Um procedimento cirúrgico minimamente invasivo é mostrado aqui, que envolve a colocação da sonda Doppler a laser no crânio sobre a região distal da artéria cerebral média (ACM), um local periorbital adequado para ratos e camundongos, para avaliar o fluxo sanguíneo durante a oclusão transitória da ACM.
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Artigo de método
Colocação periorbital de uma sonda Doppler a laser para monitoramento do fluxo sanguíneo cerebral antes da oclusão da artéria cerebral média em modelos de roedores
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Resumo
Resumo
A oclusão da artéria cerebral média (MCAO) é o método padrão-ouro para modelagem pré-clínica de AVC isquêmico em roedores. No entanto, a oclusão bem-sucedida não é garantida nem mesmo pelas mãos cirúrgicas mais habilidosas. Os erros ocorrem principalmente quando o filamento não é colocado na profundidade correta e incluem casos de ausência de infarto ou perfuração do vaso, o que pode causar a morte. A fluxometria Doppler a laser (LDF) é uma técnica confiável que fornece feedback em tempo real sobre o fluxo sanguíneo cerebral regional (CBF) durante o procedimento MCAO. Aqui demonstramos uma técnica rápida para colocação periorbital de uma sonda Doppler a laser para medição de CBF em camundongos e ratos. Nossa justificativa era simplificar a implementação do LDF, incentivando o uso generalizado para melhorar a confiabilidade cirúrgica. A técnica elimina a necessidade de afinamento do crânio e equipamentos especializados, com colocação na região periorbital em vez de colocação dorsal, promovendo eficiência e facilidade de adoção. O protocolo descrito aqui engloba preparações pré-cirúrgicas, colocação de sonda Doppler periorbital e cuidados pós-operatórios. Os resultados representativos incluem representações visuais de elementos processuais, juntamente com traçados representativos de LDF ilustrando cirurgias MCAO bem-sucedidas, com casos de colocação malsucedida de filamentos levando a complicações. O protocolo ilustra o LDF na confirmação da colocação adequada do filamento e oferece um procedimento simplificado em comparação com métodos alternativos.
Introdução
O método de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) tem sido amplamente utilizado em roedores desde que foi introduzido na comunidade científica para aplicação em ratos em 19861 com a adaptação de Longa descrita em 19902 e adaptações para camundongos logo após3. Embora não descrito na publicação de Longa, o uso do sinal de fluxometria com Doppler a laser (LDF) para confirmar a colocação do filamento foi logo descrito na literatura4. O emprego de LDF durante o procedimento MCAO é destaque na literatura, mas é designado como uma etapa opcional nos atuais Procedimentos Operatórios Padrão (SOPs) das Redes de Avaliação Pré-clínica de AVC (SPAN)5.
O uso de LDF confirma a colocação correta do filamento durante o procedimento MCAO e, portanto, contribui para o rigor do desenho do estudo e resultados subsequentes, particularmente em experimentos projetados para explorar a eficácia do medicamento. O uso de LDF reduz os erros cirúrgicos decorrentes da colocação incorreta do filamento, o que resulta na situação dicotômica de nenhuma lesão quando o filamento não é colocado longe o suficiente ou mortes de animais devido à perfuração do vaso que ocorre quando o filamento é inserido muito longe. Por outro lado, o uso de LDF não está associado à variabilidade do tamanho do infarto comumente observada após o procedimento MCAO6. O uso de LDF no procedimento MCAO pode ser percebido como difícil e oneroso, particularmente em ratos, porque o crânio é mais espesso do que em camundongos e pode exigir afinamento do crânio antes da colocação de LDF 7,8. Além disso, a colocação da sonda dorsal é frequentemente descrita com alguns protocolos que requerem equipamento especializado ou preparação 7,8,9. Com qualquer uma dessas barreiras, a implementação do LDF para confirmar a colocação do filamento pode não ocorrer.
Neste protocolo, descrevemos a colocação da sonda laser Doppler no crânio e sobre a região distal da artéria cerebral média - uma colocação periorbital - para a avaliação do fluxo sanguíneo durante o procedimento MCAO em camundongos e ratos. Nosso raciocínio foi desenvolver um procedimento que tenha múltiplas vantagens sobre alguns métodos relatados na literatura 7,8,9,10, pois é minimamente invasivo, rápido e não requer afinamento craniano ou equipamento especializado além da sonda Doppler a laser.
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Protocolo
Camundongos e ratos adultos foram usados para ilustrar este protocolo (25 g, C57BL / 6J, Jackson Laboratories; 250 g, Sprague Dawley, Envigo). O manejo dos animais e os procedimentos experimentais foram realizados com aprovação e em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Arizona, leis nacionais e de acordo com os princípios de cuidados com animais de laboratório11. Ratos e camundongos foram alojados em um horário claro/escuro de 12 h (7h-19h) com comida e água disponíveis ad libitum.
1. Preparação pré-cirúrgica
NOTA: Normalmente, a cirurgia MCAO em um roedor é realizada como uma cirurgia de sobrevivência, necessitando do uso de uma técnica cirúrgica asséptica ou apenas de pontas, conforme descrito em um protocolo IACUC específico da instituição. Nesse caso, o cirurgião usa uma técnica somente de dicas com instrumentos e suprimentos esterilizados.
- Desinfete a superfície de trabalho cirúrgico com desinfetante comercial e prepare pacotes cirúrgicos estéreis de instrumentos, cortinas, gaze, cotonetes, suturas e lâminas de bisturi em autoclavagem. Manter condições estéreis durante a cirurgia de sobrevivência de acordo com as técnicas aprovadas pela IACUC, como cobrir botões de microscópio e cortinas com filme plástico de qualidade alimentar.
- Use um esterilizador de esferas secas germinador para reesterilizar os instrumentos cirúrgicos entre os procedimentos se várias cirurgias de roedores forem realizadas durante uma sessão.
- Coloque o rato ou camundongo em uma câmara de indução e induza a anestesia com 3%-5% de isoflurano (1 L/min usando uma mistura combinada de 80% de ar e 20% de oxigênio).
- Mova o animal da câmara para a bancada e o nariz para anestesia (camundongo: 0,5 L / min 80% / 20% de mistura de oxigênio / ar; rato: 1,5 L / min 80% / 20% de mistura de oxigênio / ar). Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos e raspe cuidadosamente o espaço entre a orelha e a órbita ocular na lateral da cirurgia MCAO (geralmente a direita), para não cortar a pele com um aparador. No rato, quando raspado, a covinha do bigode será visível aproximadamente a meio caminho entre a órbita ocular e a orelha. Continue a raspar as regiões conforme necessário para o procedimento MCAO9 (não no escopo deste artigo).
- Volte o animal para a câmara conforme necessário ou coloque-o num nariz na mesa cirúrgica preparada, aquecido a 37 °C. Insira um termômetro retal. O animal deve ser mantido a aproximadamente 36 °C ± 1 °C durante todo o procedimento e de acordo com o protocolo IACUC aprovado.
- Aplique betadine em um cotonete e desinfete a pele, espiralando para fora do centro da região cirúrgica. Limpe com uma almofada de preparação de álcool. Repita as duas etapas para um total de três ciclos. Confirme a anestesia adequada e avalie a cada 15 minutos durante o procedimento usando o refluxo de pinça do dedo do pé.
2. Colocação da sonda Doppler periorbital
- Com uma tesoura pequena, faça um corte vertical (camundongo: ~ 0,5 cm; rato: ~ 0,7 cm) entre o canto do olho e a dobra da orelha, conforme mostrado na Figura 2A (camundongo) e na Figura 3A (rato) para expor o super fácio e o músculo subjacente.
NOTA: Trate a dor no pré-operatório de acordo com a aprovação do protocolo IACUC. - Usando uma pinça afiada e uma tesoura curva, corte cuidadosamente a camada muscular até que o crânio seja alcançado. O crânio será plano e difícil de tocar com a ponta da pinça. Esta é a janela na qual a sonda Doppler a laser ficará, conforme visualizado na Figura 2B.
- Use uma ferramenta de cautério com fórceps para coagular o sangue emergente, alargar a janela e garantir a rota para o crânio.
- Assim que a janela estiver aberta, seque com cotonetes para remover o excesso de sangue conforme necessário.
Coloque o camundongo ou rato em decúbito dorsal. - Use uma pinça para retrair qualquer pele ou tecido e coloque a sonda Doppler na janela periorbital de modo que ela encoste no crânio perpendicularmente sem pele ou músculo presente para impedir o sinal do laser. Esta região está sobre a ACM distal, conforme ilustrado na Figura 1A,B. Prenda a colocação da sonda com fita adesiva de laboratório. Neste protocolo, é descrito o uso de uma sonda reta.
NOTA: Reconhecemos que os protocolos de cirurgia variam entre os laboratórios. Na literatura (quando relatada), alguns trituram o crânio e outros não9. Pode ser porque o crânio é mais fino na região periorbital, mas isso é apenas especulação. Em nossa experiência, a colocação direta sem trituração pode ser alcançada em camundongos e ratos e é demonstrada neste protocolo. - Monitore as leituras relativas do fluxo sanguíneo no monitor com o software apropriado (Figura 2D, Figura 3C,D). As leituras do LDF variam. No entanto, a faixa ideal para detecção de quedas de fluxo sanguíneo é de >200 unidades de perfusão (UP).
- Prossiga para a cirurgia MCAO9 (não no escopo deste artigo). Durante a cirurgia MCAO, teste a colocação da sonda amarrando brevemente a artéria carótida comum, o que deve causar uma queda repentina no fluxo sanguíneo (~ 50%).
3. Remoção da sonda Doppler e cuidados pós-operatórios
- Na conclusão do MCAO ou sempre que as leituras do fluxo sanguíneo forem concluídas, remova a sonda Doppler a laser da janela cirúrgica. A sonda Doppler normalmente permanece no lugar durante a cirurgia MCAO do camundongo porque os tempos de isquemia geralmente são inferiores a 90 min. Por outro lado, no procedimento MCAO de rato, a sonda Doppler pode ser removida após a colocação do filamento e durante a isquemia (normalmente > 90 min) e, em seguida, colocada novamente na janela periorbital para confirmar a reperfusão, repetindo as etapas 2.6 e 2.7.
NOTA: Um rastreamento contínuo LDF típico do MCAO do camundongo pode ser observado na Figura 4A. Os traçados típicos de LDF de um procedimento MCAO de rato são ilustrados na Figura 4B. - Injete anestésico local aprovado pela IACUC por via subcutânea ao longo do local da incisão prospectiva.
- Feche a pele com 1-2 suturas usando um nó cirúrgico padrão com fio de sutura absorvível ou cola cirúrgica, de acordo com o protocolo IACUC aprovado. Trate a dor pós-cirúrgica de acordo com a aprovação do protocolo IACUC (por exemplo, bupivacaína HCL 0,5% e lidocaína 2%, uma vez intra-incisão para camundongos e ratos). Os animais não devem ser deixados sozinhos até que sejam capazes de manter a decúbito esternal, e nenhum animal é devolvido à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.
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Resultados
A colocação da sonda Doppler a laser na região da ACM é representada visualmente na Figura 1, oferecendo um pictograma da vasculatura e servindo como um guia visual das perspectivas sagital e dorsal. A Figura 2 resume as etapas críticas para a colocação e os resultados da sonda Doppler a laser no mouse. A Figura 2A apresenta uma imagem de um camundongo anestesiado e preparado com uma marcação tracejada no local da incisão vertical n...
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Discussão
O MCAO é o procedimento padrão-ouro para modelar a oclusão e reperfusão da artéria cerebral em roedores e tem sido a pedra angular da pesquisa pré-clínica de AVC, permitindo a indução de isquemia focal em roedores para mimetizar a fisiopatologia do AVC humano. É um procedimento cirúrgico exigente com significativa variabilidade inter e até intra-cirurgião. Embora não haja evidências de que a aplicação do LDF reduza a variabilidade, ela pode melhorar o rigor científico e os resultados do ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pelo NINDS 1R41NS124450. Biorender: KT26JWLYF6
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Materiais
tesoura
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| de mola curva | pinça Castroviejo | 1501710 | |
| #5 | Ferramentas de ciências finas | 11250-20 | |
| pinça #5/45 | Ferramentas de ciências finas | 1151-35 | |
| Forcepts Ferramenta de cauterização | Conmed | M18019-01 | |
| Fita de laboratório | Fita de rotulagem Fisherbrand | 15-950 | |
| Monitor Doppler a laser | Moore Instruments | Software MOORVMS-LDF | |
| LDF | Perisoft para Windows ou moorSOFT | NA | |
| Mouse clippers | Philips Norelco | MG7910 | |
| Periflux System 4000, sonda 407 | Equipamento Perimed | não está mais disponível | |
| filme plástico | Glad | press n seal | |
| Cortador de ratos | oster | A5 ou similar | |
| Pequena anestesia de roedores | JD Medical | encomenda | |
| pequena tesoura | excelta | 362 Sissors ou | |
| similar sistema de monitoramento de temperatura com sonda | Physitemp | TCAT-2AC Controller |
Referências
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models
Posted by JoVE Editors on 3/18/2025. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66839
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