Artigo de método

Transformação mitocondrial em Baker

2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/66856

⸱

7 de junho de 2024

 ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este trabalho explica como transformar mitocôndrias de levedura usando um método biolístico. Também mostramos como selecionar e purificar os transformantes e como introduzir a mutação desejada na posição alvo dentro do genoma mitocondrial.

Resumo

A levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizada para entender a biologia mitocondrial há décadas. Este modelo forneceu conhecimento sobre vias mitocondriais essenciais e conservadas entre eucariotos e fungos ou vias específicas de leveduras. Uma das muitas habilidades de S. cerevisiae é a capacidade de manipular o genoma mitocondrial, o que até agora só é possível em S. cerevisiae e na alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. A transformação biolística das mitocôndrias de levedura nos permite introduzir mutações dirigidas ao local, fazer rearranjos genéticos e introduzir repórteres. Essas abordagens são usadas principalmente para entender os mecanismos de dois processos altamente coordenados nas mitocôndrias: tradução por mitorribossomos e montagem de complexos respiratórios e ATP sintase. No entanto, a transformação mitocondrial pode potencialmente ser usada para estudar outras vias. No presente trabalho, mostramos como transformar mitocôndrias de leveduras por bombardeio de microprojéteis de alta velocidade, selecionar e purificar o transformante pretendido e introduzir a mutação desejada no genoma mitocondrial.

Introdução

A levedura Saccharomyces cerevisiae é um modelo amplamente reconhecido usado para estudar a biogênese mitocondrial. Como a levedura é um organismo anaeróbico e facultativo, é possível estudar extensivamente as causas e consequências da introdução de mutações que prejudicam a respiração. Além disso, este organismo possui ferramentas genéticas e bioquímicas amigáveis para estudar as vias mitocondriais. No entanto, um dos recursos mais poderosos para explorar os mecanismos de montagem de complexos respiratórios e síntese de proteínas mitocondriais é a capacidade de transformar as mitocôndrias e modificar o genoma da organela. Anteriormente, foi útil introduzir no DNA mitocondrial (mtDNA) mutações pontuais ou pequenas deleções / inserções 1,2,3,4,5, excluir genes 6,7, fazer rearranjos gênicos 7,8, adicionar epítopos às proteínas mitocondriais 9,10, realocar genes do núcleo para a mitocôndria11,12, e introduzir genes repórter como BarStar13, GFP14,15, luciferase16 e o ARG8m17,18 mais amplamente utilizado. As modificações do genoma mitocondrial nos permitiram dissecar e identificar mecanismos que, de outra forma, seriam difíceis de compreender. Por exemplo, o gene repórter ARG8 m inserido no locus COX1 no DNA mitocondrial foi crucial para entender que o Mss51 tem um papel duplo na biogênese de Cox1. Primeiro, é um ativador translacional do mRNA de COX1 e, segundo, é um acompanhante de montagem paraa proteína Cox1 7,19 recém-produzida. Este trabalho apresenta um método detalhado para transformar as mitocôndrias de S. cerevisiae. Embora o protocolo de transformação mitocondrial tenha sido publicado anteriormente 16,20,21,22,23, uma abordagem visual por meio de um vídeo é essencial para entender completamente as diferentes etapas e detalhes do método. O método consiste em várias etapas e é dividido em quatro etapas gerais:

Diagrama do processo de edição de genes; partículas de tungstênio, revestimento de DNA, etapas de integração do genoma mitocondrial.
Figura 1: Visão geral do procedimento de transformação mitocondrial por bombardeio de microprojéteis de alta velocidade: 1) As partículas de tungstênio são esterilizadas e preparadas antes do revestimento de DNA. 2) Dois plasmídeos diferentes são precipitados na superfície dos WPs. Um deles é um plasmídeo bacteriano contendo a construção que será direcionada para a matriz mitocondrial. O outro é um vetor de expressão de levedura nuclear que carrega um marcador de auxotrofia. 3) Uma cepa de levedura receptora sem DNA mitocondrial (rho0) é cultivada em uma fonte de carbono fermentativa como galactose ou rafinose, que não exerce nenhuma repressão de glicose da expressão gênica mitocondrial34,35. A cultura é espalhada em placas de Petri contendo o meio de bombardeio. 4) WPs revestidos com plasmídeos são disparados para a cepa do receptor por bombardeio de microprojéteis de alta velocidade. 5) Colônias de rho sintéticas positivas contendo o plasmídeo mitocondrial são selecionadas por acoplamento a uma cepa de teste. 6) A construção mitocondrial é integrada ao genoma mitocondrial no locus desejado, acasalando a cepa sintética (doador) com a cepa aceptora por um processo conhecido como citodção. 7) O receptor positivo, cepa haplóide que carrega a construção mitocondrial, é selecionado e purificado em diferentes meios. Abreviaturas: WPs = partículas de tungstênio; mtDNA = DNA mitocondrial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Transformação de células com a construção de DNA destinada a se integrar ao genoma mitocondrial (Figura 1, etapas 1-4)
Embora seja possível transformar diretamente uma levedura contendo um genoma mitocondrial completo (rho +), a transformação é 10-20 vezes mais eficiente se as células não tiverem DNA mitocondrial (rho0) 24 . As partículas de tungstênio (WPs) são revestidas com dois plasmídeos diferentes que serão cotransformados. O primeiro é um vetor de expressão μ levedura 2 que carrega um marcador de auxotrofia, como LEU2 ou URA3 (por exemplo, YEp351 ou YEp352, respectivamente). Se a introdução biolística de DNA nas células de levedura for bem-sucedida, os transformantes crescerão no meio de auxotrofia (ou seja, um meio sem leucina ou uracila). Este plasmídeo é útil para fazer a primeira seleção das células que adquiriram o plasmídeo nuclear; caso contrário, o número de colônias resultantes saturaria a placa. O segundo plasmídeo é um plasmídeo bacteriano (como pBluescript ou similar) contendo a construção mitocondrial destinada a ser integrada ao genoma mitocondrial. A construção deve conter pelo menos 100 nt de sequências mitocondriais flanqueadoras de 5' e 3' para recombinação com a região mitocondrial de interesse. Em nossa experiência, sequências flanqueadoras maiores têm maior probabilidade de se recombinar com sucesso com o locus alvo no genoma mitocondrial.

Um exemplo específico é mostrado na Figura 225. Neste exemplo, o objetivo era excluir a região do gene mitocondrial COX1 que codifica os últimos 15 aminoácidos da proteína correspondente (Cox1ΔC15) (Figura 2A). O plasmídeo bacteriano portador da mutação COX1ΔC15 continha 395 nt e 990 nt das regiões 5 'e 3' não traduzidas do gene, respectivamente. O plasmídeo foi derivado do pBluescript (pXPM61) e, juntamente com o plasmídeo de 2 μ YEp352, foram coprecipitados na superfície dos WPs (Figura 2B). Os WPs foram então introduzidos por bombardeio de microprojéteis na cepa receptora selecionada (Figura 2C). Esta cepa, denominada NAB6926, é uma cepa MATa, rho0 com os alelos kar1-1 e ade2 (a importância dessas características é discutida abaixo). As células foram plaqueadas em meios de bombardeio sem uracila para selecionar aquelas que adquiriram o plasmídeo de 2 μ (Figura 2C). As células foram cultivadas por 5-7 noites a 30 °C.

Seleção das células que adquiriram o plasmídeo bacteriano contendo a construção mitocondrial e o plasmídeo nuclear 2 μ carregando o marcador de auxotrofia (Figura 1, etapa 5)
As colônias positivas manterão muitas cópias do plasmídeo bacteriano em suas mitocôndrias22. Como as células transformadas são originalmente rho0, nenhuma sequência mitocondrial suporta a tradução da construção mitocondrial presente no plasmídeo; portanto, o gene mitocondrial transformado não será expresso. É necessário acoplar os transformantes com uma cepa de teste para detectar as colônias de leveduras que adquiriram o plasmídeo mitocondrial. O genoma mitocondrial da cepa testadora contém uma versão mutada não funcional do gene de interesse. Após o acasalamento, as mitocôndrias se fundirão e a sequência mitocondrial incluída no plasmídeo transformado se recombinará com o gene mitocondrial mutado da cepa testadora; consequentemente, a recuperação do gene WT reconstituirá a função. O diplóide resultante terá um fenótipo positivo detectável (geralmente a capacidade de crescer em meio respiratório ou um meio sem arginina). As células positivas que carregam o plasmídeo bacteriano nas mitocôndrias são denominadas "células rho sintéticas". No exemplo específico da Figura 2D, as células rho sintéticas portadoras da construção COX1ΔC15 (denominadas XPM199) foram replicadas em um meio sem uracila (esta é a placa mestra da qual as colônias positivas foram purificadas). Eles também foram replicados em um gramado da cepa de teste L4527, que contém a mutação não funcional cox1D369N. Após o acasalamento por duas noites, o genoma mitocondrial de L45 e XPM199 se recombinou, resultando em um gene COX1 funcional; portanto, os diplóides recuperaram a capacidade de crescer em meios respiratórios. Da placa mestra, escolhemos as colônias positivas. Eles foram listrados em placas sem uracila, e os testes seletivos foram repetidos para obter células rho sintéticas puras (Figura 2E). É importante notar que a placa de teste é apenas para a identificação de colônias de rho sintéticas, e os mutantes não podem ser recuperados dessas placas.

Integração da construção no genoma mitocondrial da cepa pretendida
Essa etapa é alcançada por um processo denominado citodução28,29 (Figura 1, etapa 6). Nesta abordagem, a cepa sintética (cepa doadora) é acoplada à cepa receptora pretendida do tipo de acasalamento oposto. Um requisito essencial é que pelo menos uma das duas cepas de acasalamento carregue a mutação kar1-1 para impedir a fusão nuclear30. Assim, o acasalamento das duas células produz um zigoto binucleado (Figura 3). A rede mitocondrial das células parentais (doador e aceitador) se funde e as moléculas de DNA mitocondrial se recombinam. Os zigotos binucleados são incubados/recuperados para permitir o brotamento, que produzirá células haplóides. Esses haplóides carregam o fundo nuclear de uma das células parentais. Da mesma forma, os haplóides podem transportar o DNA mitocondrial da célula parental ou do DNA mitocondrial recombinado de interesse. No entanto, a mutação kar1-1 não é 100% eficaz, e alguns diplóides verdadeiros serão formados durante o acasalamento28,29. A cepa sintética de rho- (doador, XPM199) carregava o alelo kar1-1 no exemplo. Como marcador seletivo, apresentava o alelo ade2, tornando-se um auxotrófico para adenina (Figura 4). A cepa aceptora foi XPM10, uma cepa rho+ com a construção cox1Δ::ARG8m, onde o repórter ARG8m substituiu os códons COX1 no genoma mitocondrial7. A mistura de ambas as culturas de células foi adicionada a uma placa YPD como uma gota para permitir o acasalamento. Após 3-5 h, as células foram observadas ao microscópio óptico para detectar a formação de shmoos (Figura 3B), uma forma celular associada ao acasalamento. Após o tempo de incubação/recuperação, os zigotos binucleares foram plaqueados em meio sem adenina para evitar o crescimento das células doadoras.

Seleção da cepa haploide que carrega o genoma mitocondrial de interesse (Figura 1, etapa 7)
Uma mistura de células doadoras, aceptoras e diplóides está presente após a citação. Portanto, após a incubação/recuperação dos zigotos binucleados, as células devem ser cultivadas em diferentes meios seletivos para identificar e purificar os haplóides de interesse. O meio seletivo depende dos genótipos do doador, das cepas aceitadoras e da construção mitocondrial pretendida. No entanto, em geral, o raciocínio para a escolha do meio seletivo é: i) após a incubação/recuperação, a mistura de citodução é cultivada em meio seletivo onde a cepa parental do doador não pode crescer. No exemplo específico da Figura 4A, B, o doador (cepa sintética de rho) carrega o alelo ade2 não funcional. Assim, a mistura de citoducção deve ser incubada em uma placa média sem adenina. Esta é a placa mestra. ii) Uma vez que as colônias crescem, a placa mestra é replicada novamente em um meio sem adenina (para gerar uma nova placa mestra de onde as colônias positivas de interesse serão purificadas) e, em seguida, em um meio onde apenas diplóides podem crescer. Isso é necessário para evitar a purificação inadvertida de colônias diplóides. No caso do exemplo da Figura 4C, apenas diplóides podem crescer em meios sem leucina. iii) A placa mestra também é replicada em meios onde apenas os haploides aceitadores que incorporaram o DNA mitocondrial de interesse crescerão. No exemplo da Figura 4C, os haplóides crescem em meios respiratórios contendo etanol / glicerol como fonte de carbono, uma vez que a proteína Cox1ΔC15 é funcional. A cepa rho + resultante com o mtDNA de interesse foi denominada XPM20925. As cepas usadas na Figura 2 e na Figura 4 estão listadas na Tabela 1.

Processo de edição de genes de levedura, diagrama com mtDNA e COX1ΔC15, plasmídeo URA3, cepa sintética rho⁻.
Figura 2: Diagrama descrevendo um exemplo específico de transformação mitocondrial e seleção de células rho positivas. (A) A modificação pretendida do genoma mitocondrial foi uma deleção da região que codifica os últimos 15 aminoácidos da subunidade Cox1 (Cox1ΔC15). (B) Os WPs foram revestidos com dois plasmídeos para transformar células de levedura. Um foi o plasmídeo de 2 μ Yep352 que foi direcionado e expresso no núcleo. O outro foi o plasmídeo pXPM61, que contém o alelo COX1ΔC15 mais 395 nt e 990 nt dos COX1 5 'e 3'-UTRs, respectivamente. (C) Os WPs foram introduzidos em células da cepa NAB69, que não possui DNA mitocondrial (cepa rho0 ). As colônias transformantes obtidas das placas de bombardeio foram replicadas em um meio sem uracila, o marcador auxotrófico do plasmídeo nuclear YEp352. (D) Para selecionar as colônias rho positivas, a placa -URA foi replicada em um meio sem uracila. Esta foi a placa mestra da qual as colônias positivas foram colhidas e isoladas. Também foi replicado em placas com rich media (YPD) e um gramado de uma cepa de teste. Durante o acasalamento, o DNA mitocondrial sintético foi recombinado com o DNA mitocondrial da cepa testadora, L4527, que carrega uma mutação no gene COX1 (D369N). Os diplóides que cresceram no meio respiratório continham o DNA transformado. As colônias correspondentes foram escolhidas da placa mestra para relistrar e purificar. Para ajudar a identificar as colônias positivas na placa mestra em todas as réplicas do revestimento, foram feitas marcas com um marcador permanente nas bordas das placas (linhas verdes). (E) As colônias positivas selecionadas foram resquentadas em um meio sem uracila. Esta foi a nova placa mestre. Como em D, mais duas rodadas de testes foram realizadas para purificar as colônias sintéticas de rho. Abreviaturas: WPs = partículas de tungstênio; mtDNA = DNA mitocondrial; -URA/Sorb = sem uracila/ contendo Sorbitol; WT = tipo selvagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Processo de fusão de células de levedura; diagrama e imagem do microscópio; transferência rho+; estágios de acasalamento; biologia celular.
Figura 3: Diagrama descrevendo o procedimento de citodução. (A) Visão geral de como as células se acasalam durante a citação. Durante a citodção, as mitocôndrias das cepas doadora e receptora se fundem para que o DNA mitocondrial de ambas as cepas se recombine. Como a fusão nuclear é reduzida devido à mutação kar1-1 30, os zigotos binucleares são formados. Após algum tempo de incubação / recuperação, os brotos de zigotos binucleares e os aceptores haplóides contendo a mutação mitocondrial pretendida são selecionados. (B) O acasalamento da cepa sintética (doadora) e da cepa aceptora por meio da citoducção permite a formação de shmoos (setas vermelhas), uma forma característica da levedura de acasalamento. A imagem foi tirada em microscópio óptico com objetiva de 100x. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama de cruzamento genético de levedura mostrando o doador XPM199 e o aceitador XPM10, destacando o revestimento mestre ADE e o processo de crescimento recombinante para integração de DNA.
Figura 4: Diagrama descrevendo um exemplo específico de citoducção para integrar a mutação COX1ΔC15 no genoma mitocondrial. (A) Culturas líquidas da cepa rho sintética (doador, XPM199) e da cepa de interesse (aceptor, XPM10) foram misturadas para acasalar. Após a formação do shmoo, a mistura foi recuperada em uma cultura líquida por 2-4 h. Em seguida, a mistura de citoducção foi espalhada em uma placa com um meio sem adenina para evitar o crescimento das células doadoras. (B) Representação esquemática dos eventos de recombinação do DNA mitocondrial do doador (XPM199) e do aceptor (XPM10) durante a citação. (C) A placa mestra foi replicada em diferentes meios seletivos para identificar e purificar os haplóides que integraram o gene mitocondrial pretendido no DNA da organela (XPM209) 25. Abreviaturas: -ADE = sem adenina; -LEU = falta de leucina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

NOTA: Recomendamos fazer seis transformações para cada construção, pois a eficiência da transformação mitocondrial geralmente é baixa. A composição dos diferentes meios de crescimento é mostrada na Tabela 2.

1. Preparação de partículas de tungstênio

  1. Pesar 30 mg de partículas de tungstênio de 0,7 μm (WPs, microtransportadores) em um microtubo. Adicione 1,5 mL de etanol a 70% (EtOH) para esterilizar. Vortex os WPs e deixe-os descansar por 10 min em temperatura ambiente.
  2. Centrifugue a 13.200 x g por 15 min em temperatura ambiente. Lave os WPs adicionando 1,5 mL de água estéril às partículas, agitando-as e centrifugando a 13.200 × g por 15 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.
  3. Adicione 500 μL de glicerol estéril a 50% (a concentração final é de 60 μg de WPs/μL).
    NOTA: Os WPs podem ser armazenados a -20 °C por pelo menos 6 meses. Desse estoque, pegue a quantidade necessária para seis transformações (100 μL).

2. Revestimento de DNA WPs

  1. Adicionar 5 μg do plasmídeo de 2 μ e 15 μg do plasmídeo bacteriano que contém a sequência mitocondrial a um microtubo sobre gelo.
    NOTA: O volume final não deve exceder 50 μL para evitar diluir ainda mais os reagentes necessários para o revestimento de DNA.
  2. Adicione 100 μL da suspensão WP e vórtice por 5 s (6 mg de WPs).
  3. Adicione 4 μL de espermidina 1 M. Breve vórtice.
  4. Adicione 100 μL de CaCl2,5 M 2 gelado, brevemente vórtice. Incubar no gelo por 10 min; Brevemente vórtice a mistura a cada 3 min.
    NOTA: A solução de CaCl2 é esterilizada por filtro e não deve ser autoclavada.
  5. Centrifugar os WP durante 30 s a 13,200 × g a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Lave as partículas ressuspendendo-as suavemente em 200 μL de EtOH a 100% a -20 °C.
  6. Centrifugar os WP durante 30 s a 13,200 × g a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Repita a lavagem.
  7. Ressuspenda os WPs em 60-70 μL de temperatura ambiente 100% EtOH usando uma ponta de pipeta; não vórtice.
    NOTA: Para garantir a qualidade dos plasmídeos, o revestimento de DNA deve ser realizado no mesmo dia da transformação biolística.

3. Preparação de material biolístico

  1. Antes do bombardeio, esterilize seis suportes de macroportadores (Figura 5) em uma autoclave e seque-os completamente. Como alternativa, mergulhe-os em EtOH e esterilize-os usando uma chama com a ajuda de uma pinça. Coloque-os em uma placa de vidro estéril.
  2. Durante a precipitação de DNA (10 min de incubação no gelo na etapa 2.4), insira seis macrotransportadores (ou discos voadores) em cada um dos seis suportes de macrotransportadores com a ajuda de pinças estéreis.
    NOTA: Não esterilize os macrocarriers.
  3. Misture os WPs revestidos de DNA com a pipeta. Adicione 10 μL de WPs a cada superfície macrotransportadora e distribua por toda a superfície com a ponta da pipeta. Se necessário, adicione alguns microlitros extras de 100% de EtOH à superfície do macrotransportador para fazer uma distribuição uniforme dos WPs. Deixe a suspensão secar à temperatura ambiente por ~20 min.

4. Preparação de células de levedura e placas de bombardeio

  1. Inocular a cepa do receptor rho0 em 2 mL de meio YPR (Tabela 2). Crescer durante uma noite a 30 °C numa roda rotativa.
  2. Diluir 300 μL da cultura em 30 ml de meio YPR fresco. Cultivar a 30 °C e 200 rpm num agitador rotativo durante duas noites até que a cultura esteja saturada.
  3. Centrifugue as células de levedura a 600 × g por 5 min em temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células de levedura em 600 μL de meio YPD (Tabela 2).
  4. Usando uma alça de vidro estéril, espalhe 100 μL da suspensão de células de levedura em uma placa média de bombardeio sólido.
    NOTA: O meio de bombardeio não deve ter o marcador de seleção do plasmídeo de 2 μ que será usado para transformação.
  5. Repita a etapa 4.4 para as outras cinco placas.
  6. Incube por 1-3 h em temperatura ambiente antes do bombardeio para garantir que o meio líquido seja completamente absorvido na superfície da placa.

5. Geração de uma cepa sintética por transformação biolística

NOTA: Antes de começar, certifique-se de ler o manual do usuário do equipamento biolístico. Descreveremos o protocolo do equipamento referenciado (Tabela de Materiais e Figura 5).

  1. Limpe a câmara do sistema de entrega de partículas biolísticas com etanol 70% para evitar contaminação e deixe repousar por pelo menos 10 min. Pouco antes do bombardeio, limpe a superfície com uma toalha de papel limpa.
  2. Abra as válvulas do tanque de hélio para definir cerca de 2.000 psi.
  3. Ligue o equipamento e ligue a fonte de vácuo.
  4. Usando uma pinça, coloque o macrotransportador voltado para baixo no suporte do macrotransportador.
    NOTA: Não use a tela de parada que acompanha o equipamento.
  5. Aparafuse a tampa do macrotransportador na parte superior do macrotransportador. Todas as peças juntas constituem o sistema de lançamento do microporta-aviões (Figura 5).
  6. Coloque o sistema de lançamento do microtransportador dentro da câmara de vácuo no quinto nível a partir da parte inferior.
  7. Coloque uma das placas contendo o gramado de deformação rho0 no segundo nível a partir do fundo da câmara. Certifique-se de que a placa esteja voltada para cima e sem a tampa.
  8. Usando uma pinça estéril, coloque um disco de ruptura na tampa de retenção. Aparafuse a tampa de retenção no tubo de aceleração; Certifique-se de que a tampa de retenção esteja firme.
    NOTA: Não trate os discos rompidos com isopropanol conforme sugerido no manual, pois observamos que a eficiência da transformação diminui.
  9. Feche a porta da câmara de vácuo.
  10. Coloque a chave VAC/VENT/HOLD na posição VAC . Quando o vácuo de 25-28 inHg for atingido, mude a chave VAC/VENT/HOLD para a posição HOLD .
    NOTA: Esteja ciente de que o vácuo alcançável pode variar de acordo com o nível do mar. Obtivemos sucesso chegando a 25 inHg.
  11. Pressione o botão FIRE para disparar os WPs. Espere que a pressão aumente no tubo de aceleração até atingir 1,300 psi, quando o disco de ruptura quebrará, fazendo um som pop.
  12. Imediatamente após a quebra do disco de ruptura, o interruptor FIRE e o vácuo são liberados alterando o interruptor VAC/VENT/HOLD para a posição VENT .
  13. Com cuidado, com pinça estéril, remova quaisquer detritos do disco de ruptura presentes na superfície da placa e cubra a placa com a tampa.
  14. Repita o procedimento para as cinco placas restantes, colocando um novo disco de ruptura e macrotransportador em cada rodada.
  15. No final, feche a válvula principal do tanque de hélio.
  16. Feche a câmara e construa um vácuo colocando a chave VAC/VENT/HOLD na posição VAC . Libere o sistema de qualquer pressão de hélio pressionando e soltando o interruptor FIRE algumas vezes. Repita com a porta aberta.
  17. Desligue a bomba de vácuo e o equipamento de bombardeio.
  18. Limpe o sistema de entrega com 70% de EtOH. Lave os suportes do macrotransportador com uma solução SDS a 0,1%; enxágüe com água destilada estéril e 100% de EtOH.

6. Seleção sintética de colônias de rho-

  1. Incubar as placas de bombardeio durante 5-7 noites a 30 °C.
    NOTA: É importante verificar diariamente se as placas estão contaminadas. Se necessário, a região contaminada pode ser cortada com uma espátula estéril para evitar mais contaminação.
  2. Inocular a estirpe de teste do tipo de acasalamento oposto em 2 ml de meio YPD durante a noite (ver o exemplo específico na Figura 2D,E).
  3. Inocular 150 μL da cultura de cepas do testador em uma placa YPD. Usando uma alça de vidro estéril, espalhe o testador uniformemente na superfície da placa. Deixe o prato secar por pelo menos 5 min.
  4. Faça réplicas das placas de bombardeio usando almofadas de veludo e um carimbo replicador.
    1. Replicar numa placa de meio de dropout correspondente ao marcador de auxotrofia plasmídica de 2 μ transformado. O crescimento leva uma incubação durante a noite a 30 °C. Em seguida, conservar a 4 °C até nova utilização. Esta placa é a placa mestra.
    2. Replique na placa YPD que contém o gramado do testador da etapa 6.3. Incubar a 30 °C durante duas noites. Em seguida, replique esta placa no meio seletivo para detectar a presença do gene mitocondrial de interesse, por exemplo, meio respiratório ou meio sem arginina, e incube durante a noite a 30 ° C. Apenas as células que abrigavam o plasmídeo bacteriano sintético nas mitocôndrias crescerão no meio seletivo após o acasalamento com a cepa testadora.
  5. Identifique na placa mestra (etapa 6.4.1) as colônias correspondentes que cresceram na etapa 6.4.2.
    NOTA: Como a placa de bombardeio (e, portanto, a placa mestra) está repleta de colônias transformantes, pode ser difícil identificar as colônias positivas observadas na placa de acoplamento do testador. Por esse motivo, é altamente recomendável desenhar algumas pequenas linhas de cada lado de todas as placas com um marcador permanente. Desenhe linhas semelhantes no anel do selo replicante. Essas linhas serão úteis para orientar e localizar colônias positivas na placa mestre (veja o exemplo na Figura 2D).
  6. Purifique as colônias positivas listrando-as da placa mestre para uma segunda placa de saída seletiva, como na etapa 6.4.1. Incubar durante duas noites a 30 °C.
    NOTA: É essencial que o streaking permita o crescimento de colônias únicas para garantir uma cepa pura.
  7. Repita o processo de seleção (etapas 6.2-6.5) para confirmar a presença do plasmídeo bacteriano nas mitocôndrias.
    NOTA: Normalmente, esse processo pode ser repetido mais duas vezes para selecionar cepas de rho- sintéticas estáveis.
  8. Uma vez que a cepa sintética mantém de forma estável o DNA do plasmídeo nas mitocôndrias, selecione 3-5 colônias positivas diferentes e inocule-as em 2 mL de YPD. Utilizar esta cultura para preparar um stock criovídico (misturando 600 μL de cultura e 600 μL de glicerol a 50% para conservar a -70 °C) e para inserir a sequência plasmidial no mtDNA de interesse por citoducção (passo 6.7).
    NOTA: Como não há pressão seletiva para manter o plasmídeo transformado nas mitocôndrias da cepa de rho sintética, o plasmídeo pode ser facilmente perdido. Portanto, recomendamos fazer a citodução o mais rápido possível.

7. Integração da construção presente na cepa sintética de rho- no local alvo no genoma mitocondrial por citoducção

  1. Inocular dois tubos com 3 mL de meio YPD, um com as células doadoras (células rho sintéticas) e outro com as células aceptoras (célula de levedura onde a construção final é esperada). Incubar durante a noite a 30 °C.
  2. Misture 750 μL da cepa do doador e 250 μL da cepa do receptor em um microtubo estéril (proporção de 3:1).
  3. Centrifugue a mistura por 1 min a 13.200 × g; descarte o sobrenadante. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL com a extremidade cortada, pegue uma gota do pellet celular e coloque-o em uma placa YPD. Incubar a 30 °C durante 2-4 h.
    NOTA: Para evitar contaminação cruzada, não coloque mais de duas suspensões de células em uma única placa (veja o example na Figura 4A).
  4. Pegue uma pequena quantidade da mistura de células, ressuspenda-a em 15 μL de água estéril em uma lâmina e coloque uma lamínula. Verifique sob um microscópio óptico a presença de shmoos com objetiva de 40x ou 100x; essa forma característica aparece quando dois tipos de acoplamento estão presentes (Figura 3B).
  5. Se shmoos estiverem presentes, ressuspenda uma pequena quantidade (~ 0,5 mm3) da massa celular em 2 mL de meio YPD. Incubar durante 2 h a 30 °C numa roda rotativa para permitir a recuperação dos zigotos binucleares.
  6. Vortex a mistura e diluir 10 μL da suspensão celular em 990 μL de água estéril (diluição 1:100). Use esferas de vidro ou uma alça de vidro estéril para espalhar 100 μL da diluição celular em um meio de gota onde apenas a cepa aceptora (e diplóides esporádicos) crescem. Incube por 2-3 noites a 30 °C.
  7. Replique as colônias resultantes no meio seletivo necessário, conforme explicado na introdução (estágio 4; consulte a Figura 4C para um exemplo específico).
  8. Após a identificação das colônias positivas, coloque-as novamente no mesmo meio seletivo para purificar a cepa haplóide que carrega o mtDNA de interesse.
  9. Selecione pelo menos duas colônias positivas e cultive-as em 2 mL de meio YPD a 30 ° C durante a noite. Faça um backup criogênico misturando 600 μL de glicerol a 50% com 600 μL da cultura YPD saturada. Conservar a -70 °C.
  10. Isole o DNA das cepas resultantes 31,32. Amplificar a região desejada por PCR e sequenciar para confirmar a presença da mutação mitocondrial.
    NOTA: Cada colônia positiva é uma réplica técnica que deve ser confirmada independentemente para garantir a sequência correta no genoma mitocondrial.

Resultados

Esta seção apresenta alguns resultados representativos dos diferentes estágios da transformação mitocondrial. A Figura 6 mostra um procedimento de bombardeio. As células rho sintéticas carregavam um plasmídeo bacteriano com o gene repórter ARG8m, que substituirá a sequência codificadora de um gene mitocondrial (Figura 6A). Após o bombardeio, a placa foi replicada em um meio sem uracila (-URA); esta é a placa mestra (Figura 6B). As colônias em crescimento possuem o vetor de expressão de levedura com o marcador de auxotrofia URA3 . De acordo com a seção 6 do protocolo, a placa de bombardeio também foi replicada em um meio YPD contendo um gramado da cepa do testador. Nesse caso, a cepa testadora abrigava um alelo defeituoso do gene ARG8m no genoma mitocondrial (ARG8m-1)1. Após 2 noites de incubação, o gramado do testador e as células transformadoras se acasalaram e as mitocôndrias se fundiram. Esta placa foi replicada em um meio sem arginina. Apenas os diplóides contendo o plasmídeo mitocondrial foram capazes de crescer neste meio seletivo porque o gene ARG8m presente na cepa sintética substituiu o ARG8m-1 defeituoso do genoma mitocondrial da cepa testadora.

O número de colônias positivas geralmente varia de zero a 20 por placa. No presente exemplo, foram obtidas quatro colônias sintéticas positivas de rho, que foram purificadas listrando-as em meio sem uracila. Na primeira rodada de purificação, muitas colônias negativas foram obtidas junto com as positivas. No entanto, após duas ou três rodadas de purificação, é possível obter a cepa sintética positiva pura. Na Figura 6C, mostramos algumas colônias de rho sintéticas positivas após três rodadas de purificação e teste. A maioria das colônias da placa mestre -URA são positivas para a sonda testadora. Curiosamente, nem todas as células de uma colônia positiva contêm o plasmídeo mitocondrial, indicando que o plasmídeo transformado foi perdido em uma população da colônia. Esse resultado é esperado, pois não há pressão seletiva para manter o plasmídeo mitocondrial, tornando-o instável. No entanto, uma cepa de rho- sintética como as mostradas na Figura 6C pode ser levada para a próxima etapa, citoducção (seção 7 do protocolo), e usada para preparar o estoque a ser armazenado a -70 ° C. A Figura 6D também mostra a terceira rodada de purificação de uma cepa de rho- sintética. No entanto, neste caso, como os transformantes eram praticamente incapazes de manter o plasmídeo mitocondrial, eles foram descartados.

Descrevemos uma estratégia geral para selecionar colônias de rho sintéticas positivas, que é apresentada na Figura 7A. Neste caso, a construção mitocondrial presente nas células rho sintéticas tem várias centenas de nucleotídeos para se recombinar com o DNA mitocondrial da cepa testadora (por exemplo, a construção COX1ΔC15 na cepa rho sintética se recombina com o gene mutado cox1D369N no DNA mitocondrial do testador (Figura 2D); ou a construção cox1Δ::ARG8m na cepa rho sintética com o gene mutado ARG8m-1 no DNA mitocondrial do testador (Figura 6A). No entanto, se não houver disponibilidade de uma cepa de teste para selecionar as células rho sintéticas positivas de interesse, há uma abordagem indireta para selecioná-las 33. Nesse caso, o plasmídeo bacteriano também deve conter um fragmento de um gene mitocondrial, como COX2 ou COX3. A cepa do testador contém uma cópia não funcional do gene mitocondrial cox2 ou cox3 . No exemplo dado, a sequência do fragmento cox3 presente no plasmídeo bacteriano pode complementar a sequência cox3 presente nas mitocôndrias do testador e, após a recombinação, fornecer um gene COX3 funcional. Depois de cruzar as células rho sintéticas com a cepa testadora, os diplóides podem respirar apenas se as células rho sintéticas contiverem o plasmídeo bacteriano dentro das mitocôndrias (Figura 7B).

A Figura 8 exemplifica o processo de citodução. As cepas doadora e receptora possuem auxotrofia de leucina e adenina, respectivamente. Assim, após a citação, a mistura foi plaqueada em um meio sem leucina, impedindo o crescimento das células doadoras. Esta é a placa mestra. Neste ponto, apenas haploides com o fundo nuclear da cepa aceptora e diplóides esporádicos crescerão. Para descartar diplóides, a placa mestra foi replicada em meios sem adenina, onde apenas diplóides podem crescer. Neste exemplo, o DNA mitocondrial resultante após a citoducção é mutado e os haplóides pretendidos não podem crescer no meio respiratório de etanol / glicerol. Portanto, a placa mestre precisa ser replicada em placas YPD com um gramado de uma cepa de testador. A posição dos diplóides respiratórios positivos indica quais colônias purificar da placa mestra. Duas rodadas de purificação são necessárias para obter a cepa final pura. A integração mitocondrial é geralmente corroborada pela amplificação por PCR da região circundante de interesse e sequenciamento.

Finalmente, os genes podem ser inseridos no locus específico do genoma mitocondrial. Por exemplo, os genes repórteres podem ser inseridos na extremidade 3 'da sequência de codificação de um gene mitocondrial ou substituir a região codificadora do gene mitocondrial, entre outras opções (Figura 9A). No entanto, os genes também podem ser inseridos em locais ectópicos dentro de regiões não codificantes do genoma mitocondrial. O local comumente usado é 295 nt a montante do códon de início do gene COX2 . A alteração nessa região não codificante é inócua13. Para expressar com sucesso o gene no sítio ectópico, ele deve ser flanqueado por um promotor e terminador mitocondrial. As sequências flanqueadoras de COX2 são as mais ideais, uma vez que COX2 é o gene mitocondrial com as sequências não traduzidas 5 'e 3' mais curtas (73 nt do 5 'UTR e 119 nt do 3' UTR) ( Figura 9B ). Para esta construção, o plasmídeo bacteriano tem as seguintes características: o molde é um plasmídeo que contém a região codificadora COX2 , com 1120 nt a jusante do códon de parada e 670 nt a montante do códon de início AUG , denominado pXPM5025. O gene de interesse é projetado para ser flanqueado por 73 nt do COX2 5'-UTR e 119 nt do COX2 3'-UTR. Posteriormente, foi inserido, conforme indicado anteriormente, a 295 nt a montante do códon inicial COX2 AUG, que é uma região não codificante (Figura 9B). Observe que este plasmídeo e, conseqüentemente, no genoma mitocondrial resultante, os UTRs COX2 5 'e 3' são duplicados. Após o bombardeio deste plasmídeo, as células rho sintéticas são acasaladas para citoducção com uma cepa receptora que possui uma extensa deleção da região COX2 (alelo cox2-62 )1. Durante a citodção, o plasmídeo mitocondrial da cepa rho sintética se recombina com o DNA mitocondrial do aceptor. O genoma mitocondrial resultante tem a construção ectópica e um gene WT COX2 . Portanto, as colônias positivas poderão crescer em meio respiratório (Figura 9B).

Diagrama do sistema de lançamento de microtransportadores, configuração de pressão de hélio, placa de amostra, tubo de aceleração.
Figura 5: Representação esquemática do equipamento de bombardeio de microprojéteis de alta velocidade. Nosso laboratório usa o Sistema de Entrega de Partículas Biolistic-PDS-1000 / He (Tabela de Materiais). Abreviatura: WPs = partículas de tungstênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama de transformação de levedura e resultados de placa de Petri mostrando a funcionalidade do gene ARG no mtDNA sintético.
Figura 6: Exemplo de uma placa de transformação de microprojéteis de alta velocidade. (A,B) Após o bombardeio, as placas foram incubadas por 5-7 noites a 30 °C. Se um contaminante crescer (indicado por uma seta azul), ele pode ser cortado com uma espátula estéril. Depois de replicar as placas no meio marcador de seleção (-URA neste caso), a placa mestra também foi testada quanto à presença do plasmídeo mitocondrial por acoplamento a uma cepa de teste. Nesse caso, a cepa do testador tem o alelo não funcional ARG8m-1 1. Após o acasalamento por 2 noites e a replicação da placa em um meio sem arginina (-ARG), surgiram quatro colônias positivas (indicadas com setas vermelhas). (C) As colônias de rho sintéticas positivas foram purificadas por recolocação em meio -URA, e o teste de réplica foi realizado conforme descrito anteriormente. Essas placas representam a terceira rodada de purificação. (D) Algumas colônias de rho sintéticas positivas perderam a construção mitocondrial. Abreviaturas: mtDNA = DNA mitocondrial; -URA = falta de uracila; -ARG = falta de arginina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama do processo de integração do plasmídeo bacteriano; transferência de genes para mtDNA; conceito de engenharia genética.
Figura 7: Diagrama mostrando como selecionar colônias de rho sintéticas positivas após o bombardeio. (A) O plasmídeo bacteriano contém uma versão mutada não funcional de um gene mitocondrial. Para detecção, as colônias sintéticas de rho são acasaladas a uma cepa de teste contendo uma mutação não funcional diferente do mesmo gene no DNA mitocondrial. Após o acasalamento, os mtDNAs mutantes se recombinam e um gene funcional pode ser recuperado por complementação. Aqui, o diplóide cresce em um meio seletivo onde nem a cepa sintética nem o testador podem crescer. (B) Neste caso, o plasmídeo contém uma sequência adicional de um gene mitocondrial (ou seja, um pedaço de COX3). Após a transformação, a cepa sintética de rho- é selecionada por sua capacidade de complementar uma mutação COX3 na cepa testadora, de modo que apenas os diplóides podem crescer em um meio seletivo (ou seja, meio respiratório). Este método é útil se uma cepa de teste para o gene de interesse não estiver disponível. A detecção de colônias de rho sintéticas positivas neste caso é indireta. Abreviatura: mtDNA = DNA mitocondrial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Experimento em placa de Petri; processo de citodução; observação do crescimento de leveduras; avaliação da transferência genética.
Figura 8: Exemplo de citodução para integrar uma construção no locus alvo no DNA mitocondrial. Após o acasalamento e recuperação, as células mistas e os zigotos binucleares foram plaqueados em um meio sem leucina. Nesse caso, como a cepa doadora possui o alelo leu2,3-112, esse meio impede o crescimento do doador. Esta placa foi replicada no mesmo meio (placa mestra), em um meio onde apenas diplóides podem crescer (-ADE) e em um meio onde o aceptor com a mutação pretendida pode crescer (setas vermelhas). Nesse caso, nem o doador nem as células receptoras podem crescer em meios respiratórios. Apenas o diplóide resultante após o acasalamento com um gramado de uma cepa de teste pode crescer em um meio respiratório. Essas colônias diplóides respiratórias são um guia para selecionar e purificar as colônias positivas da placa mestra. Abreviaturas: -LEU = falta de leucina; -ADE = falta de adenina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama de transferência de genes mitocondriais com doador rho sintético para processo aceitador de mtDNA.
Figura 9: Diagrama mostrando como integrar a construção mitocondrial mutada (presente na cepa rho- sintética) na cepa aceitadora. (A) Neste exemplo, a cepa aceptora carrega o gene repórter ARG8 m que substitui os códons do gene de interesse. O rho-DNA sintético contém uma versão mutada deste gene. O plasmídeo e o DNA mitocondrial se recombinam através das regiões flanqueadoras 5 'e 3', e o repórter ARG8m é substituído pela sequência mutada do gene de interesse. (B) Genes estranhos podem ser inseridos ectopicamente em regiões específicas do genoma mitocondrial 7,13,36. Neste exemplo, um gene pode ser introduzido em uma posição 295 nt a montante do gene COX2. Esta é uma região não codificante do mtDNA. Um gene estranho de interesse é flanqueado por 73 nt e 119 nt do COX2 5 'UTR e 3' UTR, respectivamente. Esta construção é inserida em um plasmídeo contendo o gene COX2 mais 670 nt e 1120 nt das regiões 5' e 3' UTR. A cepa sintética (doador) carrega essa construção nas mitocôndrias. Nesse caso, a cepa aceptora (XPM13)7 tem uma deleção significativa do gene cox2 (alelo cox2-62)1. Após a citação, o DNA mitocondrial do doador e do aceitador se recombina. O gene COX2 é restaurado e o gene de interesse é inserido no local ectópico (295 nt a montante do gene COX2). Abreviaturas: mtDNA = DNA mitocondrial; nt = nucleotídeos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cepa de leveduraGenótipoREF
NAB69Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0)1
NB71Matα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1)1
XPM10bMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m)7
XPM209Matα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)26
XPM199Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61)26
XPM13Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)7
L45Matα, ade1, op1 (rho+, cox1-D369N)28

Tabela 1: Exemplos de cepas de levedura usadas em transformação biolística e citodução.

Meios de crescimentoComponentes
YPD2% de glicose, 2% de bactopeptona, 1% de extrato de levedura
YPR2% de rafinose, 2% de bactopeptona, 1% de extrato de levedura
YPEG*3% de glicerol, 3% de etanol*1, 2% de bactopeptona, 1% de extrato de levedura
Mídia suspensa2% de glicose, 6,8% de base de nitrogênio de levedura com (NH4)2SO4, mistura de aminoácidos drop-out*2
Mídia de bombardeio5% de glicose, 6,8% de base de nitrogênio de levedura com (NH4)2SO4, 1 M sorbitol, mistura de aminoácidos drop-out*2,3.
*1 Adicione etanol após a autoclavagem quando o meio estiver quente.
*2 A quantidade de mistura de aminoácidos pode variar de acordo com os estoques disponíveis ou a quantidade indicada pelo fabricante.
*3 Para os meios de bombardeio, adicione os aminoácidos e as bases nitrogenadas conforme necessário, dependendo da cepa de levedura. Certifique-se de que a composição seja específica para a auxotrofia no plasmídeo de 2μL usado para a seleção.

Tabela 2: Meios de crescimento de levedura usados neste protocolo.

Discussão

O presente trabalho descreveu como transformar mitocôndrias da levedura S. cerevisiae com sucesso. O processo, desde o bombardeio de microprojéteis de alta velocidade até a purificação da cepa de levedura pretendida, leva ~ 8-12 semanas, dependendo de quantas rodadas de purificação da cepa de rho- sintética são necessárias. Algumas das etapas críticas do método são as seguintes. Primeiro, quanto maiores as regiões flanqueadoras adicionadas ao redor do local da mutação na construção do gene mitocondrial, maior a probabilidade de integração bem-sucedida da mutação alvo. O tamanho mínimo das regiões flanqueadoras é de ~100 nt; No entanto, o uso de mais de 500 NT em cada lado da mutação é altamente recomendado. Em segundo lugar, ao selecionar as colônias rho sintéticas após a transformação, recomenda-se que não ocorram mais do que 3-4 rodadas de purificação; caso contrário, há um alto risco de que eventualmente a construção mitocondrial seja perdida, pois não há pressão seletiva para manter o plasmídeo nas mitocôndrias. Terceiro, para evitar prejudicar o usuário ou o equipamento, você deve ler atentamente o manual da máquina de bombardeio antes de iniciar o procedimento. Este equipamento é delicado e utiliza alta pressão e vácuo.

Uma limitação desse procedimento é que, até o momento, apenas leveduras e a alga verde C. reinhardtii são candidatas a transformar mitocôndrias com esse método. Seria relevante se pudéssemos introduzir mutações dirigidas ao local no genoma mitocondrial de outros organismos. Outra limitação é que é desafiador transformar muitas construções diferentes na mesma sessão. Recomenda-se fazer seis transformações para cada construção, cada uma das quais deve ser testada, selecionada e purificada. Isso resulta em mais de 50 placas de meio apenas para obter colônias de rho puras de uma única mutação mitocondrial.

Apesar dessas limitações, a capacidade de manipular o genoma mitocondrial da levedura contribuiu significativamente para a compreensão de muitas vias de biogênese de complexos respiratórios. Essa abordagem pode ser usada para introduzir genes repórteres para monitorar e quantificar a tradução mitocondrial 1,7,36,37, interromper genes mitocondriais 38, identificar chaperonas de montagem de complexos respiratórios39, entender melhor os mecanismos de tradução e montagem mitocondrial acoplada 7,11,12,36e procurar supressores ao seguir a expressão de um gene mitocondrial mutado40. Até agora, embora certas abordagens para manipular o genoma mitocondrial em mamíferos tenham sido relatadas anteriormente41, não existe nenhum método generalizado para transformar o DNA mitocondrial para esses organismos.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Esta publicação foi financiada pelo Programa de Apoio a Projetos de Investigação e Inovação Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 a XP-M]. UPD é um membro do CONAHCYT (CVU:883299). Queremos agradecer à Dra. Ariann Mendoza-Martínez pela ajuda técnica com as imagens do microscópio óptico. Licenças de biorender: DU26OMVLUU (Figura 2); BK26TH9GXH (Figura 3); GD26TH80R5 (Figura 4); PU26THARYD (Figura 7); ML26THAIFG (Figura 9).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ponteiras de pipeta de 1 mLAxygenT-1000-B
1,5 mL MicrotuboAxygenMCT-150-C
10 μ Ponteiras de pipeta LAxygenT-10-C
15 mL tubo inferior cônicoAxygenSCT-25ML-25-S
200 μ Ponteiras de pipeta LAxygenT-200-Y
50 mL fundo cônicoAxygenSCT-50ML-25-S
AfiIINew England BioLabsR0520S
AgaroseSeaKem50004
Balança analíticaOHAUSARA520
AutoclaveTOMYES-315
Ágar BactoBD214010
Bacto peptonaBD211677
Suporte de macroportador biolisíticoBIO-RAD1652322
VWR89038-528
Cloreto de cálcioFisher ScientificC79-500
CSM -ADEFormediumDCS0049
CSM -ARGFormediumDCS0059
CSM -LEUFormediumDCS0099
CSM -URAFormedium
Frasco de vidro de culturaKIMAX KIMBLE25615
Tubo de vidro de culturaPyrex9820
DextroseBD215520
EtanolJT Baker 9000
FórcepsMillipore620006
Contas de vidroSigmaZ265926
Cabo de vidroSigmaS4647
GlicerolJT BAKER2136-01
Tanque de hélio grau 5 (99,99 %)--
HSTaq  KitPCR BIO
MicrocentrifugueEppendorf022620100
NdeINew England BioLabsR0111L
Agitador orbitalNew Brunswick scientificNB-G25
Tubos de PCRAxygenPCR-02-C
PDS-1000 / He TM Sistema de entrega de partículas biolísticasBIO-RAD165-2257
Placas de Petri (100X10)BD252777
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
RafinoseFormediumRAF03
Replica platerde ruptura Z363391Scienceware
1350 PsiBIO-RAD1652330
SorbitolSigmaS7547
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseThermo ScientificEL0011
Rotador de Cultura de TecidosThermo Scientific88882015
Microcarriers de tungstênio M10BIO-RAD1652266
Bomba de vácuo de capacidade de 100L / min-
Almofadas de veludoBel-ArtH37848-0002
Vórtice Scientifc IndustriesSI-0236
Aplicador de madeira em bastãoPROMA1820060
Extrato de leveduraBD212750
Levedura Base de nitrogênio sem aminoácidosBD291920
Bico de Bunsen DCS0169 Discos

Referências

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965(2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359(2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), 4146(2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory manual. 2000 ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. : a. Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. 2015 edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144, Pt 1 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Saccharomyces cerevisiaetradu o mitocondrialbombardeamento biol sticofun o do mitorribossomofosforila o oxidativaedi o do genoma mitocondrialmitoc ndrias de levedura

Artigos relacionados