Artigo de método

Um fluxo de trabalho baseado na web para selecionar intensificadores específicos de genes e tecidos

DOI:

10.3791/66840

⸱

18 de julho de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 3Stem Cell Medicine Department, Murdoch Children's Research Institute, The Royal Children's Hospital, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine, reNEW Melbourne, Murdoch Children's Research Institute, 5Systems Biology Institute (SBI) Australia

Neste artigo

Resumo

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Apresentamos um fluxo de trabalho sem codificação para que os biólogos identifiquem intensificadores de genes específicos do tecido usando apenas ferramentas baseadas em navegador. Nosso protocolo aproveita marcas públicas de histonas H3K4me1 / H3K27ac e dados Hi-C, permitindo que pesquisadores sem experiência em programação acessem, analisem e identifiquem possíveis elementos regulatórios associados a seus genes de interesse.

Resumo

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Os intensificadores são regiões de DNA que regulam a expressão gênica. Mutações dentro dos intensificadores podem resultar em regulação gênica anormal, levando a doenças. Portanto, identificar intensificadores que regulam a atividade gênica em tecidos específicos é crucial para entender a base genética da doença. No entanto, os intensificadores são difíceis de identificar, pois não codificam proteínas. Embora vários repositórios aprimoradores e ferramentas de identificação estejam disponíveis, a complexidade dessas ferramentas pode representar um desafio para os biólogos. Para facilitar os biólogos no uso desses recursos, apresentamos um protocolo amigável para biólogos (https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow) que aproveita os dados genômicos existentes baseados na web, como marcas de histonas H3K4me1 e H3K27ac e dados de análise de conformação de cromatina (Hi-C) para descobrir intensificadores associados a um gene de interesse (GoI) em um tecido-alvo onde o intensificador está ativo. Este protocolo é totalmente baseado na web e não requer habilidades de programação dos usuários finais. Demonstramos a utilidade dessa abordagem caracterizando candidatos a intensificadores que regulam o TBX5, um gene crítico para o desenvolvimento do coração. Este protocolo facilita a identificação de potenciadores associados a este gene no ventrículo esquerdo.

Introdução

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Os intensificadores são regiões de DNA não codificantes que regulam a transcrição, o desenvolvimento e a diferenciação celular dos genes 1,2. A mutação de intensificadores pode levar a várias doenças, incluindo distúrbios do desenvolvimento, cânceres e outras condições genéticas 3,4,5,6. Portanto, entender os intensificadores é fundamental para entender a expressão gênica, a mutação e as doenças.

Para entender como os intensificadores interagem com seus genes-alvo, é importante identificar suas localizações dentro do genoma. No entanto, identificar os locais dos intensificadores nem sempre é simples, pois os intensificadores podem estar localizados próximos ao local de início da transcrição (TSS) e muito mais distantes, abrangendo dezenas a centenas de quilobases 2,7,8,9.

Apesar de sua localização genômica imprevisível, os intensificadores apresentam assinaturas bioquímicas e estruturais distintas, permitindo que sejam rastreados sistemicamente. Geralmente, os intensificadores tendem a ser enriquecidos em regiões intergênicas e intrônicas, com um pequeno número encontrado nos éxons 2,8. Eles são frequentemente marcados por modificações específicas de histonas e ligação ao fator de transcrição, que definem seus papéis regulatórios e determinam sua atividade espaço-temporal em diferentes estágios de desenvolvimento e tecidos10,11.

ChIP-seq é usado para identificar locais de ligação do fator de transcrição (TFBSs) e marcas de modificação de histonas, como a marca registrada de intensificadores, H3K4me1, marcas de intensificador ativo, marcas H3K27ac e H3K4me3, que são enriquecidas nas regiões promotoras 1,12,13,14,15. Técnicas de captura de conformação de cromatina (3C) e seus derivados, como 4C, 5C, Hi-C e ChIA-PET, são usadas para mapear interações físicas entre regiões genômicas distantes. Enquanto o 3C tem como alvo interações específicas em tecidos específicos, o Hi-C oferece uma arquitetura de todo o genoma entre os tipos de células16,17.

Além dos métodos atuais, abordagens especializadas foram desenvolvidas para caracterizar intensificadores, incluindo bancos de dados de intensificadores agrupados, como EnhancerAtlas ou EnhancerFinder18,19. No entanto, essas ferramentas geralmente exigem que os pesquisadores integrem vários conjuntos de dados para investigar vários intensificadores em muitos tecidos, o que pode ser esmagador para biólogos sem experiência em bioinformática e mineração de dados.

Aqui, descrevemos um protocolo amigável para selecionar potenciadores, inteiramente baseado em ferramentas web existentes. Isso permite que os pesquisadores consultem um gene de interesse (GoI) e recuperem os intensificadores correspondentes. O protocolo aqui seleciona intensificadores com base em um conjunto específico de critérios: modificações de histonas, interações da cromatina e especificidade do tecido 1,12,13,14,15,16,17,20,21. Os intensificadores encontrados nos íntrons são mais propensos a mostrar atividade específica do tecido em comparação com os intensificadores intergênicos, que estão posicionados nas regiões genômicas entre os genes22. Para garantir uma cobertura abrangente de potenciais intensificadores ativos, definimos o intervalo de pesquisa entre dois GoIs vizinhos para aumentar a probabilidade de capturar elementos regulatórios localizados fora dos corpos gênicos. Usamos uma marca epigenética específica do intensificador, H3K4me1, e uma marca de intensificador ativo, H3K27ac, para listar os candidatos ao intensificador. Esses candidatos foram então refinados com base em dados Hi-C, retendo intensificadores com interações físicas com o promotor correspondente. Este protocolo foi projetado para orientar os biólogos no processo de identificação do intensificador usando apenas ferramentas baseadas na web disponíveis publicamente. Ao integrar dados epigenéticos e de interação da cromatina, a abordagem descrita aqui oferece uma estrutura prática para gerar hipóteses sobre potenciais potenciadores para posterior validação experimental.

Protocolo

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NOTA: Um passo a passo está disponível em https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow. Os dados utilizados no protocolo estão resumidos na Tabela 1 e na Tabela 2. A solução de problemas está disponível no Arquivo Suplementar 1.

1. Localizando o GdI (Figura 1)

  1. Abra o navegador do genoma EnsEMBL (https://www.EnsEMBL.org).
  2. Escolha a montagem do genoma apropriada que corresponda à espécie e à versão.
  3. Insira GoI no campo de pesquisa e clique em Ir.
  4. Selecione o link para o ID do gene EnsEMBL apropriado.
  5. Clique no link para o visualizador da guia Região em detalhes , localizado abaixo da seção de resumo, para navegar pela região ao redor do GdI.

2. Definindo a região de detecção do intensificador (Figura 2)

  1. Identifique os dois genes vizinhos do GdI para definir a região de detecção. Use a trilha Gene Legend para procurar esses genes, que são anotados como elementos visuais relacionados ao EnsEMBL/Havana mesclado na trilha Basic Gene Annotations from GENCODE . Determine a direcionalidade do GdI pelos sinais de < e > no nome do gene apropriado na trilha GENCODE.
  2. Clique e arraste para selecionar a região intergênica entre esses genes e clique em Ir para a região na caixa pop-up para visualizar a área selecionada. Redefina a região de interesse a qualquer momento, repetindo esta etapa.
  3. (OPCIONAL) Personalize a exibição selecionando Adicionar/remover faixas na parte superior do visualizador de faixas. Modular o nível de zoom usando os controles de zoom/navegação acima do visualizador de trilha.

3. Análise da marca de histona (Figura 3)

  1. Na barra lateral do visualizador da guia Região em detalhes , selecione Configurar esta página.
  2. Na barra lateral da tela da guia Configurar imagem da região , no menu suspenso Regulamento , selecione Atividade por célula/tecido.
  3. Use a barra de pesquisa de células/tecidos para pesquisar e selecionar tecidos de interesse. Como alternativa, use a barra de navegação alfabética abaixo da barra de pesquisa para encontrar tecidos de interesse.
  4. Selecione a guia Experimentos , ao lado de Célula/Tecido.
  5. Selecione H3K4me1 e H3K27ac como um marcador de intensificadores e H3K4me3 como um marcador de promotores.
  6. Selecione Configurar exibição de faixa.
  7. Selecione Exibir trilhas para visualizar regiões marcadas com H3K4me1 na região de detecção do aprimorador e regiões marcadas com H3K4me3 a montante do GdI.
  8. Para os candidatos a intensificadores, recupere as coordenadas das regiões genômicas marcadas por H3K4me1 dentro das regiões de detecção definidas clicando nos elementos visuais/box coloridos nas trilhas H3K4me1 recém-adicionadas. Isso revela o pop-up "Hists & Pols", que contém informações sobre a localização genômica do elemento no par de bases (bp).
    1. Recupere candidatos a aprimorador ativos escolhendo regiões H3K4me1 em que os elementos visuais/de caixa coloridos de H3K4me1 e H3K27ac se sobrepõem. A granularidade do nível de zoom pode afetar o número de candidatos aprimoradores mostrados nesta faixa.
    2. Como alternativa, defina manualmente as regiões de interesse para cada recurso genômico clicando e arrastando na trilha para encapsular os picos do gráfico na trilha H3K4me1/H3K27ac. Copie as coordenadas de localização genômica em um arquivo de texto e salve no formato .bed .
  9. Da mesma forma, para regiões promotoras, replique a etapa 3.8 usando a trilha H3K4me3, com foco na região a montante do GdI.

4. Análise de captura de conformação da cromatina (Hi-C) (Figura 4)

  1. Acesse o portal de dados 4DN (https://data.4dnucleome.org/). No gráfico de barras empilhadas principal da página inicial do 4DN (Figura 5), certifique-se de que os Conjuntos de experimentos estejam selecionados como o eixo Y, o Tipo de experimento seja selecionado como o eixo X e o gráfico seja agrupado por Organismo.
  2. Ao longo do eixo X do gráfico de barras principal, encontre a barra Hi-C in situ. Clique na parte da barra que está agrupada para Conjuntos de Experimentos Humanos e, em seguida, clique no botão Procurar no pop-up. Filtre conjuntos de dados relevantes usando o painel do lado esquerdo.
  3. Clique no link na coluna Título da Bioamostra relevante para o tecido de interesse.
  4. Clique em Explorar dados na guia Arquivos processados para explorar o conjunto de dados Hi-C com mais detalhes.
  5. Insira as coordenadas do promotor identificado no tecido de interesse (da etapa 3.9) e marque a região horizontalmente clicando com o botão direito do mouse no mapa de calor (Figura 4). As linhas adicionadas garantem que a região promotora seja rastreada visualmente no mapa de calor. Remova linhas acidentais clicando com o botão direito do mouse na linha e selecionando régua horizontal/vertical e Fechar série.
  6. Insira as coordenadas de todos os intensificadores de controle validados experimentalmente23 para calcular o limite de interação com base em seu mínimo. Esses intensificadores de controle foram previamente confirmados para interagir com a região promotora, servindo como referência para definir a interação mínima significativa.
  7. Defina o limiar promotor-intensificador, utilizando os intensificadores de controlo, com base na pontuação de interação diferente de zero mais baixa, de acordo com a chave de cor no lado direito da matriz.
  8. Insira as coordenadas genômicas de todas as regiões associadas a H3K4me1 (da etapa 3.8) e marque verticalmente no mapa de calor Hi-C. Isso permite um padrão de verificação cruzada, onde a interseção entre os intensificadores marcados com H3K4me1 (vertical) e a região promotora (horizontal) pode ser examinada quanto a interações significativas.
    1. Em seguida, filtre as regiões de interação fraca comparando as pontuações de interação das regiões marcadas com H3K4me3 com o limiar de interação (etapa 4.6).
    2. Selecione as coordenadas genômicas que exibem frequências de interação mais altas do que o limite definido no mapa de calor do portal 4DN. Essas regiões aparecem como sinais mais concentrados (mais escuros) no mapa de calor, exceto no formato BED.

Resultados

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Para ilustrar o uso do protocolo apresentado, investigamos o gene TBX5 no coração humano, explorando intensificadores associados a TBX5 usando o fluxo de trabalho abrangente envolvendo dados H3K4me1, H3K27ac e Hi-C. O TBX5 é um gene que contribui para o desenvolvimento dos membros e do coração, incluindo a formação das quatro câmaras e a separação do septo24. A mutação nesse gene é uma das principais causas da síndrome de Holt-Oram (HOS), que causa anormalidades nos membros e cardiopatia congênita (DCC), incluindo defeitos septuais24. A mutação de intensificadores cardíacos associados ao TBX5 pode influenciar criticamente a DCC24. Um estudo anterior descobriu três intensificadores TBX5 conhecidos em tecido cardíaco humano específico - ou seja, "Enhancer 2", "Enhancer 9" e "Enhancer 16" (Arquivo Suplementar 2), que demonstraram ter fenótipos comparativos em camundongos transgênicos23.

Investigamos as regiões enriquecidas com H3K4me1 e H3K27ac entre RBM19 e TBX3, que são dois genes flanqueadores a jusante e a montante de TBX5 em humanos, para recuperar possíveis intensificadores no locus TBX5 (Figura 1 e Figura 2). Para identificar os intensificadores específicos do coração, as células do músculo cardíaco foram escolhidas. As regiões do potenciador cardíaco TBX5 putativas foram recuperadas como coordenadas (chr12: início-fim) e 22 regiões associadas a H3K4me1 e H3K27ac foram identificadas (Figura 3 e Arquivo Suplementar 3). Potenciadores cardíacos TBX5 putativos foram recuperados do banco de dados genômico EnsEMBL para cruzar dados Hi-C mantidos no banco de dados 4DNucleome (Figura 4). Isso foi feito para avaliar possíveis interações entre potenciais intensificadores e o promotor cardíaco TBX5 . Seguindo o protocolo aqui descrito, 21 das 22 regiões genômicas foram confirmadas para interagir com o promotor TBX5 (chr12: 114400143-114410103) nas células do músculo cardíaco (Arquivo Suplementar 4). Houve uma região que não teve interação física com o promotor (Figura 4, passo 4.8). Finalmente, comparamos este protocolo com esses intensificadores biologicamente validados e o atual banco de dados padrão-ouro de intensificadores cardíacos, VISTA Cardiac Enhancers Browser, e revelamos intensificadores adicionais não capturados atualmente pelo banco de dados25.

Realizamos uma comparação cruzada dos 21 intensificadores TBX5 recuperados pelo protocolo aqui apresentado com bancos de dados existentes. Recuperamos 4 intensificadores TBX5 do VISTA Cardiac Enhancer Browser (Arquivo Suplementar 5)25. Dos 4 intensificadores cardíacos identificados pelo VISTA, 3 intensificadores, hs2329, mm1282 e m370 se sobrepuseram às regiões identificadas por este protocolo de detecção de intensificador baseado na web (Figura 5). Cada um dos intensificadores previstos também compartilhou as regiões genômicas com intensificadores previamente validados experimentalmente de Smemo et al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) e Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), embora não tenham mostrado sobreposição com o Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38). Um dos intensificadores identificados pelo VISTA, hs498 não se sobrepôs a nenhum intensificador previsto por este protocolo ou aos intensificadores validados experimentalmente de Smemo et al.23 (Figura 5), embora a região tenha mostrado sobreposição parcial com as marcas H34Kme1 (Figura 5). Da mesma forma, o Enhancer 9 não se sobrepôs aos intensificadores previstos por este pipeline, mas foi associado às marcas H3K4me1 (Figura 5).

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Figura 1: Guia passo a passo para localizar o GdI no EnsEMBL Genome Browser. O utilizador abre primeiro a página inicial do EnsEMBL (1.1), seleciona a espécie (Humano) e introduz o gene na barra de pesquisa (1.2-1.3). Na lista de resultados, o ID do gene apropriado é selecionado (1.4), o que abre a página de resumo do gene. Em seguida, o usuário clica no hiperlink Região em detalhes (1.5) para visualizar a região genômica ao redor do GdI, incluindo elementos vizinhos e recursos regulatórios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Definindo a região de detecção do intensificador ao redor do GoI usando o EnsEMBL Genome Browser. Para definir a região de detecção do intensificador, identifique os dois genes vizinhos que flanqueiam o GoI usando as Anotações Básicas de Genes da trilha GENCODE , onde os genes são mostrados como blocos amarelos escuros marcados com anotações EnsEMBL / Havana mescladas. A direção transcricional de cada gene é indicada por pontas de seta (< ou >) ao lado do nome do gene (2.1). Para selecionar a região intergênica entre os genes vizinhos, clique e arraste pela região de interesse e escolha Ir para a região na caixa pop-up para ampliar (2.2). Para adicionar anotações regulatórias ou relacionadas ao aprimorador, clique em Adicionar/remover faixas (2.3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Configuração de trilhas de modificação de histonas na região de detecção do intensificador usando o EnsEMBL Genome Browser. Na barra de ferramentas à esquerda, clique em Configurar esta página (3.1) para acessar o painel de configuração da trilha e navegue até "Atividade por célula/tecido" na seção Regulamento (3.2). Na guia aberta, selecione a seção "Experimentos" (3.3) e use a barra de pesquisa Célula/Tecido para localizar e selecionar seu tecido de interesse (célula do músculo cardíaco) (3.4). No painel de marcas de histonas (3.5), habilite H3K4me1 e H3K27ac como marcas de intensificador ativas e H3K4me3 como marca promotora e clique em "Configurar exibição de faixa" (3.6). Depois de confirmar as seleções de trilhas, clique em "Exibir trilhas" (3.7) para retornar ao visualizador do genoma. Os picos das marcas de histonas são agora mostrados na região de detecção (3.8) como blocos coloridos sob o rótulo de tecido correspondente (amarelo: H3K4me1, azul: H3K27ac e laranja: H3K4me3). Pop-up "Hists & Pols" contendo as coordenadas genômicas da região em pares de bases (chr:start-end), que podem ser copiados e salvos para análise downstream. Um pop-up "Hists & Pols" aparece depois de clicar nos elementos coloridos da faixa. O pop-up contém as coordenadas genômicas da região em pares de bases (por exemplo, chr12:11443450-114451611 para a região promotora), que podem ser copiadas e salvas para análise downstream (3.8). Da mesma forma, para extrair intensificadores candidatos, priorize as regiões onde os picos H3K4me1 e H3K27ac se sobrepõem, conforme mostrado pelo alinhamento vertical de picos e caixas entre as trilhas (3.9). As regiões sobrepostas podem ser selecionadas diretamente clicando em suas caixas ou clicando e arrastando manualmente pelos picos alinhados para definir uma região (por exemplo, chr12:114400143-114410103 para uma região candidata ativa). As coordenadas mostradas no pop-up devem ser salvas no formato BED para validação ou visualização downstream. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Visualização das interações da cromatina promotor-intensificador usando mapas de calor Hi-C do 4D Nucleome Data Portal. A página inicial do Portal de Dados do 4D Nucleome exibe um gráfico de barras empilhadas resumindo os tipos de experimentos disponíveis por organismo. O conjunto de dados "Hi-C in situ " para amostras humanas é selecionado clicando na seção correspondente da barra (4.1). Uma lista filtrada de conjuntos de dados relevantes é exibida; um conjunto de dados Hi-C derivado de células H9 diferenciadas em mioblastos cardíacos é selecionado (4.2). O conjunto de dados selecionado (4.3) é aberto no navegador HiGlass por meio do botão Explorar dados (4.4). A região genômica de interesse é inserida na caixa de coordenadas (4.5) e a matriz de contato é renderizada como um mapa de calor em escala de cores. Cores mais escuras (vermelho profundo a preto) indicam frequência de contato com cromatina mais forte, enquanto cores mais claras (branco a laranja) representam interações mais fracas. Uma régua horizontal é colocada na coordenada do promotor e as réguas verticais são desenhadas nas posições de três intensificadores de controle validados experimentalmente (4.6). Essas interseções são usadas para definir um limite de interação estrito, definido pelo sinal visível mais forte (cor mais escura) entre os contatos promotor-intensificador (4.7). Regras verticais adicionais são desenhadas nos locais dos intensificadores marcados com H3K27ac e H3K4me1 candidatos (da etapa 3.8). Os candidatos cujas interseções promotor-intensificador são iguais ou mais escuras que o limite são retidos, enquanto aqueles com sinais mais fracos (quadrados de cores mais claras) são excluídos (4.8). As coordenadas retidas são extraídas manualmente e salvas no formato BED para análises posteriores. (a. Intensificador 2, b. Aprimorador 9 e c. Aprimorador 16) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Visualização do navegador genômico dos intensificadores TBX5 previstos em comparação com os intensificadores cardíacos validados pelo VISTA e os intensificadores de controle. Os instantâneos do navegador do genoma exibem o intervalo de pesquisa do intensificador (ETAPA 2) comparando os intensificadores previstos recuperados pelo protocolo baseado na web (inferior) com os intensificadores validados pelo VISTA (superior) e os intensificadores de controle validados experimentalmente (centro). O painel principal mostra o locus genômico completo com elementos reguladores anotados, incluindo picos específicos de H3K4me1 (amarelo), H3K27ac (azul) e H3K4me3 específicos do músculo cardíaco (laranja). Três figuras ampliadas capturam o alinhamento entre o recuperado pelo protocolo, o VISTA e os intensificadores de controle. A sobreposição com os intensificadores de controle é delineada com caixas vermelhas. As coordenadas para cada sub-região são exibidas nos painéis inferiores do navegador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Dados utilizados no estudo. Clique aqui para fazer o download desta Tabela.

Tabela 2: Ferramentas baseadas na Web usadas no estudo. Clique aqui para fazer o download desta Tabela.

Arquivo Suplementar 1: Instruções de solução de problemas para o EnsEMBL Genome Browser. Clique aqui para fazer o download deste arquivo.

Arquivo suplementar 2: Um arquivo BED no formato GRCh38, os intensificadores de controle cardíaco TBX5 validados experimentalmente 23. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Um arquivo BED no formato GRCh38, intensificadores cardíacos TBX5 recuperados pelo STEP3 do EnsEMBL. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Um arquivo BED no formato GRCh38, intensificadores cardíacos TBX5 recuperados pelo STEP4 do EnsEMBL. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 5: Um arquivo BED no formato GRCh38, intensificadores cardíacos TBX5 recuperados do navegador VISTA 25. Clique aqui para fazer o download deste arquivo.

Discussão

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O protocolo baseado na web descrito aqui funciona como um fluxo de trabalho para recuperação de intensificadores, em vez de previsão de intensificadores. Ao alavancar conjuntos de dados específicos de tecidos disponíveis publicamente, modificações de histonas (H3K4me1 e H3K27ac) e dados de interação Hi-C, ele restringe os potenciadores potenciais associados ao GdI. Ao contrário das ferramentas de previsão computacional que dependem de aprendizado de máquina ou modelos baseados em sequência, nossa abordagem se concentra na recuperação de intensificadores apenas com base em dados experimentais. As instruções de resolução de problemas para o navegador do genoma EnsEMBL são fornecidas no Ficheiro Suplementar 1.

Esse fluxo de trabalho integra elementos-chave, como marcas de histonas e dados de interação da cromatina, semelhantes a métodos avançados como ChIA-PET e PLAC-seq, que mapeiam as interações intensificador-promotor com maior precisão10,11. No entanto, esse método é benéfico quando técnicas experimentais de alta resolução não são viáveis, pois o protocolo consome menos recursos e economiza um tempo significativo.

A principal limitação da abordagem apresentada acima é sua dependência da disponibilidade e qualidade dos conjuntos de dados existentes, o que pode afetar a precisão das interações recuperadas. Investigar a atividade do intensificador durante o desenvolvimento cardíaco no contexto de mutações genéticas associadas ao TBX5 requer resolução específica do tecido. Para tal análise, o tecido cardíaco embrionário seria o mais adequado dada a sua relevância para a regulação do desenvolvimento. No entanto, nenhum conjunto de dados embrionários incluiu que os dados de modificação de histonas estavam disponíveis publicamente no momento da análise. Para explicar isso, a integração de recursos alternativos como ENCODE, Enhancer Atlas 2.0 ou EnhancerFinder pode expandir a utilidade do pipeline, fornecendo conjuntos de dados adicionais para identificação e validação do enhancer18,19.

No TBX5 REPFIX, a análise baseada em H3K4me1 revelou 22 potenciadores putativos como ponto de partida para uma investigação mais aprofundada. A análise Hi-C subsequente mostrou que 21 dos 22 candidatos a intensificadores com base em marcas anteriores de modificação de histonas interagiram com o promotor TBX5 nas células musculares cardíacas (Figura 5). Isso apóia a confiabilidade da abordagem baseada em marcas de modificação de histonas na previsão de regiões de interesse.

Optamos por não priorizar a conservação da sequência entre as espécies neste protocolo, embora seja um critério comum para identificar intensificadores. Como anteriormente provou ser menos eficaz para intensificadores de tecidos ou espécies específicas, muitos dos quais não são fortemente conservados durante a evolução26. Diante disso, optamos por nos concentrar em marcadores baseados em cromatina que são mais diretamente indicativos da atividade do intensificador funcional. No entanto, a conservação da sequência ainda pode ter valor em contextos específicos, como o estudo de intensificadores com significado evolutivo. Nesse caso, ele pode ser adicionado como uma etapa opcional para usuários interessados em elementos regulatórios conservados.

O protocolo mostrou-se eficaz na recuperação de 21 potenciadores específicos do coração para o gene TBX5 do site EnsEMBL, que anteriormente havia escapado à identificação por uma plataforma existente, o VISTA Cardiac Enhancers Browser. Embora o protocolo aqui descrito não tenha conseguido recuperar um dos potenciadores, hs498, sugerindo a possibilidade de limitação na detecção, a abordagem descobriu alguns intensificadores não detectados pelo VISTA Cardiac Enhancers Browser. No entanto, é necessária uma validação adicional dos intensificadores recuperados, pois o protocolo produz um número maior de regiões putativas em comparação com os bancos de dados VISTA com curadoria. Essa contagem mais alta aumenta o risco de falsos positivos, e um número maior de intensificadores previstos não indica necessariamente melhor especificidade ou relevância funcional. A incorporação de conjuntos de dados experimentais adicionais ou ensaios funcionais, como análise de expressão gênica, perturbação CRISPR ou ensaios repórter, será crucial para confirmar a validade biológica desses candidatos, conforme realizado em Smemoet al. 23.

A comparação cruzada com três intensificadores validados experimentalmente mostrou sobreposição parcial com as regiões previstas (Figura 5). O intensificador previsto "e1" foi posicionado de forma mais ampla do que o intensificador 2 validado, enquanto "e18" mostrou sobreposição parcial com o intensificador 16 (Figura 5). Esses resultados sugerem que essa abordagem identifica com sucesso regiões com atividade regulatória conhecida, embora a abrangência mais ampla dos intensificadores previstos possa refletir a flexibilidade nos limites do intensificador. Os intensificadores geralmente funcionam como elementos modulares e sua atividade pode depender do contexto da cromatina, do tipo de célula e do tempo de desenvolvimento 2,27. Portanto, as regiões previstas podem incluir os principais sítios ativos com sequências adjacentes que contribuem para a função regulatória, apesar da necessidade de validação experimental para determinar quais partes dessas previsões mais amplas são funcionalmente ativas em um contexto específico de tecido ou desenvolvimento. Enquanto o VISTA Cardiac Enhancer Browser identificou quatro regiões dentro da faixa definida, apenas um potenciador, mm370, se sobrepôs parcialmente a um intensificador validado experimentalmente, o Enhancer 16, especificamente na região marcada por H3K4me1 (Figura 5)23. A porção restante do mm370, que não se sobrepõe ao Enhancer 16, pode indicar uma sub-região não funcional ou inativa do enhancer28,29.

Divulgações

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Os autores não relatam interesses conflitantes.

Agradecimentos

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Agradecemos aos membros do laboratório Ramialison (Transcriptômica e Bioinformática, reNEW Bioinformatics Hub) pelas discussões úteis. MR e HTN são apoiados por um NHMRC Ideas Grant (APP1180905). Agradecemos a Richard Saffery pelo apoio. O MR é financiado por uma bolsa de estudos para futuros líderes da Heart Foundation (107328). O financiamento adicional de infraestrutura para o Murdoch Children's Research Institute foi fornecido pelo Esquema de Apoio à Infraestrutura do Instituto de Pesquisa Independente do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Governo Australiano. O Instituto Australiano de Medicina Regenerativa é apoiado por doações do Governo do Estado de Victoria e do Governo Australiano. O Centro de Medicina de Células-Tronco da Fundação Novo Nordisk é apoiado por doações da Fundação Novo Nordisk (NNF21CC0073729).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Estação de trabalho do computadorN/AN/AComputador compatível com navegador da Web, sistema operacional Windows/Mac/Linux
Portal de dados 4DNPortal de dados 4DNhttps://data.4dnucleome.org/
GaláxiaGaláxiahttps://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445
GithubGithubhttps://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow
VISTA Navegador VISTA Cardiac Enhancerhttps://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/

Referências

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