Aqui, descrevemos um método que permite a descalcificação de tecidos ósseos recém-obtidos e a preservação de RNA de alta qualidade. Um método também é ilustrado para seccionar amostras de Formalina Fixada Parafina Embebida (FFPE) de ossos não desmineralizados para obter resultados de boa qualidade se os tecidos frescos não estiverem disponíveis ou não puderem ser coletados.
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Artigo de método
Métodos para Habilitar a Transcriptômica Espacial de Tecidos Ósseos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Compreender a relação entre as células e sua localização dentro de cada tecido é fundamental para descobrir os processos biológicos associados ao desenvolvimento normal e à patologia da doença. A transcriptômica espacial é um método poderoso que permite a análise de todo o transcriptoma em amostras de tecido, fornecendo informações sobre a expressão gênica celular e o contexto histológico em que as células residem. Embora este método tenha sido amplamente utilizado para muitos tecidos moles, sua aplicação para as análises de tecidos duros, como o osso, tem sido um desafio. O maior desafio reside na incapacidade de preservar a morfologia do RNA e do tecido de boa qualidade durante o processamento das amostras de tecido duro para seccionamento. Portanto, um método é descrito aqui para processar amostras de tecido ósseo recém-obtidas para gerar efetivamente dados transcriptômicos espaciais. O método permite a descalcificação das amostras, garantindo cortes de tecido bem-sucedidos com detalhes morfológicos preservados, evitando a degradação do RNA. Além disso, são fornecidas diretrizes detalhadas para amostras que foram previamente embebidas em parafina, sem desmineralização, como amostras coletadas de bancos de tecidos. Usando essas diretrizes, são mostrados dados transcriptômicos espaciais de alta qualidade gerados a partir de amostras de banco de tecidos de tumor primário e metástase pulmonar de osteossarcoma ósseo.
Introdução
O osso é um tecido conjuntivo especializado composto principalmente por fibras de colágeno tipo 1 e sais inorgânicos1. Como resultado, o osso é incrivelmente forte e rígido, ao mesmo tempo em que é leve e resistente a traumas. A grande força do osso deriva de seu conteúdo mineral. De fato, para qualquer aumento na porcentagem de conteúdo mineral, a rigidez aumenta em cinco vezes2. Consequentemente, os investigadores enfrentam problemas significativos quando analisam, por meio de secção histológica, a biologia de uma amostra óssea.
A histologia óssea não descalcificada é viável e, às vezes, nec....
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Protocolo
Todos os procedimentos em animais descritos abaixo foram aprovados em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Faculdade de Medicina Dentária da Universidade de Pittsburgh.
1. Método para preparar blocos FFPE de amostras de tecido ósseo que requerem desmineralização
- Preparação de reagentes e materiais
- Prepare EDTA 20% pH 8,0. Para 1 L, dissolver 200 g de EDTA em 800 mL de água ultrapura, ajustar o pH para 8,0 com hidróxido de sódio 10 N e, finalmente, levar o volume para 1L com água ultrapura. Armazene em temperatura ambiente.
NOTA: Sempre use EDTA 20% pH 8.0 recém-prepar....
- Prepare EDTA 20% pH 8,0. Para 1 L, dissolver 200 g de EDTA em 800 mL de água ultrapura, ajustar o pH para 8,0 com hidróxido de sódio 10 N e, finalmente, levar o volume para 1L com água ultrapura. Armazene em temperatura ambiente.
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Resultados
O método apresentado aqui descreve como processar ossos recém-isolados para obter amostras FFPE desmineralizadas que podem ser facilmente seccionadas com um micrótomo, preservando a integridade do RNA (Figura 1). O método foi empregado com sucesso em fêmures murinos, mas pode ser seguido para outras amostras de tecido ósseo de dimensões semelhantes, ou pode ser adaptado para amostras ósseas maiores (por exemplo, amostras humanas) aumentando todos os parâmetros (tempo, volumes de soluções, et.......
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Discussão
Aqui, um método detalhado é fornecido para preparar blocos FFPE de ossos descalcificados e preservar a integridade do RNA para sequenciamento (ou seja, sequenciamento de próxima geração (NGS)) ou para outras técnicas relacionadas ao RNA (ou seja, hibridização in situ , reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR), etc.).
O método utiliza EDTA para descalcificar amostras de tecido ósseo; a incubação de EDTA permite uma desmineralização lenta, mas fina, .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por fundos do Pittsburgh Cure Sarcoma (PCS) e do Osteosarcoma Institute (OSI).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agitador orbital avançado | VWR | 76683-470 | Utilizar para manter os tecidos sob agitação durante a incubação, conforme indicado nas instruções do método. |
| Escovas de pêlo de camelo | Ted Pella | 11859 | Use para lidar com seções FFPE conforme relatado nas diretrizes. |
| Kit de índice duplo TS Set A 96 rxns | 10X Genomics | PN-1000251 | Use para realizar transcriptômica espacial. |
| Etanol 200 Proof | Decon Labs Inc | 2701 | Use para realizar a desidratação do tecido, conforme relatado nas instruções do método. |
| Ácido etilenodiaminotetracético, sal dissódico di-hidratado (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | S312-500 | Use para preparar EDTA 20% pH 8.0. |
| Fórceps de Propósito Geral de Ponta Média Curvada Fisherbrand | Fisher Scientific | 16-100-110 | Use para manusear seções FFPE conforme relatado nas diretrizes. |
| Sonda de Precisão Fina Fisherbrand | Fisher Scientific | 12-000-153 | Use para lidar com seções FFPE conforme relatado nas diretrizes. |
| Marca Fisher Lâminas de microscópio Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | Use para anexar pergaminhos seccionados conforme relatado nas diretrizes. |
| Lâminas de micrótomo de diamante de alto perfil | CL Sturkey | D554DD | Use para seccionar blocos FFPE conforme relatado nas diretrizes. |
| Sequenciador Novaseq 150PE | Novogene | N/A | . |
| Paraformaldeído (PFA) 32% Solução Aquosa Grau EM | Microscopia Eletrônica Sciences | 15714-S | Diluir até a concentração final de 4% com 1x PBS para realizar a fixação do tecido. |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | Pronto para usar. Use para diluir o PFA e realizar lavagens conforme relatado nas instruções do método. |
| Banho Flutuante de Tecido Premiere | Fisher Scientific | A84600061 | Use para remover rugas das seções FFPE conforme relatado nas diretrizes. |
| Descontaminante de Superfície RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 7002 | Use para limpar todas as superfícies conforme relatado nas instruções do método. |
| Kit RNeasy DSP FFPE | Qiagen | 73604 | Use para isolar o RNA das seções FFPE depois de geradas, conforme relatado nas diretrizes. |
| Micrótomo rotativo semiautomatizado | Leica Biosystems | RM2245 | Use para seccionar blocos FFPE conforme relatado nas diretrizes. |
| Hidróxido de sódio | Millipore Sigma | S8045-500 | Prepare a solução de 10 N dissolvendo lentamente 400 g em 1 litro de água Milli-Q. |
| Space Ranger | 10X Genomics | 2.0.1 | Use para processar a saída de dados de sequenciamento. |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Use para realizar a infliltração e incorporação de tecidos, conforme relatado nas instruções do método. |
| Kit de Acessórios Visium | 10X Genomics | PN-1000194 | Use para realizar experimentos transcriptômicos espaciais. |
| Kit de Sonda de Transcriptoma Humano Visium Pequeno | 10X Genomics | PN-1000363 | Use para realizar experimentos transcriptômicos espaciais. |
| Kit de Slides de Expressão Gênica Espacial Visium 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000188 | Use para colocar as seções se estiver realizando experimentos transcriptômicos espaciais. |
| Xileno | Leica Biosystems | 3803665 | Use para realizar a limpeza do tecido conforme relatado nas instruções do método. |
Referências
- Baig, M. A., Bacha, D. Histology. Bone. , StatPearls Publishing. (2024).
- Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
- Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G.
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Reimpressões e permissões
