Estabelecemos um ensaio de remontagem de luciferase dividida para monitorar os contatos retículo-mitocôndria endoplasmática em células vivas. Usando este ensaio, descrevemos um protocolo para medir quantitativamente o nível desses acoplamentos inter-organelas em HEK293T células, sob a condição de tratamento químico.
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Artigo de método
Ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos de retículo endoplasmático-mitocôndrias em células vivas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os locais de contato do retículo endoplasmático (ER)-mitocôndrias desempenham um papel crítico na saúde e homeostase celular, como a regulação do Ca2+ e da homeostase lipídica, dinâmica mitocondrial, biogênese de autofagossomos e mitofagossomos e apoptose. A falha em manter o acoplamento mitocondrial ER normal está implicada em muitas doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e paraplegia espástica hereditária. É de considerável importância explorar como a desregulação dos contatos ER-mitocondriais pode levar à morte celular e se reparar esses contatos ao nível normal pode melhorar as condições neurodegenerativas. Assim, ensaios aprimorados que medem o nível desses contatos podem ajudar a esclarecer os mecanismos patogênicos dessas doenças. Em última análise, o estabelecimento de ensaios simples e confiáveis facilitará o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Aqui descrevemos um ensaio de luciferase dividida para medir quantitativamente o nível de contatos ER-mitocôndrias em células vivas. Este ensaio pode ser usado para estudar o papel fisiopatológico desses contatos, bem como para identificar seus moduladores na triagem de alto rendimento.
Introdução
As interações entre o RE e as mitocôndrias são vitais para a homeostase celular e sobrevivência 1,2,3,4. Evidências anteriores indicam que qualquer tipo de interrupção ou desregulação nos locais de contato ER-mitocôndrias pode contribuir para várias doenças neurodegenerativas, metabólicas e cardiovasculares, bem como câncer 5,6,7,8,9,10. Por exemplo, um aumento anormal da captação de Ca2+ nas mitocôndrias pode levar à morte celular pela abertura dos poros de transição de permeabilidade das mitocôndrias, que são comumente vistos em alguns modelos da doença de Alzheimer 5,11. Da mesma forma, a redução dos contatos ER-mitocôndrias pode resultar em diminuição da produção de ATP e comprometimento da ingestão de Ca2+, como visto em modelos de esclerose lateral amiotrófica 5,11,12. À medida que mais estudos estão sendo conduzidos no domínio dos contatos ER-mitocôndrias, proteínas e genes adicionais relacionados à doença que podem afetar esses contatos estão sendo descobertos. Apesar do conhecimento atual e das evidências que mostram o papel dos locais de contato ER-mitocôndrias, ainda é necessário muito trabalho para elucidar como esses contatos podem levar à perda da função celular e, finalmente, à morte celular.
Vários métodos foram desenvolvidos para avaliar a proximidade das duas membranas, a morfologia estrutural e a distância entre os dois locais de contato com as organelas 3,4,13. As abordagens para monitorar o acoplamento ER-mitocôndria incluem imagens baseadas em marcadores de fluorescência14,15, imagens baseadas em repórteres FRET16 e imagens baseadas em sonda de fluorescência dividida17,18, que usam epifluorescência e microscopia confocal. A microscopia de super-resolução e de resolução atômica também são ferramentas poderosas para visualizar com precisão os contatos entre organelas, embora sua utilização na análise do local de contato ainda seja limitada, pois requerem microscópios altamente dedicados e conhecimento técnico19. Além disso, microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e outras técnicas de EM, como tomografia eletrônica (ET) e microscopia crioeletrônica, são comumente usadas, pois fornecem imagens ultraestruturais de alta resolução dos locais de contato, que muitas vezes são impossíveis de explorar usando outras abordagens experimentais 20,21,22 . No entanto, esses métodos baseados em EM são uma técnica de rendimento muito baixo que também pode ser afetada por procedimentos de fixação química. Mais recentemente, métodos baseados em marcação de proximidade têm sido usados para detectar locais de contato, bem como para identificar novas proteínas do local de contato. Por exemplo, o ensaio de ligação de proximidade (PLA) foi usado para quantificar as proximidades de organelas23 , 24 , enquanto uma versão revisada do ensaio de ascorbato peroxidase (APEX) foi utilizada na identificação de novas proteínas do local de contato25 , 26 . É importante reconhecer que todos esses métodos descritos acima têm pontos fortes e limitações intrínsecas na detecção dos contatos entre as organelas. Assim, o emparelhamento de diferentes técnicas é necessário para obter uma interpretação completa dos locais de contato com as organelas.
Anteriormente, estabelecemos o ensaio de remontagem split-Renilla luciferase 8 (ensaio split-Rluc) para monitorar o nível de contatos da membrana ER-mitocôndrias (Figura 1A) 24 , 26 , 27 . Resumidamente, cada metade dividida da luciferase de Renilla é conjugada com uma sequência de direcionamento de ER ou mitocôndria. Quando transfectada em conjunto, cada metade dividida da enzima é expressa no RE ou na membrana mitocondrial. Quando o ER e as mitocôndrias são posicionados próximos um do outro, as metades divididas se juntam e reconstituem toda a enzima com atividade de luciferase. Para a construção split-Rluc, usamos Renilla luciferase 8 (Rluc8) em pBAD/Myc-His27 para o modelo inicial. O sítio de divisão (entre os aminoácidos 91 e 92) foi determinado com base em relatórios anteriores27. Para a metade N-terminal do Rluc8, as sequências de DNA para os aminoácidos 1-91 do Rluc8 foram fundidas à extremidade 3 'da marca FLAG e a sequência de direcionamento mitocondrial AKAP1 de camundongo no vetor pcDNA3.1 TOPO por PCR27. Para a metade C-terminal direcionada ao RE, as sequências de DNA que codificam os aminoácidos 92-311 foram fundidas à extremidade 5 'da etiqueta myc e à sequência de localização UBC6 ER da levedura. Aqui, atualizamos a construção do plasmídeo split-Rluc de modo que as metades divididas da luciferase Renilla sejam expressas em um único vetor (pCAG) sob o mesmo promotor e subsequentemente clivadas em dois fragmentos à medida que T2A, uma sequência de peptídeo 2A autoclivada do vírus Thosea asigna, é inserida entre as duas metades divididas ( Figura 1B ). O mapa e as sequências de DNA do plasmídeo são fornecidos no Arquivo Suplementar 1 e na Figura Suplementar S1. Usando este sistema, medimos os efeitos de três produtos químicos (inibindo GTPases envolvidas na polimerização de actina) nos contatos ER-mitocôndrias. Este ensaio split-Rluc é um sistema de ensaio simples, mas robusto, para triagem de alto rendimento para moduladores de contato entre organelas24.
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Protocolo
1. Manutenção e semeadura celular (Dia 1)
- Manter HEK293T células em meios de cultura de células contendo meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) (em placas de cultura de 100 mm) em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2.
- Antes de começar, verifique a confluência da placa visualizando ao microscópio. Quando as células atingirem aproximadamente 80-90% de confluência, prepare-se para semear as células em uma placa de cultura de 6 poços, removendo o meio e lavando com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS).
- Remova o DPBS da placa de cultura e trate as células com 1 mL de vermelho de fenol tripsina-EDTA a 0,05%. Incubar por 3 min, depois retirar a placa da incubadora e adicionar 9 mL de meio de cultura (DMEM com 10% de FBS) para interromper a reação de tripsina. Pipete lentamente para cima e para baixo para garantir que todas as células ainda presas à placa sejam desalojadas. Transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mL.
- Centrifugue a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente. Remova o meio e ressuspenda os grânulos celulares com 1 mL de meio fresco (DMEM + 10% FBS).
- Conte o número de células usando um hemocitômetro.
- Garanta uma distribuição uniforme das células girando suavemente o tubo. Retire imediatamente 10 μL da suspensão celular e coloque em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Adicione 90 μL de mídia ao mesmo tubo.
- Depois de misturar as células e o meio suavemente, pegue a suspensão celular e aplique 10 μL em cada uma das câmaras do hemocitômetro, pipetando suavemente sob a lamínula.
- Usando uma objetiva de 10x, focalize as linhas de grade do hemocitômetro sob um microscópio. Uma vez focado, conte o número de células em um conjunto de 16 quadrados (4 x 4 quadrados) usando um contador de contagem manual. Repita até que todos os quatro conjuntos de 16 quadrados sejam contados.
- Calcule o número total de células/mL tomando a contagem média de células (de cada um dos 16 quadrados de canto) e multiplicando por 105.
NOTA: Em vez de usar um hemocitômetro para contar células, um contador de células automatizado pode ser usado de acordo com as instruções do fabricante.
- Assim que a contagem de células estiver concluída, prepare-se para plaquear as células em uma placa de 6 poços a 7,5 × 105 células /densidade de poço com 2 mL de meio/poço. Em um tubo de 50 mL, adicione o volume necessário de células junto com 13 mL de meio. Dispense 2 mL da suspensão de células diluídas em cada um dos 6 poços.
- Antes do plaqueamento, calcule o número de células necessárias para 7,5 × 105 células/poço usando C1V1 = C2V2 onde C1 é a contagem inicial de células (número de células/mL), V1 é o volume necessário da suspensão inicial de células, C2 é a densidade de células-alvo desejada (número de células/mL), e V2 é o volume final necessário para a semeadura celular.
- Após a distribuição, bata suavemente na placa em todos os lados para espalhar as células e, em seguida, coloque-a em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2 durante a noite.
2. Transfecção celular mediada por polietilenoimina (PEI) e semeadura celular pós-transfecção (Dia 2)
- Remova a placa de 6 poços da incubadora e aspire os meios de cultura existentes de cada poço. Adicione 2 mL de meio fresco por poço.
- Transfecte as células com DNA de plasmídeo split-Rluc (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry) dissolvido em tampão TE (pH 8,0).
- Para cada poço, misture o DNA (750 ng) e PEI (proporção de DNA / PEI = 1: 3) em 200 μL de DMEM em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Rapidamente vórtice o DNA / PEI no nível 8 por aproximadamente 2 s para garantir que eles se misturem bem para formar complexos. Depois disso, gire-o brevemente em uma mini centrífuga (<3 s).
- Deixe a mistura de DNA / PEI incubar em temperatura ambiente por 15 min e, em seguida, adicione a mistura (soltando-a) à superfície do meio de cultura na placa de 6 poços contendo células. Bata suavemente na placa (para distribuir uniformemente a mistura) e incube-a em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2 por 6 h.
- Durante a incubação, prepare uma placa de 96 poços revestida com Poli-D-Lisina (PDL) adicionando primeiro 70 μL de PDL (50 μg/mL em DPBS) a cada poço e incubando em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2 por pelo menos 1 h. Remova a solução de PDL e lave cada poço 2x com 100 μL de DPBS. No final da segunda lavagem, certifique-se de que todos os DPBS restantes sejam removidos.
- Às 6 h após a transfecção, prepare-se para semear as células transfectadas em uma placa de 96 poços revestida com PDL.
- Retire a placa de 6 poços contendo células transfectadas da incubadora, aspire o meio e lave cada poço com 2 mL de DPBS. Depois de remover o DPBS, adicione 350 μL de vermelho de fenol tripsina-EDTA a 0,05% e incube por 1-2 min. Para interromper a reação da tripsina, adicione 1,7 mL de meio a cada poço.
- Depois de transferir as células junto com o meio para um tubo de 50 mL, gire o tubo a 300 × g por 5 min em uma centrífuga de mesa. Aspire o meio e ressuspenda o pellet celular com 1 mL de meio fresco. Conte o número de células usando um hemocitômetro (conforme descrito na etapa 1.5).
- Semeie as células em uma placa de 96 poços revestida com PDL a uma densidade de 4 × 104 células/poço em 100 μL de meio de cultura. Para isso, em um tubo de 50 mL, adicione o volume necessário de células (veja abaixo para cálculo) junto com o volume apropriado de meio (volume total de 12 mL). Usando uma pipeta multicanal, dispense 100 μL da suspensão de células diluídas em cada um dos 96 poços. Incubar as células durante 18 h numa incubadora humidificada a 37 °C com 5% de CO2.
- Calcule o número de células necessárias para 4 × 104 células/poço usando C1V1 = C2V2 onde C1 é a contagem inicial de células (número de células/mL), V1 é o volume necessário da suspensão inicial de células, C2 é a densidade de células-alvo desejada (número de células/mL) e V2 é o volume final necessário para a semeadura de células.
3. Tratamento químico e ensaio de luciferase em células vivas (Dia 3)
- Em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, prepare as três soluções frescas de 50 μM de rosina (50 mM de estoque em DMSO), 25 μM de Ehop-016 (25 mM de estoque em DMSO) e 50 μM de ZCL278 (50 mM de estoque em DMSO) diluindo cada solução estoque (50 mM de Rhosina, 25 mM de Ehop-016 e 50 mL de ZCL278; todos em DMSO) 1:1.000 na quantidade necessária (50 μL/poço × número de poços) de meios de cultura. Para cada solução, adicione substrato de células vivas (estoque de 50 mM em DMSO) para Renilla luciferase diluída 1:2.000 até uma concentração final de 25 μM. Para fazer soluções de ZCL278 de 0,5, 5 e 50 μM, execute diluições seriais usando o ZCL278 inicial de 50 μM em meios de cultura.
NOTA: Se o tempo de incubação química for desejado por menos de 1-1,5 h, as células podem ser pré-incubadas com substrato de células vivas (para Renilla luciferase) por 1-1,5 h antes de serem tratadas com cada produto químico. Adicionamos produtos químicos e substrato de células vivas simultaneamente para otimizar o protocolo para triagem de medicamentos de alto rendimento. - Remova o meio de cada poço da placa de 96 poços contendo células transfectadas e adicione 50 μL de mistura de meios químicos e substratos a cada poço.
- Depois de incubar as células por 1 h, 2 h ou 5 h, retire a placa de cultura da incubadora, carregue-a no leitor de placas de luminescência e meça a luminescência.
- Antes de começar, certifique-se de que o leitor de placas esteja ligado. Acesse o software leitor de microplacas e crie um novo file clicando em Nova sessão. Defina a temperatura do leitor de placas para 37 °C clicando em Incubadora, marcando a opção de temperatura e digitando 37 °C. Em Layout da placa, escolha a opção Desconhecido e especifique os poços a serem medidos clicando e arrastando.
- Em Protocolo, clique em Luminescência e mantenha as configurações padrão. Quando terminar a configuração, carregue a placa com a tampa no leitor de placas e escolha Run Plate In. Clique em Iniciar e a janela de salvamento do arquivo aparecerá. Salve o arquivo em sua área de trabalho renomeando-o e clicando em Salvar.
NOTA: A luminescência continuará a ser produzida por >24 h após a adição do substrato da célula viva.
- Quando a leitura estiver concluída, remova a placa do leitor de placas e clique em Run Plate In para colocar o leitor de volta. Depois de concluído, coloque a placa de volta na incubadora umidificada (37 °C, 5% CO2) até a próxima leitura.
- Quando terminar, transfira os dados de luminescência para um programa gráfico para plotar a unidade de luminescência relativa (RLU) (eixo y) para cada variável (por exemplo, produtos químicos ou concentrações) (eixo x) e analise os dados.
4. Validação do ensaio split-Rluc com outros métodos.
- Realize outros ensaios, como ensaio de ligação de proximidade (PLA), microscopia eletrônica de transmissão e monitoramento da captação de cálcio mitocondrial para validar os resultados obtidos do ensaio split-Rluc, conforme descrito anteriormente24.
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Resultados
Usamos o protocolo descrito acima para medir o nível de contatos ER-mitocôndrias após a adição de três compostos conhecidos por inibir GTPases específicas. CDC42, RHO e RAC são GTPases que promovem a polimerização da actina28 quando ativadas e são inibidas por ZCL278, Rhosin e Ehop-016, respectivamente24. HEK293T células transfectadas com split-Rluc foram tratadas com DMSO (controle), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) ou Ehop-016 (25 μM) e incubadas por 1 h, 2 h e 5 h...
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Discussão
Usamos um ensaio de remontagem split-Renilla luciferase 8 (ensaio split-Rluc) para quantificar o nível de acoplamentos ER-mitocôndrias. Neste estudo, modificamos a construção original split-Rluc24 gerando um único vetor, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, codificando cada componente split-Rluc (MitoRlucN e RlucCER) e uma sequência de peptídeo...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e Derrame (NINDS, R01NS113516).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de Microcentrífuga SafeSeal de 1,7 mL | Sorenson | 16070 | |
| TC Tratado | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Pontas de Pipeta de 10 mL OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
| 10 μ Ponteiras de pipeta L OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
| 20-200 μ L Pontas chanfradas OneTip | USA Scientific | 1111-1210 | |
| 50 mL Polipropileno Tubo Cônico | Falcon | 352070 | |
| Racks de Microtubos de 96 Poços | ThermoFisher Scientific | 8770-11 | |
| Placa de 96 poços TC Treated | USA Scientific | CC7682-7596 | |
| 100 mm x 20 mm TC Prato Tratado | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 1250 μ Centrífuga L Tips OneTip | USA Scientific | 1112-1720 | |
| 5910 Ri - Centrífuga Refrigerada | Eppendorf | 5943000131 | |
| Dimetil sulfóxido, anidro, ≥ 99,9% | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| DMEM, glicose alta | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DPBS, sem cálcio, sem magnésio | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| EHop 016 | Bio-Techne Tocris | 6248 | Dissolver em DMSO; armazenar a -70 ° C |
| EnduRen Substrato de Célula Viva | Promega | E6481 | Armazene alíquotas a -70 ° C |
| Eppendorf 2-20 μ Pipeta L | Eppendorf | 3123000039 | |
| Eppendorf Research plus 100-1000 μ Pipeta L | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus 1-10 µ Pipeta L | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus 12 canais | Eppendorf | 3125000028 | |
| Eppendorf Research plus 200 μ Pipeta L | Eppendorf | ||
| Soro Fetal Bovino, regiões qualificadas, aprovadas pelo USDA | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubadora, 184 L, Aço Inoxidável Polido | ThermoFisher Scientific | 381 | |
| Contador de contagem manual | Sigma-Aldrich | HS6594 | |
| HEK 293T Células | ATCC | CRL-3216 | |
| Hemacitômetro - Neubauer Bright Line, Câmara de Contagem Dupla | LW Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
| Invitrogen TE Buffer | ThermoFisher Scientific | 8019005 | |
| Microscópio | Zeiss | Axiovert 25 CFL | |
| Mini centrífuga | Benchmark Scientific | C1012 | |
| Multi Tube Rack para tubos cônicos de 50 ml, cônicos de 15 ml e microcentrífugas | Boekel Scientific | 120008 | |
| PEI MAX - Cloridrato de polietilenomina linear de grau de transfecção (MW 40.000) | Polysciences | 24765-100MG | |
| Pipet-Aid XP | USA Scientific | 4440-0101 | |
| Hidrobrometo de poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Cloridrato de rhosina | Bio-Techne Tocris | 5003 | Dissolver em DMSO; armazenar a -70 ° C |
| Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Varioskan LUX leitor de microplacas multimodo | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | |
| Vortex | ThermoFisher Scientific | 2215365 | nível 8 |
| Sistema de aspiração a vácuo VWR | VWR | 75870-734 | |
| ZCL 278 | Bio-Techne Tocris | 4794 | Dissolva em DMSO; armazene a -70 ° O |
Referências
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Reimpressões e permissões
