Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

Angela C. Debruyne; Gabriele Ferrari; Hang Zhou; Nore Van Loon; Nina Heymans; Irina A. Okkelman; Ruslan  I. Dmitriev

doi:10.3791/66845

Method Article

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

DOI:

10.3791/66845

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August 9th, 2024

Angela C. Debruyne^*¹ , Gabriele Ferrari^*¹ , Hang Zhou^*¹ , Nore Van Loon¹ , Nina Heymans¹ , Irina A. Okkelman¹^,² , Ruslan I. Dmitriev¹^,²

¹Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, ²Ghent Light Microscopy Core, Ghent University

^* These authors contributed equally

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.

Abstract

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Os esferoides tumorais multicelulares são um modelo popular de microagregado de tecido 3D para reproduzir o microambiente tumoral, testar e otimizar terapias medicamentosas e usar bio e nanossensores em um contexto 3D. Sua facilidade de produção, tamanho previsível, crescimento e gradientes de nutrientes e metabólitos observados são importantes para recapitular o microambiente celular semelhante a um nicho 3D. No entanto, a heterogeneidade esferóide e a variabilidade de seus métodos de produção podem influenciar o metabolismo celular geral, a viabilidade e a resposta aos medicamentos. Isso dificulta a escolha da metodologia mais adequada, considerando os requisitos de tamanho, variabilidade, necessidades de biofabricação e uso como modelos de tecidos 3D in vitro em biologia de células-tronco e cânceres. Em particular, a produção de esferoides pode influenciar sua compatibilidade com microscopias quantitativas ao vivo, como imagens metabólicas ópticas, microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM), monitoramento de hipóxia esferóide com nanossensores ou viabilidade. Aqui, uma série de protocolos convencionais de formação de esferóides são apresentados, destacando sua compatibilidade com as microscopias de campo amplo, confocais e de dois fótons ao vivo. A imagem de acompanhamento para análise pipeline com autofluorescência multiplexada FLIM e, usando vários tipos de câncer e esferóides de células-tronco, também é apresentada.

Introduction

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Os esferoides multicelulares representam um grupo de modelos de tecidos 3D obtidos pela autoagregação de células e exibindo uma forma esférica. Eles são amplamente utilizados para imitar a interação célula-célula e célula-matriz in vitro e para reproduzir um contexto 3D dentro de uma infinidade de construções derivadas de câncer e células-tronco. Várias técnicas são empregadas para reduzir a ligação celular e promover a agregação. Isso inclui o método de queda suspensa com base na tensão superficial¹; métodos de repelência de fixação celular, como placas de fixação ultrabaixa, micromoldes e micropoços ^2,3; abordagem baseada em ondas acústicas⁴; métodos de agregação induzida por fluxo (frascos giratórios, biorreator e dispositivos microfluídicos)⁵; formação assistida por partículas magnéticas⁶ e uso de matrizes e andaimes sintéticos e baseados em ECM promotores de agregação ^7,8,9.

Na pesquisa, desenvolvimento e validação de novas terapias medicamentosas contra o câncer, os esferoides são um modelo atraente devido à sua capacidade de recapitular os gradientes limitados por difusão espacial de nutrientes, resíduos e_O2, muitas vezes levando à formação de um núcleo necrótico, típico dos tumores sólidos^10,11. Esses modelos in vitro mais confiáveis e sofisticados desafiam a necessidade de uso extensivo de modelos animais (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.0¹²), de acordo com o princípio 3Rs da pesquisa animal (substituição, redução e refinamento). Além do câncer, os esferoides encontram sua aplicação na pesquisa com células-tronco. Por exemplo, as células-tronco pluripotentes têm a capacidade de formar corpos embrióides (EB), que podem ser usados para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) em tipos de células especializadas que são difíceis de obter diretamente de pacientes, como células precursoras neurais¹³ ou células da granulosa ovariana ^13,14. Além disso, a formação de um EB é frequentemente o primeiro passo no desenvolvimento de modelos organoides mais complexos, por exemplo, neural¹⁵, retinal¹⁶, cardíaco¹⁷, fígado¹⁸, estômago¹⁹ e organoides intestinais²⁰. Fatores como tamanho, reprodutibilidade, rendimento e aplicações a jusante devem ser considerados ao escolher um método de formação de esferóides apropriado para os experimentos.

O aumento da complexidade da cultura 3D pode levar a uma maior variabilidade em comparação com a cultura 2D. Fatores como composição de nutrientes²¹, evaporação do meio²², viscosidade²³, controle de pH²⁴, método de formação de esferoides e até mesmo o tempo de cultura^25,26 podem resultar na obtenção de esferoides de morfologia, tamanhos, viabilidade e quimiorresistência diferentes^27,28. Pesquisas recentes demonstraram que os gradientes de oxigênio dos esferoides nem sempre são estáticos e são afetados pelo método de formação, tamanho do esferóide e viscosidade extracelular, afetando a heterogeneidade do esferóide²⁹. Para melhorar a reprodutibilidade e a acessibilidade dos dados em esferoides, a base de conhecimento MISpheroID foi desenvolvida²⁶, identificando linhagem celular, meio de cultura, método de formação e tamanho dos esferoides como as informações mínimas para um resultado reprodutível. Portanto, foi feita uma comparação detalhada de vários métodos de alto rendimento (SphericalPlate 5D, micromoldes feitos em laboratório e moldes de microtecido) e de baixa fixação (ou seja, placas de 96 poços revestidas com Biofloat e Lipidure, sem andaimes e baseadas em andaimes) (Figura 1 e Tabela 1), incluindo o tamanho do poço (dada uma estimativa do tamanho máximo do esferóide), consumíveis usados, tempo de preparação e a possibilidade de monitorar os esferoides sem transportá-los para placas de microscopia. Este último permite estudos de longo prazo, enquanto os esferoides produzidos com métodos de alto rendimento geralmente resultam em experimentos de endpoint. Todos os métodos, exceto as grades da Placa 5Dspheri, não trazem autofluorescência indesejada, possibilitando seu uso direto em microscopia.

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Figura 1: Métodos de formação de esferóides explicados. Métodos de alto rendimento, como o SphericalPlate 5D, que integrou micropoços patenteados na placa, enquanto os micromoldes produzidos em laboratório e os moldes MicroTissue usam carimbos para fazer vários micropoços em agarose (azul). Placas de baixa fixação, como Lipidure (Amsbio) e Biofloat (Sarstedt), usam um revestimento não aderente que inibe a adesão à superfície celular e promove a autoagregação celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	Placa 5D SpheriPlate	Micromoldes de produção própria	Microtecido	Métodos de fixação baixa
Número de esferoides/poço	750	1589	81	1
Poço de diâmetro	90 μm	400 μm	800 μm	1 milímetro
Volume de cultura	1 mL	5 ml	1 mL	200 μL
Outros consumíveis	/	7 mL de agarose a 3%	500 μL de agarose a 2%	/ *
Tempo de preparação	10 minutos	2 h + 3 dias de adaptação de mídia	0,5 h + 15 min adaptação de mídia	10–30 min + 1 h de secagem
Monitorização	Sim	Não**	Sim	Sim
Autofluorescente	Sim	Não	Não	Não
Reutilizável	Não	Sim	Sim	Não**
Custar	€€	€	€€€€	€€€€: Revestimento e Matrigel
Custar	€€	€	€€€€	€€: Placa comercial de 96 poços
* Algumas linhagens celulares precisam de adição de ECM (ou seja, 2% a 5% de Matrigel) para formar esferóides compactos.
**O revestimento é reutilizável até se esgotar. No entanto, cada placa consumirá uma pequena quantidade de mídia e a poeira pode se acumular com o tempo. A esterilização do filtro é necessária regularmente.

Tabela 1: Comparação de vários métodos de formação de esferóides²⁹. "Monitorização": capacidade de monitorizar o esferóide sem necessidade de transferência para uma placa de microscopia. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€€: 150-500€ , €€€€: >500€

A microscopia de fluorescência permite o monitoramento direto dos principais aspectos biológicos dos esferoides, incluindo morte celular, viabilidade, proliferação, metabolismo, viscosidade e até propriedades mecânicas³⁰. A microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM) fornece uma dimensão quantitativa adicional para estudar as interações da sonda fluorescente dentro de seu (micro) ambiente³¹ ^, ³² ^, ³³ ^, ³⁴ , permitindo resolver os espectros de emissão sobrepostos de acordo com diferentes tempos de vida de emissão³⁵ ^, ³⁶ e sondar o metabolismo celular com base na autofluorescência celular intrínseca. Assim, compostos autofluorescentes celulares difundidos como nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NAD (P) H), mononucleotídeo de flavina (FMN), dinucleotídeo de flavina adenina (FAD), protoporfirina IX e outros podem ser medidos com FLIM de um e dois fótons e servem como 'sensores' intrínsecos do catabolismo da glicose, fosforilação oxidativa (OxPhos) e fornecem uma visão geral do estado redox celular. O NAD (P) H existe nas formas citoplasmáticas livres ou nas mitocôndrias ligadas a proteínas ^37,38. Da mesma forma, o estado oxidado do FAD é fluorescente com uma vida útil mais longa da forma livre. As microscopias NAD(P)H e FAD geralmente envolvem FLIM excitado por dois fótons, com o objetivo de prevenir fotodanos à amostra³⁹. Freqüentemente, o FLIM de 'imagem metabólica óptica' pode ser combinado com o uso de sondas à base de corantes, biossensores geneticamente codificados, microscopia de imagem de fosforescência ao longo da vida (PLIM) e medições baseadas em intensidade raciométrica, a fim de fornecer uma imagem mais completa do metabolismo esferóide ou organoide, oxigenação, proliferação e viabilidade celular²⁹ ^, ³⁰ ^, ³¹. Além disso, o FLIM também pode ser combinado com o método de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) para medir a variação ao longo da vida do fluoróforo do doador quando em contato próximo com o aceitador para investigar a ligação de um medicamento com seu domínio alvo 33,40,41.

As imagens FLIM adquiridas são normalmente analisadas para calcular o tempo de vida pixel a pixel. Atualmente, existem pelo menos 3 estratégias comuns usadas para obter o tempo de vida da fluorescência: 'FLIM rápido' semiquantitativo ⁴² (às vezes chamado de 'sentido tau' ⁴³ ^, ⁴⁴ ), ajuste da curva de decaimento, usando ajuste exponencial de um, dois ou três e abordagem 'sem ajuste' com transformação fasorial e análise de gráfico fasorial. Dependendo do fornecedor, o software fornecido (LAS X, Symphotime, SPCImage, etc.) ou de código aberto (por exemplo, FLIMfit⁴⁵, FLIMJ⁴⁶ ou outros⁴⁷) pode ser usado para lidar com dados FLIM medidos. Normalmente, o software fornecido pelo fornecedor é útil para análise preliminar de dados, enquanto as soluções de código aberto podem fornecer estudos mais precisos usando, por exemplo, gráficos fasoriais e visualização 3D.

Apesar da utilidade e atratividade do FLIM como método para estudar esferoides, muito poucos protocolos experimentais estão disponíveis, e há uma falta geral de conhecimento na escolha do método de formação mais apropriado para experimentos bem-sucedidos de microscopia multiparamétrica ao vivo envolvendo FLIM. Aqui, uma comparação detalhada dos protocolos de formação de esferóides comumente usados é apresentada com base em sua morfologia, viabilidade e oxigenação com o nanossensor de detecção de oxigênio (MMIR1) recentemente validado e caracterizado em vermelho distante e infravermelho próximo (NIR). A nanopartícula catiônica é impregnada com dois corantes repórteres, o aza-BODIPY insensível ao Ø_de referência (excitação 650 nm, emissão 675 nm) e a metaloporfirina sensível ao NIR O₂, PtTPTBPF (excitação 620 nm, emissão 760 nm). O MMIR1 permite a análise em tempo real de gradientes de oxigênio em um microscópio de fluorescência convencional (usando análise raciométrica) ou microscópio de fosforescência (PLIM) sem introduzir toxicidade celular e permitindo sinais estáveis, monitoramento de longo prazo e multiplexação^25,29. Dependendo da necessidade de coloração com corantes ou nanossensores, rendimento de esferóides ou tipo de célula, o protocolo de formação mais adequado pode ser escolhido. Uma vez que os estudos de viabilidade e oxigenação de esferoides são relevantes para estudos de câncer e esferoides derivados de células-tronco, os protocolos apresentados também incluem exemplos e resultados típicos esperados de NAD(P)H-FLIM e FAD-FLIM com esses modelos. Os pipelines de imagem e análise apresentados têm como alvo as plataformas de microscopia FLIM baseadas em contagem de fótons únicos correlacionadas ao tempo mais populares.

Protocol

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1. Geração de esferóides multicelulares

Cultura de células
NOTA: As culturas de células podem ser coletadas na American Type Culture Collection (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich ou outros fornecedores. O ATCC fornece todas as informações de manuseio necessárias, incluindo meios de crescimento preferidos, procedimentos de subcultura, nível de biossegurança, taxa de crescimento e perfis STR. Aqui, 500 células/esferóide da linha celular de câncer de cólon humano HCT116 são usadas no meio 5A de McCoy (VWR, 392-0420) suplementado com 10% de FBS e 1 mM de piruvato de sódio. Para experimentos de longo prazo que são monitorados diariamente, HEPES 10 mM, pH 7,2 pode ser adicionado ao meio.
1. Cultive a cultura de células para atingir 70% -90% de confluência.
2. Enxaguar as células com PBS estéril pré-aquecido (37 °C) (5 ml para balão de 25 cm² ou 10 ml por balão de 75 cm² ).
3. Adicione 0,05% de tripsina - 1 mM de solução de EDTA (0,5 mL por 25 cm² ou 1 mL por frasco de 75 cm² ) e incube por 5-10 min a 37 ° C em 5% de CO₂, 95% de umidade para atingir o descolamento celular.
  NOTA: Controle o descolamento da célula sob o microscópio de luz de transmissão (campo claro). A superexposição das células à solução enzimática dissociante pode afetar sua viabilidade.
4. Neutralize a tripsina adicionando excesso de meio de cultura celular contendo 10% de FBS (pelo menos 5 mL de meio por 1 mL de solução de dissociação).
  NOTA: Para células cultivadas em meios de cultura com baixo FBS ou sem FBS, a neutralização da tripsina pode ser feita com a adição de 0,5 mL de 100% de FBS à cultura de células tratadas com tripsina, seguida de centrifugação para transferir as células para seus meios de cultura originais.
5. Dissocie os agregados celulares por pipetagem para obter suspensão unicelular no meio.
  NOTA: A pipetagem com uma pipeta sorológica com uma ponta de pipeta de 1000 μL na parte superior melhora muito a geração de suspensão de célula única em um grande volume de cultura de células em suspensão.
6. Use uma câmara de contagem (hemocitômetro com regras de Neubauer ou alternativas) para contar o número de células por 1 mL da suspensão celular.
7. Diluir a suspensão celular para obter o número desejado de células por mililitro.
8. Adicionar solução concentrada de sonda de O₂ (nanopartículas) à suspensão celular a uma concentração final de 10 μg/ml para análise raciométrica de O₂.
  NOTA: Para garantir uma suspensão celular homogênea (com a sonda), ressuspenda várias vezes antes da formação do esferoide. Se a sonda O₂ não for necessária, pule esta etapa e prossiga com a formação dos esferoides. Um protocolo modificado deve ser aplicado ao manusear iPSCs. Resumidamente, as iPSCs são cultivadas em colônias em placas revestidas com Geltrex e passadas usando ReLeSR conforme descrito no protocolo⁴⁸ fornecido pelo fornecedor. No dia da formação dos esferóides, as colônias devem ser grandes, compactas e exibir centros de várias camadas com bordas distintas. Enxágue as células com PBS estéril pré-aquecido. Adicione 1 mL de reagente de dissociação celular suave (GCDR) e incube a 37 °C por 8-10 min. Use uma ponta de 1000 μL para separar suavemente as células do poço e obter uma suspensão unicelular. Transfira a suspensão de célula única para um tubo cônico estéril de 50 mL e adicione 4 mL de meio DMEM-F12 pré-aquecido para neutralizar o GCDR. Lave o poço com 1 mL de DMEM-F12 e transfira-o para o resto da suspensão celular. Centrifugue a 300 x g por 5 min. Ressuspenda em 1 mL de meio apropriado para experimentos adicionais. Para os experimentos descritos neste manuscrito, foi utilizado mTeSR + 10 μM Rock Inhibitor. Conte e dilua a suspensão celular para obter o número desejado de células por mililitro.
Métodos de formação de esferóides
1. Micro-moldes de placa de Petri 3D
  NOTA: Este método de alto rendimento é usado para gerar simultaneamente um grande número de esferoides (81 esferoides) em uma matriz de micromoldes 9 x 9 com 800 μm de diâmetro e 800 μm de profundidade.
  1. Enxágue os micro-moldes para fundição de placas de Petri 3D em dH₂O e coloque em recipiente autoclavável.
  2. Meça 2 g de pó de agarose grau eletroforese e coloque-o em um frasco de vidro seco de 200 mL seguro para autoclave.
    NOTA: Certifique-se de que a garrafa e o pó de agarose estejam secos, sem líquido ou umidade.
  3. Micro-moldes de autoclave para fundição de placas e garrafas de Petri 3D com pó de agarose por 30 min em ciclo seco.
  4. Faça uma solução salina a 0,9 p/v% por adição de 0,9 g de NaCl em 100 mL de água ultrapura e esterilize em autoclavagem.
    NOTA: O NaCl é recomendado pelo fabricante. Aumenta a estabilidade da agarose.
  5. Prepare a solução de agarose adicionando a solução salina estéril ao pó de agarose esterilizado. Aparafuse a tampa frouxamente encaixada para evitar o acúmulo de pressão. Gire a garrafa para misturar o pó de agarose.
  6. Ferva e dissolva o pó de agarose usando um forno de micro-ondas. Pare o micro-ondas com frequência (~a cada 10 s). Agite o frasco e repita até que a agarose se dissolva.
    CUIDADO: A solução de agarose está quente e requer manuseio cuidadoso. Agitar imediatamente após o processo de fusão pode fazer com que a solução estoure do recipiente. Para evitar acidentes, use recipientes suficientemente grandes cheios até 50% da capacidade e use proteção individual adequada (luvas, luva de forno, proteção para os olhos e jaleco).
  7. Deixe a solução de agarose dissolvida esfriar até 60-70 °C. Usando técnicas e condições assépticas, pipete a agarose fundida no micromolde (500 μL para a série 12 ou 330 μL para a série 24).
    NOTA: Evite a formação de bolhas ao misturar ou pipetar agarose. Remova quaisquer pequenas bolhas presas nas pequenas características do micromolde pipetando ou raspando suavemente antes que a agarose solidifique.
  8. Deixe a agarose solidificar por cerca de 2-3 min. Em seguida, flexione cuidadosamente o micromolde para remover a placa de Petri 3D e transfira para uma placa de cultura de tecidos de 12 poços.
    NOTA: A flexão excessiva do micromolde pode levar à formação de rachaduras dentro do molde de agarose.
  9. Para equilibrar a placa de Petri 3D, adicione 2,5 mL/meio de cultura de células de poço. Incube por 15 min ou mais. Remova o meio de cultura e substitua-o por meio novo. Repita mais uma vez para equilibrar a placa de Petri 3D com um meio de cultura.
    NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui até a semeadura celular. Para armazenamento de longo prazo (até 2 semanas a 4 °C), use a solução PBS em vez de média.
  10. Remova completamente a placa de Petri 3D ao redor do meio de cultura (ou PBS) e remova com precisão o meio dentro da placa de Petri 3D inclinando a placa de cultura de tecidos.
  11. Semeie cuidadosamente 190 μL de suspensão celular contendo 40.500 células gota a gota na câmara de semeadura celular (consulte a etapa 1.1).
    NOTA: O número de micro-poços em selos de agarose determina o número de esferóides produzidos por selo. Neste caso, este molde de agarose contém 81 micropoços (81 x 500 células/esferóide). A variação da concentração de células em suspensão adicionada a um macropoço permite alterar o número de células por esferoide, controlando assim o tamanho do esferoide.
  12. Aguarde ~ 10 minutos para que as células se estabeleçam nos recursos do DSH de Petri 3D. Em seguida, adicione 2 mL de meio na parte externa da placa de Petri 3D.
  13. Coloque a placa de cultura de tecidos na incubadora de cultura de células e troque o meio ao redor da placa de Petri 3D conforme necessário.
2. Placa de fixação baixa
  NOTA: Este método é usado para gerar um único esferóide por poço. Placas revestidas (Lipidure ou Biofloat) estão disponíveis comercialmente (pule as etapas 1.2.2.1-1.2.2.4). Alternativamente, o revestimento pode ser adquirido separadamente e usado para revestir placas de vários poços não tratadas. Recomenda-se encher os poços nas bordas das placas de 96 poços com água estéril ou PBS devido à evaporação mais rápida nesses poços, limitando assim o número de poços para esferoides a 60. Caso sejam necessários menos esferoides, encha os poços vazios ao redor com água ou PBS. Use pontas sem poeira para manuseio de líquidos para evitar trazer pequenas partículas para os poços, pois elas interferem na formação de esferoides.
  1. Preparar uma solução de revestimento a 0,5 p/v% dissolvendo 0,25 g do pó de polímero em 50 ml de etanol num recipiente de vidro em garrafa. Filtre o revestimento com filtro.
    NOTA: A esterilização do filtro e todas as próximas etapas devem ser realizadas em condições estéreis sob fluxo laminar.
  2. Adicione 200 μL da solução de revestimento a cada poço de uma placa de cultura de fundo em U 96.
  3. Incube por 1 min e retire o excesso de revestimento.
    NOTA: A solução de revestimento pode ser usada várias vezes. Armazene em um recipiente de vidro em temperatura ambiente (RT). Recipientes de plástico não são recomendados, pois o plástico pode se dissolver parcialmente e se tornar parte da solução. Se houver poeira, esterilize o filtro com filtros de polietersulfona (PES) ou seringa de náilon de 0.22 μm.
  4. Deixe a placa de 96 poços secar ao ar por cerca de 1 h.
    NOTA: Se as células precisarem de uma matriz extracelular, prossiga para a etapa 1.2.3. As placas revestidas podem ser armazenadas no RT quando embrulhadas em alumínio por até 1 mês. Ao semear uma quantidade menor de células/poço, centrifugar a placa por 5 min a 300 g pode ajudar a puxar as células para baixo.
3. Protocolo de formação auxiliada por matriz extracelular
  NOTA: Algumas linhagens celulares não produzem matriz extracelular (MEC) suficiente e precisam da adição de ECM, como Matrigel, Cultrex ou Geltrex, para formar esferóides compactos 49,50,51. Para tipos de células como câncer de mama MDA-MB-231, papila dérmica humana, células de câncer de próstata e outras, é possível usar a etapa 1.2.2 com as seguintes modificações⁵², exigindo a adição de MEC. De preferência, use pontas sem poeira para manuseio de líquidos para evitar que a poeira interfira na formação do esferoide. As etapas 1 e 4-7 devem ser executadas sob uma cabine de segurança biológica (classe II).
  1. Prossiga com as etapas 1.2.2.1-1.2.2.4 (placas de fixação baixas) para tratamento de superfície.
  2. Pré-resfrie a placa de 96 poços a 4 °C na geladeira.
  3. Prepare a centrífuga com o adaptador correto para a placa de 96 poços e pré-ajuste para 4 °C.
  4. Preparar uma solução a 5% de matriz de membrana basal (BMM) em meios de cultura de células pré-arrefecidos (4 °C).
    NOTA: O BMM reticula rapidamente em RT. Ao manusear, mantenha os estoques e as soluções no gelo.
  5. Prepare a suspensão celular (consulte a etapa 1.1).
  6. Adicione 50 μL da solução BMM em cada poço.
  7. Adicione suavemente 50 μL de suspensão celular em cada poço em cima da solução BMM (25.000 células/poço).
    NOTA: Não exploda este volume no poço, ou então as células se espalharão nas laterais dos poços e não se acumularão no fundo. Um número menor de células por poço pode ser obtido ajustando a densidade celular de acordo. Nem todas as células formarão esferóides em todas as densidades de semeadura; A otimização deve ser realizada por tipo de célula e dimensão desejada. Com os volumes fornecidos, a concentração final de BMM é de 2,5%. Se for necessária uma concentração diferente, a solução-mãe deve ser preparada a uma concentração mais baixa/mais elevada.
  8. Centrifugue a placa de 96 poços por 5 min a 300 x g e 4 °C.
    NOTA: Sem esta etapa, as células não se agregam adequadamente no fundo do poço, causando a formação de vários agregados menores. A centrífuga deve ser resfriada para evitar reticulação nesta fase.
  9. Coloque a placa na incubadora de cultura de células. Os agregados são considerados maduros no dia 4 após a semeadura.
    NOTA: Para protocolos adicionais sobre a formação de esferoides, consulte o Arquivo Suplementar 1.

2. Microscopia ao vivo de esferóides

Preparação de esferoides para análise de imagens ao vivo
NOTA: Dependendo do desenho do experimento (por exemplo, monitoramento de longo prazo ou análise de ponto final, configuração do microscópio ou propriedades espectrais da fluorescência medida) ou devido à incompatibilidade do método de produção de esferoides com a microscopia (por exemplo, espessura da amostra, autofluorescência do material, flutuação de esferoides durante a imagem) monitoramento direto de esferoides na placa, onde foram produzidos, pode não ser possível. O protocolo explica a preparação de esferoides para imagens, que são adequados para a maioria dos microscópios de campo amplo invertido e confocais.
1. Preparar e pré-aquecer (37 °C) os meios de imagem: DMEM suplementado com HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), piruvato de sódio (1 mM), L-glutamina (2 mM) e glicose (5 mM), sem vermelho de fenol.
  NOTA: O bicarbonato de sódio sozinho ou em combinação com HEPES-Na pode ser usado, se o controle de CO₂ for fornecido durante a imagem²⁴. Alguns tipos de cultura de células não toleram a presença de HEPES. Dependendo do desenho experimental, o teor de piruvato, glutamina e glicose pode ser modificado.
2. Prepare placas de microscopia estéreis (disponíveis comercialmente ou feitas em laboratório) com superfícies de vidro de cobertura revestidas (para uma forte adesão esferoidal) ou não revestidas (baixa adesão esferoidal) (espessura # 1,5).
  NOTA: A necessidade e o tipo de revestimento dependem do tipo de célula, das propriedades de adesão dos esferoides e da taxa de migração celular da interface de cultura 3D para 2D. É importante considerar isso, pois o revestimento pode facilitar a perda de organização 3D, alterando a forma dos microgradientes nos esferoides e, como resultado, o comportamento celular. Para alguns experimentos (por exemplo, imagens analisadas a resposta à estimulação medicamentosa), é necessária uma forte aderência esferoide à superfície e é preferível um revestimento com gelatina, BMM, colágeno, colágeno / poli-D-lisina ou poli-D-lisina.
3. Lave suavemente os esferóides corados com sonda de O₂ dos micropoços da agarose micropadronizada ou da placa de 96 poços e transfira os esferóides ainda flutuantes para um frasco de 2 mL.
  NOTA: Para garantir a coleta de todos os esferóides do método de alto rendimento, enxágue o molde 1-3 vezes com o volume adicional de meio de cultura, combinando todas as suspensões de esferóides em um frasco. Para esferóides em uma placa de fixação baixa, colete esferóides um por um de poços individuais para um frasco ou diretamente para uma placa de microscopia se um pequeno número de esferóides for suficiente para o experimento. Ao transferir esferoides grandes, corte a extremidade da ponta da pipeta para garantir que não haja danos durante a pipetagem.
4. Deixe o frasco na posição vertical por até 5 min para permitir que os esferóides se depositem no fundo do frasco, formando um pellet visível.
5. Remova o meio do tubo, deixando os esferóides intactos, e ressuspenda-os suavemente em uma quantidade suficiente de cultura fresca.
  NOTA: Para facilitar o manuseio de esferoides, a transferência de esferoides para o meio de imagem também pode ser feita nesta fase em pequenos lotes; Consulte as etapas 2.1.7 e 2.1.8. Os esferoides dos diferentes grupos experimentais devem ser tratados igualmente, pois a composição do meio e o tempo de pré-condicionamento do meio podem afetar seu metabolismo.
6. Enquanto os esferóides estiverem flutuando, transfira um volume igual de suspensão de esferóides por poço da placa de microscopia.
7. Incubar os esferóides durante 1-2 h a 37 °C numa incubadora de CO₂ para garantir a sua fixação à superfície da placa de microscopia/poço. Para obter imagens, prossiga com a etapa 2.1.9. Para coloração de esferóides com sondas adicionais, prossiga com a etapa 2.1.8.
  NOTA: A taxa de migração celular do esferóide 3D para a interface de superfície 2D é uma função do tempo. Para evitar a perda de organização 3D, o tempo de incubação deve ser otimizado em relação ao tipo de célula, tipo de revestimento da superfície e ao design do experimento. Por exemplo, o HCT116, dependendo do tamanho do esferoide, precisa de pelo menos 2 h para uma fixação adequada do esferóide à superfície revestida de colágeno IV/poli-D-lisina, enquanto a fixação do hDPSC e a migração para a interface 2D são extremamente rápidas, levando à perda de organização 3D em 1-2 h. Para evitar a geração de imagens de 'esferóides 2D' devido ao espalhamento excessivo, superfícies de vidro não revestidas são usadas com o tempo de incubação reduzido.
8. Adicione sonda(s) de fluorescência em concentrações recomendadas ou empiricamente otimizadas a um volume conhecido de suspensão esferoide. Incubar durante 1 h a 37 °C CO₂ incubadora antes da obtenção de imagens.
  NOTA: Para ensaio vivo / morto, use iodeto de propídio e Calceína Green-AM em uma concentração final padrão de 1 μg / mL. Para evitar o efeito tóxico da coloração com iodeto de propídio nos corpos embrióides iPSC, a concentração final de iodeto de propídio foi de 0,5 μg/mL. O tempo de carregamento da sonda pode ser prolongado se a difusão da sonda não for eficiente devido ao grande tamanho do esferóide. O tempo de carregamento deve sempre ser considerado como parte do tempo total de incubação necessário para a fixação do esferóide à superfície. Se for necessário mais tempo para a fixação do esferóide, o procedimento de coloração deve ser organizado no final desse período. Esteja ciente de que um tempo de incubação mais longo pode levar à perda da organização 3D.
9. Remova os meios de cultura de células ou meios contendo sondas fluorescentes e troque-os por um volume necessário de meios de imagem. Para garantir que nenhum fundo de fluorescência do meio esteja no caminho da imagem esferoide, repita a etapa de troca de meio (lavagem) até 5 vezes.
  NOTA: Para evitar a remoção do esferóide durante a troca de meios, recomenda-se aspirar cuidadosamente o meio com uma pipeta de 200 μL das bordas das placas de microscopia e realizar a adição de mídia pela parede ou lateralmente na placa de microscopia.
10. Prossiga imediatamente com a etapa 2.2.1 do protocolo de imagem.
  NOTA: Um intervalo muito longo entre a preparação para a imagem e a aquisição real da imagem pode influenciar o metabolismo celular (por exemplo, por meio da composição alterada do meio), a viabilidade (algumas sondas fluorescentes usadas para análise de endpoint têm efeitos tóxicos, o que pode estimular a morte celular após um longo período de incubação), bem como levar a uma perda de organização 3D. Se vários grupos de esferoides ou condições experimentais devem ser comparados, o projeto experimental deve ser desenvolvido de acordo para manter o tempo do tratamento, pré-condicionamento e procedimentos de imagem o mais iguais possível entre os grupos analisados.
Aquisição de imagem
NOTA: O protocolo descreve a imagem multiparamétrica de esferoides vivos usando o microscópio confocal Stellaris 8 Falcon (Leica) e o software Leica Application Suite X (LAS X) versão 4.7. No entanto, apenas pequenas modificações serão necessárias para realizar tal análise em plataformas de microscopia alternativas.
1. Ligue a unidade de controle climático de temperatura 30-60 minutos antes da imagem. Defina a velocidade de ventilação e temperatura necessárias (35-37 °C).
  NOTA: Se, além do controle de temperatura, a concentração de gás (por exemplo, CO₂ ou O₂) precisar ser controlada durante a imagem, os dispositivos correspondentes também devem ser iniciados com antecedência para atingir as condições necessárias antes da imagem.
2. Ligue o microscópio e os dispositivos conectados (ou seja, laser WLL, computador, bomba de água para a objetiva de imersão em água e outros blocos eletrônicos operacionais). Inicie o software de controle do microscópio (por exemplo, LAS X Machine Mode ou Machine Mode with Environmental Control) fornecido com a configuração exata do microscópio e inicialize a calibração da platina.
3. Escolha a objetiva necessária no software e aplique o fluido de imersão, se necessário.
  NOTA: Para microscopia ao vivo, recomenda-se o uso de objetivas de imersão em água ou glicerol com distância de trabalho suficiente ('longa'), por exemplo, HC Fluotar L 25x/0.95 W VIS IR (distância de trabalho de 2.4 mm), HC PL Apo 40x/1.25 GLYC (distância de trabalho de 0.35 mm) ou pelo menos NA = 0.4 ou superior para as objetivas de ar. A escolha da ampliação e da distância de trabalho depende da natureza e do tamanho da amostra fotografada e dos sinais de fluorescência medidos (brilho, rendimento quântico, eficiência de coloração, ver, por exemplo, discussão sobre corantes e nanopartículas⁵³). Objetos grandes (esferoides ou organoides, tamanho de >500 μm), 'biorreator' ou chips microfluídicos requerem objetivas de longa distância de trabalho e menor ampliação, enquanto a análise de células individuais ou organelas celulares requer alta ampliação, muitas vezes obtida por meio de imagens em 'mosaico'.
4. Configure a placa de microscopia com esferóides no palco. Ajuste o foco e encontre um objeto/região de interesse (ROI).
  NOTA: Se objetos pequenos, fracamente fluorescentes, de baixo contraste ou raros precisarem ser encontrados e for difícil encontrar o foco, recomenda-se pré-focar nas paredes da placa de microscopia e 'filtrar' a superfície para o objeto de interesse por serpentina, começando por um dos cantos do poço.
5. Escolha a janela Abrir projeto e clique no ícone correspondente, Criar um novo projeto. Dê um nome padrão (por exemplo, começando com "descrição YY-MM-DD+") para o arquivo do projeto de pesquisa. Durante a geração de imagens, todas as imagens produzidas serão salvas automaticamente no arquivo .lif do projeto criado.
6. Abra a janela Aquisição . Defina o comprimento de onda de excitação do laser de luz branca (WLL) e a faixa necessária de detectores híbridos ou de varredura de ressonância (tipo HyD S, HyD X ou HyD R) com base nas propriedades espectrais conhecidas da fluorescência medida (espectros de excitação/absorbância e emissão). Escolha os tipos de digitalização Linha ou Quadro .
  NOTA: Para a maioria dos corantes fluorescentes disponíveis comercialmente, as propriedades espectrais podem ser encontradas (ou adicionadas) no pacote LAS X Dye Assistant. Escolha o detector com a faixa de sensibilidade de espectro apropriada compatível com as propriedades espectrais da sonda e, no caso do FLIM, compatível com a contagem de fótons (ou seja, HyD X ou HyD R). Para imagens multiparamétricas, defina o WLL em várias posições de excitação (por exemplo, para imagens simultâneas de FAD/Flavinas e dois canais de fluorescência da sonda MMIR1 O₂raciométrica - referência e sensível, as configurações de excitação/emissão podem ser 460 nm/510-590 nm HyD X1 e 614 nm/631-690 HyD X3 e 724-800 nm HyD R de acordo com uma ou duas sequências de varredura sequencial). É importante atribuir o detector apropriado para coletar a emissão, pois os detectores podem ter sensibilidade espectral diferente⁵⁴.
7. (Opcional para FLIM) Na janela Aquisição , escolha o modo FLIM para realizar imagens combinadas com a contagem de fótons (coleta de decaimento). Imediatamente, um 'módulo FLIM adicional no software LAS X' será aberto para navegar e analisar os dados FLIM.
8. (Opcional para FLIM) Escolha a taxa de repetição de pulso WLL com base na vida útil média esperada do fluoróforo.
  NOTA: A frequência do pulso do laser deve ser ajustada para coletar o decaimento total da fluorescência. Isso pode ser feito usando um recurso Pulse Picker instalado no microscópio. A sobreposição do decaimento da fluorescência com o pulso do laser levará ao encurtamento da vida útil estimada da fluorescência. Recomenda-se ter intervalos de pulso de 4 a 5 vezes mais longos do que a vida útil média esperada da fluorescência (por exemplo, 25 ns/40 MHz para vida útil de até 5 ns). Muitos lasers pulsados têm uma taxa de repetição fixa de 80 MHz (ideal apenas para uma faixa de até 2-3 ns). Isso é importante para escolher os fluoróforos corretos para o experimento.
9. Inicie a imagem de visualização usando o modo FAST LIVE e ajuste o foco fino do objeto de imagem em uma seção de interesse.
  CUIDADO: Siga rigorosamente as regras de segurança do laser. Sempre considere as regras de segurança do laser e espere até que a imagem pare antes de ligar a luz de transmissão, olhar para a ocular ou para a amostra.
  NOTA: No modo FAST LIVE , uma varredura de alta velocidade de 600 Hz (corresponde a uma taxa de quadros máxima de 4,43/s se o modo de varredura X bidirecional for usado), resolução de 256 x 256 pixels é aplicada automaticamente à imagem para manter a fluorescência protegida contra fotobranqueamento. Abra o orifício (por exemplo, para 3-4 UA) e/ou aumente a intensidade do laser se o sinal de fluorescência for muito fraco para focar no objeto. Evite a coleta de decomposição incompleta.
10. (Opcional para FLIM) Ao observar um histograma de intensidade de pixel que aparece durante a imagem em uma janela do módulo FLIM (modo Live ), ajuste a intensidade do laser/tamanho e a resolução do orifício apropriados para atingir a taxa de contagem ~ 1 limite de pulso de fóton/laser (linha vermelha). Evite ir significativamente acima de 1 para excluir o risco de efeito de empilhamento. Se necessário, ajuste a taxa de repetição de pulso WLL para ter uma coleção de decaimento completa em uma janela de decaimento (para evitar a coleta de decaimento incompleta, consulte a etapa 2.2.8).
  NOTA: Se o número de fótons (intensidade) não for suficiente para reconstruir um decaimento confiável para análise de ajuste ou nuvem de gráfico fasorial, aplique várias repetições de varredura (quadros ou linhas, ou configure o tempo de varredura), aumente a intensidade do laser e/ou sacrifique a resolução (tamanho do ROI digitalizado). Esteja ciente de que diminuir a taxa de repetição do laser requer que mais fótons sejam coletados para uma reconstrução de decaimento confiável, e uma correção adicional dos parâmetros de imagem pode ser necessária. Esteja ciente do impacto potencial da luz intensa e da iluminação contínua longa na viabilidade e metabolismo celular⁵⁵. O impacto negativo na viabilidade e no metabolismo pode ser diferente em cada caso individual, dependendo da intensidade, duração e comprimento de onda da luz de excitação, bem como da modalidade de imagem (por exemplo, imagem confocal de um fóton vs. multifóton). Ajustar os parâmetros de imagem de acordo e, se necessário, controlar a viabilidade/morte celular por Calceína Green-AM ou intensidade de iodeto de propídio em experimentos piloto⁵⁶. Sempre que possível, otimizações adicionais do protocolo de coloração da sonda de fluorescência devem ser consideradas para atingir um sinal de fluorescência adequado durante a microscopia ao vivo.
11. (Opcional para pilha z 3D) Enquanto estiver no Fast Live , defina as coordenadas, a direção da varredura e atribua-as a Início e Fim na janela Z-stack (Modo de varredura XYZ). Escolha o tamanho do passo Z ou o número de passos.
  NOTA: Embora o software calcule automaticamente o número "ideal" de etapas, com base na resolução usada e nos parâmetros de digitalização, a reconstrução 3D ao vivo normalmente pode exigir um número menor de etapas para obter uma aquisição rápida, por exemplo, tamanho de passo de 1-2 μm, tamanho de pilha de 50-100 μm, varredura bidirecional, exigindo 2-3 min do tempo total de varredura. Esteja ciente de que as organelas subcelulares, células e o modelo de célula 3D também podem se mover durante as medições. Além disso, devido à profundidade de penetração da luz e aos limites de dispersão, normalmente apenas 50-100 μm de profundidade de varredura no FLIM confocal podem ser alcançados.
12. Quando todas as configurações necessárias forem aplicadas, comece a criar imagens.
13. Dê um nome apropriado à imagem.
14. Procure o próximo objeto de imagem no modo de luz de transmissão e repita o procedimento de imagem com configurações de imagem previamente otimizadas (etapas 2.2.8 a 2.2.12).
  NOTA: Para a comparação baseada em intensidade ou análise de razão de intensidade (por exemplo, análise de oxigenação baseada em sonda MMIR O₂), sempre mantenha as mesmas configurações de imagem para todos os objetos analisados (ampliação e tipo de lente objetiva, intensidade do laser, potência e frequência de pulso, comprimento de onda de excitação, alcance dos detectores, orifício, velocidade de varredura, tempo de permanência e resolução de pixels). No entanto, como o tempo de vida da fluorescência não depende da intensidade da fluorescência e requer que um número apropriado de fótons seja coletado para um cálculo confiável, os parâmetros de imagem FLIM podem ser reajustados ao longo do experimento para manter os números de fótons coletados comparáveis entre diferentes tratamentos ou condições experimentais. Portanto, para análises multiparamétricas em que a análise baseada em intensidade e fluorescência é necessária, configurações de imagem universais otimizadas devem ser aplicadas para todos os objetos nos grupos experimentais comparados. Para comparação "somente FLIM", é possível comparar imagens adquiridas com configurações de imagem ligeiramente diferentes, pois o software LAS X fornece cálculo do IRF para medição de imagem individual⁴². No entanto, para análise de ajuste FLIM fora do LAS X (por exemplo, FLIMfit⁴⁵), a função de resposta do instrumento (IRF) deve ser medida para cada condição de imagem diferente, pois não pode ser exportada do software de imagem. Assim, para a simplicidade do projeto experimental e da carga de trabalho, é recomendável aplicar as mesmas configurações de imagem para todas as imagens no conjunto de dados. Em seguida, as medições IRF correspondentes podem ser feitas com o uso de fluoróforos de tempo de vida de fluorescência extintos ou de fluorescência rápida (dentro da faixa de ps) com as propriedades de emissão do canal espectral medido 57,58,59, por luminescência de nanopartículas de ouro ⁶⁰ ou por sinal de geração de segundo harmônico para FLIM multifóton⁶¹. No software LAS X, os parâmetros de imagem previamente otimizados podem ser carregados para um novo projeto clicando com o botão direito do mouse no arquivo de interesse e escolhendo Aplicar configurações de imagem.
15. Quando a sessão de imagem for finalizada, salve o projeto de imagem. Para finalizar a sessão de imagem, remova a amostra do estágio de microscopia e limpe a objetiva do líquido de imersão (se usado) de acordo com o procedimento padrão implementado na instalação de imagem. Feche o projeto e o software. Desligue o microscópio, os lasers e todos os dispositivos conectados.
16. Prossiga com a análise dos dados de imagem (etapa 2.3).
Processamento de imagem fasorial NAD (P) H / FAD-FLIM com módulo LAS X FLIM e FIJI
NOTA: O protocolo descreve uma análise do tempo de vida de fluorescência de esferoides imageados para dados no domínio da frequência em exemplos de NAD(P)H e FAD/Flavins autofluorescência FLIM. A medição da autofluorescência NAD(P)H tornou-se um padrão-ouro para análise metabólica, onde componentes curtos e mais longos da vida útil da autofluorescência NAD(P)H estão associados à glicólise ou fosforilação oxidativa (OxPhos), respectivamente. Isso pode ser analisado pela mudança em um gráfico fasorial ao longo da trajetória metabólica em direção aos padrões medidos de NAD (P) H livre ou NAD (P) H ligado a proteínas³¹^,⁶². Para analisar a trajetória do deslocamento metabólico, bem como para comparar a posição das nuvens fasoriais (ver a NOTA abaixo do passo 2.3.6) em um gráfico entre grupos experimentais, foi implementada uma análise simplificada das coordenadas fasoriais, com base no cálculo do centro geométrico (centróide) da nuvem fasorial²⁹. O protocolo descrito demonstra o cálculo das coordenadas do centróide em FIJI e a medição da distância entre dois pontos em um gráfico fasorial usando coordenadas (por exemplo, a distância de um centróide da nuvem fasorial de autofluorescência NAD (P) H esferóide a um ponto teórico de "NAD (P) H livre"). Da mesma forma, FAD e outros sinais de autofluorescência podem ser analisados. Um conjunto de dados 1 com .lif (Software LAS X necessário) ou .ptu Formatos de arquivo para aprender este procedimento é fornecido (Processo suplementar 2, Processo suplementar 3, Processo suplementar 4, Processo suplementar 5, Processo suplementar 6, Processo suplementar 7, Processo suplementar 8, Processo suplementar 9, e Arquivo Suplementar 10).
1. Abra o módulo FLIM no LAS X, selecione Abrir projeto e carregue o arquivo de imagem esferóide (.lif) para análise de NAD(P)H/FAD de autofluorescência.
  NOTA: Devido a possíveis bugs e perda de dados intermediária no módulo FLIM, use uma cópia do arquivo de imagem esferóide original (.lif) para análise NAD(P)H/FAD, mantendo o arquivo bruto inalterado.
2. Selecione uma única imagem e navegue até a interface de análise FLIM. Clique em Fasorial para acessar o gráfico fasorial e ativar o modo de análise fasorial. Aplique o filtro (Mediana ou Wavelet) e defina o Limite para minimizar o ruído e melhorar a visibilidade dos dados para todas as análises fasoriais. Escolha os harmônicos. Para análise da mudança metabólica com base nos dados de NAD(P)H, prossiga com as etapas 2.3.3-2.3.5. Para a comparação geral dos gráficos fasoriais, prossiga a partir da etapa 2.3.6.
  NOTA: Aplique as configurações de análise (tipo de filtro, harmônicos, limite, binning e ROIs fasoriais) igualmente a todas as imagens em um conjunto de dados comparado.
3. (Opcional para análise NAD(P)H) Escolha qualquer imagem relacionada ao conjunto de dados e use a opção Cursor de taxa de desenho para dois componentes para localizar com precisão a posição de 0,45 ns em um círculo universal de um espaço de plotagem fasorial padrão. Esta posição será atribuída a um tempo de vida médio de fluorescência de uma solução homogênea pura de NAD (P) H, que normalmente está próxima do decaimento mono-exponencial⁶².
  NOTA: O NADH livre e o NAD (P) H livre têm propriedades espectrais semelhantes e valores semelhantes de vida útil de fluorescência em solução aquosa, com dois componentes de vida útil curta, 0,3 ns e 0,7 ns⁶³. Assim, pela simplicidade da análise baseada em fasores e devido a uma pequena diferença entre os componentes do tempo de vida, seu decaimento de fluorescência é aceito como monoexponencial, o que permite a alocação da nuvem fasorial em um círculo universal. O tempo médio de vida de referência de uma forma livre de NAD(P)H também pode ser medido e plotado em um espaço fasorial para uma análise semelhante. O tempo de vida de referência foi escolhido com base na literatura⁶²; observe que em outras fontes, um valor ligeiramente diferente de um NAD (P) H livre em solução pode ser encontrado (0,4 ns⁶⁴).
4. (Opcional para análise NAD(P)H) Exporte o gráfico fasorial com tempo de vida de NAD(P)H livre alocado (consulte a etapa 2.3.3) clicando com o botão direito do mouse no gráfico e selecionando Exportar dados. Exporte o gráfico fasorial como um arquivo de formato .tiff para uma pasta de armazenamento designada.
  NOTA: O tamanho original do pixel da imagem de plotagem fasorial exportada do módulo LAS X FLIM é sempre 1024 x 600 pixels. Se outro software for usado para exportação e pré-análise de dados, certifique-se de que todas as imagens de plotagem fasorial sejam exportadas com o mesmo tamanho e resolução.
5. Para exportar nuvem fasorial relacionada ao esferoide, utilize a ferramenta Draw Cursor no módulo LAS X FLIM para escolher o ROI do esferóide na imagem. Exporte o gráfico fasorial gerado conforme descrito na etapa 2.3.4.
  NOTA: As coordenadas g e s correspondentes (semelhantes a x e y) do espaço fasorial serão atribuídas a cada pixel da ROI escolhida, de acordo com seus tempos de vida, transformados em um conjunto de dados no domínio da frequência^64,65. O cluster de pixels com valores semelhantes de t_f(tempo de vida da fase) e t_m (tempo de vida da modulação) formará um padrão de nuvem (nuvem fasor) em um gráfico, onde o código de cores (com um intervalo de azul profundo a vermelho) refletirá a abundância de valores de tempo de vida. Pela posição da nuvem em um círculo universal ou no interior, os decaimentos mono ou multi-exponenciais podem ser distinguidos. Alguns meios de medição exibem forte (auto)fluorescência, levando ao aparecimento de uma nuvem correspondente em um gráfico fasorial, que não pode ser simplesmente removida com a média do limiar de intensidade. Esse padrão influenciará o cálculo das coordenadas do centróide e deve ser excluído do gráfico fasorial exportado. Trabalhar com o ROI do esferóide permite a exclusão dos pixels não relacionados da análise fasorial posterior.
6. Repita o procedimento de exportação do gráfico fasorial para todas as ROIs esferóides em um conjunto de dados (consulte as etapas 2.3.4 e 2.3.6). Além disso, verifique o conjunto exportado de imagens .tiff para garantir o conjunto completo de dados para análise comparativa adicional e garantir que todas as imagens exportadas tenham o mesmo tamanho de pixel (consulte a NOTA na etapa 2.3.4).
  NOTA: Nesta fase do protocolo, o conjunto de imagens deve incluir fasor com a localização de NAD(P)H livre (com base na literatura ou dados obtidos empiricamente) e todos os gráficos fasoriais de ROI esferóide (ou padrões alternativos de ROI, se necessário para a análise específica). A partir desta etapa, uma análise mais aprofundada será feita em FIJI e posteriormente em uma planilha. Usando a janela de ferramentas Analisar , defina a opção Escala no FIJI e certifique-se de que todas as imagens de plotagem fasorial sejam calibradas com o mesmo tipo de unidade, por exemplo, apenas em pixels. Caso contrário, defina o comprimento da unidade na janela Definir escala para a escolhida (por exemplo, para escala baseada em pixels, coloque 1 no campo Distância em pixels e defina a unidade de comprimento como Pixel). Para comparação adicional, meça todos os dados exportados usando o mesmo tipo de unidade.
7. (Opcional para análise NAD(P)H) Determine a posição do ponto de pixel de uma vida útil média de fluorescência de NAD(P)H livre na imagem de gráfico fasorial exportada correspondente (consulte a etapa 2.3.3): Abra a imagem fasorial com FIJI, amplie a imagem para visualizar claramente com uma resolução de pixel a interseção entre o semicírculo universal e a linha Cursor de proporção para dois componentes ; use a ferramenta ROI do retângulo para selecionar a interseção.
  NOTA: Certifique-se de que a seleção retangular seja uma pequena área ao redor do ponto de interseção para determinação precisa de suas coordenadas na próxima etapa (etapa 2.3.9).
8. (Opcional para análise NAD(P)H) Abra a ferramenta Analisar , escolha a janela Definir medidas e selecione Centroide como um parâmetro de medição. Clique em Medir na janela de ferramentas Analisar para determinar as coordenadas do centróide do ponto de referência NAD(P)H livre. Exporte essas coordenadas para uma planilha.
  NOTA: As coordenadas NAD (P) H livres serão usadas como ponto de referência para comparar as distâncias deste ponto até a posição da nuvem fasorial esferóide em um conjunto de dados (a maneira de caracterizar a mudança metabólica entre glicólise e OxPhos na análise de autofluorescência NAD (P) H FLIM)
9. Usando FIJI, abra a imagem da nuvem fasorial esferoide. Abra a ferramenta Janela de imagem , escolha Ajustar e selecione Limite de cor na barra de ferramentas. Selecione o Método de Limiar de escolha (por exemplo, Otsu) e defina o Valor de Matiz e o Valor de Brilho para restringir os parâmetros para a seleção de uma parte de nuvem fasorial com as coordenadas de pixel mais abundantes. Clique em Selecionar para definir a área do cluster.
  NOTA: Mantenha os mesmos parâmetros de limite para todas as imagens de gráfico fasorial, que devem ser analisadas. Para os dados NAD(P)H-FLIM apresentados, o método de limiar Otsu com valor de matiz definido 9 e valor de brilho 160 foi escolhido e aplicado a todas as imagens fasoriais. Como alternativa, a área selecionada pode ser copiada para o ROI Manager (siga o caminho Editar > Seleção > Adicionar ao Manager) para criar uma biblioteca de ROIs fasoriais para análise posterior.
10. Mantendo a seleção, calcule as coordenadas do centróide da área selecionada seguindo o procedimento descrito na etapa 2.3.9. Exporte essas coordenadas para o arquivo de planilha.
11. Repita as etapas 2.3.9 e 2.3.10 para determinar as coordenadas do centróide para todas as imagens fasoriais ROI para criar um conjunto de dados na planilha.
  NOTA: O uso da biblioteca ROI Manager ajuda a simplificar e organizar a análise de ROI (consulte a etapa 2.3.10)
12. (Opcional para análise NAD(P)H) Abra a planilha com as coordenadas de referência de NAD(P)H livre e ROIs de esferoides exportadas de diferentes grupos de comparação. Calcule a distância entre cada centróide fasor esferóide individual para referenciar a posição de NAD(P)H livre usando coordenadas determinadas e a seguinte equação:
  
  Onde, X_c e Y_c são coordenadas centróides, X_f e Y_fsão as coordenadas de referência.
  NOTA: A aplicação do parâmetro centróide para determinação do deslocamento em direção ao tempo de vida de referência é apropriada apenas no caso de todos os centróides de um conjunto de dados estarem na mesma trajetória linear em direção ao ponto de referência. Para verificar isso, todos os pontos centróides do conjunto de dados devem ser plotados junto com o ponto de referência no mesmo espaço de coordenadas, e o alinhamento da tendência linear deve ser realizado. Se o coeficiente R² da linha de tendência linear traçada através de todos os pontos for próximo de 1 (por exemplo, R² é 0,8-0,99), a análise de distância é considerada apropriada.
13. Organize todos os dados de acordo para comparação e realize análises estatísticas com o uso de qualquer software correspondente (por exemplo, Origin, MatLab). Escolha o teste estatístico apropriado de acordo com as características do conjunto de dados (normalidade da distribuição, número de unidades estatísticas, etc.).
  NOTA: Para análise NAD(P)H, compare os valores de distância para caracterizar a mudança metabólica dependendo das condições experimentais. Para comparação de quaisquer gráficos fasoriais entre grupos experimentais, realize a comparação das coordenadas dos centróides da nuvem fasorial ROI.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Escolhendo o método apropriado de formação de esferoides
O método de formação de esferóides selecionado pode influenciar muito o tamanho, a forma, a densidade celular, a viabilidade e a sensibilidade aos medicamentos dos esferoides (Figura 2). Anteriormente, os efeitos de vários métodos de alto rendimento (SphericalPlate 5D, micromoldes feitos em laboratório e moldes MicroTissue) e os métodos de baixa fixação de 'rendimento médio' (placas de 96 poços revestidas com Biofloat e Lipidure) foram comparados na viabilidade e oxigenação dos esferoides²⁹.

Aqui, diferentes métodos de formação resultam em esferóides de diferentes tamanhos, mesmo com a mesma concentração inicial de 500 células/esferóide. Os esferoides HCT116 formados em placas de 96 poços de baixa fixação foram significativamente maiores em comparação com os métodos de alto rendimento após 5 dias de formação (Figura 2 e Tabela 2). Além disso, os métodos de baixa fixação levaram ao desenvolvimento evidente de um núcleo necrótico detectado pela coloração com iodeto de propídio (vermelho), enquanto os esferoides gerados com outros métodos (MicroTissue, moldes feitos em laboratório e placa esférica 5D) demonstraram a distribuição difusa de células mortas pelo corpo esferóide (Figura 2A). Essa diferença na viabilidade celular ao longo do volume do esferóide também pode afetar a difusão de oxigênio através do meio, que por sua vez pode ser afetada pela pressão parcial de O₂ , taxa de consumo, temperatura e solubilidade de O₂ . Além disso, em métodos de alto rendimento, os nutrientes se esgotam e os resíduos se acumulam mais rapidamente, pois um número maior de esferoides está dentro do mesmo volume e, portanto, requer uma troca de meio mais frequente (Figura 2A).

A oxigenação esferóide geral foi medida usando a sonda MMIR1 recentemente caracterizada e validada²⁹, com um protocolo detalhado relatado anteriormente²⁵. A oxigenação só pôde ser comparada entre os métodos de alto rendimento e o método de baixa ligação separadamente (Figura 2B), pois a relação sinal-ruído é diferente em todos os métodos de formação de esferóides comparados. Os esferoides 5D da placa esférica apresentaram menor oxigenação geral em comparação com o MicroTissue (valor de P = 0,0697) e os micromoldes feitos em laboratório (valor de P = 0,0005) (Figura 2C). Os esferoides produzidos com a placa esférica 5D são cultivados a uma distância maior da superfície da interface do ar do meio em comparação com os métodos de molde de agarose, causando uma entrega mais lenta de O₂ na cultura estática. Essa hipótese é válida, pois os valores de oxigenação entre as duas placas de baixa inserção e, adicionalmente, entre os dois métodos de molde de agarose são estatisticamente semelhantes (Figura 2D).

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Figura 2: Os métodos de formação de esferóides afetam a morfologia, tamanho, viabilidade e oxigenação. (A) Os esferóides HCT116 (densidade inicial de semeadura de 500 células) foram cultivados por 5 dias antes da coloração de 1 h com iodeto de propídio (necrose celular, vermelho, 1 μg / mL) e Calceína Green-AM (células viáveis, verde, 1 μg / mL). Os métodos de formação de baixa ligação produzem esferóides maiores contendo um núcleo necrótico (vermelho). A barra de escala é de 100 μm. (B) A oxigenação em esferoides HCT116 (semeadura inicial de 500 células com adição de 20 μg / mL MMIR1 durante a formação do esferoide, 6 dias) produzida por diferentes métodos mostrou mais esferoides oxigenados com o MicroTissue e micromoldes feitos em laboratório do que o SphericalPlate 5D. (C) Oxigenação geral do esferóide calculada pelas medições de proporção. (D) Tamanho dos esferóides na área quadrada após 5 dias. Os resultados mostram a média ± SEM de 6-16 esferoides. 5D = Placa Esférica 5D, MM = Método Micromold, MT = Método MicroTissue. Valor de p < 0,001 e ****Valor de p <0,0001 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Método de formação	Quantidade de esferóides por poço	Quantidade total de células semeadas por poço	Área quadrada (μm²)
Microtecido	81	40.500 células/190 μl	112.558 ± 15.702
Micropoços feitos em laboratório	1859	794.500 células / mL	53.460 ± 8.332
Placa esférica 5D	750	375.000 células/mL	44.048 ± 7.259
Lipidure	1	500 / 200 μL	257.148 ± 28.132
Bioflutuador	1	500 / 200 μL	254.475 ± 21365

Tabela 2: Diferentes métodos de formação de esferóides levam a diferenças no tamanho do esferóide, medido pela área ao quadrado.

Ao selecionar um método específico de formação de esferóides para os experimentos, deve-se ter em mente que a adição de nanopartículas pode influenciar a forma do esferoide. Ao usar o revestimento à base de lipídios com micropoços de fundo redondo, pode ocorrer precipitação da sonda, levando à formação de "esferóides satélites" ou esferóides não circulares (Figura 3). A adição da sonda O₂ à placa comercial Biofloat resulta em uma periferia esferóide não compacta, sugerindo a potencial interferência das nanopartículas com o revestimento da microplaca. A morfologia dos esferóides também pode ser afetada pela poeira presa às pontas das pipetas. As células em suspensão podem aderir à poeira, afetando assim a forma. Portanto, recomenda-se o uso de ponteiras de pipeta recarregáveis já fornecidas em um rack.

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Figura 3: Imagens de microscopia de luz de transmissão com exemplos de formação de esferóides não ideais. O armazenamento incorreto de nanopartículas pode causar precipitação da sonda, interferindo na formação de esferoides. Exemplos de interferência de sonda e poeira. A barra de escala é de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Claramente, os métodos de formação de esferóides afetam o tamanho, a morfologia e a viabilidade do esferóide e levam a diferenças em sua oxigenação. O método de alto rendimento com moldes de agarose (por exemplo, comercialmente disponíveis, como o molde MicroTissue) é compatível com a maioria dos experimentos. Resulta em uma forma mais reprodutível, não induz precipitação de nanopartículas, é reutilizável e pode ser compatível com microscopia de acompanhamento direto. No entanto, para esferoides grandes (>800 μm) e cultura de longo prazo, o método de baixa fixação é recomendado, pois os métodos de alto rendimento exigiriam troca frequente de meios. Nesse caso, o problema da precipitação de nanopartículas e sua influência na formação de esferóides podem ser evitados pela pré-coloração durante a noite da cultura de monocamada 2D antes da formação de esferóides (Figura 4).

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Figura 4: Algoritmo sugerido para selecionar o método de formação de esferóides para microscopia de fluorescência ao vivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

FLIM multiparâmetro de esferoides NAD(P)H por microscopia FLIM de dois fótons revela heterogeneidade metabólica em esferoides HCT116
Um marcador de autofluorescência proeminente em imagens metabólicas sem marcadores, o NAD (P) H mostra uma vida útil mais curta para a glicólise e uma vida útil mais longa para o OxPhos, permitindo decifrar a distribuição espacial da atividade metabólica em modelos 3D como esferóides e organoides³¹. Para analisar convenientemente a distribuição de NAD(P)H em esferoides HCT116, foi utilizado um método quantitativo baseado em fasor para análise de NAD(P)H de autofluorescência, revelando estados ligados à glicólise e fosforilação oxidativa (OxPhos). Embora as imagens de intensidade de fluorescência dos esferoides HCT116 não tenham revelado diferenças significativas entre os esferoides, a imagem FLIM rápida do NAD(P)H revelou uma clara diferença nas seções ópticas dos esferoides. Em imagens FLIM rápidas, esferóides com uma área interna exibindo uma vida útil de fluorescência mais curta foram marcados com um círculo branco, identificando-o como um núcleo glicolítico (Figura 5A). Consequentemente, os esferoides foram divididos em dois grupos, o grupo do núcleo glicolítico e o grupo do núcleo não glicolítico, com base na presença ou falta de um núcleo glicolítico. Uma análise fasorial baseada em centróide foi empregada para analisar estatisticamente as diferenças entre dois grupos distintos e medir a distância do centróide do cluster de pixels até o ponto NAD(P)H livre. Conforme ilustrado na Figura 5B, houve uma diferença óbvia de cluster de pixels entre o grupo glicolítico e o grupo não glicolítico no gráfico fasorial. Para medir com precisão a distância, o ponto NAD(P)H livre no gráfico fasorial foi marcado com precisão usando o módulo FLIM no software LAS X e, em seguida, exportado para o software FIJI para a determinação exata das coordenadas. Posteriormente, seguindo o protocolo 2.3, as coordenadas centróides foram medidas no gráfico fasorial de cada grupo usando o software FIJI. A distância (D) do centróide ao ponto NAD(P)H livre, usando o teorema de Pitágoras, foi calculada facilitando a análise dos perfis de NAD(P)H para distinguir esferóides OxPhos e esferoides com núcleo glicolítico. Os resultados, conforme exibidos no boxplot, mostram as diferenças significativas de distância entre os esferoides do núcleo glicolítico e o grupo do núcleo não glicolítico (***Valor P < 0,001) (Figura 5C). Este resultado foi consistente com imagens FLIM rápidas, demonstrando que este método de análise fasorial é adequado para análise quantitativa da divergência NAD(P)H de populações de esferóides. Além disso, para validar se essa abordagem era aplicável para comparar a distância entre os dois grupos de esferoides, foi realizada uma análise de regressão linear para centróides de ambos os grupos e ponto NAD(P)H livre (Figura 5D). O resultado mostrou que os centróides estão alinhados com o NAD(P)H livre, com alto coeficiente de correlação (R² = 0,997), validando a viabilidade de comparar a distância para inferir a diferença do NAD(P)H entre os grupos esferoides.

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Figura 5: Análise fasorial de esferóides HCT116 feitos usando placas de baixa fixação: comparação de núcleos glicolíticos e não glicolíticos da distribuição de NAD (P) H via FLIM de dois fótons. Parâmetros de aquisição: intensidade do laser: 15%, resolução: 512 x 512 pixels, ex. 741 nm/em. 411-491 nm. (A) A intensidade de fluorescência e as imagens FLIM rápidas exibem a distribuição de NAD (P) H em esferóides HCT116, distinguindo esferóides com núcleo glicolítico (esquerda) daqueles sem (direita). O círculo branco na imagem rápida do FLIM exibiu uma área de vida útil mais curta, definindo um núcleo glicolítico. Densidade inicial de semeadura: 50 células (esquerda) e 500 (direita), tempo de incubação: 6 dias, barra de escala: 50 μm. (B) A metodologia para medir a distância do centróide dos esferóides HCT116 ao ponto NAD (P) H livre em gráficos fasoriais, usando o módulo LAS X FLIM e o software FIJI em dois grupos de esferóides distintos (D: distância). Para esferoides HCT116, um filtro wavelet e um valor limite 10 foram empregados para o gráfico fasorial. (C) Boxplot mostrando a diferença de distância do centróide ao ponto NAD (P) H livre, comparando grupos de núcleo glicolítico e núcleo não glicolítico (*** P < 0,001). (D) O ajuste linear de centróides de gráfico fasorial de núcleos glicolíticos, grupos de núcleos não glicolíticos e coordenadas teóricas NAD(P)H livres demonstrou alinhamento linear preciso com R² = 0,997, permitindo a comparação direta da diferença de distância entre esferóides de núcleo glicolítico e núcleo não glicolítico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise multiplexada de autofluorescência e hipóxia de FAD em esferoides de células-tronco da polpa dentária humana (DPSC)
Os esferoides de células-tronco da polpa dentária são uma ferramenta experimental atraente para a biofabricação de diferentes tecidos, incluindo osteoblastos 25,66,67. No entanto, sua viabilidade e metabolismo raramente são estudados. Esses esferóides derivados de células-tronco exibem tamanhos bastante pequenos (<200 μm), autofluorescência verde brilhante de FAD / Flavinas (mais tarde referido como FAD) (ex. 460 nm, em. 550 nm) e a presença de gradientes hipóxicos 'diretos' e 'invertidos'²⁹. A Figura 6 demonstra os resultados da imagem raciométrica confocal combinada da oxigenação dos esferoides (com a ajuda de nanopartículas sensíveis ao_O2 MMIR) e da autofluorescência FLIM do FAD. O gradiente de oxigenação direta 'clássico' foi observado em esferoides de 69 mm de diâmetro, enquanto esferoides maiores (141 μm) apresentaram gradiente 'invertido'. Adicionar FAD-FLIM a essas medições ajuda a validar as diferenças no metabolismo oxidativo, como demonstram os gráficos rápidos de FLIM e fasor: pequenos esferoides exibiram uma fração mais proeminente de vida útil mais longa do FAD, potencialmente indicando maior atividade glicolítica nos esferoides de tamanho menor.

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Figura 6: Exemplo de imagem multiparamétrica de autofluorescência de flavina (ex. 460 nm/em. 510-590 nm) e oxigenação (análise da razão de intensidade com nanopartículas sensíveis a MMIR O₂ : ex. 614 nm/referência em. 631-690 nm/em. sensível 724-800 nm) em esferoides hDPSC de diferentes tamanhos (pequeno: 188 células/esferóide, grande: 820 células/esferoide), produzido pelo método de micromoldes de agarose autoproduzidos de alto rendimento (FLIM confocal). (UMA, B) Exemplo representativo da razão de intensidade de oxigenação e imagem de tempo de vida de autofluorescência de flavina em esferoides hDPSC grandes (A, "B Sphs") e pequenos (B, "S Sphs"). (C, D) Análise comparativa do tempo de vida da flavina-autofluorescência usando análise de nuvens fasoriais, com base na comparação de centros geométricos de nuvens fasorais. (E) As coordenadas dos centróides de pixel (centros geométricos) da autofluorescência da flavina do esferóide hDPSC grande (B Sphs) e do esferóide hDPSC pequeno (S Sphs) no gráfico fasorial. Dois códigos de cores diferentes aplicados para diferentes abordagens de análise FLIM, onde o código de cores com τ mostra a distribuição do tempo médio de chegada dos fótons (imagens FAST-FLIM), enquanto o código de cores com τ φ - fase tau corresponde à análise fasor-FLIM do tempo de vida da fluorescência nos mesmos esferóides. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise multiplexada da autofluorescência do FAD e morte celular em esferoides iPSC humanos
Os esferoides de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) são frequentemente usados como um primeiro passo durante a indução da diferenciação específica do tecido e a produção de organoides, por exemplo, no caso da cultura de organoides neurais. Dependendo de seu manuseio e do protocolo de geração específico, a viabilidade e a subsequente reprodutibilidade dos organoides podem ser severamente afetadas. A investigação não destrutiva de organoides e esferoides contendo células progenitoras neurais é crucial para a avaliação estrutural, monitoramento e previsão da qualidade dos tecidos neurais em crescimento e montados durante seu desenvolvimento^68,69. A Figura 7A mostra que o FLIM não destrutivo de moléculas autofluorescentes de flavina / FAD pode nos fornecer informações sobre a viabilidade dos esferóides iPSC. A imagem foi realizada 4 dias após a semeadura de 9.000 iPSCs em poços comerciais de placas de fixação ultrabaixa (Corning). Antes da imagem, os esferoides foram corados por 1 h com 0,5 μg/mL de iodeto de propídio (PI) para visualizar as células mortas. Nenhum núcleo necrótico foi observado nesses esferoides iPSC com uma densidade de semeadura de 9.000 células após 4 dias. Três padrões principais podem ser distinguidos no gráfico fasorial correspondente da autofluorescência flavina/FAD (painel esquerdo da Figura 7B): padrão de autofluorescência do meio (cor magenta), padrão (com τ médio φ - fase tau, ~ 2,6 ns) correspondendo a nenhuma região PI (ROI1) e padrão (com τ médio φ ~ 3,1 ns) de regiões correlacionadas com o marcador de morte celular - coloração (ROI2). Uma comparação adicional de culturas 2D de iPSCs tratadas e não tratadas com IP não demonstrou nenhum impacto do IP no aparecimento de padrões fasoriais de flavina / FAD de longa vida ( Figura 7C ), indicando que esse aumento de vida útil de flavinas / FAD pode ser um marcador independente de viabilidade comprometida de iPSCs e suas células derivadas. Embora esta observação esteja de acordo com o recente relatório sobre imagens baseadas em intensidade⁷⁰, não podemos descartar completamente a presença de intensidade de iodeto de propídio com canal de emissão FAD (506-582 nm). Uma investigação mais aprofundada é necessária para provar a ligação entre as alterações na vida útil da flavina / FAD e eventos potenciais de morte celular. A análise simples baseada em fasores multiparamétricos de regiões ROI demonstra uma maneira elegante de triagem rápida e análise de dados.

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Figura 7: Autofluorescência de flavina confocal FLIM e coloração de iodeto de propídio em esferoides iPSC para avaliar a viabilidade celular. (A) Autofluorescência de flavina (esquerda) e iodeto de propídio - PI (direita) FLIM de um esferóide iPSC 4 dias após a semeadura de 9.000 células em uma placa de fixação ultrabaixa (Corning) e coloração PI (0,5 μg/mL, 1 h) antes da imagem. (B) Análise do gráfico fasor das imagens gerais de autofluorescência de flavina (esquerda) e iodeto de propídio (direita) e ROIs correspondentes (ROI1 - verde e ROI2 - vermelho, autofluorescência do meio - magenta). As ROIs foram selecionadas com base na presença de marcação com iodeto de propídio. (C) análise rápida de FLIM e gráfico fasorial da autofluorescência de flavinas em cultura 2D de iPSC tratada e não tratada com PI (0,5 μg/mL, 1 h). Nenhum impacto da coloração PI na aparência da longa vida útil de fluorescência das flavinas (corresponde a um padrão fasorial dentro de um círculo rosa) foi detectado ao coletar a excitação da flavina dentro de uma faixa de 469-542 nm. Esta faixa de detector não se sobrepõe ao espectro de excitação de PI (550-720 nm). Quando uma faixa de excitação mais ampla para FAD é coletada (469-590 nm), um impacto de PI pode ser notado. O código de cores da imagem corresponde aos valores médios do tempo de chegada dos fótons (fast-FLIM). Os parâmetros de imagem foram T = 35 °C, objetiva de imersão em água 25X/0,95 (AB), objetiva de glicerol 40X/1,25 (C). Flavinas: ex. 460 nm, em. 506-582nm (AB), orifício 4 UA. PI: ex. 535 nm, em. 584-667 nm, orifício 1 UA. Canais: Intensidade e Tau. A taxa de repetição de 40 MHz para coletar o decaimento total da autofluorescência da flavina. Configurações de análise fasorial; Harmônico 1, Limiar 1 (AB), 47 (C), Filtro Mediano 17 (AB), 11 (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Protocolos adicionais sobre formação de esferóides. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Dados FLIM do núcleo glicolítico e do núcleo não glicolítico.lif. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Dados FLIM do núcleo glicolítico.ptu. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Dados FLIM de núcleo não glicolítico.ptu. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 5: Núcleo glicolítico FLIM.tif rápido Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 6: Núcleo não glicolítico FLIM.tif rápido Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 7: Núcleo glicolítico NAD (P) H livre point.tif Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 8: Fasor do núcleo glicolítico plot.tif Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 9: NAD (P) H livre de núcleo não glicolítico point.tif Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 10: Núcleo fasor não glicolítico plot.tif Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os esferoides multicelulares estão se tornando um método de escolha nos estudos de microambientes de nicho de tumores e células-tronco, descoberta de medicamentos e desenvolvimento dos 'blocos de construção de tecidos' para biofabricação. A arquitetura interna heterogênea dos esferoides, gradientes de nutrientes e oxigenação podem imitar os de tecidos e tumores in vivo em um ambiente relativamente simplificado e acessível. Com a necessidade de mais transparência metodológica^26,28 e padronização⁷¹, espera-se que esses protocolos ajudem os pesquisadores a escolher o melhor método de formação de esferoides para os experimentos de microscopia de imagem de fluorescência ao vivo. Os métodos apresentados aproveitam os sensores de nanopartículas de coloração celular e a autofluorescência celular intrínseca, que podem ser facilmente combinados com a coloração da morte celular.

As etapas mais críticas estão no protocolo de formação de esferóides; Assim, para o método à base de agarose de alto rendimento, é essencial equilibrar suficientemente os moldes de agarose para o meio de cultura. O tempo de equilíbrio insuficiente levará à diluição de nutrientes no PBS remanescente e trará fatores adicionais para a heterogeneidade esferóide 21,26,72,73. O molde de agarose recém-feito também deve ser verificado visualmente quanto à presença de bolhas de ar, microfissuras e outros defeitos.

Embora eficiente para imagens, a suspensão de nanopartículas pode exibir autoagregação e causar a formação de esferóides de formato irregular em métodos de formação de baixa aderência. Isso geralmente pode ser mitigado pela adição de soro ao meio de cultura ou pela pré-coloração da cultura de células em monocamada antes da formação do esferoide. Freqüentemente, durante a compactação de esferoides, a adição de uma pequena quantidade de nanopartículas (por exemplo, 10% da concentração inicial de coloração) também pode ajudar a corar a zona de proliferação dos esferoides. Por fim, é importante usar ponteiras de pipeta estéreis "livres de poeira" com todos os métodos de formação.

O impacto potencial da iluminação na viabilidade celular deve sempre ser considerado durante os experimentos de imagem. Assim, é importante conhecer os fatores de risco que afetam negativamente cada experimento de imagem ao vivo. Em geral, o fotodano envolve vários mecanismos: (1) alto aumento local de temperatura, (2) estresse mecânico e (3) estresse fotoquímico (reação oxidativa e de radicais livres)⁷⁴. Dependendo da modalidade de imagem (por exemplo, imagem confocal de um fóton vs. multifóton, modos de iluminação contínua vs. pulso, a sensibilidade dos detectores e a potência da fonte de luz em diferentes comprimentos de onda, se o ajuste de excitação for possível), tipo de célula e tecido (por exemplo, acúmulo dependente do tipo de tecido de pigmentos absorventes de luz com eficiência ou outras moléculas de autofluorescência, organização 3D vs. 2D, crescimento e composição dos meios de imagem), a origem da sonda fluorescente (por exemplo, propriedades fotossensibilizantes) diferentes combinações de fatores de risco podem provocar fototoxicidade durante a imagem. Além disso, mesmo que nenhum aumento na morte celular seja observado após a iluminação, os efeitos anteriores da pré-morte dependentes da energia da luz nas mitocôndrias e no metabolismo podem interferir potencialmente na análise e interpretação do experimento⁵⁵.

Para excluir o impacto fototóxico nos resultados experimentais, o pesquisador deve realizar monitoramento geral da viabilidade celular e mudanças na morfologia celular em comparação com o controle intacto ou usando sondas de morte celular para estimar o aumento da taxa de morte celular após a iluminação. Se os experimentos metabólicos forem realizados, a otimização dos parâmetros de imagem deve ser feita de acordo nos experimentos piloto para estimar e minimizar o impacto da imagem nos parâmetros metabólicos medidos. No caso de sondas sensíveis ao oxigênio, a sobredosagem de luz pode ser facilmente rastreada por um aumento repentino da vida útil e da intensidade da fosforescência do corante sensível ao_O2 (mudanças correspondentes na relação de intensidade de referência ao corante sensível ao_O2) devido ao chamado efeito de "consumo fotoinduzido de_O2"^53,75. Isso pode ser feito facilmente pela análise da curva cinética de experimentos de lapso de tempo com diferentes parâmetros de potência de luz usando, por exemplo, o seguinte protocolo publicado²⁵. Em 'defesa' da iluminação de pulso (por exemplo, utilizada na microscopia TCSPC-F(P)LIM), os estudos recentes demonstraram seu impacto mínimo na produção de ROS e fotobranqueamento da sonda em comparação com as medições de iluminação em estado estacionário^76,77, apontando para uma vantagem adicional do TCSPC-FLIM em comparação com a abordagem convencional de imagem baseada em intensidade.

A principal limitação dos métodos de formação de esferoides apresentados reside em aplicações de monitoramento direto e de longo prazo. Os moldes de agarose requerem uma objetiva de longa distância de trabalho (ou microscópio vertical adicional ou microscópio estéreo de fluorescência) devido à espessa camada de agarose e o material da 5D Spheriplate pode interferir nas medições em canais fluorescentes vermelhos (sonda O₂ ). O tamanho do esferóide produzido por métodos de alto rendimento é limitado pelo diâmetro do micropoço e requer troca frequente de meio para evitar o esgotamento e a acidificação do meio. Com todas essas limitações, recomendamos as placas de Petri 3D (MicroTissue) para experimentos que exigem alto rendimento (por exemplo, para aplicações de bioimpressão 3D) e métodos de baixa fixação para estudos básicos de "médio rendimento", também exigindo números de células menores.

O monitoramento da oxigenação raciométrica e os experimentos convencionais de microscopia baseada em corante de fluorescência de células vivas são acessíveis em microscópios invertidos amplamente disponíveis se equipados com uma câmera sensível ao infravermelho próximo (NIR), excitação baseada em diodo emissor de luz (LED) e objetiva apropriada²⁵. Para um seccionamento óptico e FLIM mais apropriados, recomenda-se o uso de sistemas de microscópio confocal comercial disponíveis no mercado (como descrito aqui). Embora também descrevamos um método para detectar a autofluorescência NAD(P)H, exigindo um microscópio FLIM de dois fótons mais caro, existem muitas abordagens diferentes, compatíveis e úteis para sistemas FLIM confocais, equipados idealmente com laser de luz branca e detectores híbridos ou SPAD. Isso inclui avaliação do metabolismo celular, proteínas biossensores FRET-FLIM, mecânica celular e tecidual de imagem, autofluorescência de tipos específicos de células e tecidos e interações receptor-medicamento visualizadas via FLIM-FRET³¹.

O software de aquisição e análise FLIM fornecido pelo fornecedor pode afetar o sucesso do experimento, pois nem sempre é possível exportar o IRF ou as imagens em um formato compatível com a análise de código aberto downstream. O pós-processamento é uma parte importante do fluxo de trabalho de análise FLIM e ainda não é universalmente padronizado ou aceito. O ajuste de curva requer um número maior de fótons e mais poder computacional em comparação com a abordagem fasorial. O FLIMfit⁴⁵ (ajuste global e pixel a pixel) e o Flimview⁷⁸ estão entre os softwares abertos usados para análise de ajuste de curvas, enquanto o PAM⁷⁹, o FLUTE⁶⁴ e o AlliGator⁸⁰ são usados para análise fasorial. FLIMJ⁴⁶ é um plugin ImageJ útil que funciona com ambas as abordagens. Juntas, essas opções ajudam a melhorar a rotina de pós-processamento e torná-la mais rápida, versátil e fácil de usar.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Fundo Especial de Pesquisa (BOF) da Universidade de Ghent (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Fundação de Investigação da Flandres (FWO, I001922N) e União Europeia, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN n.º 101073507.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Tripsina-EDTA	Gibco	25300-054	Também disponível na Sigma
10 mL pipetas serológicas	VWR	612-3700	Produtos semelhantes também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas
Placas de cultura de células de 12 poços, Greiner	bio-one	665-180	Estéril Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning e outras empresas.
Corrediça de câmara de 12 poços, removível	Ibidi	81201	Também disponível na Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific e outros
Tubos de centrífuga de 15 mL	Nerbe plus	02-502-3001	Produtos semelhantes também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas
Micromoldes de placa de Petri 3D	Microtecido	Z764000-6EA
Placas de cultura de células de 6 poços, Greiner estéril	bio-one	657160	Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas
Etanol 70%	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Placa revestida de 96 poços disponível comercialmente para formação de esferóides
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Aplicar em diluição 1:1000
Software CellSens Dimension	Olympus	versão 3
Colágeno da placenta humana, tipo IV	Sigma	C5533	Para a preparação de placas de microscopia revestidas com 0,07 mg/mL de colágeno e 0,03 mg/mL de poli-D-lisina
Microscópio confocal FLIM Leica	Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon microscópio invertido com laser de luz branca, detectores HyD X, câmara de controle climático/T (OkoLab), 25x/0,95 W objetiva
D(+)-Glicose	Merck	8342	Prepare uma solução estoque M, 1:100 para preparação de meio de imagem (concentração final 10 mM)
Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), vermelho de fenol, glicose, piruvato e glutamina livre	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	Para preparação de meio de imagem
Soro Fetal Bovino ( FBS)	Gibco	10270-098	Também disponível na Sigma. Precisa ser inativado por calor antes do uso.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Diluição 1/100 para preparação de meio de imagem (concentração final 10 mM)Células de câncer de
cólon humano HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	versão 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	versão 4.6.1.27508
L-glutamina	Gibco	25030	Também disponível na Sigma. Aplicar na diluição 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, precisa de adição de 1 mM de piruvato de sódio e 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Meio de crescimento padrão para células HCT116
selos PDMS impressos em 3D micropadronizados	N/A	N/A	Fornecido pelo Centro de Tecnologia de Microssistemas, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Universidade de Ghent
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Câmara de medição Neubauer	Fisher Scientific	15980396
Sondas de O2: MMIR1	N/A	N/A	A Caracterização completa, validação e algumas aplicações podem ser encontradas em: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolver o comprimido de PBS em 500 mL de água destilada.
Estreptococos de caneta :P (10.000 U/mL) / estreptomicina (10.000 μ g/mL) solução 100x	Gibco	15140-122	Também disponível na Sigma. Aplicar na diluição 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	Para a preparação de 0,07 mg/mL de colágeno e 0,03 mg/mL de placas de microscopia revestidas com Poly-D-lysine
Iodeto de Propídio	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Coloração de morte celular, use 1 µ g/mL a 1h de incubação
Filtro de seringa PVDF 0,22 µ m	Novolab	A35149	Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas
Piruvato de sódio (100 mM)	Gibco	11360-070	Diluição 1/100 para preparação de meio de imagem (concentração final 1mM)
Placa esférica 5D 24 poços	Kugelmeiers	SP5D-24W
petridish estéril	Greiner bio-one	633181	Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas
Balão de cultura de tecidos (25 cm² )	VWR	734-2311	Produtos semelhantes também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas
Balão de cultura de tecidos (75 cm²)	VWR	734-2313	Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas
Placa de 96 poços com fundo em U	VWR	10062-900	Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one e outras empresas
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Outros tipos de Agarose, como Agarose de baixo ponto de fusão (A-9414, Sigma), Agarose para uso rotineiro (A-9539, Sigma)
Microscópio invertido de fluorescência de campo amplo	Olympus	N/A	Microscópio de fluorescência invertida IX81, com controle motorizado do eixo Z, CoolLED pE4000 (16 canais, 365-770 nm), câmera ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS, placa de aquecimento de vidro Okolab, software CellSens Dimension v.3 e objetivas de ar 4x/0.13 UPlanFLN e 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Opcional, para imagens de alta resolução) 60x/1,0 LUMPLFLN água

References

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