma eficaz.

Protocolo

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Foram utilizados camundongos C57BL/6J machos (idade: 6-8 semanas; peso: 20-22 g) para todos os testes comportamentais. Os camundongos foram submetidos a condições estacionárias (ou seja, temperatura, 23 ± 1 °C; umidade, 55% ± 5% e ciclo claro-escuro de 12/12 h com luzes acesas às 7:00). Todos os testes comportamentais foram realizados entre 10:00 e 17:00. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Comitê Profissional de Experimentos com Animais da Universidade de Qingdao. Após um período de aclimatação de 1 semana, todos os camundongos foram expostos a poluentes ambientais inaláveis.

1. Exposição a poluentes

  1. Administração intranasal por instilação
    1. Dissolva os poluentes ambientais inaláveis em uma solução salina a 0,9%. Use solução de sulfato de zinco a 5% uma vez, o que demonstrou causar disfunção olfativa17. Para camundongos controle, administre solução salina normal a 0,9%.
    2. Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% 18 e avaliar a profundidade da anestesia usando o reflexo de pinça do dedo do pé. Aplique pomada veterinária nos olhos do rato para evitar o ressecamento. Posicione o mouse de costas em uma superfície inclinada, com a cabeça voltada para baixo.
    3. Usando uma pistola de pipetagem, administre 10 μL da solução em uma narina do camundongo, permitindo inalar naturalmente a solução para a cavidade nasal.
    4. Para garantir o bem-estar do camundongo e evitar qualquer desconforto potencial, repita a inalação para a outra narina após um intervalo de 10 minutos.
    5. Aos 3 dias após a administração intranasal por instilação em camundongos, realize o teste de alimentos enterrados.

2. Teste de alimentos enterrados

  1. Realize a privação de alimentos 18-24 h antes do teste, removendo todos os pellets de ração do funil de alimentos da gaiola doméstica. Troque os materiais de cama para ratos. Não remova a garrafa de água.
  2. Disponha a mesa de operação conforme descrito abaixo.
    1. 1 h antes do início do teste, leve a gaiola contendo os camundongos para a sala de cirurgia para descansar.
    2. Organize a sala de cirurgia durante este período. Use e marque gaiolas de mouse padrão de PVC transparente como A, pois elas criam um ambiente familiar. Use e marque a gaiola de teste como B, que é uma gaiola de esquilo padrão de PVC transparente. Marque a gaiola comum usada para colocar os camundongos após o experimento como gaiola C.
    3. Cubra as gaiolas A e B com 3 cm de material de cama e meça-as com uma régua. Disponha as gaiolas lado a lado, com uma distância de 0,5 m entre cada gaiola (Figura 1).
    4. Defina a área experimental como uma área com raio de 2 m, sendo o centro o centro das gaiolas. Defina a área fora do alcance de 2 m como a área de observação.
    5. Mantenha a gaiola C e as gaiolas contendo camundongos não testados o mais longe possível da área experimental.
  3. Registre o tempo para encontrar comida conforme descrito abaixo.
    1. Selecione uma posição aleatoriamente na gaiola B, enterre a comida 1 cm abaixo da superfície da cama e alise a superfície da cama.
    2. Coloque o mouse na gaiola A por 4 min. Transfira os mouses para a gaiola B no final do tempo, ligue o dispositivo de vídeo e retorne à área de observação.
    3. Quando o mouse pegar o bloco de comida com a pata dianteira, pare a gravação do vídeo. Em alguns casos, os ratos podem ser vistos comendo com a cabeça inclinada sobre a comida. Esse comportamento também indica sucesso na tentativa, mesmo que o camundongo não esteja segurando a comida com a pata dianteira.
    4. Registre dados. Registre o tempo desde o contato com o tapete na parte inferior da gaiola B até que o alimento seja encontrado para cada camundongo. Se os ratos não encontrarem comida após 4 minutos, registre o tempo de descoberta como um tempo de atraso de 240 s.
    5. Coloque o mouse na gaiola C após o teste.
    6. Retire a ração da gaiola B e coloque-a em um saco lacrado. Substitua a comida na gaiola B e teste o próximo mouse após trocar o material da cama, conforme descrito abaixo.
      1. Para os ratinhos alojados na mesma gaiola, testar com o mesmo conjunto de materiais de cama na gaiola B. Para ratos em gaiolas diferentes, limpe a gaiola com álcool e substitua os materiais de cama.
    7. Adicione ração e água aos ratos após o experimento. Realize o experimento de discriminação de odor social 1 dia depois.
      NOTA: As máscaras precisam ser usadas durante todo o processo e as luvas transparentes precisam ser trocadas após cada mouse terminar o experimento para evitar o odor cruzado o máximo possível. Mantenha a amplitude dos movimentos o menor possível para evitar o estresse do mouse.

3. Experiência social da discriminação do odor

  1. Coleta de urina
    1. Colete separadamente a urina de camundongos machos e camundongos fêmeas sexualmente maduros e alíquota em tubos em volumes iguais19. Embalar em tubos de microcentrífuga de 2 mL com 300 μL de urina em cada tubo.
    2. Armazene as amostras a -80 ° C até o uso. Agite os tubos para distribuir uniformemente a amostra após o descongelamento. Não descongele e congele a amostra repetidamente.
  2. Disponha a mesa de operação conforme descrito abaixo.
    1. 1 h antes do início do teste, leve a gaiola contendo os camundongos para a sala de cirurgia para descansar.
    2. Organize a sala de cirurgia durante este período, conforme descrito nas etapas 2.2.2-2.2.5.
  3. Registre o tempo para encontrar a urina conforme descrito abaixo.
    1. Faça uma ranhura com fita adesiva ao redor de cada um dos dois lados largos da gaiola B grande o suficiente para conter o tubo de microcentrífuga contendo 300 μL de urina masculina e feminina. Coloque os tubos e mantenha as duas tampas dos tubos fechadas por enquanto.
    2. Coloque o mouse na gaiola A e defina uma contagem regressiva para 4 min. Abra os dois tubos da gaiola B no final do intervalo.
    3. Transfira o mouse para a posição central da gaiola B, à mesma distância dos dois tubos, ligue o equipamento de gravação de vídeo e recue suave e lentamente para a área de observação.
    4. Quando o rato cheira a parede/boca do tubo ou mesmo dentro do tubo, o tubo é cheirado com sucesso. Neste momento, pressione o cronômetro e registre a hora como a hora de cheirar o tubo (M s), depois continue a registrar o tempo de residência (X s) até que o mouse se afaste do tubo.
    5. Continue cronometrando o tempo cheirando o outro tubo. Quando o rato cheira a parede/boca do tubo ou mesmo dentro do tubo, o tubo é cheirado com sucesso. Pressione o cronômetro e registre o tempo que levou para cheirar o outro tubo (N s) e, em seguida, continue a registrar o tempo de residência (Y s) até que o mouse se afaste do tubo.
    6. Transfira o mouse para a gaiola C no final do experimento.
    7. Troque os tubos de urina e o material de cama da gaiola B após cada teste com camundongos. Coloque a urina de rato usada em um saco limpo de acordo com o sexo.
    8. Troque as luvas e teste o próximo mouse conforme descrito acima.
  4. Realize o experimento em um laboratório sem odor óbvio. Evite produtos pessoais que emitam odores fortes. Use luvas e máscaras durante todo o procedimento para evitar ao máximo a passagem de odores. Mantenha a amplitude dos movimentos o menor possível para evitar o estresse do mouse.

Resultados

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Poluentes ambientais inaláveis prejudicam a função olfativa em camundongos. O zinco atmosférico emitido por incineradores e veículos motorizados demonstrou ser um poluente inalado que pode resultar em inflamação pulmonar alérgica20. O sulfato de zinco é considerado um dos compostos típicos que causam disfunção olfativa21. Portanto, usamos sulfato de zinco como tratamento para expor camundongos por instilação intranasal e testamos usando o teste de comida enterrada e o experimento de discriminação de odor social. No teste de enterro de comida, demorou mais de 240 s para os camundongos expostos ao sulfato de zinco encontrarem a comida em comparação com o grupo controle (Figura 2). Camundongos privados de comida com olfato normal normalmente encontram a comida enterrada em 1 minuto. Quando os camundongos desenvolveram disfunção olfativa, demorou mais para encontrar comida ou mesmo não conseguiram encontrar comida. Em comparação com o grupo de controle, os camundongos do grupo exposto demoraram mais para encontrar comida, com alguns casos em que não conseguiram encontrar comida em 240 segundos, indicando danos à função olfativa.

Resultados semelhantes foram observados no experimento de discriminação de odores sociais. Em camundongos expostos ao sulfato de zinco, nem a urina masculina nem a feminina puderam ser inaladas durante o tempo de observação definido (Figura 3A). Além do tempo definido, os camundongos expostos ao sulfato de zinco cheiraram brevemente a urina feminina e masculina, mas o tempo de inalação foi significativamente menor do que o dos camundongos controle (Figura 3B). Quando volumes iguais de urina feminina e masculina são apresentados ao mesmo tempo, os camundongos machos geralmente preferem a urina feminina22. Os camundongos do grupo exposto precisaram de mais tempo para distinguir entre urina feminina e masculina ou nem conseguiram distinguir entre elas. Especificamente, em comparação com o grupo de controle, os camundongos do grupo exposto passaram mais tempo cheirando a urina e passaram menos tempo nas proximidades da urina.

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Figura 1: Layout da tabela de operação. As gaiolas A e B foram mantidas a uma distância de 0,5 m. O equipamento de gravação de vídeo foi controlado acima da gaiola B pelo suporte do telefone celular, e o campo de vídeo foi ajustado para gravar o ambiente interno da gaiola. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Resultados do teste de alimentos enterrados. Análise estatística dos camundongos controle e dos camundongos expostos ao sulfato de zinco em busca de alimento. Os camundongos do grupo de controle encontraram comida dentro de 30 s, e os camundongos expostos ao sulfato de zinco encontraram comida por mais de 240 s, o que foi calculado como 240 s. Um teste t de amostra independente foi usado para comparar as diferenças entre os dois grupos. Os dados são apresentados como DP ± médio (n = 3 camundongos por grupo); ** p < 0,01. Se algum animal não encontrasse o alimento após 240 s, o tempo para encontrar o alimento era registrado como 240 s, como foi o caso de todos os animais tratados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Experimento de discriminação de odor social. (A) Análise estatística dos camundongos controle e camundongos expostos ao sulfato de zinco em busca de urina. Os camundongos do grupo de controle encontraram urina em 30 segundos, e os camundongos expostos ao sulfato de zinco passaram mais de 240 segundos procurando urina feminina ou masculina, que foi contada como 240 segundos. Se algum animal não encontrou o frasco de urina após 240 s, o tempo para encontrar o frasco foi registrado como 240 s, como foi o caso de todos os animais tratados. (B) O tempo de residência em contato com a urina foi analisado estatisticamente para camundongos controle e camundongos expostos ao sulfato de zinco. Um teste t de amostra independente foi usado para comparar as diferenças entre os dois grupos. Os dados são apresentados em média ± DP (n = 3 camundongos por grupo); ** p < 0,01, * p < 0,5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Este artigo apresenta dois protocolos fundamentais projetados para a avaliação rápida do comprometimento olfativo em camundongos. Poluentes ambientais inaláveis variados resultam em níveis distintos de disfunção olfativa em camundongos. O teste de alimentos enterrados é empregado para avaliar a capacidade de detectar odores voláteis, enquanto o experimento de discriminação de odores sociais avalia a capacidade do animal de discernir e diferenciar vários odores sociais. O protocolo aqui serve para avaliar os efeitos tóxicos dos poluentes ambientais na função olfativa.

Poluentes ambientais inalados, incluindo ozônio, amônia e escapamento de diesel, possuem odores que podem influenciar a percepção olfativa dos camundongos durante a inalação da amostra 23,24. É crucial observar que a realização de experimentos comportamentais em camundongos imediatamente após a conclusão da exposição pode potencialmente produzir resultados falso-negativos22. Para resolver essa preocupação, implementamos medidas para aumentar a confiabilidade experimental. Especificamente, as gaiolas foram completamente limpas e os materiais de cama foram substituídos após o período de exposição. Posteriormente, foram realizados experimentos comportamentais com intervalo de 24 h pós-exposição22. Este ajustamento processual visa garantir resultados precisos e significativos.

No experimento de enterro de alimentos, um parâmetro-chave foi o tempo que os ratos levaram para localizar alimentos escondidos. Vale a pena notar que camundongos estressados tendem a exibir atividade aumentada e foco reduzido durante o teste, o que pode levar a resultados falsos positivos 25,26,27,28. Portanto, é imperativo garantir que os camundongos permaneçam calmos e não sejam submetidos a estresse indevido durante a fase de teste. Para evitar qualquer interferência potencial, os camundongos foram transferidos de seu alojamento para a área de teste 1 h antes do experimento. Este passo foi dado para permitir que os ratos se aclimatassem e reduzissem o estresse. Para facilitar o registro preciso do tempo, o gravador de vídeo foi ativado quando os camundongos foram introduzidos na gaiola experimental B e, em seguida, os observadores imediatamente se retiraram para a área de observação. Os observadores foram posicionados a uma distância ideal de 2 m da gaiola, garantindo uma observação clara sem causar perturbação. Os critérios para identificar a descoberta bem-sucedida de alimentos incluíram casos em que os ratos usaram as patas dianteiras ou inclinaram a cabeça sobre a comida. Ambos os comportamentos foram considerados indicativos de encontrar comida, alinhando-se a padrões amplamente aceitos19. Nos casos em que vários camundongos dentro do mesmo grupo de dose precisaram de testes, foi garantido que eles não fossem devolvidos à sua gaiola de criação original, mas temporariamente colocados em uma gaiola C comum. Somente depois de testar todos os camundongos na mesma gaiola, eles retornaram coletivamente ao seu alojamento original. Dado o odor potencial dos alimentos testados, foram tomadas precauções para armazená-los em sacos herméticos com antecedência e fechá-los novamente ou colocá-los em recipientes herméticos após o uso. Essas medidas foram implementadas para manter a integridade das condições experimentais e garantir resultados confiáveis.

Em experimentos de discriminação de odor social, é essencial utilizar amostras de urina derivadas de camundongos sexualmente maduros19. A determinação da maturidade sexual é baseada na idade dos camundongos, um parâmetro que varia entre diferentes linhagens de camundongos. Após a coleta, recomenda-se armazenar a urina masculina e feminina separadamente na geladeira a -80 °C. Estudos anteriores empregaram cronômetros para fins de cronometragem. No entanto, esse método tinha limitações, como os observadores estarem situados a uma distância considerável da gaiola experimental, levando a possíveis problemas, como observações pouco claras e tempo impreciso 19,22,29. Para enfrentar esses desafios, aprimoramos os procedimentos de cronometragem incorporando equipamentos de vídeo em vez de cronômetros. Essa modificação não apenas facilita a aquisição de dados mais precisos, mas também permite a coleta de dados de vários grupos experimentais.

Nesses experimentos, o dispositivo de vídeo foi usado para registrar o comportamento dos camundongos, o que tem a vantagem de reduzir a taxa de quadros do vídeo e permitir que os observadores registrem o tempo de várias atividades comportamentais dos camundongos com mais precisão, compensando a deficiência de que os observadores não puderam observar o comportamento dos camundongos na área de observação. No entanto, a desvantagem de usar equipamentos de gravação de vídeo é que o tempo de análise aumentará. No final do experimento, precisávamos assistir ao vídeo novamente para registrar o tempo das várias atividades comportamentais de cada rato. Quando o número de camundongos é grande, é necessário analisar o vídeo de cada camundongo, o que aumentará a carga de trabalho do laboratório.

Os resultados da pesquisa indicam que vários poluentes ambientais inaláveis podem afetar negativamente a função olfativa. Este artigo apresenta uma abordagem rápida, descomplicada e razoavelmente precisa para avaliar a toxicidade olfativa associada a poluentes ambientais inaláveis. Este método é crucial na realização de avaliações de risco para disfunção olfativa atribuída a poluentes ambientais em seres humanos.

Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82204088, 82273669) e pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong, China (ZR2021QH209).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5-10 μ L  micropipeta ajustávelEppendorf, Alemanha3123000225Instilação intranasal
solução salina a 0,9%Solarbio7647-14-5Dissolver poluentes
Sulfato de zinco anidroMacklin7733-02-0Expor camundongos
Tubo de centrífuga (2 mL)Biosharp IncorporatedBS-20-MColocar urina
Balança eletrônicaChangzhou Ohaus Co. EX125DZHPeso de anestésicos e poluentes
GraphPadPrism Software GraphPad8.0.1análise estatística
Detector de poeira portátilTSI  IncorporadoDuatTrak figure-materials-18532Ratos expostos à inalação Equipamento de
gravação de vídeoApple Inc.iPhone 6s PlusO tempo de atividade dos mouses foi registrado
Mixer de vórticeHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.Vórtice-5 Solução de mistura

Referências

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