Este protocolo descreve o método para reduzir a ingestão dietética de ácido fólico ou colina em camundongos fêmeas antes da gravidez com o objetivo de investigar o impacto da dieta materna nos resultados de saúde da prole.
Artigo de método
Modificando os níveis de ácido fólico ou colina na dieta materna para estudar o impacto das deficiências nos resultados de saúde da prole
Neste artigo
Resumo
Resumo
A nutrição materna durante a gravidez e lactação desempenha um papel importante no neurodesenvolvimento da prole. O metabolismo de um carbono (1C), que gira em torno do ácido fólico e da colina, bem como de outras vitaminas do complexo B, desempenha um papel fundamental durante o fechamento do tubo neural do feto em desenvolvimento. No entanto, o impacto dessas deficiências nutricionais maternas durante a gravidez nos resultados de saúde da prole após o nascimento permanece relativamente indefinido. Além disso, as deficiências dietéticas maternas em ácido fólico ou colina podem afetar outros resultados de saúde na prole - tornando este um modelo valioso. Este protocolo tem como objetivo delinear o procedimento para induzir uma deficiência no metabolismo de 1C em camundongos fêmeas por meio de modificações na dieta. As fêmeas são colocadas em dietas no desmame, até 2 meses de idade, por 4-6 semanas antes do acasalamento e permanecem na dieta durante a gravidez e lactação. Os descendentes dessas fêmeas podem ser avaliados quanto a resultados de saúde. As fêmeas podem ser usadas várias vezes para gerar descendentes, e os tecidos das fêmeas podem ser coletados para medir as medições de metabólitos 1C. Este protocolo fornece uma visão geral de como induzir deficiências dietéticas maternas em ácido fólico ou colina para estudar os resultados de saúde da prole.
Introdução
A nutrição materna durante a gravidez e lactação desempenha um papel vital no desenvolvimento da prole. O metabolismo de um carbono (1C) é uma rede metabólica chave que integra sinais nutricionais com biossíntese, homeostase redox e epigenética. O ácido fólico e a colina são componentes centrais do 1C que desempenham um papel importante no fechamento do tubo neural. É amplamente recomendado para as mulheres suplementarem com ácido fólico e colina durante a idade fértil1. Embora o papel crítico do ácido fólico no desenvolvimento fetal esteja claramente estabelecido, os mecanismos subjacentes envolvidos permanecem obscuros. Recomenda-se que as mulheres em idade fértil tomem ácido fólico antes de engravidar, pois o fechamento do tubo neural ocorre no primeiro trimestre2. Mães grávidas com deficiência de ácido fólico ou outros componentes do 1C, como a colina, têm maior incidência de partos com defeitos do tubo neural devido à alta demanda de síntese de nucleotídeos e outros processos exigidos pelo início do período gestacional3.
O impacto a longo prazo de dietas maternas deficientes na ingestão do metabolismo 1C nos resultados de saúde da prole é pouco compreendido. Pesquisas de nossos laboratórios, bem como de outros, demonstraram que dietas maternas deficientes em ácido fólico ou colina realmente afetam os resultados de saúde da prole após AVC isquêmico usando modelos pré-clínicos 4,5,6. O impacto da dieta materna também foi demonstrado em estudos clínicos em que foram descritos volumes cerebrais menores e níveis alterados de metilação7. A teoria das Origens do Desenvolvimento da Saúde e da Doença (DOHaD) sugere que as doenças crônicas prospectivas são programadas no útero 8,9, e a dieta materna desempenha um papel importante.
Este protocolo foi desenvolvido para delinear o método para alterar o consumo dietético de 1C em camundongos fêmeas antes da gravidez, com o objetivo de examinar os efeitos da nutrição materna nos resultados de saúde da prole.
Protocolo
Este protocolo foi aprovado e todos os animais foram utilizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Meio-Oeste (Protocolo 2983). Camundongos C57BL / 6J fêmeas, 2 meses de idade (peso corporal, ~ 20 g), foram usados neste estudo. Em geral, camundongos fêmeas em idade reprodutiva podem ser usados10. Para garantir que os efeitos da ninhada sejam evitados, várias fêmeas precisam ser usadas para cada dieta11. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação experimental
- Obtenha ácido fólico ou dieta deficiente em colina de fabricantes comerciais de alimentos para roedores. Consulte a Tabela 1 para obter a lista detalhada de micro e macronutrientes, incluindo a quantidade exata de ácido fólico ou colina necessária em dietas deficientes.
NOTA: Uma dieta de controle correspondente também precisa ser solicitada; os detalhes estão listados na Tabela 1. Essas dietas foram baseadas em AIN93G e continham os nutrientes recomendados para roedores10. - Em colaboração com o fabricante, determine a coloração das dietas, pois isso pode ajudar na distribuição de dietas corretas durante os estudos experimentais. Este estudo usou verde para dietas deficientes em ácido fólico, amarelo para colina e branco para dieta controle. Todos eles são facilmente distinguíveis.
NOTA: Não há restrições ao consumo de água. A água não contém ácido fólico, colina ou outros metabólitos 1C.
2. Induzir deficiência dietética de ácido fólico ou colina
- Antes de colocar as fêmeas em dietas, pesar todos os animais. Isso será chamado de peso da linha de base.
- Dependendo da configuração individual da gaiola de laboratório (ventilada ou não, consulte a Tabela de Materiais), substitua ou complete os pellets de dieta especial para cada gaiola algumas vezes por semana. Não encha demais os hoopers de alimentos da gaiola com dietas especiais, pois isso pode levar à deterioração dos pellets quando eles interagem com a saliva dos animais e à deterioração com o tempo.
NOTA: Certifique-se de que o estoque de dieta seja armazenado de acordo com as diretrizes do fabricante e usado antes da data de validade. - Mantenha os camundongos fêmeas nas dietas por 4-6 semanas antes do acasalamento.
- Introduza os camundongos machos nas gaiolas das fêmeas para o acasalamento. Certifique-se de que os machos sejam introduzidos em gaiolas femininas depois que as fêmeas estiverem em dietas especiais por um período mínimo de 4-6 semanas. Introduza um macho em uma gaiola fêmea por um a vários dias.
NOTA: No presente estudo, os machos foram mantidos com as fêmeas durante toda a duração do experimento (~ 4 meses) para aumentar o número de filhotes produzidos, uma vez que o acasalamento em camundongos pode ocorrer após o nascimento12. Mulheres após 6 meses de idade não foram utilizadas em nenhum estudo. - Verifique as fêmeas diariamente em busca de um tampão copulatório, o que indica que ocorreu reprodução.
- Colete as medidas de peso das ratas todas as semanas para acompanhar sua saúde e estado de gravidez.
NOTA: É seguro para as fêmeas serem mantidas na dieta para gravidez (~ 21 dias) e lactação (~ 21 dias). - Quando os filhotes forem desmamados da mãe (~ 21 dias após o nascimento), coloque-os em uma dieta deficiente em ácido fólico e colina, bem como em uma dieta controle. Para obter detalhes, consulte a seção de resultados.
NOTA: Ao estudar o impacto da dieta materna nos resultados de saúde da prole, recomenda-se que a prole seja colocada em uma dieta controle após o desmame. A dieta controle deve conter quantidades adequadas de vitaminas e nutrientes para a sobrevivência. - Ao final do estudo (determinando os pesos semanais para monitorar a saúde geral das fêmeas mantidas em dietas com ácido fólico ou deficientes em colina), eutanasiar as mães usando uma overdose de CO2 (dosagem, deslocamento de volume de 10% a 30% por minuto, seguindo protocolos aprovados institucionalmente) e coletar os tecidos (etapa 3) para confirmar as deficiências alimentares.
3. Coleta de tecido para as medições de 1C e os metabólitos relacionados
NOTA: Ao sacrificar animais, é importante certificar-se de que os animais não respondam a um beliscão no dedo do pé. Uma vez que os animais não respondem, a dissecção dos tecidos pode começar. O tecido que será dissecado precisa ser determinado previamente13,14, e os materiais precisam ser preparados. Esses materiais incluem tubos para armazenamento, ferramentas de dissecação apropriadas e gelo seco ou nitrogênio líquido.
- Coletar sangue e tecidos hepáticos seguindo protocolos previamente publicados 15,16.
- Colete ~ 500-1000 μL de sangue usando uma punção cardíaca seguindo as etapas abaixo. Para detalhes, consulte Parasuraman et al.17:
- Faça um corte em forma de V na pele e na parede abdominal. Mova os órgãos abdominais para o lado e insira uma agulha através do diafragma e no coração para coletar a amostra de sangue.
- Coloque as amostras de sangue em tubos revestidos com EDTA. O tubo pode ser deixado à temperatura ambiente até que todas as amostras tenham sido coletadas.
- Centrifugar as amostras de sangue numa centrifugadora a 1000-2000 x g durante 7 min a 4 °C para isolar o plasma sanguíneo. Colete o plasma em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e armazene-o a -80 ° C até a análise.
- Para remover o fígado, abra o abdome e disseque todo o fígado seguindo o protocolo publicado anteriormente15.
- Depois de remover o fígado da cavidade corporal, corte o tecido em pedaços menores com uma pequena tesoura e congele-os com gelo seco ou nitrogênio líquido.
NOTA: Os pedaços de tecido congelados podem ser colocados em um tubo de microcentrífuga criogênica de 1,5 mL e mantidos a -80 ° C até a análise.
- Depois de remover o fígado da cavidade corporal, corte o tecido em pedaços menores com uma pequena tesoura e congele-os com gelo seco ou nitrogênio líquido.
- Colete ~ 500-1000 μL de sangue usando uma punção cardíaca seguindo as etapas abaixo. Para detalhes, consulte Parasuraman et al.17:
Resultados
O foco deste estudo foi investigar o impacto das deficiências alimentares maternas no ácido fólico ou colina nos resultados de saúde da prole. Os pesos semanais foram determinados para monitorar a saúde geral das fêmeas mantidas em dietas com ácido fólico ou deficiência de colina. Em nosso trabalho anterior, não foram observadas alterações no peso corporal entre os grupos dietéticos maternos4. A Figura 1 mostra os pesos basais e semanais para as fêmeas mantidas em dietas controle, colina ou deficientes em ácido fólico durante as quatro semanas anteriores ao acasalamento (F (1,144,4,577) = 11,96, p = 0,196). Uma observação geral feita é que o número de descendentes nessas dietas especiais é reduzido no número de filhotes em comparação com a ração padrão de camundongos. Isso não foi determinado como estatisticamente significativo.
Quando os camundongos fêmeas são alimentados com dietas deficientes em 1C, ácido fólico ou colina, há alterações nos metabólitos nos tecidos do corpo que processam o 1C. As medições de 1C e metabólitos relacionados podem ser feitas usando uma variedade de técnicas. No presente estudo, foi utilizada cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem com cromatografia líquida de ultra-eficiência (UPLC), conforme descrito anteriormente12. Ambas as medidas hepáticas (Tabela 2) e plasmáticas (Tabela 3) de 1C para homocisteína total, S-adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomocisteína (SAH), metionina, cistationina, betaína e colina são apresentadas. Existem diferentes maneiras de medir esses metabólitos; LC-MS é apenas uma maneira.
Os dados apresentados na Tabela 2 e na Tabela 3 mostram algumas pequenas alterações nos níveis de metabólitos. As medições atuais foram feitas quando as fêmeas estavam acasalando com dietas por 6 meses. Pode ser melhor medir os metabólitos após 4 semanas ou após uma a duas rodadas de gestações. Os dados do fígado e do plasma foram analisados usando ANOVAs unidirecionais e software estatístico e gráfico. Quaisquer efeitos significativos da dieta ANOVA com as comparações de pares de Tukey, bem como comparações de pares entre a dieta controle e as dietas com deficiência de ácido fólico ou colina.
Figura 1: Peso corporal de camundongos fêmeas mantidos em dietas com um carbono suficiente e deficiente. Pesos corporais de camundongos fêmeas antes de iniciar dietas especialmente formuladas (linha de base) e, em seguida, pesos semanais por 4 semanas em dietas de controle (CD), bem como dietas deficientes em ácido fólico (FADD) e colina (ChDD). Os dados são apresentados como média + erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Metabolismo de um carbono e papéis biológicos relacionados (metilação e síntese de nucleotídeos). As enzimas são indicadas em círculos pretos. Abreviaturas: BHMT, betaína homocisteína metiltransferase; CHDH, colina desidrogenase; COMT, catecol-O-metiltransferase; DHFR, diidrofolato redutase; dTMP, monofosfato de desoxitimidina; dTTP, trifosfato de desoxitimidina; dUMP, monofosfato de desoxiuridina; dUTP, trifosfato de desoxiuridina; FR, receptor de folato; MTHFR, metilenotetrahidrofolato redutase; MTR, metionina sintase; MTRR, metionina sintase redutase; RFC, transportador de folato reduzido; SAM, S-adenosilmetionina; SAH S-adenosilhomocisteína; e TS, timidilato sintase. Esta figura é modificada de Jadavjiet al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Lista de conteúdos de micro e macronutrientes em dietas de controle do metabolismo de um carbono, ácido fólico e deficiência de colina. A dieta deficiente em ácido fólico contém 0,3 mg/kg de ácido fólico. A dieta deficiente em colina contém 300 mg / kg de bitrato de colina. Os valores são listados na tabela em destaques vermelhos entre colchetes. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Concentrações maternas de metabólitos de um carbono no tecido hepático isolado. Esses dados são adaptados de Hurley et al.4. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 3: Concentrações maternas de metabólitos de um carbono no plasma isolado. Esses dados são adaptados de Hurley et al.4. Clique aqui para baixar esta tabela.
Discussão
Durante a implementação deste protocolo em laboratórios de pesquisa, existem várias notas importantes que os pesquisadores precisam considerar antes de iniciar os experimentos. Em primeiro lugar, na fabricação de dietas, é necessário tempo suficiente para fabricar a dieta antes do início do estudo experimental. Os prazos de entrega podem variar de empresa para empresa, e o envio de dieta também precisa ser levado em consideração. Camundongos fêmeas que estão em idade reprodutiva (~ 2-2,5 meses de idade) podem ser colocados na dieta 4-6 semanas antes do acasalamento 4,6,14. Estudos anteriores usaram apenas camundongos C57Bl / 6J 4,5,6,18, mas outros grupos usaram camundongos BALB / c em estudos semelhantes19 , 20 , 21 .
A dieta fabricada usada neste estudo contém 1% de succinil sulfatiazol para ajudar a reduzir a síntese de folato pela flora intestinal; Esta é outra razão pela qual uma dieta de controle precisa ser usada, pois contém os mesmos antibióticos que estão presentes nas dietas deficientes. Uma vez que a dieta tenha sido fabricada e enviada, seu armazenamento é vital. É importante seguir as instruções do fabricante para que a dieta possa durar durante o estudo experimental. É importante observar que a ração de camundongo padrão é formulada com níveis elevados de ácido fólico e colina para apoiar a gravidez e a saúde geral das colônias de camundongos. Portanto, o uso de uma dieta controle em estudos destinados principalmente a explorar os efeitos da deficiência de ácido fólico e / ou colina precisa ser usado. Para tais estudos experimentais, recomenda-se a obtenção de dietas controle dos fabricantes com a quantidade mínima recomendada de ácido fólico (2,0 mg/kg) ou bitrate de colina (1150 mg/kg)10 (Tabela 1).
Além disso, a combinação de ácido fólico na dieta e deficiência de colina em mulheres ainda não foi tentada. Tanto o ácido fólico quanto a colina são importantes doadores de metila, e há uma alta demanda por eles durante a gravidez para o desenvolvimento da prole. Trabalhos anteriores demonstraram que o metabolismo do folato e da colina está intimamente ligado à função cerebral normal16,17. Isso também foi demonstrado por outros em outros tecidos18,19. Não se sabe se uma dieta deficiente em ácido fólico e colina produziria descendentes viáveis.
Ao considerar o desenho experimental, é importante observar que as deficiências dietéticas em 1C em homens foram relatadas como impactando negativamente os resultados de saúde da prole11. Este é um ponto importante a considerar ao colocar os machos em gaiolas com fêmeas que são alimentadas com uma dieta deficiente em ácido fólico ou colina. Neste ponto, o impacto da deficiência alimentar de curto prazo em homens permanece desconhecido.
A criação bem-sucedida de camundongos pode apresentar desafios no progresso experimental. Recomenda-se consultar a equipe de cuidados com os animais da instituição ou a literatura, incluindo fornecedores que criam camundongos com sucesso. A pesagem semanal das fêmeas ajudou a monitorar a progressão da gravidez.
O impacto a longo prazo das deficiências maternas em 1C durante a gravidez nos resultados de saúde da prole requer mais investigação 4,14. Este protocolo descreveu como induzir deficiências dietéticas maternas de ácido fólico ou colina em um modelo de camundongo, bem como como confirmá-lo. Para determinar outros marcadores potenciais de deficiências alimentares em ácido fólico ou colina, certifique-se de consultar a Figura 2 18. Este modelo experimental facilita o estudo das deficiências dietéticas maternas em ácido fólico ou colina durante a gravidez e lactação nos resultados de saúde da prole a longo prazo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de 1,5 mL | Eppendorf | ||
| C57BL/6 Camundongos Fêmeas | Charles River | 27 | Os camundongos também podem ser criados em casa. |
| Dieta Deficiente em Colina | Envigo | TD.06119 | |
| Dieta de Controle | Envigo | TD.190790 | |
| Tubos | |||
| Dieta Deficiente em Ácido Fólico | Envigo | TD.01546 | |
| GraphPad prisma | https://www.graphpad.com/features | ||
| Habitação para roedores | Produtos de Laboratório, LLC | Um GaiolaRacks ventilados e Cromatografia líquida em gaiolas-espectrometria | |
| de massa em tandem (LC-MS/MS)Sciex | , Framingham, MA | 5500 QTrap | |
| Cromatografia líquida de ultra-eficiência (UPLC) | Shimadzu, Columbia, MD, EUA | Nexera |
Referências
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Reimpressões e permissões
