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Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

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DOI:

10.3791/66857

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22 de novembro de 2024

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1Italian Liver Foundation, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Resumo

Os hepatócitos primários são uma ferramenta comumente usada para estudos in vitro relacionados ao fígado. No entanto, a manutenção dessas células sempre foi um desafio devido à rápida perda de morfologia, viabilidade e funcionalidade em cultura. Uma abordagem recente para a cultura de longo prazo é a geração de organoides tridimensionais (3D), uma ferramenta in vitro que pode recapitular tecidos em um prato com base na maravilhosa capacidade do fígado de se regenerar. Os protocolos publicados foram projetados para obter organoides 3D funcionais de longo prazo de hepatócitos adultos primários (Hep-Orgs). A ferramenta de ponta organoide 3D requer a capacidade de isolar células do tecido adulto, e esta etapa inicial é crucial para um resultado final de alta qualidade. A perfusão de colagenase em duas etapas, introduzida na década de 1970, ainda é um procedimento válido para a obtenção de hepatócitos únicos. O presente artigo tem como objetivo descrever todas as etapas cruciais do procedimento cirúrgico, otimizando assim o procedimento de isolamento de hepatócitos primários no modelo de rato. Além disso, é dada especial atenção às directrizes PREPARE para aumentar a probabilidade de procedimentos bem sucedidos e garantir resultados de elevada qualidade. Um protocolo detalhado permite que os pesquisadores acelerem e otimizem o trabalho a jusante para estabelecer organoides 3D a partir de hepatócitos primários de ratos adultos. Em comparação com os hepatócitos 2D, os Hep-Orgs ainda eram viáveis e em proliferação ativa no Dia 15, demonstrando um potencial de longo prazo.

Introdução

Os hepatócitos primários são uma ferramenta importante e amplamente utilizada para estudos in vitro relacionados ao fígado. No entanto, sua expansão e manutenção têm sido historicamente desafiadoras, pois perdem morfologia e funcionalidade após alguns dias na cultura1. A cultura 2D é uma condição limitante, em particular, para hepatócitos que possuem formato poligonal e estrutura polarizada com membranas apicais e basolaterais diferenciadas. De fato, a adesão dos hepatócitos à placa interfere em sua atividade normal, pois leva a um citoesqueleto plano com interação limitada entre as células e entre as células e a matriz extracelular (MEC), reduzindo a polarização e as vias de sinalização envolvidas2.

Para contornar as limitações desse método, Dunn e colegas3 usaram primeiro a dupla camada de colágeno. Este método de cultura, conhecido como "método de cultura sanduíche", baseia-se na semeadura de hepatócitos primários entre as duas camadas da matriz. Este método tem muitas vantagens, incluindo cultura a longo prazo, manutenção da morfologia poligonal e atividades transcricionais comparáveis às dos hepatócitos recém-isolados4. Um método semelhante, baseado no mesmo princípio, onde a base é composta de Matrigel enquanto a sobreposição de colágeno, evidenciou a presença de uma rede canalicular bem estabelecida5.

Apesar da confiabilidade do método de cultura sanduíche para o crescimento de hepatócitos, o presente trabalho espera estabelecer uma cultura organoide 3D, uma ferramenta in vitro usada para recapitular tecidos em um prato e formar uma ponte potencial para a medicina personalizada, permitindo a geração de insights biológicos específicos de doenças, identificando alvos moleculares, testando drogas, estabelecendo biobancos e abrindo novos horizontes para tecnologias inovadoras como organ-on-chip6. Os hepatócitos primários foram incorporados em gotículas de matriz hemisférica conhecidas como "domos" para permitir um crescimento robusto de organoides no interior das cúpulas e garantir o fluxo dos fatores solúveis, incluindo o fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e o fator de crescimento epidérmico (EGF), do meio de cultura. Esses fatores de crescimento ativam diretamente as vias de sinalização para garantir a sobrevivência dos hepatócitos7. Os organoides hepáticos são geralmente obtidos a partir de células-tronco/progenitoras isoladas de estágios embrionários ou de ratos adultos, camundongos, fígado humano (e também cães e gatos)8. Mesmo que a conformação 3D melhore a diferenciação de células-tronco em hepatócitos adultos, essa ferramenta ainda carece da maturidade do tecido primário original9. Para superar esse problema, em 2018, dois grupos diferentes 9,10 publicaram simultaneamente um protocolo para obter uma cultura de longo prazo de organoides hepáticos 3D a partir de hepatócitos primários de camundongos adultos (referidos como Hep-Orgs). Seus protocolos recapitulam a resposta ao dano proliferativo da regeneração hepática, cultivando hepatócitos com alto nível de citocinas inflamatórias, pois ocorre após a hepatectomia parcial. De fato, os estudos acima demonstram que os hepatócitos podem mudar para um estado ductal após a lesão12 ou quando a proliferação de colangiócitos é suprimida13. Sua capacidade bipotente permite a plasticidade celular, o que é importante para estruturas complexas, como organoides. Portanto, esses protocolos superam o problema da incapacidade de expandir os hepatócitos primários in vitro.

A ferramenta de ponta organoide 3D requer a capacidade de isolar células do tecido adulto, e esta etapa inicial é crucial para um resultado final de alta qualidade. Embora a preparação de organoides 3D possa ser considerada uma técnica recente e em desenvolvimento (porque a definição de organoide foi cunhada por Lancaster14 e Huch15 há apenas dez anos), a perfusão de colagenase em duas etapas é um procedimento antigo introduzido por Seglen na década de 197016. Com foco nas publicações mais recentes da área, os protocolos de Ng17 e Shen18 podem ser considerados o padrão-ouro para a realização do procedimento em ratos, enquanto os de Cabral19 e Charni-Natan20 para camundongos. Não é incomum que os pesquisadores se concentrem na escolha da melhor matriz extracelular (MEC) e fatores de crescimento para desenvolver organoides 3D, mas se deparem com falhas como procedimento cirúrgico inadequado, baixa viabilidade e rendimento dos hepatócitos ou altos níveis de contaminação bacteriana. Esses problemas prolongam os experimentos a jusante e aumentam o número de animais necessários para os experimentos seguintes. Por outro lado, se os procedimentos cirúrgicos e de isolamento forem bem configurados, o elevado número de hepatócitos viáveis obtidos permite o preparo de um grande número de organoides, limitando assim o uso de animais. O presente protocolo aborda principalmente essas questões usando soluções comerciais e otimizando uma canulação precisa da veia porta que garante etapas ideais de perfusão e digestão com o fígado in situ.

A fim de melhorar a qualidade, reprodutibilidade e traduzibilidade de nossa pesquisa com animais, consideramos cuidadosamente as diretrizes PREPARE: Planejamento de Pesquisa e Procedimentos Experimentais em Animais: Recomendações para Excelência21. Essas diretrizes de relatórios tentam aumentar a probabilidade de sucesso por meio do planejamento e representam um passo importante na implementação dos 3Rs de Russel e Burch (substituição, redução e refinamento). As diretrizes do PREPARE cobrem 15 tópicos principais que devem ser abordados de acordo com cada projeto de pesquisa individual. Descreveremos os tópicos em que nos concentramos durante o planejamento e preparação do projeto.

O presente trabalho tem como objetivo descrever, em um protocolo exaustivo, detalhado e conseqüente, as etapas cruciais da cirurgia no modelo de rato para permitir que os pesquisadores acelerem e otimizem o trabalho a jusante. Quando abordamos esses protocolos no início, tivemos problemas de contaminação bacteriana, baixa eficiência da digestão do fígado, baixo rendimento primário de hepatócitos e baixa viabilidade de hepatócitos que podem facilmente afetar o sucesso da técnica. Mostrando como abordar e resolver recursos críticos, este protocolo otimizou o procedimento para isolamento primário de hepatócitos de ratos. A perfusão hepática de ratos e o subsequente isolamento primário de hepatócitos adultos são as principais etapas preliminares para diferentes aplicações. Em particular, este protocolo é adequado para todos os procedimentos que requerem um bom rendimento de hepatócitos adultos de alta qualidade e alta viabilidade. Os resultados do protocolo são apropriados para estabelecer modelos in vitro para estudar a fisiologia e patologia hepática.

Protocolo

Todos os procedimentos e alojamento dos animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Lei Italiana e da diretiva da Comunidade Europeia. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com os Animais local e pelo Ministério da Saúde italiano (licença n° 321/2022-PR) de acordo com o art.31 do decreto 26/2014.

1. Preparação para o procedimento animal

NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter a composição do meio e do buffer e a Tabela de Materiais para obter detalhes comerciais.

  1. Aqueça o banho-maria a 42 °C e, em seguida, coloque o tampão de perfusão e 1x PBS no banho-maria por cerca de 20 min.
    NOTA: Devido à sensibilidade enzimática, o tampão de digestão é aquecido somente quando o procedimento de perfusão for iniciado com sucesso. Durante o procedimento de perfusão, mantenha as soluções em banho-maria.
  2. Coloque o médio completo de William e PBS + 3% P/S no gelo.
  3. Prepare a bomba peristáltica e conecte a tubulação com a garrafa de vidro e a armadilha de bolhas, ambas preenchidas com tampão de perfusão.
  4. Enquanto escorva a bomba, encha a tubulação com tampão de perfusão quente para remover o ar e lavar o etanol residual (baixa velocidade da bomba). Esta etapa também é importante para verificar o funcionamento correto da bomba e possível vazamento do tubo.

2. Preparação para isolamento de hepatócitos

  1. Durante o procedimento animal, exponha os seguintes instrumentos à luz UV: placa de Petri 100 mm, filtro de células 100 μm, raspador tamanho M, pinças grandes, copo para gelo, bandeja para gelo.

3. Procedimento inicial com animais e anestesia

  1. Anestesiar o rato adulto (250-350 g de peso corporal; 10-12 semanas de idade) por injeção intraperitoneal de mistura de anestésicos (concentração final para xilazina: 22,5 mg / kg; para cetamina: 112,5 mg / kg; aprox. volume final: 0,8-1,0 mL).
  2. Monitore a profundidade da anestesia beliscando os dedos dos pés até que o rato não responda mais a estímulos nocivos. Geralmente leva 5 min. A dose de anestésico garante uma anestesia cirúrgica profunda que minimiza o risco de sofrimento ou angústia durante o procedimento
    NOTA: A exsanguinação é o método secundário de eutanásia de ratos usado neste experimento e garante que o animal tenha sido sacrificado de forma eficaz.
  3. Raspe o abdômen e limpe-o com etanol 70% para reduzir a contaminação bacteriana durante a cirurgia.
    NOTA: Esta é uma cirurgia de não sobrevivência, portanto, a assepsia completa não é mantida.
  4. Coloque o rato no meio da bandeja de dissecção e prenda os membros usando agulhas.
  5. Faça uma incisão em forma de U através da pele e do músculo do centro da parte inferior do abdômen até a caixa torácica, prenda a pele e dobre-a até a cabeça, expondo os intestinos.
  6. Mova cuidadosamente o intestino para o lado esquerdo do animal, para fora da cavidade abdominal, e exponha a veia porta hepática e a veia cava.
  7. Com um alicate, passe um fio de algodão sob a veia porta e prepare 2 nós, 1 cm um do outro, que circundam a própria veia.
    NOTA: Um fio preto é mais fácil de visualizar.
  8. Injete 100-150 UI de heparina dissolvida em 1x PBS (volume total de 300 μL) na veia cava para evitar a coagulação do sangue.

4. Canulação e perfusão hepática

  1. Ligue a bomba a uma taxa de baixa velocidade (fluxo inferior a 1 mL/min).
  2. Insira o angiocath 18 G na veia porta ao nível do fio em um ângulo plano em relação à veia.
  3. Remova manualmente a agulha interna para deixar a cânula na veia. O sangue fluirá dentro dele, enchendo o plugue e evitando bolhas de ar presas na etapa seguinte.
  4. Enquanto o tampão de perfusão flui na tubulação, conecte a cânula pressionando o botão C na extremidade de saída usando um conector Luer lock.
  5. Neste ponto, amarre os nós, um ao redor do cateter dentro da veia e outro ao redor do cateter, antes de entrar na veia para estabilizar o tubo na posição correta.
  6. Corte a veia cava para deixar o sangue sair. Certifique-se de que o fígado comece a inchar e clarear rapidamente (segundos) em 2-3 s. Isso confirma que o tampão de perfusão está fluindo corretamente pelo fígado.
    NOTA: Se alguns lobos permanecerem vermelhos, o angiocateter é colocado muito profundamente. Se houver apenas manchas vermelhas, bater levemente no fígado pode ajudar na perfusão nos pontos específicos. Despeje um pouco de 1x PBS sobre o abdômen aberto para ajudar a mover o sangue e verificar se há vazamentos.
  7. Aumente lentamente o fluxo da bomba para 10 mL / min e mantenha-o por pelo menos 10 min para permitir a limpeza do fígado do sangue.
  8. Durante a perfusão, aplique pressão na veia cava com um cotonete por intervalos de 10 s: Certifique-se de que o fígado incha ao clampear e relaxa ao liberar. Repita a pressão periodicamente (5-10 vezes) e verifique se há inchaço e relaxamento do fígado.
    NOTA: Esta etapa serve como um ponto de verificação crucial para validar visivelmente a perfusão. Tem sido essencial para garantir alta vitalidade dos hepatócitos e maximizar o rendimento final. Ao verificar ativamente esse processo, o tampão pode efetivamente atingir todas as partes da vasculatura hepática, o que a limpeza passiva do sangue por si só não alcançaria.

5. Digestão do fígado

  1. Após a perfusão, mude para o tampão de digestão pré-aquecido sem interromper o fluxo e evitando bolhas de ar na tubulação.
    NOTA: Reduzir temporariamente o fluxo pode ajudar a realizar esta passagem. O tampão de digestão inclui vermelho de fenol, o que facilita a visualização da mudança do tampão de perfusão para o tampão de digestão.
  2. Aumente a velocidade da bomba para 20 mL / min e pressione periodicamente com o cotonete para inchaço e relaxamento do fígado.
  3. Após esta etapa (com duração de cerca de 15 minutos), certifique-se de que o fígado fique cada vez mais mole. Neste ponto, a agulha pode ser removida e a bomba para.
  4. Como a cápsula hepática é frágil após a digestão, disseque o fígado com cuidado e cuidado: agarre o tecido conjuntivo central entre os lobos com uma pinça. Corte todas as conexões com outros órgãos e levante o fígado.
  5. Lave o fígado, mergulhando-o na solução pré-resfriada de PBS + 3% P/S por alguns segundos. Em seguida, coloque-o no tubo completo contendo meio pré-resfriado de William.
    NOTA: A exsanguinação e a morte garantem a perfusão através da veia cava. A confirmação da morte do animal vem do pneumotórax induzido no momento em que o fígado é explantado, e o diafragma é totalmente dissecado e, após a inspeção, a respiração e os batimentos cardíacos não são mais funcionais.

6. Purificação de hepatócitos

  1. Sob a capa biológica, transfira o fígado para a placa de Petri 100 mm com os 15 mL de meio completo de William frio sobre uma bandeja cheia de gelo.
  2. Pressione o órgão vigorosamente com o raspador para liberar as células do meio.
    NOTA: Se a fase de digestão for executada corretamente, a liberação celular deve ser fácil e não exigir muita pressão no fígado. Não corte o fígado em pedaços; deixe-o intacto. Manter o fígado submerso no meio melhora a liberação celular.
  3. Recolher as células que contêm o meio e filtrá-las com o filtro de 100 μm, transferindo-as para um tubo cónico estéril. A filtração permite a remoção de tecidos conjuntivos e fragmentos de tecido não digeridos.
  4. Despeje cerca de 15 mL de meio completo de William frio sobre o fígado esmagado na placa de Petri para ajudar a liberar mais células. Repita as etapas 6.2 e 6.3.
  5. Repetir o ponto 6.4 pelo menos uma vez, até que todas as células estejam libertadas. Se necessário, divida o meio em tubos mais cônicos e use vários filtros de 100 μm.
    NOTA: Depois que os hepatócitos são liberados e antes da filtragem, o meio deve parecer opaco devido à presença dos hepatócitos. O fígado restante deve parecer fibroso e será descartado.
  6. Centrifugar o meio filtrado contendo células hepáticas a 50 x g durante 3 min a 4 °C com um travão de baixa velocidade.
    NOTA: Os hepatócitos são mais densos do que outras células do fígado. Devido à baixa força de centrifugação, apenas os hepatócitos estarão no pellet, enquanto outras células permanecerão no sobrenadante.
  7. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Adicione delicadamente cerca de 40 mL de meio completo de William gelado no tubo e pipete lentamente para cima e para baixo 2 a 3 vezes para ressuspender o pellet celular.
    NOTA: O pellet celular deve ser ressuspenso com cuidado para evitar danos às células.
  8. Centrifugue a 50 x g por 3 min a 4 °C.
    NOTA: Para as primeiras tentativas, conte as células viáveis com um ensaio de azul de tripano 1:10 após a segunda centrifugação antes de prosseguir para as próximas etapas. Isso pode evitar o desperdício de mídia e tempo se todas as células estiverem mortas.
  9. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 25 mL de meio completo de William gelado.
  10. Adicione 25 mL de solução de gradiente de densidade a 90% no tubo e misture suavemente.
    NOTA: Uma solução de gradiente de densidade separa os hepatócitos viáveis dos hepatócitos mortos e dos detritos celulares com base em sua densidade.
  11. Centrifugue a 200 x g durante 10 min a 4 °C. Um pellet visível deve ser obtido no fundo do tubo, correspondente aos hepatócitos viáveis, e uma camada clara no topo do gradiente composta por hepatócitos mortos.
    NOTA: Se não houver pellet, tente misturar a solução novamente girando e repita a centrifugação.
  12. Aspire a camada de células mortas do topo do gradiente e deixe 1-2 mL do meio com o pellet.
  13. Ressuspenda o pellet em 30-40 mL do meio completo de William.
    NOTA: Para todo o procedimento, use apenas pipetas sorológicas de 25 mL. Pipetas de diâmetro menor podem reduzir a viabilidade dos hepatócitos. Todas as etapas devem ser realizadas no gelo para manter +4°C.
  14. Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 4°C e, em seguida, aspirar o sobrenadante.

7. Cultura de hepatócitos e coleta de RNA

  1. Adicione uma quantidade apropriada de meio para contagem de células. Conte a viabilidade celular com azul de tripano 1:10.
  2. Cultura de hepatócitos 2D
    1. Células da placa na concentração de 500.000 células/poço de prato de 6 poços em uma placa celular revestida de colágeno com meio completo de William pré-aquecido.
    2. Coloque a cultura de células em uma incubadora umidificada com 95% de ar, 5% de CO2 a 37 °C.
    3. Após 4 h, troque o meio para o novo meio completo de William pré-aquecido.
    4. Mantenha as células na incubadora. Mude o meio diariamente.
    5. Colete hepatócitos primários em um reagente para extração de RNA antes do plaqueamento (dia 0) e nos dias 1 a 3 da cultura.
    6. Extrair o RNA de acordo com o protocolo do fabricante e transcrevê-lo inversamente para cDNA para avaliação de genes marcadores hepáticos por RT-qPCR. A lista de primers é apresentada na Tabela 2.
  3. Para cultura de hepatócitos 3D de longo prazo:
    1. Ressuspenda as células na matriz pura fria na concentração de 1.000-10.000 células em 20 μL.
      NOTA: Tente evitar fazer bolhas de matriz.
    2. Usando pontas de pipeta pré-resfriadas, plaquete gotículas de células contendo matriz em placa de cultura de células pré-aquecida.
    3. Vire a placa de cabeça para baixo e deixe-a na incubadora de cultura de células por 20-30 min.
    4. Aumente o volume e adicione o meio de hepatócitos de longo prazo 3D pré-aquecido e o meio de cultura específico de acordo com o trabalho de Peng22. Mantenha as células na incubadora.
    5. Troque o meio de hepatócitos 3D de longo prazo a cada 2-3 dias.
    6. Pelo menos após 14 dias de cultivo, as Hep-Orgs são separadas da matriz e as Hep-Orgs viáveis são avaliadas pelo ensaio de proliferação de azul de Trypan e EdU e aprovadas de acordo com o trabalho de Peng.

Resultados

Ao final dos procedimentos de montagem (etapa 6.13), obtivemos um rendimento celular de até 1 x 108 células por isolamento do fígado de cerca de 300 g de um rato. A viabilidade celular entre 78% e 97% foi estabelecida pela contagem de azul de tripano.

Como já descrito em estudos anteriores 1,18,19, os hepatócitos primários em cultura perdem sua morfologia, funções específicas do fígado e morrem em poucos dias.

É bem conhecido na literatura23,24 que os hepatócitos adultos primários perdem rapidamente a morfologia cuboidal-hexagonal, tornam-se uma forma "semelhante a fibroblastos" em poucos dias e morrem. A Figura 1 mostra as várias fases: 4 h após o plaqueamento em uma placa revestida de colágeno, os hepatócitos aderem à superfície, espalham-se em uma monocamada típica mostrando uma morfologia cuboidal, as bordas das células são definidas, as junções entre as células são lineares e a superfície das células parece lisa (Figura 1A). No dia 1, os hepatócitos primários adquirem sua forma hexagonal típica e as gotículas lipídicas tornam-se visíveis (Figura 1B). Nos dias 2-3, as gotículas lipídicas aumentam (Figura 1C-1D), enquanto nos dias 4-5, as células acumulam fibras de estresse de actina (Figura 1E-F). Também avaliamos a porcentagem de células viáveis em cultura 2D primária do dia 1 ao dia 5 e comparamos com a viabilidade antes do plaqueamento no dia 0 (Figura 2). É possível observar uma redução drástica da viabilidade já nos primeiros dias de cultivo, chegando a 49,5% (DP 12,7) no Dia 1, que diminui para 45,2% (DP 18,2) no Dia 2 e 33,5% (DP 0,77) no Dia 3. A porcentagem de células viáveis no dia 4 já é de 16,9% (DP 5,4), enquanto no dia 5 chega a 9,1% (DP 0,38). Portanto, é evidente que a perda de morfologia acompanha uma rápida morte celular progressiva de hepatócitos adultos em cultura 2D.

Os hepatócitos isolados, antes do plaqueamento (dia 0), mostraram uma alta expressão de mRNA de genes marcadores hepáticos (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2) avaliados por RT-qPCR (Figura 3). Todos os genes analisados mostram uma diminuição da expressão dependente do tempo de cultura já no dia 1 em cultura. Os níveis de expressão de mRNA destacam a perda funcional e de viabilidade dos hepatócitos primários durante o tempo.

Os hepatócitos isolados foram plaqueados em gotículas de matriz 3D e estruturas celulares organoides 3D foram acompanhadas ao longo do tempo. No dia 1 da cultura, hepatócitos únicos são suspensos nas gotículas da matriz (Figura 4A). A concentração celular é mantida intencionalmente baixa para fornecer aos hepatócitos amplo espaço para crescer. Além disso, isso nos permite acompanhar visualmente o crescimento do organoide. Os hepatócitos primários apresentaram divisão celular nos primeiros dias de cultivo (Figura 4C). Além disso, enquanto no Dia 0, os Hep-Orgs foram medidos em 30 μm, no Dia 2 os Hep-Orgs quase dobraram suas dimensões, sublinhando o crescimento de tamanho que foi mantido até o Dia 15 (33,08 μm no Dia 1; 64,86 μm no Dia 2; 45,06 μm no Dia 5; 55,19 μm no Dia 7; 51,93 μm no Dia 10; 62,90 μm no Fay 15). Em relação à forma de Hep-Orgs, enquanto no Dia 1 eram de forma redonda, atingiram a "forma de cacho de uvas" (típica dos organoides hepáticos) nos dias seguintes.

Os hepatócitos plaqueados em uma matriz 3D permanecem vivos em cultura por semanas, mostrando uma viabilidade de 23% ±10% após 15 dias usando o ensaio de azul de tripano (Figura 4B, primeira linha). Para validar a proliferação de Hep-Orgs de ratos, um teste EdU foi realizado no dia 15 (Figura 4D). No entanto, a coloração de Hoechst mostrou um alto número de células únicas em vez de Hep-Orgs, uma atividade proliferativa de hepatócitos (células verdes) estava presente, mesmo que a incorporação de EdU fosse baixa (9% ± 7%) (Figura 4B, segunda linha).

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Figura 1: Cultura 2D de hepatócitos primários em placas revestidas de colágeno ao longo do tempo. As imagens foram tiradas com ampliação de 20x com (A) microscopia de contraste de fase 4h após o revestimento, (B) Dia 1, (C) Dia 2, (D) Dia 3, (E) Dia 4, (F) Dia 5. Uma barra de escala correspondente a 50 μm é relatada em cada imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Células primárias viáveis em cultura 2D em placas revestidas de colágeno. O gráfico mostra a porcentagem de células viáveis do Dia 1 ao Dia 5, em comparação com as células viáveis plaqueadas no Dia 0, consideradas 100%. Os resultados são relatados como réplicas únicas, média e DP de 3 experimentos diferentes (* valor de p ≤ 0,05; ** valor de p ≤ 0,005). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Expressão de mRNA de marcadores hepáticos medidos por RT-qPCR em hepatócitos primários. Os resultados foram normalizados em β-Actina e/ou GAPDH (genes de manutenção) e são expressos em relação aos hepatócitos primários coletados antes do plaqueamento no dia 0, considerado como 1. Os resultados são relatados como DP ± médio de, pelo menos, 3 experimentos diferentes (**+ valor de p ≤ 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Cultura de hepatócitos 3D em gotículas de matriz ao longo do tempo. (A) Hepatócitos isolados plaqueados em gotículas de matriz para Hep-Orgs de longo prazo: na imagem, as gotículas da matriz são visíveis na superfície do poço (círculo vermelho = uma gota). (B) Porcentagem de células viáveis por azul de tripano e células proliferativas por EdU no dia 15 antes da passagem. A quantificação de células positivas para EdU foi realizada pelo software ImageJ2. Os resultados são relatados em porcentagem como Média±DP de, pelo menos, 3 experimentos diferentes. (C) Imagens de contraste de fase da cultura 3D Hep-Orgs de ratos em diferentes dias de crescimento na cultura 3D: dia 1, 2, 5, 7, 10, 15. Ampliação da imagem 20X. Uma barra de escala correspondente a 50 μm é relatada em cada imagem. (D) Ensaio de incorporação EdU de Hep-Orgs de rato no dia 15. Ampliação da imagem 20X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Buffers e composição de mídia. A tabela relata o nome e os componentes (com sua concentração final) de todos os tampões e os meios celulares usados no protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Lista de primers de ratos. A tabela relata a lista de primers usados para experimentos de RT-qPCR. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Os organoides 3D são uma fronteira para a medicina personalizada e permitem uma cultura de hepatócitos a longo prazo. A qualidade desta técnica inovadora requer um bom rendimento de hepatócitos primários viáveis e perfusão hepática e isolamento de hepatócitos bem executados. Este procedimento antigo ainda é amplamente utilizado; no entanto, compreende diferentes etapas que podem ser desafiadoras. Ao abordar o procedimento, experimentamos problemas críticos, como contaminação bacteriana, baixa eficiência da digestão hepática, baixo rendimento primário de hepatócitos e baixa viabilidade de hepatócitos, os quais podem facilmente afetar o sucesso da técnica. Partindo dos protocolos padrão-ouro 17,18, aqui destacamos como superar problemas comuns, esclarecemos as etapas mais críticas no isolamento primário de hepatócitos de ratos e resumimos as pontas dispersas que podem facilmente afetar o sucesso da técnica no modelo de rato. Embora o procedimento de perfusão hepática seja bastante desafiador e exija experiência precisa do operador, ele garante resultados de alta qualidade em termos de rendimento, integridade, viabilidade e funcionalidade dos hepatócitos primários. Esses recursos são essenciais para os estágios subsequentes.

Durante o planejamento do projeto, levamos em consideração cuidadosamente a lista de verificação das diretrizes PREPARE21. Foi dada especial atenção à literatura anterior, comparando diferentes trabalhos anteriores e entrando em contato com alguns dos autores (lista de verificação das diretrizes PREPARE _topic A1). A ferramenta organoide em si é uma maneira importante de reduzir o número de animais, pois as células podem ser propagadas em cultura por até 7 meses (lista de verificação das diretrizes PREPARE _topic A3). Por meio do diálogo com o pessoal do biotério, selecionamos um técnico experiente que prestou assistência no procedimento e contribuiu para evitar o uso de animais experimentais excedentes (lista de verificação das diretrizes PREPARE _topic B5). Foi obtida uma bomba peristáltica apropriada necessária para conduzir a perfusão hepática (lista de verificação das diretrizes PREPARE _topic B6).

As publicações de Ng17 e Shen18 são as mais recentes que descrevem o procedimento em ratos. As principais questões abordadas pelo presente protocolo, não tratadas pelas anteriores, dizem respeito ao uso de soluções comerciais e à otimização de uma canulação precisa da veia porta que garanta etapas ideais de perfusão e digestão mantendo o fígado in situ. Enquanto os protocolos de Shen18 e Ng17 usaram soluções caseiras, nosso protocolo é baseado em soluções comerciais de perfusão e digestão para reduzir a variabilidade na preparação do tampão. Um excesso de concentração da enzima digest pode ser agressivo para os hepatócitos e afetar sua qualidade e viabilidade celular25. O uso de soluções comerciais é fundamental para melhorar a reprodutibilidade do protocolo, garantindo a padronização. Além disso, o protocolo realizado por Ng17 pode ser desafiador devido à necessidade de remoção do fígado antes da fase de digestão. Nosso protocolo é baseado na perfusão e digestão do fígado sem removê-lo até que ambas as fases tenham sido realizadas, o que simplifica o procedimento. Em termos de rendimento e viabilidade celular, os resultados do nosso protocolo são comparáveis aos trabalhos anteriores.

A limpeza e desinfecção do tubo de perfusão, antes e depois do procedimento, juntamente com a desinfecção da pele antes de iniciar a cirurgia, são muito importantes para limitar a contaminação bacteriana. Além disso, a secagem completa da tubulação após a limpeza com etanol e posterior lavagem com o meio é crucial para aumentar a viabilidade celular. Na verdade, mesmo uma única injeção de etanol injetada no fígado causaria a morte celular durante o procedimento.

A temperatura da solução injetada é importante, mas também a sensibilidade da enzima colagenase à temperatura deve ser considerada. Por esse motivo, pré-aquecemos o tampão de perfusão a 42 °C antes de iniciar o procedimento cirúrgico, enquanto colocamos o tampão de digestão no banho de aquecimento apenas durante a etapa de perfusão. A adição de uma armadilha de bolhas ao tubo a montante do cateter evita que as bolhas escapadas cheguem ao cateter, bem como que o ar entre no fígado quando a solução de perfusão se esgota17.

A composição do tampão, a pressão de perfusão e a taxa de fluxo devem estar dentro da faixa apropriada17. Percebemos que baixa pressão e baixa vazão causam baixo rendimento e influenciam negativamente a viabilidade celular, uma vez que o tampão não consegue atingir os pequenos vasos. Por outro lado, a taxa de fluxo não deve ser muito alta para manter a cápsula de Glisson intacta. Como a integridade da adesão celular requer Ca2+ 18, o tampão de perfusão é uma solução livre de Ca2+ contendo EDTA para atacar as pontes contendo cálcio entre as células, por isso é essencial para remover o cálcio e lavar o sangue do fígado. O tempo de perfusão de 8-15 min com uma taxa de fluxo de 10 mL/min é crucial para permitir que todas as células sejam alcançadas pela solução livre de EDTA, Ca2+. Uma perfusão abaixo do ideal pode levar à redução da digestão.

O tampão de digestão contém Ca2+, uma vez que a colagenase que digere a matriz de colágeno é dependente de Ca2+ . A taxa de fluxo do tampão de digestão deve ser mantida em pelo menos 20 mL / min e o tempo depende da capacidade de colagenase. No caso do tampão de digestão específico que usamos, precisamos perfundir 15 min para um volume final de 300 mL de solução. Se a digestão for incompleta, as junções célula-célula são mantidas e a pressão mecânica sucessiva danificará as células, reduzindo a viabilidade. O aumento lento da taxa de fluxo contribui para a redução do impacto estressante da perfusão nas células. Durante a cirurgia, nos concentramos no pinçamento transitório da veia cava inferior e no subsequente inchaço do fígado: essa passagem melhorou significativamente a eficiência da digestão e a recuperação celular. No final da digestão, o fígado deve parecer marrom claro e macio. À medida que a ressecção hepática é concluída, a lavagem do fígado isolado em PBS +3% P/S reduz o título bacteriano e ajuda a evitar a contaminação na parte seguinte do procedimento.

Para as etapas de isolamento de hepatócitos sob a coifa biológica, o uso de pipetas sorológicas de 25 mL evita a redução da viabilidade dos hepatócitos por pipetas de menor diâmetro. Adicionamos uma etapa opcional para aumentar o rendimento primário de hepatócitos, que é o derramamento do meio completo de William sobre o fígado esmagado para repetir a etapa de raspagem sob o capô. Esta etapa é feita após a filtragem do meio liberado por células do fígado isolado e ajuda a limpar o Petri e recuperar mais células da cápsula do fígado. Se for necessário aplicar alta pressão para mover os hepatócitos através dos filtros, a viabilidade celular será baixa19.

A incapacidade dos hepatócitos de serem cultivados em 2D por mais de 2 dias nos levou a encontrar um modelo alternativo de cultura de longo prazo. Um modelo adequado para a cultura de hepatócitos por mais tempo é o Hep-Org adulto. Em comparação com os hepatócitos 2D, os Hep-Orgs ainda eram viáveis e em proliferação ativa no dia 15, demonstrando um potencial de longo prazo.

A perfusão hepática de ratos e o subsequente isolamento primário de hepatócitos adultos são as principais etapas preliminares para diferentes aplicações. Embora a reprodutibilidade possa ser uma limitação da técnica, uma vez que o procedimento envolve muitas etapas e variáveis, prestar atenção à descrição visual do procedimento ajuda a replicar o método com alta taxa de sucesso. Apontando as etapas críticas e mostrando como abordá-las, este protocolo otimiza o procedimento de isolamento primário de hepatócitos de ratos e resultados adequados para estabelecer modelos in vitro , como a geração Hep-Orgs, a fim de estudar a fisiologia e patologia hepática.

Divulgações

Todos os autores divulgaram todo e qualquer conflito de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Davide Selvestrel e ao prof. Giovanni Sorrentino do SorrentinoLab da Universidade de Trieste por nos ajudar a realizar o ensaio de proliferação de EdU. O trabalho foi apoiado por uma bolsa ad hoc do Banca d'Italia e doações internas do FIF.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
A83-01- ALK5 Inibidor IVTwin Helix  T3031
B27Thermofisher Scientific0080085SA
CFX Connect Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real   Bio-Rad
CHIR99021Twin HelixT2310
Click EdU Alexa 488 kit de imagemThermofisher ScientificC10499
Colágeno, Tipo I, solução de cauda de ratoMerckC3867-1VL
Dexametasona MerckD4902
EGFMerck  E9644
Soro fetal bovino (FBS)EurocloneECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BMEThermofisher ScientificA1413202
Heparina Sódica 25000 UI/5 mlB. Braun Melsungen AGB01AB01
HGFPeprotech  100-39H 
Solução de insulina-transferrina-selênio 100x de L-Glutamina 41400045Thermofisher Scientific
EurocloneECB3000D
Meio de Digestão do Fígado Thermofisher Scientific  17703-034
Meio de Perfusão HepáticaThermofisher Scientific17701038
suplemento N2Thermofisher Scientific17502048
N-acetilcisteínaMerckA9165
NicotinamidaMerck  N-0636
Aminoácidos Não EssenciaisMerckM7145
NormocinAurogeneant-nr-1
PBS buffer 1XPanReac AppliChemA0964,9050
Solução de penicilina-estreptomicina 100xEurocloneECB3001D
PercollSanta Cruzsc-296039A
Bomba peristálticaIsmatec™  Digital Reglo MS-4/12
TNFaPeprotech  300-01A
TRI ReagentMerckT9424
Tubing Ismatec™    ID.2,79mm
Williams' E Medium, sem glutaminaThermofisher Scientific31415029
Y27632Twin HelixT1725
Solução da Bomba

Referências

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