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Avaliação de características estruturais em Triticum aestivum e Zea mays para diferenciação fotossintética C3 e C4 usando seções à mão livre e semifinas

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DOI:

10.3791/66843

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12 de julho de 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

Avaliar as diferenças anatômicas entre as seções transversais das folhas C3 e C4 ajuda a entender a eficiência da fotossíntese. Este artigo descreve a preparação e o exame de seções transversais de folhas à mão livre e semifinas, juntamente com as ressalvas na preparação para as espécies de culturas Triticum aestivum e Zea mays.

Resumo

A eficiência aprimorada da fotossíntese C4 , em comparação com o mecanismo C3 , surge de sua capacidade de concentrar CO2 em células da bainha do feixe. A eficácia da fotossíntese C4 e a eficiência intrínseca do uso da água estão diretamente ligadas à participação do mesofilo e das células foliares do feixe, tamanho e densidade das bainhas do feixe e tamanho, densidade e espessura da parede celular das células da bainha do feixe. A análise microscópica rápida dessas características pode ser realizada em seções à mão livre e semifinas usando microscopia de luz convencional, fornecendo informações valiosas sobre a eficiência fotossintética em culturas C4 por meio da identificação e exame de tipos específicos de células. Além disso, são mostrados erros no preparo à mão livre e semifina que afetam as medidas anatômicas e os diagnósticos do tipo de célula, bem como a forma de evitar esses erros. Essa abordagem microscópica oferece um meio eficiente de coletar insights sobre a aclimatação fotossintética à variação ambiental e auxilia na triagem rápida de culturas para climas futuros.

Introdução

A fotossíntese é um processo fundamental onde a energia luminosa é convertida em energia química, servindo como pedra angular das redes tróficas terrestres. A maioria das plantas segue a via C3 da fotossíntese, onde o principal produto fotossintético é o composto de três carbonos glicerato 3-fosfato. A fotossíntese C3 evoluiu há mais de 2 bilhões de anos na atmosfera abundante em CO2 e baixa em O21. A principal enzima fotossintética ribulose 1,5 bifosfato carboxilase / oxigenase (Rubisco), que evoluiu nessas condições, é subótima para as atuais condições de baixo CO2 alto O2, pois reage competitivamente com O2, iniciando a fotorrespiração2. A fotorrespiração é uma via de desperdício que consome energia em vez de produzi-la e liberar CO2 como subproduto. Consequentemente, é crucial manter alta concentração de CO2 ao redor da Rubisco nos cloroplastos para evitar a oxigenação 3,4. Devido à incapacidade das plantas de C3 de concentrar CO2, há uma redução significativa de CO2 do ar ambiente para os cloroplastos, restringindo a fotossíntese e afetando o crescimento das plantas e a produção de biomassa 2,5,6.

Em plantas C3, a fotossíntese é limitada pela entrada de CO2 através dos estômatos, sua difusão através do mesofilo e a atividade bioquímica das enzimas fotossintéticas. A entrada de CO2 é inicialmente limitada pela condutância estomática, que é controlada por condições ambientais, como temperatura e umidade do ar. Em seguida, o CO2 se difunde através da fase gasosa e líquida interna da folha para Rubisco7. Nas plantas C3, todos os estágios da fotossíntese ocorrem nos cloroplastos das células do mesofilo, e as plantas precisam manter um influxo constante de CO2 da atmosfera para os cloroplastos. A dependência da disponibilidade de CO2 nos cloroplastos na abertura estomática, na arquitetura do mesofilo e nas características individuais das células e do cloroplasto deixa as plantas suscetíveis a restrições ambientais que eventualmente afetam a fotossíntese, como baixa disponibilidade de água e altas temperaturas 7,8,9,10, destacando particularmente sua vulnerabilidade às condições de mudança climática11.

Dados os desafios impostos pelas ineficiências da via C3, bem como as limitações na manutenção de níveis ideais de CO2 e suscetibilidade a fatores ambientais, em certas plantas, outra via, a via de fotossíntese C4, evoluiu. Caracteristicamente, as plantas C4 têm duas vias bioquímicas separadas espacialmente; a fixação inicial do CO2 ocorre nas células do mesofilo pela fosfoenolpiruvato carboxilase, que tem maior afinidade pelo CO2 do que a Rubisco e também não possui atividade de oxigenação. O produto C4 formado é posteriormente transportado para as células da bainha do feixe, onde é descarboxilado, e o CO2 é novamente liberado e fixado por Rubisco (fotossíntese C3) 12 , 13 , 14 . A maior afinidade da PEP carboxilase com o CO2 e as paredes celulares espessas das células da bainha do feixe permite a concentração de CO2 nas células da bainha do feixe e, portanto, as plantas de C4 minimizam a fotorrespiração segregando espacialmente a fixação de CO2 e o ciclo de Calvin. A adoção do caminho C4 mostra a resposta adaptativa da natureza às restrições ambientais, oferecendo insights sobre estratégias potenciais para melhorar a produtividade e a resiliência das culturas em mudanças nas condições climáticas15.

A anatomia especializada da estrutura foliar em plantas C4 é caracterizada por nervuras cercadas por células da bainha do feixe vascular aumentadas contendo cloroplastos e com um arranjo radial de células do mesofilo em um padrão de anel externo ao redor das células da bainha do feixe. As células do mesofilo estão próximas às células da bainha do feixe, o que permite um transporte rápido e contínuo de metabólitos entre os dois tipos de células. O arranjo dessa célula é típico das plantas C4 e é conhecido como anatomia de Kranz16. Nas espécies C3, a especialização e a disposição das células do mesofilo podem variar, mas as células da bainha do feixe são distintamente menores e têm alguns cloroplastos ou nenhum cloroplasto. A anatomia específica de Kranz permite concentrar o CO2 nos cloroplastos nas células da bainha do feixe onde se localiza a enzima carboxilante C3 Rubisco, dificultando efetivamente a fotorrespiração 4,17,18. Apesar de seu arranjo aparentemente complexo, essas mudanças ocorreram independentemente várias vezes na evolução das angiospermas, indicando que é uma via evolutiva relativamente viável 19,20,21, e vários táxons demonstraram estar em um estágio intermediário entre o metabolismo do carbono C 3 e C4, referido como C3-C 4 ou C 2, ter habilidades para se concentrar e reassimilar CO2 22,23,24,25.

Muitas plantas C4 são culturas com alta importância econômica, e a engenharia genética de culturas C3, como o arroz, para melhorar sua resiliência climática e garantir o rendimento tem sido um tópico de interesse nas últimas décadas26,27. No entanto, os esforços de engenharia exigem uma compreensão detalhada da anatomia especializada em C4 e como ela controla a fotossíntese 2,28.

Estabelecer a anatomia de C4 Kranz é um pré-requisito para atingir a ambiciosa meta de projetar a fotossíntese de C4 em culturas C3 25. No entanto, a compreensão atual da regulação da anatomia de Kranz e dos métodos para rastrear rapidamente suas principais características anatômicas é limitada, dificultando a identificação de espécies híbridas. Estudos anteriores mostraram que as principais características que regulam a eficiência fotossintética em plantas C3 e C4 incluem a distância internerval, o diâmetro do complexo da bainha do feixe e o tamanho das células da bainha do feixe14,29. Essas características podem ser facilmente rastreadas usando seções à mão livre e analisadas quantitativamente usando seções semifinas. Aqui, descrevemos o método de avaliação das características que permitem o diagnóstico de diferenciação anatômica C3 e C4 por meio de microscopia cruzada e óptica à mão livre, ou seja, área da bainha do feixe, distância internerval e frequência da veia.

Protocolo

1. Condições de crescimento das plantas

  1. Selecione trigo (Triticum aestivum L. Var. Trigo de inverno, "Fredis") e milho (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") como plantas representativas C3 e C4 , respectivamente. Cultive ambas as espécies de plantas em uma câmara de crescimento controlada pelo ambiente a partir de sementes.
  2. Mantenha a umidade relativa em 55% com a temperatura do ar em 25 °C/18 °C (dia/noite) com um período de luz de 12 h. Manter a densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (Q) na superfície da planta em 1200 μmol / m2 / s para representar suas condições naturais de crescimento. Cultive todas as plantas a uma concentração ambiente de CO2 de 400 μmol/mol.
  3. Regue as plantas a cada 2dias com água destilada e fertilize com a solução de Hoagland 10 dias após a emergência das mudas. Cultive as plantas nas condições dadas por 60 dias e use folhas totalmente expandidas para análises microscópicas.

2. Preparação e visualização de seções à mão livre

  1. Selecione 3 folhas maduras não senescentes de cada planta e mantenha-as em água destilada. Usando uma nova lâmina de barbear de um lado, faça um corte de nivelamento para formar um ângulo reto com a superfície da folha para garantir que as seções sejam seções transversais perpendiculares à superfície da folha.
  2. Coloque a amostra de folha em uma placa de vidro sobre um pedaço de cera dental para estabilizar a amostra e evitar escorregar. Corte movendo a lâmina diretamente para baixo na amostra da folha para cortar de forma limpa as células. Mantenha as seções transversais em água destilada.
  3. Monte as amostras em uma lâmina de vidro, colocando-as em uma gota de água e cobrindo-as com uma lamínula de vidro para visualização microscópica e imagem. Evite prender bolhas de ar.
  4. Visualize a lâmina sob um microscópio de luz composto com ampliação de 10x e 20x. Salve as imagens de acordo com o guia do software, juntamente com a escala relevante.

3. Preparação de seções semifinas

  1. Corte seções de aproximadamente 3 mm x 5 mm de tamanho das áreas intercostais ao longo da nervura central das folhas de Z. mays e T. aestivum em uma placa de vidro como na etapa 2.2. Certifique-se de que o comprimento da seção cortada corre ao longo do grão da folha.
  2. Coloque o material vegetal em uma seringa com 1 mL de tampão de fixação (aldeído glutárico a 4% em tampão fosfato 0,1 M, pH = 6,9, Tabela 1).
  3. Segure a seringa verticalmente, remova o ar e, segurando um dedo na ponta, bombeie a seringa para criar um vácuo. Repita até que as amostras estejam no fundo da seringa, indicando infiltração bem-sucedida.
  4. Transfira o conteúdo da seringa para um frasco para injetáveis de vidro rotulado e conserve a 4 °C durante 48 h antes do passo seguinte (Tabela 2).
  5. Para cada frasco para injetáveis, remova suavemente o fixador com uma pipeta e adicione o tampão fosfato até que a amostra esteja coberta. Deixe por 30 min. Repita esta etapa 3x.
  6. Remover o tampão fosfato com uma pipeta e adicionar o tetróxido de ósmio (CUIDADO) até cobrir a amostra. Amostras e outras matérias orgânicas ficarão pretas. Use luvas duplas. Deixe por 1 h.
  7. Remover a solução anterior com uma pipeta e cobrir as amostras com água destilada. Deixe por 30 min Repita esta etapa 3x e use luvas duplas.
  8. Retirar a solução anterior com uma pipeta e cobrir as amostras com a solução de água-etanol destilada 50/50. Deixe por 30 min. Repetir este passo com soluções destiladas de água-etanol das seguintes séries: 30/70, 20/80, 10/90 e 2x a 100 % de etanol. As amostras em qualquer uma destas soluções podem ser deixadas durante a noite a 4 °C.
  9. Remover a solução anterior com uma pipeta e cobrir as amostras com 1/3 de solução de resina e etanol. Coloque as amostras em uma placa misturadora e deixe por 2 h. Repita esta etapa com soluções de resina-etanol nas seguintes séries: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 e 2x a 100% de resina. As amostras em qualquer uma destas soluções podem ser deixadas durante a noite a 4 °C.
  10. Cubra as cavidades de um molde de incorporação plano (16 cavidades, dimensões da cavidade: 14 L x 4,8 W x 3 D (mm)) com 100% de resina e coloque as amostras em uma extremidade da cavidade. Prepare etiquetas de papel escritas a lápis para cada amostra e coloque-as na outra extremidade da cavidade.
  11. Preencha completamente todas as cavidades com 100% de resina e endireite as amostras e rótulos se eles se moverem. Cubra o molde com filme de incorporação e polimerize em um forno de acordo com as diretrizes do produto de resina acrílica.
  12. Coloque o bloco polimerizado com a amostra no suporte de amostra do ultramicrótomo. Apare o bloco usando uma faca de vidro áspera até que o tecido se torne visível e o excesso de resina seja eliminado.
  13. Corte seções semifinas transversalmente (1 μm) usando uma faca de vidro ou diamante. Colete as seções usando um laço de inoculação de metal da superfície da água e coloque-as em uma lâmina de vidro. Seque a lâmina numa placa de aquecimento (60 °C) para fixar as secções no vidro.
  14. Manchar as seções fixas com azul de toluidina (solução aquosa a 1%) por 5 s antes de enxaguar com água destilada e secar novamente na placa quente.
    NOTA: Certifique-se de que o processo de fixação química seja realizado sob uma capela de exaustão. As facas de vidro devem ser substituídas periodicamente para garantir cortes afiados que permitam seções sem rasgos ou distorções.

4. Imagem de amostras

  1. Imagem de seções de folhas frescas
    1. Configure o microscópio óptico composto com o software que o acompanha de acordo com o manual.
    2. Coloque a lâmina de vidro no palco. Ajuste a ocular e visualize a seção em 10x para obter uma visão geral, depois em objetivas de 20x e 40x.
    3. Em cada objetivo, navegue no canal ao vivo, concentre-se na área de interesse e localize as células da bainha do feixe ao redor da veia.
    4. Uma vez focado, clique no botão Congelar e adicione a escala pressionando o botão Barra de escala na guia Ferramentas. Salve a imagem em . Formato TIF para análise de imagens.
  2. Imagem de seções infiltradas por resina
    1. Configure o microscópio óptico automatizado em conexão com o software que o acompanha no computador.
    2. Carregue o canal transparente e coloque a lâmina na platina do microscópio. Concentre-se na seção usando uma ampliação objetiva de 40x e ajuste o brilho para garantir que todas as estruturas celulares estejam visíveis.
    3. Defina a área de localização da seção usando a função de navegador para garantir que toda a seção seja visualizada e clique no botão Costurar .
    4. Clique em Concluído e, em seguida, em Iniciar para permitir que o microscópio crie imagens de toda a seção. Abra o software de análise de imagem e abra os ladrilhos tirados pelo microscópio.
    5. Usando o recurso Alinhar, certifique-se de que os blocos não se sobreponham. Depois de gerar a imagem, ajuste o posicionamento, o brilho e a rotação usando a guia Ajustar.
    6. Imprima a escala na imagem antes de salvar em . Formato TIF.
  3. Medidas anatômicas usando o software ImageJ
    1. Abra o software ImageJ e carregue a imagem arrastando-a para a janela.
    2. Usando a ferramenta Linha, calibre a escala da seguinte maneira: Desenhe uma linha sobre a barra de escala, escolha Analisar > Definir escala, altere a distância conhecida para o comprimento da barra de escala e altere a unidade de comprimento para a unidade correta.
    3. Meça a característica prospectiva selecionando a Ferramenta Linha, desenhando uma linha na área de interesse e pressionando a tecla M .
    4. Para medições de área, selecione a Ferramenta de seleção de polígonos e desenhe ao redor do tecido de interesse. Conclua pressionando a tecla M . As medições aparecem como uma janela pop-up, que pode ser copiada para uma planilha para análise posterior dos dados.

Resultados

A Figura 1A mostra a orientação correta para seccionar a folha para seccionamento fresco e microscopia de luz. O método para cortar seções frescas usando uma navalha de um lado e uma folha de cera dental pode ser visto na Figura 1B. As seções resultantes são mostradas na Figura 1C.

A Figura 2 mostra seções à mão livre de folhas representativas da planta C3 T. aestivum e da planta C4 Z. mays. As células da bainha do feixe são visíveis ao redor da veia, com o milho tendo células mais redondas e verdes, indicando uma maior presença de cloroplastos. É possível obter a espessura da folha e a área total da bainha do feixe a partir dessas imagens; no entanto, a caracterização adicional do mesofilo não é possível com este método.

A Figura 3 mostra seções transversais semifinas de T. aestivum e Z. mays. Com este método, todos os tecidos da folha são visíveis e mensuráveis. A anatomia de Kranz é evidente em Z. mays, com células do mesofilo dispostas ao redor das veias. As bainhas dos feixes são aumentadas e preenchidas com cloroplastos, notavelmente concentrados em direção às células do mesofilo. Isso permite uma rápida troca de metabólitos entre as células da bainha do feixe e as células do mesofilo. A partir dessas imagens, as seguintes características estruturais foliares foram medidas: distância internerval entre nervuras pequenas e grandes, diâmetro da bainha do feixe, área total da bainha do feixe, área das veias, fração da área das células da bainha do feixe, área das células da bainha do feixe, frequência das veias dentro de 500 μm e espessura da folha. Os gráficos de caixa na Figura 4 mostram a diferença em tais características entre T. aestivum e Z. mays. Todas, exceto uma característica, a distância internerval entre as veias grandes, são significativamente diferentes em um intervalo de confiança de 95% com um valor de p < 0,05.

A Figura 4 mostra uma coleção de gráficos de caixa que representam as diferenças de características anatômicas entre T. aestivum e Z. mays, exemplificando as diferenças entre as estruturas das bainhas dos feixes C3 e C4 . Há uma distinção significativa entre as distâncias internervais entre as espécies de culturas, o diâmetro da bainha do feixe (sob as mesmas condições de crescimento), a fração de células da bainha do feixe e material não fotossintético (ou seja, veias) e a frequência das veias em uma largura de seção de 500 μm - todos os quais são fortemente indicativos do que é esperado entre a anatomia da folha C3 e C4 .

A Figura 5 mostra alguns exemplos de erros que podem ocorrer ao cortar ou preparar as amostras. A anatomia da folha nessas imagens é mascarada ou deformada e, portanto, não é confiável para caracterização. A coloração excessiva com azul de toluidina pode ocorrer em cortes cortados com o ultramicrótomo nos quais a coloração é deixada por muito tempo, obscurecendo assim a estrutura celular (Figura 5A, B). Erros comuns podem ocorrer durante o protocolo de infiltração em que a resina não penetra totalmente nos tecidos foliares (Figura 5C,D). As seções transversais das folhas que são cortadas ao longo do grão resultam em células oblongas nas quais o mesofilo e as células da bainha do feixe não podem ser localizados nem medidos corretamente ( Figura 5 F , G , H ).

As análises estatísticas foram realizadas em R (versão 4.3.1) para criar boxplots. As características anatômicas das folhas foram medidas em triplicata (3 folhas por planta, 3 plantas por espécie).

Configuração de cromatografia de seção foliar; extração de pigmento verde. Diagrama de etapas para separação de pigmentos.
Figura 1: Método correto para cortar seções transversais de folhas frescas. (A) A orientação das seções das folhas para obter uma seção transversal. (B) Técnica para seccionar folhas usando uma lâmina de barbear de um lado em um pedaço de cera dental plana. (C) As seções transversais resultantes aparecem como lascas de folhas finas que estão prontas para serem montadas em uma lâmina de vidro e visualizadas ao microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Microscopia de corte transversal da estrutura foliar da planta, escalas de 50μm e 100μm, detalhe do tecido vascular.
Figura 2: Seções à mão livre de folhas representativas. (A) A planta C3 Triticum aestivum (ampliação de 400x); e (B) a planta C4 Zea mays em (aumento de 200x). O tipo de célula é indicado por setas, onde V = veia, BSC = célula da bainha do feixe e MC = célula do mesofilo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama de anatomia vegetal mostrando a seção transversal do feixe vascular com rótulos para tecidos e estruturas.
Figura 3: Seções transversais semifinas. (A) Zea mays e (B) Triticum aestivum para mostrar as diferenças nas bainhas dos feixes e posições dos cloroplastos nas espécies C4 com anatomia de Kranz (A) e espécies C3 sem anatomia de Kranz (B). Abreviaturas: Tl = espessura da folha, BS = bainha do feixe, SV = nervura pequena, ID = distância internerval e LV = nervura grande. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráficos de caixa comparando T. aestivum e Z. mays usando o teste T; as métricas incluem SY-HD, LV-ID e VBA.
Figura 4: Box-plots mostrando a diferença nas características anatômicas entre Triticum aestivum e Zea mays. (A) distância internerval entre veias pequenas, (B) distância internerval entre veias grandes, (C) diâmetro da bainha do feixe, (D) área total da bainha do feixe, (E) área das veias, (F) fração da área das células da bainha do feixe, (G) área das células da bainha do feixe, (H) frequência da veia dentro de 500 μm e (I) espessura da folha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagens microscópicas de seções transversais de tecidos vegetais, destacando a estrutura celular e a anatomia.
Figura 5: Exemplos de erros comuns que podem ocorrer no processamento de tecidos, indicados por setas vermelhas. Coloração excessiva em amostras incluídas em resina acrílica LR White (A) Triticum aestivum e (B) Zea mays; rasgos em resina em cortes embebidos em resina epóxi de Spurr (C) Ceratozamia robusta e (D) Dioon mejiae; Seções à mão livre de T. aestivum mostrando (E) seção transversal e (F) seção longitudinal; viés no corte devido a cortes oblíquos em (G) Annona muricata e (H) Encephalartos villosus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

SoluçãoPreparaçãoVolume final
Base para o Buffer 1Dissolver 7,12 g de Na2HPO4. 2H2O em 200 mL de água destilada200 mL
Base para o Buffer 2Dissolver 7,12 g de NaH2PO4. 2H2O em 200 ml de água destilada200 mL
Tampão fosfatoMisture 36 mL de Base 1, 14 mL de Base 2 e 50 mL de água destilada100 mL
Solução fixadoraMisture 9,25 mL de glutaraldeído a 5% (cuidado: consulte a tabela de materiais), 12,5 mL de tampão fosfato e 28,25 mL de água destilada. Conservar a 4 °C.50 mL

Tabela 1: Receita para a solução fixadora.

PassoDescriçãoDuraçãoRepetir
1Enxágue com tampãoRemova suavemente o fixador com uma pipeta e adicione o tampão fosfato até que a amostra esteja coberta. Deixe por 30 min.30 min3x
2Coloração com tetróxido de ósmio a 1%(Cuidado: consulte a Tabela de Materiais): Remova o tampão fosfato com uma pipeta e adicione o tetróxido de ósmio até que a amostra seja coberta. Amostras e outras matérias orgânicas ficarão pretas. Use luvas duplas.60 minutos1
3Enxaguar as amostras com água destiladaRemover a solução anterior com uma pipeta e cobrir as amostras com água destilada. Deixe por 30 min. Repita esta etapa 3x. Use luvas duplas.30 min3 vezes
4Infiltração em série de etanolRetirar a solução anterior com uma pipeta e cobrir as amostras com a solução de água-etanol destilada 50/50. Deixe por 30 min. Repita esta etapa com soluções destiladas de água-etanol nas seguintes séries: 30/70, 20/80, 10/90 e 100% de etanol.30 min1
5Infiltração em série de resina-etanolRemover a solução anterior com uma pipeta e cobrir as amostras com 1/3 de solução de resina e etanol. Coloque as amostras em uma placa misturadora e deixe por 2 h. Repita esta etapa com soluções de resina-etanol nas seguintes séries: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 e 100% de resina.120 minutos1
6Conservar no frigorífico durante 72 h antes da polimerização
7Polimerize seções de folhas infiltradas de acordo com as especificações do produto para obter amostras embebidas em resina.

Tabela 2: Protocolo de infiltração de resina.

Discussão

Neste artigo, discutimos os métodos quantitativos e qualitativos de medição da anatomia foliar e as maneiras pelas quais eles podem ser otimizados. Além disso, a metodologia é aplicada a espécies de culturas representativas para determinar quais características anatômicas são mais úteis na distinção entre as seções transversais C3 e C4 . Compreender essas características é essencial, pois as espécies híbridas, denominadas fotossíntese C2 , estão se tornando uma via de pesquisa mais promissora. Até agora, apenas uma espécie de cultura, Diplotaxis tenuifolia (rúcula), foi identificada para usar a fotossíntese C2 , mas é provável que haja mais do que os registros atuais indicam25. Altos níveis de diversidade fotossintética intraespecífica e plasticidade estão presentes nas linhagens C2 . Isso implica que a confirmação da ocorrência da fotossíntese de C2 requer múltiplas linhas de evidência, como ponto de compensação de CO2 , análises ultraestruturais e imuno-histoquímica30.

Seções à mão livre e semifinas têm sido usadas na identificação e medição de tecidos vegetais específicos por muitos anos, mas este artigo tem como objetivo discutir o caso de uso particular de estruturas anatômicas da folha que afetam a diferenciação fotossintética entre plantas de cultivo C3 e C4 . Existem ressalvas para seccionamento à mão livre e semifino que devem ser consideradas. Seções à mão livre, embora rápidas de obter, provavelmente resultarão em seções de folhas com espessuras inconsistentes, dificultando análises quantitativas. Isso pode ser evitado usando equipamentos especializados para o seccionamento de material vegetal fresco (por exemplo, vibratomo ou criostato). As seções mais grossas do corte manual podem resultar em várias camadas de células umas sobre as outras, borrando as células e, portanto, a anatomia. Se o objetivo do corte for puramente qualitativo, os cortes à mão livre oferecem a vantagem do processamento químico de tecidos vegetais (ou seja, histoquímica)31. Isso permite a indicação qualitativa da presença de compostos específicos nas células vegetais. Por outro lado, seções semifinas quase sempre resultam em seções consistentemente grossas. No entanto, os processos são mais longos, delicados e, portanto, propensos a erros. Os problemas que podem surgir, bem como as formas de evitá-los, são discutidos mais adiante.

Fixação
O material fresco deve ser usado tanto para seções à mão livre quanto semifinas, ou seja, folhas de plantas suficientemente hidratadas. Seções de folhas murchas não têm integridade estrutural, pois as células têm uma pressão de turgor diminuída. Ao obter seções semifinas de material embebido em resina, é fundamental garantir que as seções das folhas sejam fixadas sob vácuo para substituir o ar dentro da folha. Isso permite integridade estrutural e osmose durante o processo de infiltração. Se essa etapa não for feita corretamente, as células provavelmente entrarão em colapso, levando a cortes transversais que não retratam com precisão a estrutura real da folha e, subsequentemente, medidas anatômicas incorretas32.

Por outro lado, a alta pressão de vácuo pode danificar folhas com tecidos moles (como cotilédones), resultando em células encolhidas ou na destruição das amostras. Isso pode ser evitado usando uma configuração apropriada da bomba de vácuo ou ignorando-a completamente e apenas mergulhando as amostras na solução fixadora. Se este último for preferido, as amostras podem ser cortadas em todos os lados, para facilitar a infiltração do fixador no tecido.

Pré-infiltração
A espessura da parede celular e o tecido escleroide são as características anatômicas mais influentes para a permeação de soluções que permitem a fixação e infiltração ideais do espécime. O objetivo das esclereídas no tecido vegetal é o suporte e a proteção mecânica, o que pode impactar o processo de infiltração33. Como esses tecidos têm paredes celulares lignificadas altamente espessadas, a permeação das soluções pode ser dificultada. Amostras com problemas de infiltração resultam em seções semifinas com células quebradas e rasgos na resina (Figura 5C, D). O corte longitudinal resulta em células distorcidas, causando vieses nas análises anatômicas e na medição das características das folhas, como tamanho e densidade celular (Figura 5F-H).

Infiltração de resina
A secção de qualidade é vital para a observação de tecidos anatômicos, que são diretamente afetados pelo meio em que a amostra está inserida. Os meios de incorporação mais comuns usados na histologia de plantas são cera de parafina, epóxi e resinas acrílicas34,35. A incorporação de cera requer a preparação de amostras por fixador químico e infiltração com cera líquida, que é endurecida à temperatura ambiente. Esses cortes geralmente resultam em seções com 5 a 10 μm de espessura, que, como demonstrado aqui, podem ser obtidas tão bem à mão (Figura 2) e requerem apenas tecido fresco não fixado. Nesse caso, o arranjo das células ao redor da bainha do feixe é vital para distinguir entre as plantas C3 e C4, o que requer o uso de um meio de incorporação mais robusto e rígido. A resina epóxi (Spurr's resin36) e a resina acrílica (LR White) foram testadas tanto para dureza, longevidade, infiltração da amostra quanto para durabilidade de seccionamento neste estudo. A resina epóxi é utilizada na incorporação de material biológico há décadas37. As resinas acrílicas são relativamente novas e foram inicialmente consideradas para incorporação de espécimes de plantas devido à sua resiliência ao longo do tempo, pois, ao contrário das resinas epóxi, não descolorem como resultado da exposição aos raios UV e são menos propensas ao encolhimento38. A resina acrílica LR White (grau duro) foi selecionada por sua fórmula não tóxica e estável aos raios UV. As resinas acrílicas tendem a ser consideravelmente menos viscosas do que as resinas epóxi, o que permite uma infiltração mais rápida da amostra, e a dureza do material permite um corte mais limpo com um micrótomo39. A Figura 5C,D mostra os resultados da resina epóxi em espécimes de folhas com grande quantidade de tecido estrutural, onde os rasgos são inevitáveis devido à maciez da resina epóxi, em comparação com a resina acrílica (Figura 3).

Ultramicrotomia
Aparar o excesso de resina pode criar rachaduras na resina que penetram na amostra. Para evitar isso, é vital considerar a densidade e a fragilidade da resina escolhida para incorporação. Cortar mais fundo na seção deve evitar quaisquer artefatos causados pelo corte manual ou áspero da faca. A amostra deve ser alinhada perpendicularmente ao suporte da amostra e validada aumentando a ampliação através da ocular, bem como visualizando uma seção fixa e manchada. As células vegetais não cortadas em um ângulo perfeitamente reto aparecem como células cônicas, em que uma extremidade é maior que a outra40.

Pós-coloração
O azul de toluidina (1% em solução aquosa) foi usado para corar cortes semifinos cortados no ultramicrótomo. Se a mancha for deixada para secar na seção por muito tempo, isso resultará em coloração excessiva, causando uma supersaturação da seção quando fotografada (Figura 5A). Quando a mancha não é bem filtrada, resulta em partículas não dissolvidas ressecando no corte, dificultando a visualização das estruturas anatômicas (Figura 5B). Esse problema pode ser evitado usando um filtro fino ao fazer a solução de azul de toluidina, bem como limitando a exposição da seção à mancha. As amostras são secas numa placa quente a 60 °C antes da coloração para garantir que a secção adere à lâmina de vidro do microscópio, mas não devem ser expostas ao azul de toluidina durante mais de 10 segundos antes de serem enxaguadas e secas novamente41.

Considerações sobre medidas anatômicas
As medidas mostradas neste artigo são apenas um exemplo das muitas características anatômicas que podem ser avaliadas quantitativamente usando seções semifinas, incluindo uma fração do espaço aéreo intercelular, espessura média do mesofilo (sem tecido vascular) e área de superfície do mesofilo exposta a espaços aéreos intercelulares por unidade de área foliar42. No entanto, embora o tamanho das células da bainha do feixe seja um indicador importante para diferenciar entre o metabolismo C3 e C4, a espessura da parede celular da bainha do feixe é outra característica importante que não pode ser visualizada apenas com base na microscopia de luz, pois determina o grau de vazamento das células da bainha do feixe, ou seja, a quantidade de CO2 que se difunde de volta nas células do mesofilo42, 43. O alto vazamento reduz a eficiência fotossintética, pois uma grande fração da energia usada para a fixação de CO2 pela PEP carboxilase é perdida 44,45,46. Para tais análises ultraestruturais, são necessárias microscopias eletrônicas de transmissão e análises de imagem. Embora apenas a microscopia de luz tenha sido considerada para o presente estudo, o protocolo inclui o tratamento com tetróxido de ósmio, um agente de contraste e fixação que é a pedra angular da microscopia MET. As amostras polimerizadas ainda podem ser usadas para análise MET sempre que necessário, mesmo que não sejam consideradas no momento da preparação.

Embora o diagnóstico anatômico possa detectar facilmente estruturas semelhantes a Kranz, a presença de C4 pode ser diagnosticada por medidas de troca gasosa que podem mostrar fisiologia típica de C4, ou seja, baixo ponto de compensação de CO2, inibição limitada de O2 da fotossíntese e diferentes composições de isótopos de carbono2 , 4 , 47 .

Deve-se notar também que a anatomia de Kranz não é necessária para o desenvolvimento da fotossíntese C4, como mostrado pela descoberta de plantas C4 unicelulares 48,49,50. A análise anatômica por si só pode, portanto, não ser suficiente para detectar a fisiologia do C4 em táxons menos estudados. O acoplamento da caracterização anatômica com a análise fisiológica oferece ferramentas poderosas para investigar características foliares e sua relação estrutura-função em culturas e plantas silvestres.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o Programa H2020 da União Europeia (projeto GAIN4CROPS, GA no. 862087). O Centro de Excelência AgroCropFuture Agroecology e novas culturas em climas futuros é financiado pelo Ministério da Educação e Pesquisa da Estônia. Agradecemos à professora Evelin Loit-Harro pelo fornecimento de sementes de T. aestivum e Z. mays, a Paula Palmet e Vaiko Vainola pelo auxílio na preparação dos cortes transversais das folhas, e a João Paulo de Silva Souza pelo auxílio na análise. Todas as imagens foram obtidas da unidade de microscopia da Universidade de Ciências da Vida da Estônia em vários projetos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Hidrogenofosfato dissódico di-hidratado (Na2HPO42H2O) puroPENTA, CZ10028-24-7
Filme de Incorporação, 7,8 mil de espessura, 8 x 12,5, (203 x 318mm)ACLAR, US10501-10
Etanol, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Perigo: Líquido e vapor altamente inflamáveis.
EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging SystemThermo Fisher Scientific,
US Molde de PTFE de embutir plano com estrutura de metal, 16 cavidadesPELCO, US10501
Frasco de vidro de 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Solução de glutaraldeído a 50%VWR Life Science, US23H2856331Perigo: Fatal se inalado. Tóxico se ingerido. Causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos. Pode causar irritação respiratória. Use luvas de proteção, roupas de proteção, proteção para os olhos e rosto.
Faca de diamante HistoDiatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienna, AT
LR Resina branca de grau duroMicroscopia Eletrônica Sciences, US14383Perigo: Causa irritação na pele. Causa irritação ocular grave Pode causar irritação respiratória. Pode causar sonolência ou tontura Use luvas de proteção, roupas de proteção, proteção para os olhos e rosto.
Lâminas de microscópioNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 e Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Tetróxido de ósmio (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Perigo: Fatal por ingestão, em contacto com a pele ou por inalação. Causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos Use luvas de proteção duplas, roupas de proteção, proteção para os olhos e rosto.
Pipeta e pontas de pipetaThermo Scientific, FIKJ16047
Dihidrogenofosfato de sódio di-hidratado (NaH2PO4 . 2H2O) puroPENTA, CZ13472-35-0
Seringa 10 mlEcoject, DE20010
Azul de toluidina, grau de uso geralFisher Scientific, GB2045836

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