Este protocolo é baseado na morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-AAD para detectar morte celular, usando a célula inteira e empregando microscopia eletrônica de varredura para observar a morfologia da membrana celular.
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Artigo de método
Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação
Neste artigo
Resumo
Resumo
A morte celular é um processo fundamental em todos os organismos vivos. O protocolo estabelece um modelo de deposição lipídica diferenciada de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) em modelo de macrófago de monócitos humanos (THP-1) para observar a morte celular. O LPS combinado com ATP é um método clássico de indução inflamatória, frequentemente usado para estudar a piroptose, mas a apoptose e a necroptose também respondem à estimulação por LPS/ATP. Em circunstâncias normais, a fosfatidilserina está localizada apenas no folheto interno da membrana plasmática. No entanto, nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, a membrana celular permanece intacta e exposta à fosfatidilserina e, nos estágios posteriores, a membrana celular perde sua integridade. Aqui, a citometria de fluxo foi usada para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-Aminoactinomicina D (AAD) para detectar a morte celular de células inteiras. Os resultados mostram que células substanciais morreram após estimulação com LPS / ATP. Usando microscopia eletrônica de varredura, observamos as possíveis formas de morte celular em células individuais. Os resultados indicam que as células podem sofrer piroptose, apoptose ou necroptose após estimulação com LPS/ATP. Este protocolo tem como foco observar a morte de macrófagos após estimulação com LPS/ATP. Os resultados mostraram que a morte celular após a estimulação de LPS e ATP não se limita à piroptose e que a apoptose e a apoptose necrótica também podem ocorrer, ajudando os pesquisadores a entender melhor a morte celular após a estimulação de LPS e ATP e escolher um método experimental melhor.
Introdução
A morte celular é um processo fisiológico fundamental em todos os organismos vivos. Nos últimos anos, estudos substanciais mostraram que a morte celular está envolvida na imunidade e no equilíbrio dentro do organismo. Estudar a morte celular nos ajuda a entender melhor o início e o desenvolvimento de doenças. Várias formas de morte celular programada foram descritas, e alguns alvos-chave nesses processos foram identificados. Piroxase, apoptose e necroptose são as três vias de morte celular programada geneticamente definidas envolvidas no equilíbrio interno e na doença1.
A piroptose é caracterizada pela formação de po....
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Protocolo
1. Linhagem celular e cultura celular
- Cultive a linha celular monocítica humana THP-1 em meio de cultura completo RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,05 mM de β-mercaptoetanol. Cultive as células a 37 ° C em ar umidificado com 5% de CO2 . Subcultura de células a cada 2-3 dias.
NOTA: THP-1 é uma célula de suspensão, selecione para alterar metade do meio para subcultura. Ao observar muitos fragmentos de células ao microscópio óptico, centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente. Ressuspenda as células no meio de cultura celular completo fresco pré-aquecido. - Use....
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Resultados
As amostras de células foram tratadas conforme descrito no protocolo e a detecção por citometria de fluxo foi feita. As células normais não podem ser coradas com Anexina V e 7-AAD (Anexina V-/7-AAD-). Nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, o PS foi exposto e ligado à anexina V, mas a membrana celular ainda estava intacta e excluiu o 7-AAD do espaço extracelular (anexina V + / 7-AAD-). Nos estágios posteriores, a membrana celular perde sua integridade, as células são coradas simultaneamente pela Anexin.......
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Discussão
Neste manuscrito, dois métodos foram usados para detectar a morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. A dupla coloração com anexina V/7-AAD foi usada, e os resultados foram analisados por citometria de fluxo da coloração global. Tal como acontece com outras análises de citometria de fluxo, um grupo de células não coradas e dois grupos de células coradas simples foram configurados para excluir resultados falsos positivos e falsos negativos. Os resultados mostram que após a estimulação com LPS.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Expressamos nossa grande gratidão a Jiayi Sun e Lu Yang do Instituto Inovador de Medicina Chinesa e Farmácia da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, pela assistência com citometria de fluxo, Cuiping Chen do Laboratório Estadual de Recursos de Medicina do Sudoeste Chinês, pela ajuda com microscopia eletrônica de varredura. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China [82104491], pela Fundação de Ciências Naturais de Sichuan [2023NSFSC0674] e pela Fundação de Ciências de Pós-Doutorado da China [2021M693789].
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de enzima pancreática a 0,25% (excluindo EDTA) | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0068 | |
| Tubo de Fundo Redondo de Poliestireno de 5 mL | CORNING | 352235 | |
| Tubo de centrífuga de 5 mL | Labgic Technology Co., Ltd. | Placa de 6 poços BS-50-M | |
| Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 220100 | ||
| Kit de análise de apoptose de anexina V-PE / 7-AAD | Absin (Shanghai) Tecnologia Biológica co.ltd | abs50007 | Anexina V-PE, 7-AAD, 5 e vezes; Tampão de ligação, solução de controle positivo de apoptose |
| incubadora de CO2 | Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd. | N / A | |
| , 100 mm | Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 230301 | |
| Celômetro K2 Contador de células fluorescentes | Nexcelom Bioscience LLC | Celômetro K2 | |
| Celómetro SD100 Câmaras de contagem | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
| Máquina centrífuga | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | L530 | |
| Chromium Alum | Guangdong Wengjiang Reagente Químico Co., Ltd. | ||
| vidros de cobertura, 9 mm | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
| Quorum Technologies | K850 | ||
| dimetil sulfóxido BOSTER | Biological Technology co.ltd | PYG0040 | |
| fixador de microscópio eletrônico | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2,5% dialdeído glutárico, 100 mM sais de fósforo |
| eletrônica | SHIMADZU | ATX124 | |
| etanol absoluto | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | citômetro de fluxo 2021033102 | |
| Becton,Dickinson and Company | FACSCanto  | ||
| software de análise de citometria de fluxo | Becton,Dickinson and Company | BD FACSDivaTM Software | |
| gelatina | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA00256 | |
| Microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo frio de alta resolução | TITACHI | Regulus 8100 | |
| linha celular monocítica humana THP-1 | Procell Life Science& Tecnologia Co., Ltd. | CL0233 | |
| microscópio invertido | Leica Microsystems Co., Ltd | DMi1 | |
| Misturador de Vórtice IR | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
| lipopolissacarídeo | Pequim Solarbio Ciência & Technology Co.,Ltd. | L8880 | LPS é derivado de Escherichia coli 055: B5 |
| Na2ATP | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | A8270 | |
| forbol-12-miristato-13-acetato | Pequim Solarbio Ciência & Technology Co.,Ltd. | P6741 | |
| salina tamponada com fosfato | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
| Pipeta | Eppendorf AG | N/A | |
| ponteiras de pipeta, 10 μ L | Servicebio Technology co.ltd | Ponteiras de pipeta T-10PL | |
| , 1 mL | Servicebio Technology co.ltd | Ponteiras de pipeta T-1250L | |
| , 200 μ L | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
| RPMI-1640 meios de cultura completos | Procell Life Science& Tecnologia Co., Ltd. | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0,05mM β-mercaptoetanol + 1% P/S |
| RPMI-1640 meios de cultura | Xangai BasalMedia Tecnologias Co., LTD. | ||
| revestidor de pulverização catódica | |||
| HH-1 |
Referências
- Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
- Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 ....
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Reimpressões e permissões
