Métodos para Habilitar a Transcriptômica Espacial de Tecidos Ósseos

O osso é um tecido conjuntivo especializado composto principalmente por fibras de colágeno tipo 1 e sais inorgânicos¹. Como resultado, o osso é incrivelmente forte e rígido, ao mesmo tempo em que é leve e resistente a traumas. A grande força do osso deriva de seu conteúdo mineral. De fato, para qualquer aumento na porcentagem de conteúdo mineral, a rigidez aumenta em cinco vezes². Consequentemente, os investigadores enfrentam problemas significativos quando analisam, por meio de secção histológica, a biologia de uma amostra óssea.

A histologia óssea não descalcificada é viável e, às vezes, necessária, dependendo do tipo de investigação (por exemplo, para estudar a microarquitetura do osso); É, no entanto, muito desafiador, especialmente se os espécimes forem grandes. Nesses casos, o processamento de tecidos para fins histológicos requer várias modificações nos protocolos e técnicas padrão³. Em geral, para realizar avaliações histológicas comuns, os tecidos ósseos são descalcificados logo após a fixação, processo que pode levar de alguns dias a várias semanas, dependendo do tamanho do tecido e do agente descalcificante utilizado⁴. As seções descalcificadas são frequentemente usadas para o exame da medula óssea, o diagnóstico de tumores, etc. Existem três tipos principais de agentes descalcificantes: ácidos fortes (por exemplo, ácido nítrico, ácido clorídrico), ácidos fracos (por exemplo, ácido fórmico) e agentes quelantes (por exemplo, ácido etilenodiaminotetrético ou EDTA)⁵. Ácidos fortes podem descalcificar o osso muito rapidamente, mas podem danificar os tecidos; ácidos fracos são muito comuns e adequados para procedimentos diagnósticos; Os agentes quelantes são de longe os mais usados e apropriados para aplicação em pesquisa, pois, neste caso, o processo de desmineralização é lento e suave, permitindo a retenção de morfologia de alta qualidade e a preservação de informações de genes e proteínas, conforme exigido por muitos procedimentos (por exemplo, hibridização in situ , imunocoloração). No entanto, quando todo o transcriptoma precisa ser preservado, como para análises de expressão gênica, mesmo uma desmineralização lenta e suave pode ser prejudicial. Portanto, melhores abordagens e métodos são necessários quando a análise morfológica dos tecidos precisa ser combinada com análises de expressão gênica das células.

Graças às recentes melhorias no sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) e transcriptômica espacial, agora é possível estudar a expressão gênica de uma amostra de tecido, mesmo quando a inclusão de parafina de fixação em formalina (FFPE) foi usada para armazenar as amostras de tecido ^6,7,8. Essa oportunidade desbloqueou o acesso a um número maior de amostras, como as armazenadas em bancos de tecidos em todo o mundo. Se o scRNA-seq for empregado, a integridade do RNA é o requisito mais importante; no entanto, no caso da transcriptômica espacial de amostras FFPE, tanto os cortes de tecido de alta qualidade quanto o RNA de alta qualidade são necessários para visualizar a expressão gênica dentro do contexto histológico de cada corte de tecido. Embora isso tenha sido facilmente alcançado com tecidos moles, o mesmo não pode ser dito para tecidos duros como ossos. De fato, até onde sabemos, nenhum estudo usando transcriptômica espacial foi realizado em amostras ósseas FFPE. Isso se deve à falta de protocolos que possam processar efetivamente os tecidos ósseos FFPE, preservando seu conteúdo de RNA. Aqui, um método para processar e descalcificar amostras de tecido ósseo recém-obtidas, evitando a degradação do RNA, é fornecido primeiro. Em seguida, reconhecendo a necessidade de análise transcriptômica das amostras de FFPE coletadas em bancos de tecidos em todo o mundo, também são apresentadas diretrizes desenvolvidas para lidar adequadamente com amostras de FFPE de ossos não desmineralizados.

Todos os procedimentos em animais descritos abaixo foram aprovados em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Faculdade de Medicina Dentária da Universidade de Pittsburgh.

1. Método para preparar blocos FFPE de amostras de tecido ósseo que requerem desmineralização

1. Preparação de reagentes e materiais
   1. Prepare EDTA 20% pH 8,0. Para 1 L, dissolver 200 g de EDTA em 800 mL de água ultrapura, ajustar o pH para 8,0 com hidróxido de sódio 10 N e, finalmente, levar o volume para 1L com água ultrapura. Armazene em temperatura ambiente.
      NOTA: Sempre use EDTA 20% pH 8.0 recém-preparado. O hidróxido de sódio (NaOH) 10 N é preparado dissolvendo 400 g de NaOH em 1 L de água ultrapura.
   2. Prepare o paraformaldeído (PFA) 4% em uma capela utilizando 1x PBS sem cálcio e magnésio.
      NOTA: Designe uma área em uma capela para trabalhar com soluções concentradas de paraformaldeído, ou sólidos de paraformaldeído, e rotule-a como tal. Para evitar a exposição, mantenha os recipientes fechados o máximo possível. Utilizar nas quantidades práticas mais pequenas necessárias para a experiência que está a ser realizada. Se a pesagem do pó de paraformaldeído e a balança não puderem ser usadas em uma capela de exaustão, primeiro pegue um recipiente, depois adicione o pó de PFA na coifa e cubra antes de retornar à balança para pesar o pó. Sempre use PFA a 4% recém-preparado.
   3. Use um recipiente adequado para cada amostra.
      NOTA: Por exemplo, para 1 mg de tecido ósseo, use um recipiente que permita que pelo menos 1 mL de qualquer solução entre em contato com o osso.
   4. Esterilize todo o equipamento cirúrgico necessário para a dissecção.
   5. Limpe todas as áreas com uma solução descontaminante para remover RNases.
   6. Colete os materiais experimentais restantes, incluindo recipientes de gelo, spray de etanol a 70% e tenha acesso a um agitador orbital.
2. Isolamento de amostras de tecido ósseo de camundongos
   1. Eutanasiar o camundongo pela exposição ao CO₂ , depois realizar a luxação cervical e deitá-lo de costas. Pulverize a pele do camundongo com etanol 70%.
   2. Usando uma tesoura de dissecação estéril, abra a pele e exponha o músculo da perna. Corte o músculo ao longo da perna para obter uma visão clara da posição do osso e desarticule suavemente o osso para removê-lo sem danos.
      NOTA: Não é necessário remover totalmente todo o músculo ligado ao osso. Tente ser o mais rápido possível para limitar a degradação do RNA.
   3. Coloque imediatamente a amostra de osso em um tubo contendo 4% de PFA e coloque o tubo no gelo.
   4. Repita o procedimento para coletar outras amostras de osso conforme desejado.
   5. Colocar amostras com PFA a 4% em agitação num agitador orbital a 140 rpm a 4 °C durante pelo menos 24 h para permitir a fixação adequada.
3. Descalcificação de amostras de tecido ósseo
   1. Recupere o tecido ósseo do agitador orbital após a fixação.
   2. Lave o tecido ósseo 2 vezes com 1x PBS por 3 min em um agitador orbital a 140 rpm para remover qualquer PFA restante.
   3. Usando uma tesoura de dissecação estéril, remova todos os músculos restantes ainda presos ao osso.
   4. Lave o tecido ósseo mais uma vez com 1x PBS por 3 min.
   5. Coloque o tecido ósseo em um novo recipiente com 20% de EDTA pH 8,0. Em seguida, coloque o recipiente em um agitador orbital a 140 rpm por 30 min em temperatura ambiente (RT).
   6. Descarte a solução, adicione EDTA fresco a 20% pH 8,0 no recipiente e coloque-o em um agitador orbital a 140 rpm por 30 min em RT.
   7. Repita a etapa 1.3.6 10 vezes.
   8. Descarte a solução, adicione EDTA fresco a 20% pH 8,0 no recipiente e coloque-o a 4 ° C em uma câmara fria em um agitador orbital a 140 rpm durante a noite.
4. Desidratação de amostras de tecido ósseo
   1. Retire a amostra de tecido ósseo do recipiente.
   2. Inspecione o tecido e verifique a eficiência da descalcificação girando e torcendo suavemente o osso. Como alternativa, faça um raio-X do osso usando uma máquina de raios-X.
      NOTA: Se a amostra flexionar facilmente, um bom grau de descalcificação foi alcançado. Caso contrário, os parâmetros de descalcificação (tempo, velocidade de agitação, volume de EDTA pH 8,0. 20% usado, etc.) devem ser aumentados.
   3. Lave o tecido ósseo 2 vezes com 1x PBS por 3 min para remover resíduos de EDTA.
   4. Coloque o tecido ósseo em um novo recipiente e inicie a desidratação com etanol a 70%. Incubar durante 15 min a 140 rpm.
   5. Descarte a solução de etanol a 70%, coloque a amostra em solução de etanol a 90% e incube por 15 min a 140 rpm.
   6. Descarte a solução de etanol a 90%, coloque a amostra em etanol a 100% e incube por 15 min a 140 rpm.
   7. Descarte o etanol 100%, coloque a amostra em etanol 100% novo e incube por 15 min a 140 rpm.
   8. Descarte o etanol 100%, coloque a amostra em etanol 100% novo e incube por 15 min a 140 rpm.
   9. Descarte o etanol 100%, coloque a amostra em etanol 100% novo e incube por 30 min a 140 rpm.
   10. Descarte o etanol 100%, coloque a amostra em etanol 100% novo e incube por 45 min a 140 rpm.
       NOTA: A desidratação também pode ser realizada usando um processador automático. Nesse caso, configure o programa com as mesmas condições relatadas para a desidratação manual. As condições relatadas são para espécimes com espessura não superior a 4 mm (ou seja, amostras de tecido ósseo obtidas de camundongos). Para amostras com espessura superior a 4 mm, o tempo de desidratação deve ser determinado experimentalmente.
5. Limpeza de amostras de tecido ósseo
   1. Coloque a amostra de tecido ósseo em um novo recipiente e inicie o processo de limpeza usando xileno. Incubar por 20 min a 140 rpm.
   2. Descarte o xileno usado, adicione xileno novo e incube por mais 20 minutos a 140 rpm.
   3. Descarte o xileno usado, adicione xileno novo e incube por 45 min a 140 rpm.
      NOTA: A limpeza também pode ser realizada usando um processador automático. Nesse caso, configure o programa com as mesmas condições relatadas para a limpeza manual. As condições relatadas são para espécimes com espessura não superior a 4 mm (ou seja, amostras de tecido ósseo obtidas de camundongos). Para amostras com espessura superior a 4 mm, o tempo deve ser determinado experimentalmente.
6. Infiltração e incorporação de amostras de tecido ósseo
   1. Recupere a amostra de tecido ósseo do agitador orbital/processador automático após a limpeza.
   2. Coloque a amostra de tecido ósseo em um de incorporação e inicie a infiltração com cera (consulte a Tabela de Materiais). Incubar durante 30 min a 60 °C.
   3. Descarte a cera usada, adicione a nova cera e incube por 30 min a 60 °C.
   4. Descarte a cera usada, adicione nova cera e incube por 45 min a 60 °C.
   5. Coloque cuidadosamente a amostra de tecido ósseo em um molde com a orientação desejada.
   6. Deixe o bloco de amostra solidificar em uma superfície fria.
   7. Armazene o FFPE obtido a 4 °C até que esteja pronto para iniciar o seccionamento.
      NOTA: O bloco FFPE pode ser armazenado por muitos anos antes que o corte seja realizado.

2. Diretrizes para seccionamento de amostras FFPE não desmineralizadas

NOTA: As diretrizes a seguir fornecem dicas e instruções valiosas úteis para melhorar muito a qualidade das seções de tecido, evitando a degradação do RNA, especialmente em casos de pequenas amostras ósseas não descalcificadas. Essas diretrizes também podem ser aplicadas a amostras de ossos descalcificados, quando disponíveis. Para amostras maiores de tecido ósseo, a desmineralização deve ser realizada para obter cortes de melhor qualidade; Nesses casos, o método relatado acima deve ser seguido e os parâmetros (tempo, volumes de soluções, etc.) devem ser ajustados de acordo. As diretrizes a seguir são adequadas quando os tecidos ósseos FFPE já foram processados (por exemplo, bloco FFPE coletado de bancos de tecidos ou outros laboratórios) ou quando as seções coletadas serão utilizadas para realizar qualquer tipo de análise que exija RNA de boa qualidade, seções de tecido de alta qualidade ou ambos.

1. Preparação do equipamento
   1. Pulverize todas as superfícies de trabalho e instrumentos com soluções descontaminantes para remover RNases.
   2. Preparar um banho-maria com água bidestilada e regular a temperatura para 42 °C.
   3. Pegue uma lâmina de micrótomo, borrife-a com etanol 70% para remover resíduos de óleo e, em seguida, borrife-a com soluções descontaminantes para remover RNases.
   4. Prenda a lâmina no micrótomo. Certifique-se de que o ângulo de folga esteja definido para 10°.
      NOTA: Sempre use lâminas novas para seccionar.
   5. Prepare dois baldes de gelo.
   6. Pegue pinças, escovas e sondas, borrife-as com soluções descontaminantes para remover RNases e coloque-as em um dos dois baldes de gelo.
   7. Prepare um banho de gelo adicionando água bidestilada ao outro balde de gelo.
      NOTA: o bloco FFPE não deve flutuar na água adicionada; Portanto, a quantidade de água adicionada ao balde de gelo deve ser apenas o suficiente para permitir que a amostra seja molhada sem flutuar.
2. Corte
   1. Retire o bloco FFPE do armazenamento a 4 °C e coloque-o no micrótomo. Defina o comando como Aparar ou para 14 μm de espessura de rolagem e comece a aparar a amostra até que o tecido seja exposto.
      NOTA: Se o bloco FFPE já tiver sido aparado e o tecido já estiver exposto, pule a etapa 2.2.1. Verifique se o bloco está sem furos e rachaduras. Em caso afirmativo, prossiga diretamente para a etapa 2.2.2. Caso contrário, corte algumas seções para achatar a superfície e evitar os furos e rachaduras e, em seguida, prossiga para a etapa 2.2.2.
   2. Coloque o bloco FFPE no banho de gelo para hidratar a amostra. O tempo de hidratação deve ser determinado experimentalmente.
      1. Comece com 2 min e aumente o tempo se a hidratação não for suficiente. Não exceda 10 min. A hidratação expandirá o tecido e reduzirá a formação de "venezianas" e linhas. Tempos de hidratação mais longos podem causar rachaduras no bloco de parafina e, possivelmente, descolamento de tecido.
      2. Se 10 min for insuficiente para hidratar a amostra, execute ciclos de hidratação não superiores a 10 min e tente seccionar novamente.
      3. Se a superfície do bloco não estiver lisa e limpa devido a rachaduras ou cortes, considere reincorporar a amostra. A qualidade do RNA não será afetada pelo processo de reincorporação.
   3. Coloque a amostra na pinça de amostra do micrótomo, alinhe-a com a lâmina e comece a seccionar. Defina a espessura da rosca para 5 μm.
   4. Recolher o corte e colocá-lo em banho-maria a 42 °C com uma pinça fria e escovas.
      NOTA: Alternativamente, se o isolamento de RNA de seções de tecido for realizado, colete as seções em um tubo de centrífuga e siga as especificações de fabricação para preparação de RNA (consulte a Tabela de Materiais).
   5. Incube a seção no banho-maria para esticar o tecido e eliminar quaisquer rugas e dobras residuais.
      NOTA: O tempo de flutuação no banho-maria para cada seção deve ser determinado experimentalmente. Considere deixar as seções ósseas por mais um minuto se ocorrerem problemas de descolamento de tecido. Não deixe a seção flutuando por muito tempo, pois longos tempos de flutuação podem danificar o tecido.
   6. Colocar a secção numa lâmina de vidro e, em seguida, incubá-la durante 3 h a 42 °C.
   7. Coloque a lâmina de vidro em um dessecador ou forno durante a noite em RT para uma secagem adequada.
   8. Guarde a lâmina de vidro com a seção anexada em RT em uma caixa de slides.
      NOTA: Os slides podem ser armazenados por muitos anos no RT. Se for realizada a transcriptómica espacial, em vez de uma lâmina de vidro, coloque a secção na lâmina de expressão genética espacial fornecida pelo fabricante e siga as recomendações comunicadas (ver Tabela de Materiais).

O método apresentado aqui descreve como processar ossos recém-isolados para obter amostras FFPE desmineralizadas que podem ser facilmente seccionadas com um micrótomo, preservando a integridade do RNA (Figura 1). O método foi empregado com sucesso em fêmures murinos, mas pode ser seguido para outras amostras de tecido ósseo de dimensões semelhantes, ou pode ser adaptado para amostras ósseas maiores (por exemplo, amostras humanas) aumentando todos os parâmetros (tempo, volumes de soluções, etc.).

Figura 1: Representação esquemática do protocolo. Diagrama esquemático do método de obtenção de blocos FFPE de tecidos ósseos descalcificados com integridade de RNA preservada (pontos 1 e 2). Diagrama esquemático das diretrizes para a seção de blocos FFPE (ponto 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para validar o momento correto da descalcificação, foi realizado um curso de tempo no qual os fêmures não descalcificados, os fêmures descalcificados por 3 h (para os quais o EDTA foi trocado a cada 30 min por um total de 6 vezes) e os fêmures descalcificados por 24 h (para os quais o EDTA foi trocado a cada 30 min por um total de 10 vezes e depois deixado em EDTA durante a noite) foram comparados (Figura 2). Os blocos FFPE obtidos foram então seccionados de acordo com as diretrizes acima, e a qualidade histológica e a integridade do RNA dos cortes obtidos foram verificadas. Para tanto, a integridade estrutural e a morfologia dos cortes teciduais foram avaliadas por meio da coloração de hematoxilina e eosina (H&E) seguida de inspeção microscópica (Figura 2A,C,E), enquanto a qualidade do RNA foi avaliada avaliando-se o valor da distribuição do fragmento de RNA com tamanho superior a 200 nucleotídeos (200 nt) (conhecido como escore DV200)4 (Figura 2B, D, F). As imagens de H&E mostraram que os cortes de fêmur não descalcificados e descalcificados por 3 h apresentaram várias fraturas, buracos e danos (Figura 2A, C), enquanto os cortes de fêmures descalcificados por 24 h apresentaram boa qualidade histológica (Figura 2E). Todas as amostras apresentaram escores DV200 superiores a 50%, que é considerado o valor mínimo para realizar análises scRNA-seq ou transcriptômicas espaciais4. Tempos de incubação mais longos com trocas diárias de EDTA, a 4 °C, com agitação mais leve em recipientes menores, também foram testados e não são recomendados, pois, nessas condições, a integridade do RNA das amostras diminui drasticamente (Figura 2H). Portanto, o tempo de incubação foi reduzido para 24 h, enquanto a frequência, agitação e volumes de descalcificação foram aumentados para aumentar a descalcificação.

Figura 2. Cortes e controle de qualidade (QC) da integridade do RNA de fêmures de camundongos com 8 semanas de idade após descalcificação. Os fêmures de camundongos de 8 semanas foram recentemente dissecados, fixados e descalcificados com 20% de EDTA pH 8,0. em diferentes momentos, embebidos em parafina usando o método descrito e seccionados seguindo as diretrizes relatadas. O controle de qualidade histológico dos cortes obtidos foi então realizado por meio da coloração H&E, enquanto a integridade do RNA foi avaliada avaliando o valor de distribuição do fragmento de RNA com tamanho maior que 200 nucleotídeos (200 nt) (DV200). (A) Coloração H & E mostrando seções de fêmur de camundongo de 8 semanas após nenhuma descalcificação. A imagem à direita mostra uma ampliação maior da área encaixotada. (B) RNA QC de seções de fêmur de camundongo com 8 semanas de idade após nenhuma descalcificação. (C) Coloração H & E mostrando seções de fêmur de camundongo com 8 semanas de idade após 3 h de descalcificação. A imagem à direita mostra uma ampliação maior da área encaixotada. (D) RNA QC de seções de fêmur de camundongo com 8 semanas de idade após 3 h de descalcificação. (E) Coloração H & E mostrando seções de fêmur de camundongo com 8 semanas de idade após 24 h de descalcificação. A imagem à direita mostra uma ampliação maior da área encaixotada. (F) RNA QC de seções de fêmur de camundongo com 8 semanas de idade após 24 h de descalcificação. (G) Coloração H & E mostrando cortes de fêmur de camundongo com 8 semanas de idade após 72 h de descalcificação. A imagem à direita mostra uma ampliação maior da área encaixotada. (H) RNA QC de seções de fêmur de camundongo com 8 semanas de idade após 72 h de descalcificação. Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; VD200 (%) = % do valor da distribuição do fragmento > 200 nt; nt = nucleotídeos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para testar a eficácia das diretrizes relatadas para lidar com amostras FFPE não desmineralizadas, foram coletados blocos FFPE de metástases de osteossarcoma primário humano não desmineralizado e metástases de osteossarcoma pulmonar obtidas de nosso Registro de Tumor de Oncologia Musculoesquelética e Banco de Tecidos (MOTOR) e análise transcriptômica espacial foi realizada (Figura 3). Antes de prosseguir com a análise transcriptômica espacial, os blocos FFPE foram reincorporados em parafina para obter uma superfície inicial lisa. Em seguida, foram avaliados o RNA e a qualidade histológica dos cortes (dados não apresentados). As etapas de hidratação foram decisivas, uma vez que os espécimes de osteossarcoma primário não podiam ser seccionados sem hidratação adequada. Por outro lado, as metástases pulmonares não exigiram nenhuma etapa de hidratação. Após a secção, os tecidos foram colocados em uma lâmina transcriptômica espacial (Figura 3A), corados com H&E (Figura 3D), e a análise transcriptômica espacial foi realizada de acordo com as especificações do fabricante (ver Tabela de Materiais). As bibliotecas de cDNA obtidas foram sequenciadas e os dados processados foram visualizados com o Space Ranger para controle de qualidade5 (Figura 3B). A produção do Space Ranger mostrou pontuações muito altas (quase 100%) para códigos de barras válidos, identificadores moleculares únicos válidos (UMIs), bases Q30 e mediana de genes detectados por ponto (entre 1700 e 5000), demonstrando robustez e solidez dos dados obtidos (Figura 3B). Por meio de análise de cluster baseada em gráficos não enviesados, 12 clusters principais foram identificados, incluindo clusters de células osteogênicas, imunológicas, epiteliais e endoteliais, bem como adipócitos (Figura 3E). É importante notar que os limites dos clusters se sobrepuseram às bordas das regiões histológicas identificadas pelo patologista (Figura 3D). Seções adicionais das mesmas amostras também foram coradas com o tricrômico de Goldner para visualizar áreas mineralizadas (Figura 3C).

Figura 3. Análise transcriptômica espacial de dois pares de osteossarcoma primário (OS) não descalcificado e metástases pulmonares. Blocos FFPE de dois pares correspondentes de osteossarcoma primário humano não desmineralizado e metástase pulmonar foram coletados de nosso banco de tecidos MOTOR. As amostras foram seccionadas usando as diretrizes relatadas e colocadas em uma lâmina de expressão gênica espacial Visium para amostras FFPE para realizar análise transcriptômica espacial. (A) Slide de Expressão Gênica Espacial Visium para amostras FFPE com as seções anexas. (B) Saída do Space Ranger mostrando parâmetros comuns usados para avaliar a qualidade dos dados obtidos para todas as amostras. (C) Coloração tricrômica de Goldner mostrando localização de tecidos ósseos mineralizados e osteóide. (D) Coloração H & E mostrando a anotação do patologista. (E) Análise de agrupamento mostrando a localização das populações de células residentes no tecido. Abreviaturas: FFPE = fixado em formalina e embebido em parafina; MOCs = células osteogênicas malignas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.