Este protocolo fornece uma técnica para colher e cultivar gânglio da raiz dorsal (DRG) explantado de ratos Sprague Dawley adultos em um dispositivo multicompartimental (MC).
Artigo de método
Coleta, incorporação e cultura de gânglios da raiz dorsal em dispositivos multicompartimentais para estudar características neuronais periféricas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A característica neuronal periférica mais comum da dor é um limiar de estimulação reduzido ou hipersensibilidade dos nervos terminais dos gânglios da raiz dorsal (DRG). Uma causa proposta para essa hipersensibilidade está associada à interação entre células imunes no tecido periférico e neurônios. Os modelos in vitro forneceram conhecimento fundamental para entender como esses mecanismos resultam em hipersensibilidade ao nociceptor. No entanto, os modelos in vitro enfrentam o desafio de traduzir a eficácia para humanos. Para enfrentar esse desafio, um modelo in vitro fisiologicamente e anatomicamente relevante foi desenvolvido para a cultura de gânglios da raiz dorsal intactos (DRGs) em três compartimentos isolados em uma placa de 48 poços. Os DRGs primários são colhidos de ratos Sprague Dawley adultos após a eutanásia humana. O excesso de raízes nervosas é aparado e o DRG é cortado em tamanhos apropriados para cultura. Os DRGs são então cultivados em hidrogéis naturais, permitindo um crescimento robusto em todos os compartimentos. Este sistema multicompartimental oferece isolamento anatomicamente relevante dos corpos celulares DRG de neurites, tipos de células fisiologicamente relevantes e propriedades mecânicas para estudar as interações entre células neurais e imunes. Assim, esta plataforma de cultura fornece uma ferramenta valiosa para investigar estratégias de isolamento de tratamento, levando a uma abordagem de triagem aprimorada para prever a dor.
Introdução
A dor crônica é a principal causa de incapacidade e perda de trabalho em todo o mundo1. A dor crônica afeta cerca de 20% dos adultos em todo o mundo e impõe um ônus social e econômico significativo2, com custos totais estimados entre US$ 560 e US$ 635 bilhões por ano nos Estados Unidos3.
A principal característica periférica exibida por pacientes com dor crônica é um limiar de estimulação dos nervos diminuído, o que leva o sistema nervoso a ser mais responsivo aos estímulos 4,5. O limiar de estimulação reduzido pode resultar em uma resposta dolorosa a um estímulo anteriormente não doloroso (alodinia) ou uma resposta aumentada a um estímulo doloroso (hiperalgesia)6. Os tratamentos atuais para dor crônica têm eficácia limitada, e os tratamentos que são bem-sucedidos em modelos animais geralmente falham em testes em humanos devido a diferenças mecanicistas na manifestação da dor7. Modelos in vitro que podem mimetizar com mais precisão os mecanismos de sensibilização periférica têm o potencial de aumentar a tradução de novas terapêuticas 8,9. Além disso, ao modelar os principais aspectos dos nervos sensibilizados em um sistema de cultura, os pesquisadores podem desenvolver uma compreensão mais profunda dos mecanismos que impulsionam os limiares reduzidos e identificar novos alvos terapêuticos que os revertem10.
As plataformas in vitro ou sistemas microfisiológicos ideais incorporariam a separação física de neuritos distais e corpo celular dos gânglios da raiz dorsal (DRG), um ambiente celular tridimensional (3D) e a presença de células de suporte nativas para imitar de perto as condições in vivo . No entanto, um artigo recente de Caparaso et al.11 mostra que as plataformas de cultura DRG atuais carecem de uma ou mais dessas características-chave, tornando-as insuficientes na replicação de condições in vivo . Embora essas plataformas sejam fáceis de configurar, elas não imitam a base biológica da sensibilização periférica e, portanto, podem não se traduzir em eficácia in vivo . Para resolver essa limitação, um modelo in vitro fisiologicamente relevante foi desenvolvido para a cultura de gânglios da raiz dorsal (DRG) dentro de uma matriz de hidrogel com três compartimentos isolados para permitir o isolamento fluídico temporal de neuritos e corpos celulares DRG11. Este modelo oferece relevância fisiológica e anatômica, que tem o potencial de estudar a sensibilização periférica de neurônios in vitro.
O crescente interesse no uso de explantes DRG em uma cultura 3D se deve à sua capacidade de facilitar o crescimento robusto de neuritos, que serve como um indicador indireto da viabilidade do DRG12. Enquanto os explantes DRG neonatais ou embrionários primários são predominantemente usados em plataformas de cultura in vitro atuais13,14, o uso de explantes de roedores adultos fornece um modelo melhor de fisiologia neuronal madura, que imita de perto a fisiologia DRG humana em comparação com explantes de roedores neonatais ou embrionários15. Os DRGs de explante referem-se à preservação do tecido celular e molecular do tecido DRG nativo, principalmente pela manutenção de células de suporte não neuronais nativas. Aqui, este protocolo descreve a metodologia para colher e cultivar explantes de DRG de ratos adultos da raça Sprague Dawley em um dispositivo multicompartimental (MC) (Figura 1).
A eficácia foi demonstrada na cultura de DRGs da coluna cervical, torácica e lombar sem diferenças observáveis no crescimento de neuritos. Para esta aplicação, o objetivo era provocar o crescimento de neuritos nos compartimentos externos do dispositivo; portanto, este artigo não discriminou entre os níveis de DRG. No entanto, se necessário para um experimento específico, o nível de DRG pode ser adaptado para atender às necessidades dos experimentadores. Atualmente, existem outros modelos de cultura compartimentados para a cultura 3D de DRGs16, no entanto, esses dispositivos não contêm células de suporte não neuronais nativas preservadas, o que pode limitar a tradução. Preservar a estrutura nativa dos DRGs colhidos é importante porque garante a retenção de células de suporte não neuronais, cujas interações com os neurônios DRG são essenciais para a manutenção das propriedades funcionais desses neurônios. Vários estudos co-cultivaram DRGs dissociados com células neuronais não nativas, como células de Schwann, para promover a mielinização de neurônios 17,18,19.
Protocolo
A colheita do DRG foi realizada em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Nebraska-Lincoln. Ratos Sprague Dawley fêmeas com 12 semanas de idade (~ 250 g) foram usados para o estudo. Os detalhes dos animais, reagentes e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Fabricação e montagem de dispositivos com vários compartimentos
- Projeto auxiliado por computador e impressão 3D do dispositivo multicompartimento
NOTA: O dispositivo MC consiste em três compartimentos para o isolamento de corpos celulares DRG e neurites (Figura 2A). O dispositivo MC não está disponível comercialmente; no entanto, o arquivo STL é fornecido aqui (Arquivo de Codificação Suplementar 1) para permitir a impressão 3D. A impressão do MC leva um (1) dia para ser concluída. - Carregue o arquivo STL do MC para uma impressora 3D de resina usando um software compatível.
NOTA: O material ideal para impressão é uma resina de alta temperatura. Uma das principais vantagens do uso de resina de alta temperatura é que ela é biocompatível e pode ser autoclavada e reutilizada. Uma impressora 3D de processamento de luz digital (DLP) ou outras impressoras 3D também podem ser usadas para imprimir o dispositivo. - Transfira os dispositivos impressos para uma solução de lavagem por 30 min em isopropanol (>96%) para remover a resina residual da superfície do dispositivo MC impresso.
- Pós-cura dos dispositivos a 80 °C durante 120 min utilizando um agente de cura disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais). O agente de cura melhora as propriedades mecânicas do dispositivo MC impresso, expondo-o à temperatura e aos raios UV.
- Cure os dispositivos MC termicamente em um forno a 160 ° C por 180 min.
- Esterilize os dispositivos usando uma autoclave por 45 min em um ciclo de gravidade.
2. Preparação de hidrogel
- Sintetizar ácido hialurônico metacrilato (MAHA, 85%-115% de metacrilação) e caracterizar usando um protocolo descrito por Seidlits et al.20.
NOTA: Para apoiar o crescimento de DRGs, hidrogéis triplos compostos de ácido hialurônico metacrilado, colágeno tipo I e laminina são comumente usados. Os resultados indicam que os DRGs geralmente crescem em MAHA, variando de 1,25-2,5 mg/mL e colágeno de 2,0-4,5 mg/mL. Para a laminina, verifica-se que 0,75 mg/mL é suficiente para garantir um crescimento robusto de DRGs. Aqui, são detalhados os métodos para criar um gel triplo com 1,25 mg/mL de MAHA, 4,5 mg/mL de colágeno e 0,75 mg/mL de laminina. A preparação do hidrogel deve ser feita em um gabinete de fluxo laminar para fornecer um espaço de trabalho asséptico.
3. Preparação da solução do fotoiniciador
NOTA: Um fotoiniciador é necessário para reticular o MAHA sob luz ultravioleta. É comumente usado em porcentagens de 0,3% a 0,6%.
- Prepare a solução fotoiniciadora 3 dias antes da colheita do DRG.
- Pré-aqueça o banho-maria sônico a 37 °C antes de preparar a solução do fotoiniciador.
- Trabalhando com a técnica estéril em uma capela de fluxo, prepare 23,125 mg/mL de solução de bicarbonato de sódio (NaHCO3) dissolvendo NaHCO3 em 5x solução de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)-HEPES.
- Em um frasco de vidro, misture o fotoiniciador a 0,6% peso / volume (p / v) em uma solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a 20% vol / vol 1x e solução 5X DMEM / HEPES a 80% vol / vol.
- Para proteger da luz, embrulhe o frasco de vidro em papel alumínio. No entanto, certifique-se de remover a folha de alumínio antes de transferir o frasco para o banho-maria de sonicação aquecido a 37 °C com sonicação entre 30-40 min.
NOTA: A solução fotoiniciadora deve ser protegida da luz porque pode se decompor em radicais e iniciar o processo de polimerização quando exposta à luz21. - Filtrar a solução com um filtro de seringa de 0,22 μm para um novo frasco de vidro estéril.
4. Dissolução de ácido hialurônico metacrilato
- Dissolver o ácido hialurónico metacrilato (preparado no passo 2) no mesmo dia em que a solução fotoiniciadora é preparada (passo 3).
- Coloque o MAHA liofilizado congelado em um dessecador por 15 min para atingir a temperatura ambiente.
- Trabalhando em uma capela de fluxo laminar e usando a técnica de pesagem estéril, pesar o MAHA liofilizado em um frasco de vidro.
- Adicione o volume necessário de solução fotoiniciadora filtrada ao MAHA para chegar à concentração desejada de MAHA. A concentração final comum do gel é de 1,25 mg/mL MAHA e 4,5 mg/mL de colágeno.
- Sele a tampa com filme de vedação de laboratório, embrulhe o frasco de vidro com papel alumínio e coloque-o em uma placa agitadora orbital em temperatura ambiente até dissolver totalmente (geralmente 3 dias). Ocasionalmente, vórtice a solução para quebrar grandes aglomerados de MAHA para garantir a dissolução uniforme de MAHA.
5. Montagem do dispositivo
- Coloque o dispositivo MC em uma placa de 48 poços um dia antes da colheita do DRG.
- Aplique uma linha fina de gel de silicone na ranhura abaixo do dispositivo MC (Figura 2B) usando uma seringa de 3 mL. Isso ajudará o dispositivo a se conectar com segurança à placa do poço.
- Com a ajuda da pinça #3, coloque suavemente o dispositivo MC no poço de uma placa de 48 poços, conforme mostrado na Figura 2C.
NOTA: O tamanho do dispositivo pode ser modificado para se adequar à aplicação pretendida, e uma placa de tamanho diferente pode ser usada, se desejado. Os dispositivos podem ser reutilizados. Para reutilizar, o hidrogel deve ser lavado suavemente de todos os túneis, e a ranhura de carregamento sob o dispositivo deve ser usada com etanol a 70% com agitação suave. Após a conclusão, os dispositivos podem ser autoclavados novamente para esterilizar antes do uso.
6. Preparação animal
- Autoclave todas as ferramentas de dissecação necessárias antes do início da colheita.
- Obtenha um rato Sprague Dawley macho ou fêmea adulto com idade entre 12 e 20 semanas. O sexo do rato não afeta o crescimento do DRG.
- Eutanasiar o rato de acordo com o protocolo IACUC aprovado usando overdose de CO2 como método primário de eutanásia e punção bilateral de pneumotórax como método secundário de eutanásia de acordo com as Diretrizes da American Veterinary Medical Association22.
- Coloque o rato em uma almofada estéril em uma mesa de dissecação com o lado ventral voltado para baixo. Pulverize o pelo com etanol 70%.
7. Colheita de gânglios da raiz dorsal (DRG)
- Prepare meios de corte contendo 86% de meio neurobasal A, 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (PS), 1% de glutamina e 2% de B27 mais 50x e transfira para uma placa de 24 poços. Este meio e placa de poço serão usados para armazenamento temporário de DRGs colhidos antes de incorporá-los ao hidrogel.
- Use jaleco, máscara cirúrgica, gorro, óculos de segurança e luvas.
- Usando uma tesoura grande de ponta romba, corte a pele na base da coluna cervical e depois ao longo da coluna.
- Para drenar ainda mais o sangue do canal espinhal, corte por baixo das omoplatas e pelo músculo para cortar os principais vasos sanguíneos.
- Use uma tesoura grande e afiada para cortar o músculo da coluna. Limpe o máximo de músculo possível para visualizar a coluna.
- Remova os segmentos dorsal e lateral das vértebras. Use um Rongeur reto e uma tesoura de ponta afiada para remover os processos espinhosos e transversos das vértebras, começando na extremidade cervical e movendo-se em direção à extremidade lombar.
- Remova a medula espinhal. Use uma pequena tesoura de ponta afiada para cortar cuidadosamente as raízes nervosas conectadas aos DRGs ao longo de ambos os lados da medula espinhal. Corte a extremidade cervical da medula espinhal e levante-a cuidadosamente para fora do canal espinhal gradualmente, cortando todas as raízes nervosas remanescentes conectadas aos DRGs.
NOTA: As habilidades motoras finas são essenciais para garantir que o corpo do DRG não seja cortado no processo. - Para expor DRGs, use o Rongeur curvo para remover mais partes laterais das vértebras. Puxe para fora da linha média, alternando os lados. Tenha cuidado para não cortar o corpo do DRG, pois isso pode causar danos aos corpos celulares e axônios.
- Usando a pinça # 3 e a tesoura de mola de ponta reta, remova os DRGs entre cada nível das vértebras. Segure as raízes nervosas espinhais do DRG, puxe-as cuidadosamente para fora do bolso e corte a outra extremidade do nervo espinhal. Tenha cuidado para não segurar o corpo do DRG diretamente.
- Coloque os DRGs em poços de uma placa de 24 poços (contendo meios de corte, etapa 7.1) no gelo.
- Depois de coletar todos os DRGs, limpe o espaço de trabalho, coloque a carcaça em um saco de autoclave e armazene/descarte adequadamente de acordo com o protocolo IACUC.
8. Corte e corte DRG
- Encha uma placa de Petri de 60 mm em uma bancada limpa com meios de corte (etapa 7.1). Configure o escopo de dissecação e o esterilizador de esferas de vidro e coloque uma caixa de ferramentas autoclavada com ferramentas de corte (pinça # 3 e tesoura de mola de borda reta) ao lado do escopo.
- Sob o escopo de dissecação, remova o excesso de tecido ao redor do DRG e apare as raízes nervosas próximas ao corpo do DRG (normalmente um pouco mais escuras do que os nervos circundantes).
- Encher uma segunda placa de Petri de 60 mm com meios frescos. Sob o escopo de dissecação, corte os DRGs aparados em cerca de 0,5 mm (ou entre 0,5 mm e 0,8 mm). Uma régua é colocada sob a placa de Petri durante o corte para ter o tamanho estimado correto dos DRGs cortados.
- Transfira os DRGs cortados para uma nova placa de 24 poços com a mídia no gelo.
NOTA: O corte, corte e incorporação do DRG devem ser feitos em um gabinete de fluxo laminar para fornecer um espaço de trabalho asséptico. Na ausência de um gabinete de fluxo laminar, técnicas assépticas devem ser observadas, com equipamentos de proteção individual (EPI) mínimos apropriados recomendados (jaleco, máscaras, óculos e luvas) e todas as ferramentas esterilizadas durante todo o processo para mitigar possíveis contaminações.
9. Neutralização do colagênio
- Neutralize o colágeno no mesmo dia da colheita do DRG após aparar e cortar os DRGs.
- Trabalhando com gelo, pipete ~ 8,16% de água ultrapura, ~ 1,84% de hidróxido de sódio 1 M (NaOH), ~ 10% 10x PBS e ~ 80% de colágeno do volume total da solução em um frasco de vidro.
- Misture lentamente usando uma ponta de pipeta estéril de baixa retenção para pipetar o colágeno (geralmente adicionado por último) na mistura. Certifique-se de manter a ponta da pipeta na solução durante a mistura para evitar a criação de bolhas. Verifique o pH do colágeno neutralizado usando tiras de pH para ter certeza de que é ~ 7.
NOTA: O colágeno neutralizado pode ser mantido no gelo por 2-3 h sem gelificar; portanto, a fabricação de hidrogel deve ser realizada rapidamente assim que o colágeno for neutralizado.
10. Fabricação de hidrogel
- Trabalhando com gelo, pipete a laminina (até uma concentração final de 0,75 mg/mL) e 1x PBS em um frasco de vidro.
- Usando pontas de pipeta estéreis de baixa retenção, pipete colágeno neutralizado e solução MAHA na mistura para chegar à concentração desejada.
- Misture lentamente e verifique o pH do hidrogel resultante (deve ser ~ 7).
11. Incorporação de DRG
- Execute a incorporação de vários compartimentos.
- Pipete 65,1 μL e 52,8 μL do hidrogel pré-misturado nos compartimentos soma e neurite, respectivamente.
NOTA: Isso pressupõe o uso de dispositivos MC em uma placa de 48 poços. Esses volumes podem ser alterados com base no tamanho do dispositivo MC usado. - Incorpore suavemente os DRGs cortados no compartimento do soma (Figura 2A), garantindo que eles não arranhem o fundo da placa do poço. Coloque o DRG no meio para que os neuritos possam crescer nos compartimentos adjacentes através dos túneis.
- Reticulação térmica do hidrogel na incubadora a 37 °C por 30 min. Enquanto isso ocorre, ligue a lâmpada UV para aquecer.
- Após a reticulação térmica, a reticulação UV do hidrogel por 90 s.
- Adicione o meio de crescimento DRG ao hidrogel e ao DRG e execute uma troca completa do meio após uma hora para eliminar vestígios não reagidos ou remanescentes do fotoiniciador que persistem no meio.
- Realize uma meia troca de meio a cada 3 dias e monitore o crescimento dos DRGs visualizando ao microscópio.
- Após ~ 4 semanas, quando os neuritos DRG começam a crescer (Figura 3A), capture imagens com o gerador de imagens de placas fluorescentes e quantifique o comprimento dos neuritos usando FIJI (ImageJ).
- Pipete 65,1 μL e 52,8 μL do hidrogel pré-misturado nos compartimentos soma e neurite, respectivamente.
12. Controlar a incorporação do DRG
- Pipetar 250 μL de hidrogel em uma placa de 48 poços (sem MC).
- Coloque delicadamente o DRG cortado no meio do poço e até a metade do hidrogel, garantindo que não arranhe o fundo da placa do poço.
- Reticulação térmica do hidrogel na incubadora a 37 °C por 30 min.
- UV reticula o hidrogel por 90 s.
- Adicione o meio de crescimento DRG ao hidrogel e ao DRG e execute uma alteração completa do meio após uma hora.
- Realize meia troca de meio a cada 3 dias e monitore o crescimento do DRG visualizando-o ao microscópio.
- Após ~ 4 semanas, quando os neuritos DRG começarem a crescer (Figura 3B), capture imagens com o gerador de imagens de placas fluorescentes.
NOTA: Qualquer microscópio de campo claro funcionará para geração de imagens. Um microscópio automatizado baseado em placas torna esse processo mais rápido. A incorporação de controle em géis simples sem o dispositivo é feita para comparar o crescimento de neuritos DRG em vários compartimentos. Depois que os usuários validam que os DRGs crescem de forma semelhante em MC e géis de controle, eles podem não precisar repetir os géis de controle todas as vezes.
13. Imagens DRG
- Capture imagens de campo claro com ampliação de 4x usando um gerador de imagens de placa fluorescente em uma variedade de distâncias focais para visualizar todo o dispositivo DRG e MC.
- Ajuste o brilho e o contraste da imagem para facilitar a visualização dos neurites.
- Salve a imagem como um arquivo .tiff.
14. Quantificação de neuritos DRG
- Baixe e instale o FIJI (ImageJ).
- Abra o ImageJ. Abra o arquivo de imagem e certifique-se de que o arquivo seja monocromático.
- Aumente o contraste para que os menores neurites fiquem visíveis. Faça isso abrindo a opção de brilho e contraste usando o atalho Ctrl+Shift+C.
- Ajuste os controles deslizantes do controlador conforme necessário para visualizar os neuritos e clique em Aplicar para obter o brilho e o contraste desejados.
- Abra o rastreador de neurite abrindo o menu Plugins , selecionando Segmentação e clicando em Simple Neurite Tracer.
- Inicie um novo rastreio clicando em uma extremidade do neurite contra o corpo do DRG.
- Clique em outro ponto ao longo do neurite para adicionar um traço até que o neurite seja rastreado de ponta a ponta. Clique em Concluir caminho depois de rastrear o neurite.
- Converta o comprimento traçado em unidades reais e salve os resultados copiando-os e colando-os no Excel.
- Use a ferramenta de linha reta em FIJI para desenhar uma linha do mesmo comprimento que a barra de escala (não soltando o final da linha) e observe o valor de comprimento visível na barra de ferramentas. O valor de comprimento é usado para a conversão.
- Meça o comprimento de seis neuritos longos que se estendem de ambos os lados do DRG (Figura 3C, D) e calcule o comprimento médio desses neuritos para fornecer um comprimento médio representativo do DRG, conforme mostrado na Figura 4.
NOTA: A imunocoloração foi testada em explantes DRG em géis simples para mostrar a presença de células de suporte não neuronais7. Os DRGs são fixados em paraformaldeído (PFA) a 4% à temperatura ambiente, lavados três vezes com 1x PBS por 15 min e armazenados em 1x PBS a 4 °C até a imunocoloração. - Para explantes em dispositivos MC, remova o dispositivo MC e siga o mesmo processo descrito acima7.
Resultados
O presente protocolo descreveu uma técnica para colher e cultivar DRG de ratos adultos da raça Sprague Dawley em um dispositivo multicompartimental (MC). Conforme mostrado na Figura 1, o DRG colhido de ratos adultos foi aparado e cortado em ~ 0,5 mm. Os DRGs aparados e cortados foram então incluídos em um hidrogel na região soma do dispositivo MC (Figura 2) e cultivados por 27 dias antes da quantificação dos neuritos. O DRG foi cultivado em gel simples para servir como controle. A concentração da formulação de hidrogel utilizada para este experimento foi de 4,5/1,25 mg/mL de colágeno: MAHA. Nos dias 27 e 21 para géis multicompartimentais e simples, respectivamente, houve um crescimento robusto de neuritos (Figura 3). O comprimento médio dos neuritos em MC (894,22 μm ± 308,75 μm) foi comparável ao comprimento dos neuritos em géis simples de controle (864,26 μm ± 362,84 μm) (Figura 4). Isso demonstra a capacidade do dispositivo MC de suportar a cultura DRG e o crescimento de neuritos. Os comprimentos dos neuritos foram quantificados usando o software ImageJ.
Figura 1: Diagrama esquemático mostrando o procedimento experimental. (A) Colheita de gânglios da raiz dorsal (DRG) de ratos Sprague Dawley adultos. (B) Corte e corte de DRG colhido. (C) Formulação de hidrogel, incorporação de DRG e cultura em hidrogel dentro de MC encaixado em uma placa de 48 poços. (D) Crescimento de neuritos DRG após 21-30 dias de cultivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Multicompartimento impresso com três compartimentos isolados e pode ser usado em uma placa de 48 poços. (A) Uma imagem representativa mostrando a vista superior do dispositivo MC impresso mostra os compartimentos DRG e neurite (linhas vermelhas) e a área de incorporação do DRG (verde). (B) Vista lateral do MC. (C) Uma imagem do MC encaixada em uma placa de 48 poços. Barra de escala = 10 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Crescimento de neuritos em dispositivo multicompartimental (MC) e géis simples de controle. (A) Uma imagem representativa mostrando o crescimento de neuritos rastreados em um dispositivo de múltiplos compartimentos (MC) em campo claro. (Abaixo) Neurites que cresceram através dos túneis de MC são indicados com setas. (B) Imagem do crescimento de neurite em géis simples de controle (sem MC). (C) Uma imagem representativa mostrando o rastreamento de neuritos de doze neuritos longos em géis simples de controle (linhas roxas). Seis neuritos longos em ambos os lados do DRG foram quantificados para dar o comprimento médio dos neuritos. As imagens foram capturadas com um imageador de placa fluorescente com aumento de 4x e os neuritos foram quantificados usando FIJI (ImageJ). Barras de escala = 1000 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comprimento do neurite em multicompartimentos (MC) em comparação com o do gel simples (PG). Gráfico de dispersão mostrando comprimentos individuais de neuritos com médias e desvios padrão representados por barras de erro. O comprimento médio dos neuritos no MC foi de 1204,40 μm ± 690,43 μm (± DP médio) em comparação com 864,26 μm ± 362,84 μm (DP ± médio) no gel simples, indicando que o MC suporta o crescimento dos neuritos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo de codificação suplementar 1: STL file de dispositivo multi-compartimento (MC) gerado usando software de design auxiliado por computador. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Este protocolo descreve um método para colher DRGs Sprague Dawley adultos e cultivá-los em hidrogéis naturais 3D. Em contraste com esse método, outras abordagens para a coleta de DRGs de camundongos e ratos envolvem o isolamento da coluna vertebral. A coluna vertebral excisada é reduzida pela metade e a medula espinhal é removida para expor DRGs 23,24,25. Danos à medula espinhal limitam o suprimento sanguíneo, o que afeta DRGs e neurônios internos26. Isso reduz a atividade dos DRGs, tornando as abordagens cirúrgicas mais adequadas. Além disso, foi delineado um método para imprimir em 3D um dispositivo MC robusto que permite uma cultura fisiologicamente relevante de DRGs.
Este protocolo descreve um método para cultura de DRG in vitro, enfatizando o estudo da sensibilização periférica de neurônios em um modelo anatómica e fisiologicamente relevante. Este método de cultura pode estabelecer uma separação física de neuritos distais e do corpo celular DRG em um ambiente 3D. O dispositivo MC imita o ambiente in vivo , uma vez que os explantes DRG com células são preservados e podem ser co-cultivados com células gliais nativas. O explante DRG contém células neuronais não nativas, que podem ser co-cultivadas com outras células para imitar condições fisiológicas. Essa relevância fisiológica promove estudos sobre como as células não neuronais regulam a atividade dos neuritos e ajuda na compreensão dos mecanismos básicos envolvidos na nocicepção. A incorporação dessas interações não neuronais deve produzir previsões mais precisas dos resultados da sinalização celular em comparação com modelos de cultura simplificados com DRGs dissociados. A presença de dois compartimentos de neuritos maximiza a relevância fisiológica porque DRGs únicos inervam diferentes tecidos in vivo. Este projeto permite o tratamento de um compartimento de neurite enquanto o outro serve como controle. Os compartimentos de controle e tratamento conectados a um único soma podem ser usados para estudar os efeitos entre compartimentos, imitando condições in vivo em que os neuritos se estendem de um único soma e experimentam diferentes estímulos à medida que inervam diferentes tecidos, fornecendo informações sobre a conversa cruzada entre os neuritos. Se ocorrer conversa cruzada entre neuritos em compartimentos adjacentes, os DRGs não tratados podem servir como um verdadeiro controle.
Este dispositivo pode ser usado para isolamento de tratamento ou para estudar a interação entre neurônios e DRG no contexto da dor. Como os neuritos distais podem ser tratados seletivamente separadamente do soma DRG e dos neuritos proximais, esse sistema pode ser usado para tratamentos periféricos, como terapias articulares direcionadas, onde a extremidade terminal dos neurônios sensoriais periféricos é tratada diretamente.
Uma das principais vantagens do dispositivo MC são os experimentos de alto rendimento em vários poços da mesma placa, pois o dispositivo MC foi projetado para caber em uma placa de 48 poços. Um benefício adicional da plataforma in vitro é a capacidade de alterar a rigidez do hidrogel dentro do MC, ajustando as concentrações de colágeno e MAHA para imitar as propriedades de vários microambientes teciduais. Uma limitação potencial deste protocolo é que o isolamento fluídico entre os compartimentos do neurite e do soma DRG não é ideal para culturas além de 72 h sem uma mudança de meio. Um estudo anterior confirmou que o isolamento fluídico é mantido nos compartimentos por até 72 h sem alterações de meio11. Estudos anteriores mostraram que o aumento da concentração de ácido hialurônico aumenta significativamente a densidade de reticulação do colágeno, restringindo assim a difusividade das macromoléculas na matriz do hidrogel27. Portanto, para melhorar o isolamento fluídico para culturas após 72 h, a concentração de MAHA pode ser aumentada, como demonstrado em um estudo de Caparaso et al.7, onde um aumento na MAHA resultou em melhor isolamento fluídico. A incorporação de controle é feita para garantir o crescimento comparável de neuritos DRG em MC e gel simples. Isso é para garantir que o MC não tenha impacto no crescimento do DRG. Não é recomendado repetir a incorporação de controle em todos os experimentos depois que o crescimento do DRG no MC for validado.
Os autores reconhecem que os DRGs humanos são maiores, contêm mais células e têm proporções variadas de subtipo de neurônio em comparação com os DRGs de ratos28. O uso de DRGs de roedores é uma limitação deste estudo em termos de tradução para a clínica; no entanto, esse sistema pode ser valioso como plataforma de triagem para identificar compostos que afetam a excitabilidade neuronal. Embora existam diferenças de composição entre DRGs de roedores e humanos, também há uma alta sobreposição dentro do proteoma entre DRGs de ratos e humanos29. Essa sobreposição no proteoma - e a presença dos mesmos subtipos neuronais - sugere que o DRG de rato pode ser usado para rastrear terapêuticas em alto nível, e mais testes podem ser realizados para investigar se as alterações no DRG de rato se traduzem mecanicamente no DRG humano.
Esta plataforma permite a estimulação farmacológica direcionada e o estudo de neurônios ou corpos celulares com controle temporal. Mudanças na excitabilidade neuronal e na transmissão do sinal podem ser facilmente medidas pela manipulação de neuritos ou do DRG. A capacidade de avaliar a excitabilidade neuronal usando imagens de cálcio em hidrogéis de controle simples com DRGs de explante foi demonstrada7. Métodos semelhantes podem ser empregados no dispositivo MC para avaliar a excitabilidade neuronal.
Este método pode ser usado para estudar várias condições de dor em que a estimulação de neurônios sensoriais primários periféricos é um fator determinante, como dor lombar associada ao disco. O rastreamento da hipersensibilidade ao nociceptor pode ser uma ferramenta promissora para a descoberta de novos medicamentos para reduzir a hiperexcitabilidade. A redução da hiperexcitabilidade tem o potencial de se traduzir clinicamente em redução da dor. Essa plataforma pode rastrear medicamentos de alto rendimento para identificar os candidatos mais eficazes para validação in vivo usando ensaios de comportamento semelhante à dor.
Divulgações
Os autores deste estudo declaram não ter conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da NSF (2152065) e um prêmio NSF CAREER (1846857). Os autores gostariam de agradecer a todos os membros atuais e anteriores do Wachs Lab por contribuírem para este protocolo. Os diagramas da Figura 1 foram feitos em Biorender.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #5 fórceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Para aparar e cortar DRG |
| 10x | DMEM MilliporeSigma | D2429 | |
| 1x PBS (autoclavado) | Preparado em laboratório | 7.3 - 7.5 pH | |
| 24 placas de poços | VWR | 82050-892 | Para armazenar temporariamente DRGs colhidos e cortados |
| 3 mL Seringa estéril, uso único | BD | 309657 | |
| Placas de 48 poços | Greiner Bio-One | 677180 | |
| 60 mm Placa de Petri | Fisher Scientific | FB0875713A | Para segurar meios para aparar e cortar |
| Folha de alumínio | Fisherbrand | 01-213-104 | |
| B27 Plus 50x | ThermoFisher | 17504044 | Para meios DRG |
| Colágeno tipo I | Ibidi | 50205 | |
| Curvo copo Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16221-14 | Para dissecação |
| Dumont # 3 fórceps | Fine Science Tools | 11293-00 | Para dissecção |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | Para mídia DRG |
| Forma cura | Form Labs | agente de cura | |
| Form wash | Form Labs | Para lavar o excesso de resinas MC | |
| Esterilizador de esferas de vidro | Fisher Scientific | NC9531961 | |
| Frascos de vidro (8 mL) | DWK Life Sciences (Wheaton) | 224724 | |
| GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | Para meios DRG |
| HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
| Resina V2 de alta temperatura | FormLabs | FLHTAM02 | |
| Sal de Sódio de Ácido Hialurônico | MilliporeSigma | 53747 | Usado para fazer MAHA |
| Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
| Laminina | R & D Systems | 344600501 | |
| Tesoura grande de ponta romba | Militex | EG5-26 | Para dissecação |
| Pinça grande (pontas serrilhadas) | Militex | 9538797 | Para dissecação |
| Tesoura grande de ponta afiada | Fine Science Tools | 14010-15 | Para dissecação |
| Pontas de pipeta de baixa retenção | Fisher Scientific | 02-707-017 | Para pipetagem de colágeno e MAHA |
| Ácido hialurônico metacrilato (MAHA) | Preparado em laboratório | N/A | 85 - 115% de metacrilação |
| Fator de crescimento nervoso (NGF) | R& D Systems | 556-NG-100 | Para mídia DRG |
| Mídia Neurobasal A | ThermoFisher | 10888022 | Para mídia DRG |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Penicilina/Estreptomicina (PS) | EMD Millipore | 516106 | Para mídia DRG |
| Tiras de teste de pH | VWR International | BDH35309.606 | |
| Ponteiras de pipeta (1000 µ L) | USA Scientific | 1111-2021 | |
| Preform 3.23.1 software | Formslab | Para fazer upload do arquivo STL | |
| Impressora 3D de resina | |||
| Tesoura pequena de ponta afiada | Ferramentas de ciências finas | 14094-11 | Para dissecação |
| Bicarbonato | de sódioMilliporeSigma | S6014 | |
| Copo Reto rongeur | Ferramentas de Ciência Fina | 16004-16 | Para dissecação |
| Tesoura de mola de borda reta | Ferramentas de Ciência Fina | 15024-10 | Para dissecção |
| Lâmina de Escaplão Cirúrgico (No. 10) | Fisher Scientific | 22-079-690 | |
| Filtros de seringa, PES (0.22 µ m) | Celltreat | 229747 | |
| Tesoura minúscula da mola | 14003 | precisão do mundo | para aparar e cortar a |
| lâmpada UV | Analytik Jena E.U. | de Celltreat para o hidrogel do photocrosslink (15 - 18 mW/cm2) |
Referências
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Reimpressões e permissões
