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Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação

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DOI:

10.3791/66831

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3 de maio de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Este protocolo é baseado na morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-AAD para detectar morte celular, usando a célula inteira e empregando microscopia eletrônica de varredura para observar a morfologia da membrana celular.

Resumo

A morte celular é um processo fundamental em todos os organismos vivos. O protocolo estabelece um modelo de deposição lipídica diferenciada de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) em modelo de macrófago de monócitos humanos (THP-1) para observar a morte celular. O LPS combinado com ATP é um método clássico de indução inflamatória, frequentemente usado para estudar a piroptose, mas a apoptose e a necroptose também respondem à estimulação por LPS/ATP. Em circunstâncias normais, a fosfatidilserina está localizada apenas no folheto interno da membrana plasmática. No entanto, nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, a membrana celular permanece intacta e exposta à fosfatidilserina e, nos estágios posteriores, a membrana celular perde sua integridade. Aqui, a citometria de fluxo foi usada para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-Aminoactinomicina D (AAD) para detectar a morte celular de células inteiras. Os resultados mostram que células substanciais morreram após estimulação com LPS / ATP. Usando microscopia eletrônica de varredura, observamos as possíveis formas de morte celular em células individuais. Os resultados indicam que as células podem sofrer piroptose, apoptose ou necroptose após estimulação com LPS/ATP. Este protocolo tem como foco observar a morte de macrófagos após estimulação com LPS/ATP. Os resultados mostraram que a morte celular após a estimulação de LPS e ATP não se limita à piroptose e que a apoptose e a apoptose necrótica também podem ocorrer, ajudando os pesquisadores a entender melhor a morte celular após a estimulação de LPS e ATP e escolher um método experimental melhor.

Introdução

A morte celular é um processo fisiológico fundamental em todos os organismos vivos. Nos últimos anos, estudos substanciais mostraram que a morte celular está envolvida na imunidade e no equilíbrio dentro do organismo. Estudar a morte celular nos ajuda a entender melhor o início e o desenvolvimento de doenças. Várias formas de morte celular programada foram descritas, e alguns alvos-chave nesses processos foram identificados. Piroxase, apoptose e necroptose são as três vias de morte celular programada geneticamente definidas envolvidas no equilíbrio interno e na doença1.

A piroptose é caracterizada pela formação de poros de membrana e pela liberação de conteúdo celular. Caspases ou granzimas ativadas clivam gasderminas para separar seus domínios N-terminais, que então oligomerizam, ligam-se à membrana e formam poros 2,3,4. O poro da gasdermina fornece um canal de secreção atípico através das membranas celulares, resultando em respostas celulares a jusante, incluindo liberação de conteúdo e influxo de íons 2,3,4. Em última análise, as células eventualmente experimentam ruptura da membrana plasmática e lise piroptótica facilitada pela ninjurina-15. Na apoptose, Bax e Bak ativados formam oligômeros na membrana externa mitocondrial e liberam o citocromo C, que é regulado por um equilíbrio entre proteínas pró-apoptóticas e antiapoptóticas da família BCL-2, caspases iniciadoras (caspase-8, -9 e -10) e caspases efetoras (caspase-3, -6 e -7)1,6,7. As alterações morfológicas da apoptose incluem bolhas de membrana, encolhimento celular, fragmentação nuclear, condensação da cromatina e formação de corpos apoptóticos 6,8. A serina/treonina-proteína quinase 1 (RIPK3) que interage com o receptor e a quinase de linhagem mista semelhante ao domínio (MLKL) são dois componentes centrais a jusante do mecanismo necroptótico1. RIPK3 recruta e fosforila MLKL, p-MLKL oligomeriza, associa-se à membrana celular, inicia perfurações de membrana, causa influxo de íons, aumenta a osmolaridade intracelular e, eventualmente, a ruptura celular 6,9. Gasderminas e MLKL ligam-se à membrana plasmática e medeiam piroptose e necroptose, respectivamente, enquanto BAX/BAK medeia a apoptose ligando-se à membrana externa das mitocôndrias6.

Embora cada via tenha mecanismos e resultados específicos, eles levam a alterações semelhantes na membrana celular. Em circunstâncias normais, a fosfatidilserina (PS) está localizada apenas no folheto interno da membrana plasmática. No entanto, nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, o PS será exposto, fora da membrana plasmática. A caspase-3/caspase-7 ativa as famílias TMEM16 e XKR, o que leva a uma membrana celular assimétrica e externaliza o PS durante a apoptose10. O influxo de Ca2+ mediado por Gasdermin D e MLKL leva à perda da simetria da bicamada fosfolipídica na membrana celular e à exposição do PS. A exposição ocorre antes da perda da integridade da membrana celular 11,12. Com base nas alterações semelhantes na membrana desses três tipos de morte celular programada, usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V / 7-Aminoactinomicina D (7-AAD) para detectar a morte celular. A anexina V, uma proteína de ligação a fosfolipídios dependente de cálcio, tem alta afinidade pelo PS, que pode servir como uma sonda sensível para detectar o PS exposto na superfície da membrana plasmática13. 7-AAD é uma mancha de ácido nucleico que não pode passar por toda a membrana celular. É semelhante ao iodeto de propídio (PI), um corante de ácido nucleico comumente usado. Eles têm características de fluorescência semelhantes, mas o 7-AAD tem um espectro de emissão mais estreito e menos interferência com outros canais de detecção. Devido a essas semelhanças, não é suficiente distinguir entre piroptose, apoptose e necroptose. Usamos citometria de fluxo para detectar a morte celular de células inteiras. Um segundo método é usado para capturar a membrana celular usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) para observar as possíveis formas de morte celular em células individuais.

Estabelecemos um modelo de deposição lipídica diferenciada de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) em modelo de macrófagos de monócitos humanos (THP-1) para observar a morte celular. Este protocolo se concentra em observar a morte celular em vez de investigar mecanismos.

Protocolo

1. Linhagem celular e cultura celular

  1. Cultive a linha celular monocítica humana THP-1 em meio de cultura completo RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,05 mM de β-mercaptoetanol. Cultive as células a 37 ° C em ar umidificado com 5% de CO2 . Subcultura de células a cada 2-3 dias.
    NOTA: THP-1 é uma célula de suspensão, selecione para alterar metade do meio para subcultura. Ao observar muitos fragmentos de células ao microscópio óptico, centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente. Ressuspenda as células no meio de cultura celular completo fresco pré-aquecido.
  2. Use células (nas passagens 4-10) na fase de crescimento logarítmico para todos os experimentos. Quando as células estão em boas condições e fase de crescimento logarítmico, elas são redondas, brilhantes, densas e sem aglomerados e fragmentos de células ao microscópio óptico a 100 x.

2. Diferenciação de células THP-1

  1. Prepare uma solução de estoque de PMA com uma concentração de 1 mM (dissolva 1 mg de PMA em 1,62 mL de dimetilsulfóxido). Diluir a solução-mãe de PMA com meio de cultura celular completo até obter uma concentração final de trabalho de 100 nM.
  2. Recolher as células da placa de cultura para um tubo de centrifugação estéril de 10 ml. Centrifugue a 300 x g por 3 min à temperatura ambiente, ressuspenda as células com 3 mL de meio de cultura completo contendo PMA.
  3. Abra o contador de células e o software de contagem. Pipetar 20 μL de suspensão de células para a placa do contador de células e insira-o na placa do contador de células. Clique em Preview B1, gire o botão na parte inferior direita do instrumento e ajuste a distância focal para tornar as células com centro brilhante com contornos claros no software. Clique em Contar para iniciar a contagem.
  4. Com base nos resultados da contagem, use meio de cultura completo contendo PMA para ajustar a densidade celular para 1 x 106 células / mL. Células de sementes em uma placa de 6 poços, incubar a placa por 24 h a 37 ° C e 5% de CO2 antes de iniciar o tratamento adicional.

3. Tratamento de células THP-1

  1. Prepare uma solução estoque de LPS com uma concentração de 1 mg / mL (dissolva 1 mg de LPS em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS)). Diluir a solução-mãe de LPS com meio isento de soro até obter uma concentração final de trabalho de 1 μg/ml. Preparar uma solução-mãe de ATP de Na2com uma concentração de 500 mM (dissolver 0,3026 g de ATP em 1 ml de PBS).
  2. Aspire o meio contendo PMA dos poços e lave com PBS 1x. Adicione meio sem soro ao grupo de controle e meio sem soro contendo LPS ao grupo modelo. Incubar a placa durante 6 h a 37 °C + 5% de CO2 antes de prosseguir com o tratamento adicional.
  3. Após 6 h, adicionar a solução-mãe de ATP ao grupo de modelos até uma concentração final de trabalho de 500 nM. Incubar a placa durante 45 min a 37 °C + 5% CO2 antes de prosseguir.

4. Análise por citometria de fluxo (método 1)

  1. Preparação de amostras experimentais
    1. Semeie e incube as células em placas de 6 poços de acordo com a etapa 2. Estabeleça quatro grupos de controle sem tratamento: um controle sem coloração, dois controles de coloração simples (um para cada mancha) e um controle de coloração dupla. Estabeleça um grupo de tratamento e trate de acordo com a etapa 3.
    2. Após o tratamento, aspirar todo o sobrenadante dos poços e lavar com PBS 2x. Adicione 500 μL de tripsina a 0,05% (não EDTA) a cada poço e incube na incubadora por 30 s.
    3. Adicione 1 mL de meio de cultura completo RPMI-1640 a cada poço para impedir o descolamento da célula e colete as células no tubo de 5 mL. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.
    4. Adicione 1 mL de PBS para ressuspender as células. Coloque os tubos com células em banho-maria a 37 °C durante 3 min. Centrifugue todas as amostras a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.
    5. Dilua 200 μL de tampão de ligação 5x com 800 μL de água destilada para tampão de ligação 1x. Adicione 100 μL de tampão de ligação 1x para ressuspender as células e transfira as células para o tubo de 5 mL.
    6. Adicione 5 μL de solução de anexina V-PE a um tubo de células do grupo controle por 10 min e 5 μL de solução de 7-AAD a outro tubo de células do grupo controle por 5 min (como controles de coloração simples separadamente). Agite suavemente cada tubo para misturar, corante e incubar as amostras em temperatura ambiente protegida da luz. Adicione 400 μL de PBS a cada tubo e vore suavemente para encerrar a incubação.
    7. Adicione 5 μL de solução de Anexina V-PE aos tubos restantes e incube por 5 min em temperatura ambiente. Agite suavemente cada tubo para misturar, corante e incubar as amostras em temperatura ambiente protegida da luz. Após 5 min, adicione 5 μL de solução de 7-AAD por 5 min em temperatura ambiente. Adicione 400 μL de PBS a cada tubo e vortex suavemente para encerrar a incubação.
    8. Filtrar a suspensão celular com uma malha de nylon de 35 μm que faz parte dos tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 ml. Coloque o tubo no gelo e aguarde o teste. Misture suavemente antes de testar e insira-o no instrumento.
  2. Citometria de fluxo
    1. Use citômetro de fluxo de classificação de células ativado por fluorescência para teste. Abra o software de análise de dados do citômetro de fluxo e confirme o desempenho do detector e do laser. Clique no citômetro e escolha Inicialização de fluidos, aguarde o sistema estar pronto. Exclua as bolhas da câmara de fluxo clicando em Citômetro > Modos de limpeza > Célula de fluxo de desgaseificação.
    2. Clique em Experimento, selecione em sequência Nova pasta, Experimento, Espécime, Tubo e Editar nome. Uma seta em forma pentagonal na frente do tubo, fica verde quando acende.
    3. Clique no ícone do Citômetro FACSCelesta (um ícone de tecla de atalho), selecione Parâmetro e, em seguida, selecione Sinal FSC, SSC e PE . Clique no ícone de Planilha Global (um ícone de tecla de atalho) para estabelecer o histograma PE. Para o citómetro de fluxo utilizado neste estudo, utilizar PE para a anexina V a 586 nm e traçar uma plotagem no eixo X; PerCP-Cy5.5 para 7-AAD a 700 nm e plotagem no eixo Y.
    4. Insira a amostra de controle não corada primeiro no instrumento. Clique no ícone de Painel de Aquisição (um ícone de tecla de atalho), adquira um mínimo de 10.000 eventos da população desejada. Exclua detritos usando uma porta (P1) em um gráfico de pontos FSC-A e SSC-A. Ajuste a taxa de fluxo para velocidade média e registre dados. Ajuste a tensão para colocar a população de células na diagonal do histograma FSC/SSC e clique em Reiniciar. Ajuste a taxa de fluxo para velocidade média e registre dados.
    5. Clique em Próximo tubo, execute os controles de coloração simples da Anexina V e 7-AAD para ajustar a compensação. Execute os tubos restantes e colete dados.

5. Imagem SEM (Método 2)

  1. Preparação de amostras experimentais
    1. Semeie e incube as células em placas de 6 poços de acordo com a etapa 2 e trate de acordo com a etapa 3.
    2. Após o tratamento, aspire todo o sobrenadante dos poços e lave 2x com PBS. Adicione 500 μL de tripsina a 0,05% (não EDTA) a cada poço e incube na incubadora por 30 s.
    3. Adicione 1 mL de meio de cultura completo RPMI-1640 a cada poço para impedir o descolamento da célula e colete as células no tubo de 5 mL. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.
    4. Fixe as células com 500 μL de fixador de microscópio eletrônico (dialdeído glutárico a 2,5%, sais de fósforo 100 mM) por 2 h à temperatura ambiente, seguido de durante a noite a 4 ° C.
    5. Prepare a solução de alúmen de cromo: Adicione 1,0 g de gelatina a 100 mL de água ultrapura, aquecimento em banho-maria a 70 ° C e mexa uniformemente. Adicione 0,05 g de alúmen de cromo, mexa uniformemente e filtre com papel de filtro. Mergulhe a lamínula limpa em solução de alúmen de crómio durante 2 h a 37 °C e seque-a num forno a 37 °C para utilização posterior.
      NOTA: O objetivo é evitar o descolamento celular durante o experimento.
    6. Colete as células da solução fixa. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente. Adicione 100 μL de PBS e sopre suavemente as células. Deixe cair a suspensão da célula na lamínula e deixe repousar por 5 min. Aspire todo o sobrenadante e lave 3x com PBS por 5 minutos de cada vez.
      NOTA: A operação deve ser realizada suavemente para evitar o descolamento da célula. Não agite vigorosamente, mova-se lentamente e adicione líquido lentamente ao longo da parede.
    7. Adicione 500 μL de fixação de ácido ósmico a 1% por 1 hora. Aspire todo o sobrenadante e lave 3x com PBS por 5 minutos de cada vez.
    8. Desidratar as amostras sucessivamente em uma série de concentrações de etanol (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) por 15 min por solução de EtOH.
      NOTA: Os vidros de cobertura podem ser mantidos em 100% EtOH por vários dias a 4 °C, mas devem secar o mais rápido possível para evitar desidratação excessiva.
    9. Ligue o secador de ponto crítico, abra o tanque de CO2 , resfrie a câmara a 10 °C. Embrulhe rapidamente a amostra com papel de filtro quando a pressão da câmara for de 0 psi e coloque-a na câmara.
    10. Abra a válvula de entrada, observe através da janela de observação de CO2 , aumente o nível de CO2 do líquido entre as duas linhas vermelhas (não exceda o limite superior), feche a válvula de entrada. Mergulhe a amostra por 10 min. Abra as válvulas de admissão e escape simultaneamente para equalizar o CO2 por 1 min (o COlíquido 2 desloca o EtOH). Feche a válvula de escape para elevar o nível de CO2 do líquido para a posição especificada, feche a válvula de admissão.
    11. Defina a temperatura para 35 °C e a pressão a 1250 psi. Assim que a temperatura e a pressão se estabilizarem, despressurize a 100 psi/min. Retire a amostra quando a pressão da câmara for zero e desligue o instrumento.
    12. Monte as amostras em suportes de amostras de alumínio SEM usando fita condutora. Empregue um revestidor de pulverização catódica para cobrir as amostras com uma camada (2-5 nm) de ouro.
  2. Imagiologia
    1. Use SEM de emissão de campo frio de alta resolução para geração de imagens. Defina a tensão de aceleração do SEM para 3 kV. Defina a distância de trabalho para 10 mm. Defina a ampliação para 1.000x para observar o panorama. Defina a ampliação para 5.000x e 20.000x para localizar a membrana plasmática e obter a imagem da amostra.
      NOTA: O processo de visualização de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA via MEV é semelhante a outros tipos de células e tecidos e depende dos instrumentos utilizados. A referência14 fornece um protocolo SEM detalhado com vídeos de acompanhamento.

Resultados

As amostras de células foram tratadas conforme descrito no protocolo e a detecção por citometria de fluxo foi feita. As células normais não podem ser coradas com Anexina V e 7-AAD (Anexina V-/7-AAD-). Nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, o PS foi exposto e ligado à anexina V, mas a membrana celular ainda estava intacta e excluiu o 7-AAD do espaço extracelular (anexina V + / 7-AAD-). Nos estágios posteriores, a membrana celular perde sua integridade, as células são coradas simultaneamente pela Anexina V e 7-AAD, apresentando resultados duplamente positivos (Anexina V+/7-AAD+). As células necróticas foram coradas apenas com 7-AAD (Anexina V-/7-AAD+). A Figura 1 mostra que após a estimulação com LPS/ATP, as células da região Q2 aumentaram significativamente, indicando morte celular.

Usamos MEV para capturar a superfície da membrana plasmática, observando diretamente as características da membrana de uma única célula. A Figura 2A mostra as células de controle, a Figura 2B-D mostra as células após a estimulação com LPS / ATP. Observamos células com características de piroptose, incluindo sangramento de membrana e ruptura de membrana (Figura 2B), células com características apoptóticas, incluindo sangramento de membrana e encolhimento celular (Figura 2C), e células com características de necroptose, incluindo inchaço celular e ruptura de membrana (Figura 2D).

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Figura 1: Detecção de coloração dupla de Anexina V / 7-AAD usando citometria de fluxo. (A) Coloração negativa de Anexina V e negativa de 7-AAD (Q4), coloração dupla positiva de Anexina V e negativa de 7-AAD (Q3), coloração positiva de Anexina V e 7-AAD positiva (Q2) e coloração negativa de Anexina V e 7-AAD positiva (Q1). (B) Dados quantitativos para (A). Os dados são apresentados como média ± DP (n=3), teste t não pareado, **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagens de microscopia eletrônica de varredura de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. (A) Grupo controle, ampliação de 5.000x/20.000x. (B, C, D) O grupo LPS/ATP mostra sangramento de membrana, ruptura de membrana (↑), inchaço celular (↑) e encolhimento celular (↑) com aumento de 5.000x/20.000x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Neste manuscrito, dois métodos foram usados para detectar a morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. A dupla coloração com anexina V/7-AAD foi usada, e os resultados foram analisados por citometria de fluxo da coloração global. Tal como acontece com outras análises de citometria de fluxo, um grupo de células não coradas e dois grupos de células coradas simples foram configurados para excluir resultados falsos positivos e falsos negativos. Os resultados mostram que após a estimulação com LPS/ATP, várias células perderam a integridade da membrana, indicando que a morte celular pode ter ocorrido. Este método de detecção nos permite avaliar a morte celular de células inteiras. Vale ressaltar que a dupla coloração com Anexina V/7-AAD não é suficiente para distinguir entre piroptose, apoptose e necroptose. Nos estágios iniciais dessas três formas, o PS será exposto fora da membrana plasmática e a coloração com Anexina V é positiva. A integridade da membrana é perdida durante o estágio final dessas três formas, e os resultados da coloração mostram coloração duplamente positiva. Portanto, usamos o MEV para observar melhor as possíveis formas de morte celular que podem ocorrer.

Na apoptose, ocorre a formação de poros BAX / BAK na membrana externa mitocondrial, subsequente encolhimento celular e bolhas da membrana celular. A necroptose emprega MLKL para abrir os poros da membrana celular, enquanto o sinal de piroptose ativa a gasdermina para formar poros na membrana celular. Vale ressaltar que tanto a piroptose quanto a necroptose são acompanhadas por ruptura da membrana celular na fase final. No entanto, os poros da gasermina são muito maiores do que os poros da MLKL, portanto, os poros da gasdermina não têm seletividade iônica. As células necroptóticas exibem edema significativo na morfologia15. Em última análise, eles terminam em ruptura da membrana. Independentemente da via de sinalização a montante da ativação da permeabilidade da membrana celular, as alterações na membrana celular acompanham essas três formas de morte celular. Usamos o SEM para observar melhor a membrana celular, o que fornece uma maneira intuitiva de examinar a morte celular. Observamos as características da piroptose, incluindo bolhas de membrana e ruptura da membrana, e necroptose, incluindo inchaço celular e ruptura da membrana, consistentes com características estudadas por pesquisadores anteriores15. Observamos bolhas de membrana e encolhimento celular, consistentes com as características de apoptose estudadas por pesquisadores anteriores16.

Em estudos anteriores, a combinação de LPS e ATP foi frequentemente usada para induzir piroptose. Curiosamente, observamos características de apoptose e necroptose. Embora todas as três formas possam ocorrer na morte celular induzida por LPS / ATP, estudos anteriores mostraram que a piroptose continua sendo o modo dominante de morte. O LPS é um dos padrões moleculares associados a patógenos mais caracterizados. O ATP liberado pelas células moribundas tem uma alta concentração dentro da célula. O ATP extracelular é um dos padrões moleculares associados ao perigo17. LPS / ATP é um método clássico de estimulação em duas etapas para induzir a piroptose. A pesquisa mostrou que a adição de ATP às células estimuladas por LPS pode ativar rapidamente a caspase-118, enquanto o silenciamento do gene da caspase-1 pode reverter significativamente a morte celular induzida por LPS / ATP19. Em estudos anteriores, também encontramos ativação induzida por LPS / ATP de proteínas-alvo apoptóticas e necroptóticas20,21. Embora o LPS/ATP seja um indutor clássico de piroptose, ele também pode induzir apoptose e necroptose.

Na verdade, essas três formas geralmente não existem de forma independente e se interferem entre os estágios do sinal. Por exemplo, as proteínas gasdermina têm como alvo as mitocôndrias para promover a liberação do citocromo c para aumentar a via apoptótica mitocondrial22. A ativação da caspase-3 pode clivar a gasdermina E e, em seguida, desencadear a piroptose23. Um estudo sugere que a sinalização MLKL/PIPK3 está envolvida na ativação dos inflamassomas NLRP324. Essa conversa cruzada complexa levou ao conceito de PANoptose, definida como uma via inflamatória de morte celular programada regulada pelo complexo PANoptossomo com características-chave de piroptose, apoptose e / ou necroptose que não podem ser explicadas por nenhuma dessas vias de morte celular programada sozinha25. Como o conceito de PANoptose foi proposto, os cientistas descreveram a ocorrência de morte celular programada de forma mais abrangente, o que também destaca a complexidade da morte celular programada. Enquanto isso, isso também indica as limitações desse método de pesquisa. Embora a piroptose seja considerada dominante na morte celular induzida por LPS/ATP, não se pode determinar a proporção dessas formas de morte ou se todas elas existem, mesmo envolvendo outras formas de morte programada. Esta pode ser uma área a ser investigada no futuro.

Este protocolo é baseado na morte de macrófagos induzida por LPS e ATP. Descrevemos um método de teste do todo para o indivíduo, que também é aplicável a outros modelos e células. Os resultados indicam que as células podem ter sofrido piroptose, apoptose ou necroptose, que não se limita à piroptose, ajudando os pesquisadores a entender melhor a morte celular após a estimulação com LPS e ATP e escolher um método experimental melhor. Em estudos anteriores, a coloração dupla com Anexina V/7-AAD ou Anexina V/PI foi comumente usada para indicar a ocorrência de apoptose26,27, alguns pesquisadores também a utilizaram para estudar a apoptose28. Na verdade, não podemos distinguir entre os três tipos de morte celular por meio dessas duplas colorações. Este protocolo lembra aos pesquisadores, especialmente iniciantes, que a coloração dupla de Anexina V / 7-AAD ou Anexina V / PI não pode qualificar o tipo de morte celular. Ele só pode mostrar danos celulares e morte como um todo ou indicar que a célula pode ter sofrido alguma forma de morte. Em pesquisas mais direcionadas, é necessário introduzir um grupo de controle que iniba outras mortes para mostrar que a morte do programa está à mão. Da mesma forma, mais pesquisas mecanicistas investigarão os alvos críticos de diferentes mortes programadas.

Além disso, durante a preparação do experimento, descobrimos que atualmente existem muitos procedimentos experimentais detalhados para MEV de células aderentes, com pouca descrição de células suspensas. Aqui, fornecemos uma descrição mais detalhada do método de preparação de amostras para células suspensas. A etapa 5.5 é uma etapa necessária para auxiliar na imobilização de células suspensas em lâminas de células. As operações subsequentes devem ser realizadas suavemente para evitar o descolamento da célula. Além da solução de alúmen de cromo, a poli-L-lisina também pode imobilizar as células.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Expressamos nossa grande gratidão a Jiayi Sun e Lu Yang do Instituto Inovador de Medicina Chinesa e Farmácia da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, pela assistência com citometria de fluxo, Cuiping Chen do Laboratório Estadual de Recursos de Medicina do Sudoeste Chinês, pela ajuda com microscopia eletrônica de varredura. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China [82104491], pela Fundação de Ciências Naturais de Sichuan [2023NSFSC0674] e pela Fundação de Ciências de Pós-Doutorado da China [2021M693789].

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de enzima pancreática a 0,25% (excluindo EDTA)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
Tubo de Fundo Redondo de Poliestireno de 5 mLCORNING352235
Tubo de centrífuga de 5 mLLabgic Technology Co., Ltd. Placa de 6 poços BS-50-M
Sorfa Life Science Research Co., Ltd220100
Kit de análise de apoptose de anexina V-PE / 7-AADAbsin (Shanghai) Tecnologia Biológica co.ltdabs50007Anexina V-PE, 7-AAD, 5 e vezes; Tampão de ligação, solução de controle positivo de apoptose
incubadora de CO2Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.N / A
, 100 mmSorfa Life Science Research Co., Ltd230301
Celômetro K2 Contador de células fluorescentesNexcelom Bioscience LLCCelômetro K2
Celómetro SD100 Câmaras de contagemNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
Máquina centrífugaHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
Chromium Alum Guangdong Wengjiang Reagente Químico Co., Ltd.
vidros de cobertura, 9 mmLabgic Technology Co., Ltd. BS-09-RC
Quorum TechnologiesK850
dimetil sulfóxido BOSTERBiological Technology co.ltdPYG0040
fixador de microscópio eletrônicoServicebio Technology co.ltd G11022,5% dialdeído glutárico, 100 mM sais de fósforo
eletrônicaSHIMADZUATX124
etanol absolutoChengdu Kelong Chemical Co., Ltdcitômetro de fluxo 2021033102
Becton,Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-1
software de análise de citometria de fluxoBecton,Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM Software
gelatinaGuangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
Microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo frio de alta resoluçãoTITACHIRegulus 8100
linha celular monocítica humana THP-1Procell Life Science& Tecnologia Co., Ltd.CL0233
microscópio invertido Leica Microsystems Co., LtdDMi1
Misturador de Vórtice IRVELP Scientifica SrlZX4
lipopolissacarídeo Pequim Solarbio Ciência & Technology Co.,Ltd. L8880LPS é derivado de Escherichia coli 055: B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. A8270
forbol-12-miristato-13-acetato Pequim Solarbio Ciência & Technology Co.,Ltd. P6741
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Prato de cultura de células PA04354Secador de ponto crítico balança solução K211104 BECKMAN COULTER 8546733 Cressington Scientific Instruments Ltd 108 banho-maria termostático GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd 

Referências

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