Artigo de método

Modelo Murino Transgênico Tricolor para Estudo de Lesão em Placa de Crescimento

1.6K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/66841

⸱

6 de setembro de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Connecticut Health Center

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um modelo de camundongo aprimorado para lesões na placa de crescimento ósseo de adolescentes. Usando camundongos transgênicos com repórteres fluorescentes de tri-linhagem para colágeno tipos I, II e X, as matrizes primárias associadas a três substratos diferentes da placa de crescimento, a colocação da lesão é guiada pela fluorescência nativa ao microscópio.

Resumo

As placas de crescimento da cartilagem nos ossos das crianças permitem o alongamento dos membros, mas são fracas em relação ao osso, tornando-as propensas a fraturas quando os ossos estão sobrecarregados. Melhores tratamentos para placas de crescimento gravemente fraturadas são necessários porque a resposta à lesão é uma ponte óssea que funde prematuramente a placa de crescimento, levando a membros atrofiados e / ou tortos. Modelos murinos de lesão da placa de crescimento são vantajosos para estudos mecanicistas, mas são desafiadores porque é difícil visualizar e ferir com precisão as pequenas placas de crescimento em camundongos jovens. Descrevemos aqui um modelo aprimorado de lesão da placa de crescimento usando camundongos transgênicos com repórteres fluorescentes de tri-linhagem para colágeno tipos I, II e X.

Esses camundongos apresentam fluorescência nativa associada aos três substratos primários da placa de crescimento. Uma lesão da placa de crescimento semelhante a uma lesão de Salter-Harris Tipo II é criada de forma reprodutível com uma broca usando a seção hipertrófica da placa de crescimento como referência durante a imagem ao vivo sob orientação de microscopia estéreo de fluorescência. A análise histológica congelada da fluorescência nativa simplifica a avaliação da resposta celular à lesão. Essa metodologia representa um salto substancial na pesquisa de lesões em placas de crescimento, fornecendo um método detalhado e reprodutível para investigar patologias e avaliar novas estratégias terapêuticas.

Introdução

As placas de crescimento ósseo desempenham um papel fundamental no crescimento longitudinal dos ossos longos durante a infância e a adolescência1. Situada nas extremidades dos ossos longos, a placa de crescimento compreende múltiplas zonas, sendo os condrócitos os principais componentes celulares responsáveis pela produção e manutenção dessa área de crescimento dinâmico. A ossificação endocondral da placa de crescimento ocorre para alongar e expandir os ossos por meio de uma progressão sequencial da proliferação de condrócitos, hipertrofia, apoptose, invasão por vasos sanguíneos, recrutamento de células osteoprogenitoras e, finalmente, formação óssea2. Como a placa de crescimento é relativamente mais macia que o osso, é altamente suscetível a fraturas quando os ossos são sobrecarregados durante esportes ou outras atividades. A classificação de Salter-Harris descreve cinco tipos distintos de lesões da placa de crescimento3. A fratura do tipo II através da zona hipertrófica da placa de crescimento e do tecido ósseo inferior adjacente é a mais prevalente4. Uma ponte óssea geralmente se forma em resposta a lesões da zona hipertrófica ou do osso adjacente e leva à fusão prematura das seções de ossos longos adjacentes5. As pontes ósseas impedem a expansão normal da placa de crescimento. Atualmente, não há tratamentos preventivos disponíveis para a formação da ponte óssea, e alguns não são tratados, dependendo da idade do paciente e do tamanho e localização da ponte óssea6. Quando a malformação do membro é grave, as opções cirúrgicas incluem a remoção seguida de implantação de materiais interposicionais como gordura ou borracha de silicone ou osteotomia corretiva e procedimentos de alongamento ósseo; no entanto, uma ponte óssea ainda pode se reformar6. Mais pesquisas são necessárias para prevenir a formação de pontes ósseas e melhorar os resultados de crianças com lesões na placa de crescimento ósseo.

Vários modelos animais foram estabelecidos para explorar os mecanismos subjacentes e desenvolver novas estratégias para prevenir o comprometimento da ponte óssea das placas de crescimento após a lesão 7,8,9,10,11,12. Esses modelos animais frequentemente se concentram na placa de crescimento tibial proximal e na placa de crescimento do fêmur distal como o local primário da lesão, uma vez que é normalmente onde ocorrem as lesões humanas. Os defeitos ósseos do animal são criados por uma abordagem lateral semelhante a uma via de fratura real ou uma abordagem de cima ou de baixo da placa de crescimento que leva a um orifício central na placa de crescimento. Em um modelo de rato relatado anteriormente, um defeito da placa de crescimento é criado inserindo uma broca dentária através de uma janela cortical na diáfise média da tíbia e perfurando para cima através da medula em direção à articulação do joelho para ferir centralmente a placa de crescimento 7,13. Alternativamente, um modelo de camundongo recente usa uma abordagem lateral com uma agulha de pequeno calibre para criar uma trilha de agulha plana através da placa de crescimento8. Em um modelo de rato amplamente utilizado, o defeito é criado na placa de crescimento do fêmur distal por meio da perfuração da cartilagem articular entre os côndilos9,14. Em animais maiores, como coelhos e ovelhas, os defeitos da placa de crescimento foram induzidos lateralmente diretamente na tíbia proximal e no fêmur distal por perfuração ou corte na placa de crescimento ou aproximando-se por baixo e criando um defeito central deixando as bordas da placa de crescimento inalteradas 10,11,12,15.

Modelos murinos para lesões em placas de crescimento são vantajosos para estudos mecanísticos que podem ser realizados com camundongos geneticamente modificados, como estudos de rastreamento de linhagem de células-tronco8. No entanto, um desafio significativo em modelos animais murinos ou de ratos é obter lesões consistentes e precisas em uma sub-região específica da placa de crescimento. A lesão de zonas específicas da placa de crescimento e do osso adjacente é necessária para mimetizar um dos caminhos de fratura clinicamente relevantes descritos pelas classificações de Salter-Harris. Os desafios até o momento em modelos de roedores são principalmente devidos à falta de um meio visual de identificar o substrato da placa de crescimento durante a criação cirúrgica da lesão. Este protocolo descreve uma técnica refinada para criar defeitos na placa de crescimento em substratos direcionados da placa de crescimento murina, utilizando camundongos transgênicos triplos que expressam repórteres fluorescentes de colágeno I, II e X 16,17,18. A fluorescência de cores diferentes desses colágenos em cada uma das zonas primárias da placa de crescimento permite a discriminação visual das várias seções da placa de crescimento sob um microscópio estéreo de fluorescência durante a criação cirúrgica da lesão da placa de crescimento. O uso desses camundongos transgênicos permite uma precisão de lesão sem precedentes em um camundongo jovem em um estágio de desenvolvimento comparável ao das crianças feridas.

Protocolo

A pesquisa foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Saúde da Universidade de Connecticut (IACUC) antes de iniciar o trabalho. Um esboço do protocolo é descrito no esquema da Figura 1 .

figure-protocol-1
Figura 1: Esboço do protocolo de lesão da placa de crescimento em camundongos repórteres de colágeno tricolor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Criação de camundongos e preparação para cirurgia

  1. Crie camundongos repórteres de colágeno transgênico tricolor que expressem Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP e Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 de acordo com os procedimentos de reprodução padrão para obter filhotes para cirurgia com 2 semanas de idade (± 1 dia). Verifique a expressão do transgene triplo genotipando um fragmento da ponta da cauda sob um microscópio de fluorescência. Use apenas os camundongos positivos para as três cores para maximizar o benefício do sistema repórter durante a análise histológica subsequente.
    NOTA: Esta idade de 2 semanas (± 1 dia) é selecionada porque suas placas de crescimento ósseo estão em um estágio de desenvolvimento semelhante ao do adolescente humano22. Este protocolo se aplica a ambos os sexos de camundongos.
  2. No dia da cirurgia ou um dia antes, identifique exclusivamente cada camundongo usado para cirurgia usando um punção de orelha após desinfetar a orelha e o punção de orelha com almofadas anti-sépticas de álcool, pesar cada camundongo e registrar o valor.
  3. Raspe todo o membro posterior direito, do quadril ao pé, com um cortador elétrico enquanto o camundongo está sob o efeito da anestesia com isoflurano. Para induzir a anestesia em camundongos, use uma mistura de isoflurano (2-3%) e oxigênio a 100%, administrado a uma taxa de fluxo de 1 L / min dentro de uma câmara de indução de 1-2 L. Remova o mouse e confirme se a profundidade da anestesia é suficiente com uma pitada do dedo do pé que não deve fazer com que o mouse se mova.
    NOTA: Esta profundidade de anestesia durará o suficiente para realizar o barbear sem a necessidade de um cone nasal de anestesia.
  4. Empregue imagens de raios-X com uma configuração de potência de 26 kV (800 mA) para capturar imagens tibiais em camundongos vivos sob anestesia induzida por isoflurano para registrar o comprimento inicial do membro.
    1. Antes de colocar os camundongos no gabinete de raios-X, induza um estado profundo de anestesia usando uma mistura de isoflurano (2-3%) e oxigênio a 100%, administrado a uma taxa de fluxo de 1 L / min dentro de uma câmara de indução de 1-2 L.
    2. Coloque três camundongos anestesiados de cada vez em paralelo de bruços no armário de raios-X a uma altura de prateleira que permita a obtenção de uma imagem que inclua os três camundongos. Abra as pernas para que os ossos tibiais não fiquem obscurecidos sob o mouse. Para maior precisão de medição, posicione uma escala radiopaca perto do mouse durante a imagem (Figura 2A).
  5. Retorne os camundongos preparados para sua gaiola de alojamento com a mãe para aguardar os procedimentos cirúrgicos subsequentes.

2. Preparação de material cirúrgico e área de trabalho estéril

  1. Esterilize os seguintes itens: 10-20 compressas de gaze, cotonetes aplicadores com ponta de algodão, brocas dentárias (0,5 mm de diâmetro), peças de mão odontológicas, pinças Graefe, pinças hemostáticas curvas de mosquito, tesouras finas curvas, porta-agulhas, sondas periodontais e escultores discóides cleóides dentários.
  2. Colete suprimentos estéreis adicionais necessários: uma suspensão injetável de buprenorfina, agulhas de 20 G, seringas de 1 mL, cortinas de toalha, 5-0 não tingidas, trançadas, revestidas, suturas de vicryl, iodopovidona, solução salina tamponada com fosfato, almofadas anti-sépticas com álcool, bisturis # 15, luvas cirúrgicas, sox de tubo de barreira de superfície ambiental, lubrificante para os olhos, spray de etanol a 70%. Ligue um esterilizador de esferas de vidro para esterilização adicional de itens durante a cirurgia e a almofada de aquecimento elétrico sob uma gaiola de rato limpa com roupa de cama esterilizada.
  3. Limpe e esterilize a platina do estereomicroscópio de fluorescência, as superfícies adjacentes e o suporte do instrumento cirúrgico usando etanol a 70%. Cubra essas áreas que se tornarão o espaço de trabalho cirúrgico com cortinas de toalha estéreis.
  4. Monte o sistema eletrônico de perfuração odontológica de alta velocidade. Conecte o pedal eletrônico à unidade de controle e cubra o cabo da peça de mão com um tubo de barreira de superfície desinfetado sox. Prenda a broca dentária redonda estéril de 0.5 mm. Ligue o controlador e ajuste-o para uma relação de acionamento de 1:1 e um máximo de 30,000 rpm.
  5. Prenda, com fita adesiva, a mangueira flexível da máquina de isoflurano que termina com o cone do nariz coberto com um tubo de barreira de superfície desinfetado sox no estágio de estereomicroscópio de fluorescência.
  6. Ligue o estereomicroscópio de fluorescência e o equipamento auxiliar e abra o software de aquisição de imagem.

figure-protocol-2
Figura 2: Principais etapas do procedimento de lesão da placa de crescimento murino do repórter fluorescente de trilinhagem. (A) Medição do comprimento tibial por imagem de raios-X de faxitron usando uma régua radiopaca colocada ao lado dos camundongos no gabinete de raios-X. (B) Posição adequada de um camundongo anestesiado para cirurgia sob um estereomicroscópio de fluorescência. Tíbia proximal indicada por uma seta preta. (C) Um exemplo de uma incisão feita para acessar a placa de crescimento. (D) Microscopia estereoscópica de fluorescência iluminando a zona hipertrófica da placa de crescimento (seta branca). A zona proliferativa adjacente é indicada por uma seta amarela. (E) Iluminação de luz brilhante do cirurgião colocando a broca dentária de 0,5 mm contra a placa de crescimento. (F) A colocação precisa da broca dentária é guiada por microscopia estereoscópica de fluorescência na zona hipertrófica. (G) Um exemplo de um defeito da placa de crescimento semelhante ao Tipo II de Salter-Harris (seta branca). Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Procedimento de lesão da placa de crescimento da tíbia proximal

  1. Anestesiar o camundongo na câmara de anestesia com isoflurano, ajustando a concentração de isoflurano para 2-3% e a taxa de fluxo de oxigênio para 1 L/min. Aguarde a indução de um estado anestésico profundo, verificado por um teste de pinça do dedo do pé e a observação dos padrões respiratórios.
  2. Administre metade da dose prescrita de buprenorfina por via subcutânea imediatamente após a remoção do rato da câmara. A dosagem de buprenorfina é de acordo com o protocolo animal aprovado.
  3. Aplique lubrificante ocular para proteger os olhos do camundongo de secar durante a cirurgia e transfira o camundongo em decúbito dorsal para o cone do nariz da máquina de isoflurano no estágio do estereomicroscópio (Figura 2B). Ajuste o fluxo de anestesia através do cone do nariz para 2% e a taxa de fluxo de oxigênio para 1 L/min.
  4. Desinfete o membro posterior direito, a região pélvica, a face anterior do membro posterior esquerdo e a cauda sequencialmente com iodopovidona seguido de etanol a 70%.
  5. Verifique uma profundidade estável contínua da anestesia por meio de um teste adicional de pinça do dedo do pé e observação dos padrões respiratórios antes do início da cirurgia.
  6. Sob iluminação de luz forte, empregue um bisturi # 15 para criar uma incisão na pele logo abaixo da articulação do joelho com um comprimento inicial de aproximadamente 5 mm, para revelar a extremidade proximal da tíbia direita (Figura 2C). Use uma tesoura para estender o corte, se necessário. Mantenha a tíbia contralateral esquerda sem lesões para que ela sirva como um controle interno sem lesões.
  7. Realize uma dissecção romba vertical através do músculo sobrejacente na tíbia proximal usando a parte de trás do bisturi # 15, removendo o tecido mole para uma exposição clara da placa de crescimento.
  8. Desligue as luzes da sala de cirurgia e selecione o canal de fluorescência correto para iluminar a região desejada da placa de crescimento. Os conjuntos de filtros necessários para obter imagens de cada um dos colágenos fluorescentes são Col 2 Cyan: ET436 / 20x (excitação), ET480 / 40 m (emissão), Col 10 mCherry: ET577 / 20x (excitação), ET640 / 40 m (emissão), Col 1 Topaz: ET500 / 20x (excitação), ET535 / 30 m (emissão). Posicione o mouse para observar a placa de crescimento tibial proximal (Figura 2D). Ajuste a abertura da pele um pouco mais proximal e, em seguida, distal para garantir que a placa de crescimento tibial esteja à vista e não a placa de crescimento do fêmur.
  9. Crie uma lesão semelhante a Salter-Harris Tipo II enquanto olha pela ocular do microscópio, posicionando a broca odontológica de 0,5 mm paralela ao eixo tibial no meio da zona da placa de crescimento hipertrófica, empregando uma abordagem lateral (Figura 2E, F). Para fazer um defeito de forma reprodutível que imite uma lesão de Salter-Harris Tipo II, mantenha o membro paralelo à superfície de trabalho para que a via de entrada da broca não se incline para a epífise. Aplique pressão no pedal da broca para iniciar a rotação da broca e pressione suavemente a broca na placa de crescimento, parando antes que o defeito seja mais profundo do que o diâmetro da broca (Figura 2G).
    NOTA: Um segundo par de mãos ajudando a estabilizar o membro do mouse é útil.
  10. Irrigue o local da lesão com uma gota de PBS estéril para remover quaisquer detritos.
  11. Confirme a profundidade do defeito em 0,5 mm usando uma sonda periodontal.

4. Procedimentos pós-lesão e encerramento

  1. Para caracterização de defeito de tempo zero, colha o membro posterior lesionado e o membro de controle antes do fechamento do tecido. Siga a coleta e preparação do tecido para subsequente tomografia computadorizada (microCT) e imagem crio-histológica na seção 6.
    NOTA: Para experimentos envolvendo a implantação de uma substância terapêutica no defeito da placa de crescimento, o defeito em si só pode acomodar um pedaço de biomaterial que seja aproximadamente esférico e 0,5 mm de diâmetro ou 0,082 mm3 (0,082 μL) de volume.
  2. Utilize uma pinça sob visualização microscópica para inserir o biomaterial ou injetar um líquido terapêutico no defeito dentro da placa de crescimento. Use um volume maior de biomaterial ou substância injetada se o desenho do estudo não exigir que a terapêutica seja limitada apenas ao defeito.
  3. Realinhe cuidadosamente as bordas da pele, garantindo que o material implantado, se houver, permaneça seguro dentro do local do defeito.
  4. Empregue técnicas de sutura interrompida com suturas de ácido poliglicólico 5-0 para selar a incisão da pele de forma eficaz.
  5. Limpe bem as áreas além da região cirúrgica do resíduo de iodopovidona usando cotonetes com água estéril, tomando cuidado para evitar o contato com a ferida e as áreas circundantes.
  6. Remova o mouse do cone do nariz de isoflurano no microscópio stage para uma gaiola de recuperação, posicionando-o lateralmente sobre uma cama fresca sobre uma almofada de aquecimento.
  7. Observe atentamente a frequência respiratória do camundongo por aproximadamente 5 min, administrando a dose restante de buprenorfina para analgesia, assim como os efeitos da anestesia com isoflurano diminuem, indicados por um aumento na frequência respiratória, mas antes do início da mobilidade. Mantenha o camundongo em uma gaiola de recuperação isolada até que ele demonstre todas as capacidades ambulatórias, depois disso, reunindo-o com sua mãe e irmãos.
  8. Realize inspeções diárias para as 48 horas iniciais após a operação, seguidas de avaliações semanais até o ponto da eutanásia. Concentre-se nos sinais de infecção, eficácia da locomoção, acessibilidade aos alimentos e integridade das suturas.
  9. Desmame os camundongos no horário padrão (ou seja, 3 semanas de idade).

5. Medidas do comprimento dos membros

  1. Com base nos pontos de tempo determinados pela hipótese e desenho experimental, anestesiar os camundongos com isoflurano e realizar imagens de raios-X de todo o comprimento das tíbias lesionadas e não lesionadas, conforme mostrado na Figura 2A e descrito na seção 1.4. Pontos de referência adequados para fazer medições consistentes do comprimento do membro incluem o topo da epífise tibial e a extremidade distal da tíbia na articulação tibiotalar, conforme mostrado na Figura 3.
    NOTA: A imagem é usada para avaliar o comprimento do membro e as discrepâncias de comprimento do membro devido à lesão, bem como o desenvolvimento da ponte óssea dentro dos tecidos da placa de crescimento em intervalos pós-operatórios específicos.

6. Dissecção de tecido, fixação, imagem microCT e incorporação

  1. Eutanasiar o camundongo por meio de asfixia por CO2 , de preferência usando um sistema automatizado de indução de CO2 com confirmação de morte por um método alternativo, como luxação cervical.
  2. Isole os membros posteriores intactos e remova a pele e o músculo da área capsular do osso e do joelho em preparação para análise histológica e microCT.
    1. Antes de colocar os membros posteriores no fixador, excise a patela cuidadosamente, cortando-a com uma tesoura de microdissecação para facilitar a penetração do fixador na cavidade do joelho. Empregue uma seringa de insulina de 29 G para distribuir completamente a formalina tamponada a 10% fria em todas as áreas da cavidade do joelho. Grave a região diafisária do fêmur e da tíbia para melhorar o acesso do fixador ao espaço medular. Manter o tecido articular numa posição totalmente estendida dentro do fixador durante 24-36 h a 4 °C, amarrando-o com gaze a uma bucha fina.
      CUIDADO: A formalina é tóxica e deve ser manuseada em um exaustor usando equipamento de proteção individual adequado.
  3. Após 24-48 h de fixação em formalina a 4 °C, realizar microCT de raios-X de alta resolução de amostras contralaterais e lesionadas por microCT após a transferência de amostras para PBS, para avaliação do desenvolvimento da ponte óssea. Use um tamanho de voxel de 6,0 μm, tempos de amostragem de 330.000 ms e configurações de energia de 55.000 V com uma intensidade de 145 μA.
  4. Após a microTC e mais 24 h de fixação de formalina a 4 °C, enxágue as amostras em 1X PBS por 3 x 5 min e, em seguida, mergulhe as amostras em sacarose a 10% em PBS 1X por 1 h, sacarose a 20% em PBS 1X por 1 h e sacarose a 30% em PBS 1X durante a noite. Use uma seringa de insulina de 29 G cheia de solução de sacarose para garantir que a solução de sacarose permeie todas as regiões da cavidade do joelho. Transfira para um freezer a -80 ° C se não for incorporado após a imersão noturna com sacarose para garantir a retenção do repórter de GFP e da atividade enzimática do tecido.
  5. Remova qualquer tecido muscular residual da região articular antes de incorporar. Equilibre a amostra com um meio de crio-incorporação durante a noite, facilitando a penetração do meio na cavidade do joelho.
  6. Visualize as imagens de microCT para determinar onde o defeito e a ponte óssea estão localizados antes da incorporação. Aplicar uma fina camada do meio de crio-incorporação num criomoldor e colocar a tíbia/fémur/articulação dissecada e ainda ligada de modo a que a região de interesse fique virada a 90° em relação à superfície do meio de incorporação.
    NOTA: Esta orientação permite que o corte capture a vista lateral do defeito criado lateralmente. Se a ponte óssea estiver perto da borda do defeito, essa orientação também evitará a possibilidade de perder a região de interesse durante as primeiras seções mais espessas feitas através do tecido.
  7. Posicione o criomold em gelo seco até que o meio crio-incorporador solidifique, prendendo a amostra. Continue a encher o criomold com o meio, mantendo-o em gelo seco.
  8. Depois de fixar a amostra, mergulhe o criomold em 2-metil-butano refrigerado com gelo seco até que esteja totalmente congelado. Após o congelamento, remova o excesso de 2-metil-butano, envolva os criomoldes em celofane e armazene a -20 °C ou -80 °C.
    NOTA: Para armazenamento prolongado por mais de 1-2 meses em meio crio-incorporador, recomenda-se -80 ° C para evitar o ressecamento. O crioseccionamento assistido por fita adesiva e a adesão dos cortes às lâminas de vidro são descritos anteriormente23.

7. Imagem sequencial, coloração e recriação de imagens

  1. Implemente um procedimento sequencial de imagem, coloração e reimagem para facilitar a detecção e colocalização de múltiplos sinais biológicos dentro da mesma seção de tecido, conforme descrito anteriormente23. Especificamente para as seções da placa de crescimento dos camundongos repórteres de colágeno tricolor, as etapas a seguir são recomendadas. Essa abordagem ordenada garante uma visualização abrangente de sinais moleculares e detalhes estruturais.
    1. Inicialmente, capture sinais fluorescentes endógenos para os três colágenos na primeira rodada de imagens.
    2. Aplique coloração e imagem de azul de calceína para tecido mineralizado23, seguido pela coloração e imagem da atividade enzimática da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP)23.
      NOTA: Embora os resultados da coloração da atividade enzimática TRAP não sejam exibidos aqui, esta etapa de coloração é realizada, pois é essencial para a remoção do mineral antes dos resultados da coloração Safranin O/Fast Green apresentados na seção de resultados representativos.
    3. Realize a coloração nuclear de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) conforme descrito abaixo e, em seguida, a imagem.
      1. Coloque as lâminas que passaram por imagens anteriores em um frasco Coplin contendo 1x PBS. Deixe-os submersos até que as lamínulas se soltem das lâminas. Depois de destacadas, remova e seque bem as lamínulas.
      2. Aplique a solução de contracoloração DAPI nas lamínulas, utilizando uma diluição de 1:1.000 de DAPI em uma mistura de 50% de glicerol e 1x PBS. Prossiga com o processo de imagem após a aplicação.
    4. Conclua com a aplicação da coloração Safranin O/Fast Green para acentuar a arquitetura do tecido e, em seguida, a imagem.
      NOTA: Execute isso como a etapa final para correlacionar imagens cromogênicas com sinais fluorescentes.
      1. Prepare as soluções de hematoxilina de ferro da Weigert. Prepare a Solução A dissolvendo 1 g de hematoxilina em 100 mL de etanol a 95% e a Solução B combinando 4 mL de solução de cloreto férrico a 29%, 95 mL de água deionizada e 1 mL de HCl concentrado. Misture partes iguais da Solução A e B para criar a solução de hematoxilina de trabalho de Weigert, estável por aproximadamente 4 semanas.
      2. Mergulhe as lâminas em água deionizada por 2 x 2 min para hidratar.
      3. Aplique a solução de hematoxilina de trabalho da Weigert por 5 min.
      4. Lave as lâminas em água da torneira por 5 min e, em seguida, brevemente em água deionizada por 1 min.
      5. Manchar com solução Fast Green a 0,2% (0,2 g de Fast Green FCF em 100 mL de água deionizada) por 2 min.
      6. Enxágue brevemente em ácido acético a 1% por 1 min.
      7. Manchar com solução de Safranina O a 0,1% (0,1 g de Safranina O em 100 mL de água deionizada) por 1 min.
      8. Enxágue em água deionizada até obter uma cor visualmente equilibrada, aproximadamente 5 min.
      9. Monte as lâminas em glicerol a 30% em água deionizada (evite PBS) e prossiga para a imagem imediatamente para evitar a difusão da cor do tecido. Para acentuar as células da zona de repouso da placa de crescimento, conduza a imagem com um filtro Cy5: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).

Resultados

Este protocolo utiliza camundongos repórteres fluorescentes de trilinhagem para induzir um defeito lateral da placa de crescimento na tíbia proximal com precisão, aproveitando a fluorescência vermelha inerente emitida pelo colágeno tipo X para orientação cirúrgica. A visão que o cirurgião tem ao olhar através da ocular do estereomicroscópio com o conjunto de filtros mCherry é mostrada na Figura 2D. A fluorescência nativa do Tipo X permite que o cirurgião coloque a broca na zona hipertrófica e crie uma lesão que imita um tipo comum de lesão da placa de crescimento que leva a uma ponte óssea (Figura 2F). A fluorescência sob o canal vermelho é a mais brilhante e, portanto, recomendada para uso durante a colocação da broca. Alternativamente, a criação de defeitos pode ser guiada pelo uso de outras cores da fluorescência nativa dos camundongos triplos transgênicos se o objetivo do experimento for estudar lesões em outras zonas da placa de crescimento além da zona hipertrófica e região calcificada adjacente.

A criação de um defeito semelhante ao tipo II de Salter-Harris na zona hipertrófica da placa de crescimento e do tecido ósseo inferior adjacente, usando uma broca dentária de 0,5 mm de diâmetro, foi validada por meio de microCT e imagem crio-histológica das tíbias proximais lesadas (tempo 0) em comparação com os controles laterais não lesionados em camundongos N = 3 (Figura 4). Os defeitos eram difíceis de ver nas imagens 3D de microCT, mas eram detectáveis nas seções transversais 2-D (Figura 3A, B, E, F). A Figura 3G exibe a distribuição de células ósseas produtoras de colágeno tipo I (fluorescência verde), condrócitos proliferativos produtores de colágeno tipo II (fluorescência ciano) e condrócitos hipertróficos produtores de colágeno tipo X. Na imagem do camundongo lesionado (Figura 4G), há uma ruptura da zona hipertrófica, a camada provisoriamente calcificada e alguns dos ossos formados mais recentes em relação ao controle com a zona proliferativa apenas ligeiramente perturbada. A coloração Safranin O/Fast Green (Figura 4H) ilustra melhor a localização do defeito dentro da placa de crescimento lesada, uma vez que todas as células são claramente visíveis.

A análise de raios-X fornece algumas informações sobre camundongos vivos quanto ao impacto desse tipo de lesão da placa de crescimento no comprimento da tíbia e na formação da ponte óssea ao longo do tempo (Figura 3). Imagens comparativas entre tíbias não lesionadas (Figura 3A) e lesionadas (Figura 3B), obtidas antes da cirurgia e 3 semanas após a cirurgia, revelam uma grande quantidade de crescimento do membro, afinamento das placas de crescimento e uma região opaca distinta que se desenvolveu na área da placa de crescimento lesionada em 3 semanas. Essa opacidade dentro da placa de crescimento não está presente na contraparte não lesionada nem nos camundongos antes da cirurgia. O faxitron é, portanto, uma forma de observar alterações patológicas induzidas pela lesão em camundongos vivos, como a formação de uma ponte óssea e alterações no comprimento do membro.

A imagem de microtomografia computadorizada de ossos dissecados oferece uma visualização detalhada da formação de pontes ósseas dentro das placas de crescimento lesionadas três semanas após a cirurgia (Figura 5). Como visto nas imagens de seis camundongos feridos diferentes mostrados na Figura 5, há um desenvolvimento consistente de ponte óssea em todos os camundongos. Utilizando o software Scanco Medical, o volume da ponte óssea foi calculado revisando cada seção da placa de crescimento tibial proximal, delineando a área da ponte óssea (Figura 5B) com a ferramenta select e, em seguida, integrando cada área de corte em todo o volume da placa de crescimento para obter o volume total24. O volume da ponte óssea calculado dessa forma foi de 0,0761 mm3 ± 0,0246 (média ± desvio padrão, N = 6). A maioria das pontes ósseas se forma perto do meio da placa de crescimento, apesar da abordagem lateral, que fere a borda externa, bem como o centro da placa de crescimento. Esse fenômeno pode ser atribuído ao fato de que as células-tronco mesenquimais (CTMs) da medula óssea, e não do pericôndrio, são responsáveis pela formação da ponte óssea25.

Nesses camundongos transgênicos tricolores, a análise crio-histológica da placa de crescimento lesada é enriquecida pela fluorescência do colágeno nativo (Figura 6). Ele revela a complexa interação de células ósseas e condrócitos no local da lesão. As imagens de microCT mostradas na Figura 6J,K foram fornecidas ao técnico de histologia para orientar a incorporação e secção. As células ósseas produtoras de colágeno tipo I são vistas na Figura 6L,O,P (fluorescência verde), enquanto os condrócitos proliferativos produtores de colágeno tipo II são vistos na Figura 6L,O,Q (fluorescência ciano). Os condrócitos hipertróficos produtores de colágeno tipo X são vistos na Figura 6L, O, R (fluorescência vermelha). Essa abordagem de fluorescência multicolorida permite um exame detalhado da diferenciação de condrócitos pós-cirurgia dentro da área da ponte óssea contra um pano de fundo de tecido mineralizado. A coloração DAPI foi usada para confirmar a distribuição de todos os tipos de células dentro da área da placa de crescimento (Figura 6M). A coloração Safranin O/Fast Green demonstra a organização composta e estrutural da cartilagem e do osso dentro da placa de crescimento lesada (Figura 6N). A imagem dessas seções coradas sob um conjunto de filtros Cy5 ilumina notavelmente as células da zona de repouso na interface entre o osso epifisário e a cartilagem.

figure-results-1
Figura 3: Imagens de raios-X de controle contralateral e tíbias de camundongos lesionados. (A) Imagens de raios-X da tíbia de controle contralateral são tiradas imediatamente antes da lesão, quando os camundongos têm 2 semanas de idade, e 3 semanas após a cirurgia, quando os camundongos têm 5 semanas de idade, demonstrando a extensão do crescimento que ocorre durante esse período. (B) Tíbia lesionada do mesmo mouse ao mesmo tempo aponta como em (A). Os pontos de referência usados para medições do comprimento da tíbia são o ápice da cabeça proximal da tíbia até o final da tíbia na articulação do tornozelo (setas vermelhas de duas pontas). A ponte óssea opaca é visível na placa de crescimento da tíbia proximal lesada em 5 semanas. Barras de escala = 5,00 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 4: MicroCT e imagens histológicas do controle contralateral de tempo zero e tíbias proximais de camundongos lesados. (A, E) e (B, F) mostram vistas de microCT 3D e 2D transversais, com o defeito indicado por setas vermelhas em (E) e (F). (C, G) Imagens crio-histológicas mescladas compostas mesclando três camadas de fluorescência inata com uma camada de tecido mineralizado. As células verdes (Col3.6GFPtpz) são as células ósseas produtoras de colágeno tipo I, as células de cor azul ciano (Col2A1GFPcyan) são condrócitos proliferativos produtores de colágeno tipo II e os glóbulos vermelhos (Col10A1RFPchry) são condrócitos hipertróficos produtores de colágeno tipo X. (D, H) Coloração Safranin O/Fast Green da mesma região que (C) e (G). Barras de escala = 1,0 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 5: Imagens MicroCT de pontes ósseas formadas por este protocolo. (A,C,E,G,I,K) Cortes transversais da placa de crescimento tibial proximal de seis camundongos diferentes 3 semanas após a criação do defeito da broca. Ponte óssea delineada por uma linha pontilhada vermelha em (A). (B,D,F,H,J,L) Reconstruções 3D com um plano longitudinal cortado. Ponte óssea delineada por uma linha pontilhada vermelha em (B). Barras de escala = 1,0 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 6: MicroCT e imagens histológicas do controle contralateral e tíbia proximal de camundongo lesionado com formação de ponte óssea. (A, J) e (B, K) mostram vistas 3D e transversais de microCT 2D, com a ponte óssea indicada por setas amarelas em (J) e (K). (C, L) Imagens crio-histológicas mescladas compostas mesclando três camadas de fluorescência inata com uma camada de tecido mineralizado. As células verdes (Col3.6GFPtpz) são as células ósseas produtoras de colágeno tipo I, as células de cor azul ciano (Col2A1GFPcyan) são condrócitos proliferativos produtores de colágeno tipo II e os glóbulos vermelhos (Col10A1RFPchry) são condrócitos hipertróficos produtores de colágeno tipo X. A caixa branca indica a maior ampliação mostrada nos painéis F e O. (D, M) O tecido mineralizado e a coloração DAPI na área da placa de crescimento dos painéis C e L. (E, N) Coloração Safranin O/Fast Green da mesma região que (D) e (M) escaneada com fluorescência cy5. (F,O) Uma maior ampliação da área da placa de crescimento na imagem mesclada dos painéis C e L. (G-I, P-R) Canais individuais da fluorescência nativa mostrados com um pano de fundo de tecido mineralizado. Barras de escala = 1,0 mm (A-E) e (J-N), = 250 μm em (F-I) e (O-R). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O uso inovador de camundongos repórteres de colágeno tricolor permite a criação de defeitos da placa de crescimento com tamanho e localização predeterminados, aumentando significativamente a precisão dos modelos experimentais murinos para lesões da placa de crescimento. Dado o pequeno tamanho dos camundongos de 2 semanas, é fundamental usar uma pequena broca de 0,5 mm para criar a lesão para evitar enfraquecer o membro e causar uma fratura de espessura total. O cirurgião também deve aplicar pressão suficiente ao criar o defeito para evitar perfurar muito profundamente o osso pelo mesmo motivo. O uso da periossonda é fundamental para confirmar uma profundidade de lesão consistente.

Como em qualquer cirurgia, é importante confirmar uma profundidade adequada de anestesia, confirmada por um beliscão ocasional do dedo do pé e a esterilidade é mantida durante todo o tempo. Outro ponto cirúrgico importante é que a dissecção romba com um escultor foi descrita porque evita danos aos tecidos moles e ajuda a garantir que os camundongos sejam capazes de deambular imediatamente após a recuperação da anestesia para alcançar a mãe camundongo para nutrição e conforto. Em nossa experiência, as feridas fechadas com suturas permaneceram fechadas com sucesso e os clipes de ferida não são necessários. A cirurgia em camundongos com 2 semanas de idade é recomendada para melhor imitar a criança pequena que sofre fraturas da placa de crescimento. Uma desvantagem desse protocolo é que, dada a natureza imprevisível do parto, o uso desse modelo de camundongo requer a disponibilidade do cirurgião em curto prazo.

Em relação ao posicionamento da broca para criar o defeito, o protocolo descreve a criação da lesão usando um conjunto de filtros vermelhos mCherry / Texas que ilumina a zona hipertrófica dentro da placa de crescimento devido ao brilho da fluorescência do colágeno X. Para garantir que a lesão seja criada dentro da placa de crescimento tibial, é benéfico mover levemente a abertura do tecido mole para a esquerda e para a direita para confirmar que a placa de crescimento tibial proximal está à vista, e não o fêmur. Alternar entre os canais do conjunto de filtros para iluminar a zona proliferativa de condrócitos ou as seções ósseas adjacentes é útil para confirmar o posicionamento preciso em relação à localização da zona proliferativa e das seções ósseas adjacentes.

Embora a zona proliferativa de condrócitos e o osso epifisário e metafisário possam ser distinguidos à microscopia de fluorescência nos camundongos vivos, o valor real dos repórteres de colágeno Tipo II e Tipo I é percebido durante a análise histológica da placa de crescimento. Dada a natureza aquosa dos processos crio-histológicos, os protocolos tradicionais de precipitação de corantes cromogênicos são inadequados devido ao potencial desalinhamento da cor com a imagem fluorescente causada por etapas de desidratação. Embora o protocolo aquoso produza padrões de coloração semelhantes aos das seções de parafina, a imagem pós-coloração rápida é essencial para evitar a difusão do corante do tecido. A utilização de 30% de glicerol em água destilada como meio de montagem pode desacelerar essa difusão, permitindo várias colorações cromogênicas na mesma seção, incluindo cartilagem com Safranin O/Fast Green.

O processo de ossificação endocondral é claramente visível com condrócitos vermelhos revestindo a ponte óssea em evolução (Figura 6). O uso adicional de técnicas de imuno-histoquímica, para as quais existem muitos anticorpos murinos disponíveis, pode melhorar ainda mais os estudos mecanísticos conduzidos nesses camundongos transgênicos. Ao todo, a combinação de faxitron, microCT e técnicas de imagem crio-histológica neste modelo de camundongo transgênico oferece uma compreensão abrangente das alterações macroscópicas e microscópicas que ocorrem em resposta a lesões na placa de crescimento, abrindo caminho para futuras intervenções terapêuticas para mitigar tais resultados adversos. Outras manipulações genéticas desses camundongos transgênicos podem ser feitas para permitir que estudos de rastreamento de linhagem entendam a origem das células que estão temporal e espacialmente envolvidas na cura. A experimentação em camundongos com modificações adicionais permitiria o estudo de doenças da cartilagem, como o osteocondroma - um crescimento excessivo de cartilagem e osso perto da placa de crescimento.

A consistência do nosso modelo é demonstrada pela formação reprodutível de pontes ósseas em todos os camundongos sem a necessidade de descartar nenhum camundongo do grupo devido à lesão da cartilagem articular. Esta é uma melhoria em relação aos modelos anteriores que se aproximavam da placa de crescimento a partir de uma janela cortical abaixo da placa de crescimento e inclinavam uma ferramenta afiada ou broca para cima em direção à placa de crescimento e, ocasionalmente, ultrapassavam a cartilagem articular. Uma lesão adicional da cartilagem articular não imita as lesões comuns da placa de crescimento em crianças. A lesão mais precisa desse modelo animal reduz o número de camundongos necessários por experimento e essa é outra melhoria. O uso de camundongos transgênicos permite que o pesquisador concentre a lesão em subseções da placa de crescimento, como a área hipertrófica/provisoriamente calcificada ou a epífise/zona de repouso/zona proliferativa, sem afetar a cartilagem articular. No entanto, uma limitação desse modelo é a variabilidade no volume da ponte óssea, que pode diferir em até 30% entre os animais lesionados. Consequentemente, a detecção de um efeito clinicamente significativo na formação de pontes ósseas ainda requer um grande número de animais para atingir relevância estatística.

Os benefícios para um modelo de camundongo, conforme descrito aqui, em comparação com os modelos de lesão da placa de crescimento de ratos ou coelhos publicados anteriormente 7,9,10,14, incluem um número menor de animais usados, redução de custos, um tamanho de replicação eficiente devido à formação de barras ósseas reprodutíveis, um período de estudo mais curto e colocação de lesão mais precisa devido à imagem ao vivo dos camundongos transgênicos triplos. Embora não seja discutido em detalhes, este modelo de camundongo pode ser usado para testar implantes de engenharia de tecidos ou biomateriais que fornecem fatores de crescimento. Uma limitação notável desse método murino é que o tamanho de um implante usado para administrar drogas ou células terapêuticas é limitado ao volume do defeito de aproximadamente uma esfera de 0,5 mm de diâmetro. Somente modelos animais maiores podem acomodar o volume de material de teste que seria usado em pacientes humanos. O defeito da broca criado neste protocolo não tem a mesma geometria de uma fratura fina e, portanto, difere das lesões humanas reais. No entanto, os benefícios deste modelo de camundongo são muitos, e a abordagem lateral evita danos à cartilagem articular que ocorreriam ao se aproximar cegamente acima ou abaixo da placa de crescimento alinhada com o eixo longo da tíbia. Essa metodologia representa um salto substancial na pesquisa de lesões em placas de crescimento, fornecendo um método detalhado e reprodutível para investigar patologias e avaliar novas estratégias terapêuticas.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma doação dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele (NIAMS) 1R21AR079153 e uma bolsa do Programa de Aprimoramento de Pesquisa (REP) da Universidade de Connecticut. Os autores gostariam de agradecer a assistência de Renata Rydzik, da instalação do MicroCT Imaging Core da Universidade de Connecticut.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-metil-butanoSigma AldrichM32631
Almofadas anti-sépticas de álcoolAcme United CorporationH305-200
Axio Scan.Z1Carl Zeiss AGAxio Scan.Z1
Software AxioVisionCarl Zeiss AG
Solução de Betadine (10% de iodopovidona)Avrio Health LP67618-150-01
CalceinSigma AldrichC0875
Calcein BlueSigma AldrichM1255
CFP conjunto de filtrosChroma Technology Corp.49001
CryomatrixThermo Scientific6769006
CryomoldsFisher ScientificFisherbrand #22-363-554
CryostatLeica Biosystems3050s
Lâminas de CryostatThermo Scientific3051835
CryotapeSection LabCryofilm 2C
Curvo fino tesoura Fine Science Tools14061-11
Pinça hemostática de mosquito curvoHuFriedyGroupH3
cy5 conjunto de filtrosChroma Technology Corp.49009
DAPIThermoFisher Scientific62247
Conjunto de filtros DAPIChroma Technology Corp.49000
Broca dentária (0,5 mm de diâmetro)
Escultor discóide cleóide dentalACE Surgical Supply Inc.6200097A-EA
Esterilizador de esferas de vidro seco (Inotech Steri 350)Inotech Bioscience, LLCIS-250
Perfurador de orelhaFine Science Tools24212-01
Almofada
Controle eletrônico de péNouvag AG1866nou
Motores eletrônicos 31 ESSNouvag AG2063nou
Barreira de superfície ambiental (tubo de 3 x 12 polegadas)Patterson Companies, Inc.BB-0312H
Etanol (70%)
Ethiqa XR (suspensão injetável de liberação prolongada de buprenorfina) 1,3 mg/mLFidelis Animal Health86084-100-30
Gabinete de raios-x FaxitronKubtechScientific Parameter
Fluorescência EstereomicroscópioCarl Zeiss AGLumar V12
GFP conjunto de filtrosChroma Corporação de Tecnologia.49020
Ácido acético glacialSigma AldrichARK2183
lâminas de microscópio de vidroThermo Scientific3051
GlicerolSigma AldrichG5516
Graefe fórcepsFine Science Tools11051-10
Peça de mão (contra ângulo 32: 1 botão de pressão)Nouvag AG5201
Unidade de controle do sistema de implantodontia/cirurgia oral (Straumann)Nouvag AGSEM 
Bolsa de esterilização de selagem instantânea com indicadores de processo internos/externos duplos (3 1/2 x 5 1/4  polegada)Fisher Scientific01-812-50
com indicadores de processo interno/externo duplos (5 4/1 x 10 polegadas)Fisher Scientific01-812-54
(29 G)Exel International26028
Isoflurano& nbsp;Dechra Pharmaceuticals plc17033-091-25
anestésico de isoflurano
mCherry conjunto de filtrosChroma Technology Corp.39010
Micro-dissecando scissorferramentas da ciência fina14084-08
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Agulha (20 G)Becton, Dickinson and Company305178
suporte da agulhaHuFriedyGroupNHCW
Formalina tamponada neutra (10%)Sigma AldrichHT501128-4L
Cotonetes aplicadores não estéreisAllegro Industries205
Gaze não tecida (3 x 3 polegadas)Fisher Scientific22028560
Norland Optical Adhesive, 61Norland OpticalNorland Optical Adhesive, 61
Pomada oftálmica (lubrificante ocular Optixcare)CLC Medica
PBSSigma AldrichP5368
Sonda periodontalHuFriedyGroupPQW
Phosphate tamponado com solução salina (PBS) pH 7.4 (1x)Gibco, por Life Technologies10-010-023
Lâminas de microscópio de plásticoMicroscopia Eletrônica Sciences71890-01
Tesoura/aparador profissional (Wahl Classic Peanut)Wahl Clipper Corporation8685
RollerMicroscopia Eletrônica Ciências62800-46
Scanco Software médicoSCANCO MedicalScanco μ CT 50
Acetato de sódio anidroSigma AldrichS2889
Nitrito de sódioSigma AldrichS2252
Tartarato de sódio dibásico di-hidratadoSigma AldrichT6521
Disco de espécimeLeica Biosystems14037008587
Lâmina cirúrgica de aço inoxidável #15 Produtos Cirúrgicos Aspen, Inc.
Luvas cirúrgicas estéreisCardinal Health, Inc.2D72PT65X
Campo de toalha estéril (18 x 26 polegadas)IMCO4410-IMC
SacaroseSigma AldrichS9378
Seringa (1 mL)Becton, Dickinson and Company309659
Sutura de vicryl revestida trançada não tingida (5-0)Ethicon Inc.J490G
Luz negra UVGeneral ElectricF15T8-BLB
de aquecimento elétricoBolsa de esterilização de selagem instantânea Seringa de insulina Sistema 371615

Referências

  1. Iannotti, J. P. Growth plate physiology and pathology. Orthop Clin North Am. 21 (1), 1-17 (1990).
  2. Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Injury responses and repair mechanisms of the injured growth plate. Front Biosci (Schol Ed). 3 (1), 117-125 (2011).
  3. Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries involving the epiphyseal plate. JBJS. 45 (3), 587-622 (1963).
  4. Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications in brief: Salter-harris classification of pediatric physeal fractures. Clin Orthop Relat Res. 474 (11), 2531-2537 (2016).
  5. Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49 (4), 904-912 (2011).
  6. Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Eng Part B Rev. 24 (2), 85-97 (2018).
  7. Xian, C. J., Zhou, F. H., Mccarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22 (2), 417-426 (2004).
  8. Muruganandan, S., et al. A foxa2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).
  9. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46 (6), 1555-1563 (2010).
  10. Lee, E. H., Gao, G. X., Bose, K. Management of partial growth arrest: Physis, fat, or silastic. J Pediatr Orthop. 13 (3), 368-372 (1993).
  11. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156 (2), 128-134 (2012).
  12. Foster, B. K., et al. Reimplantation of growth plate chondrocytes into growth plate defects in sheep. J Orthop Res. 8 (4), 555-564 (1990).
  13. Erickson, C. B., et al. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. J Vis Exp. (125), e55571(2017).
  14. Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19 (3-4), 475-483 (2013).
  15. Mccarty, R. C., Xian, C. J., Gronthos, S., Zannettino, A. C., Foster, B. K. Application of autologous bone marrow derived mesenchymal stem cells to an ovine model of growth plate cartilage injury. Open Orthop J. 4, 204-210 (2010).
  16. Chen, J., et al. Isolation and characterization of murine mandibular condylar cartilage cell populations. Cells Tissues Organs. 195 (3), 232-243 (2012).
  17. Clearfield, D. S., Xin, X., Yadav, S., Rowe, D. W., Wei, M. Osteochondral differentiation of fluorescent multireporter cells on zonally-organized biomaterials. Tissue Eng Part A. 25 (5-6), 468-486 (2019).
  18. Dyment, N. A., et al. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
  19. Kalajzic, I., et al. Use of type i collagen green fluorescent protein transgenes to identify subpopulations of cells at different stages of the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 17 (1), 15-25 (2002).
  20. Maye, P., et al. Generation and characterization of col10a1-mcherry reporter mice. Genesis. 49 (5), 410-418 (2011).
  21. Chokalingam, K., et al. Three-dimensional in vitro effects of compression and time in culture on aggregate modulus and on gene expression and protein content of collagen type ii in murine chondrocytes. Tissue Eng Part A. 15 (10), 2807-2816 (2009).
  22. Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sci. 152, 244-248 (2016).
  23. Dyment, N. A., et al. multi-image cryohistology of mineralized tissues. J Vis Exp. (115), e54468(2016).
  24. Chavez, M. B., et al. Guidelines for micro-computed tomography analysis of rodent dentoalveolar tissues. JBMR Plus. 5 (3), e10474(2021).
  25. Chung, R., Xian, C. J. Recent research on the growth plate: Mechanisms for growth plate injury repair and potential cell-based therapies for regeneration. J Mol Endocrinol. 53 (1), T45-T61 (2014).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Modelo de Camundongo TransgênicoCamundongos Repórteres FluorescentesRegeneração de CartilagemFormação de Ponte ÓsseaCondrócitos HipertróficosSalter-Harris Tipo IIEstereomicroscopia de FluorescênciaAlongamento de MembroDiferenciação de Condrócitos
Modelo Murino Transgênico Tricolor para Estudo de Lesão em Placa de Crescimento
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.