Artigo de método

Medidas de eletroencefalografia em saguis acordados ouvindo vocalizações coespecíficas

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DOI:

10.3791/66869

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26 de julho de 2024

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1Hakubi Center, Kyoto University, 2Center for the Evolutionary Origins of Human Behavior, Kyoto University, 3Center for Integrated Human Brain Science, Brain Research Institute, University of Niigata

Neste artigo

Resumo

Para estudar a evolução da linguagem, é importante comparar os mecanismos cerebrais em humanos com os de primatas não humanos. Desenvolvemos um método para medir de forma não invasiva o eletroencefalografia (EEG) de animais acordados. Isso nos permite comparar diretamente os dados de EEG entre humanos e animais a longo prazo sem prejudicá-los.

Resumo

A comunicação vocal desempenha um papel crucial nas interações sociais dos primatas, particularmente na sobrevivência e na organização social. Os humanos desenvolveram uma estratégia de comunicação vocal única e avançada na forma de linguagem. Para estudar a evolução da linguagem humana, é necessário investigar os mecanismos neurais subjacentes ao processamento vocal em humanos, bem como entender como os mecanismos cerebrais evoluíram, comparando-os com os de primatas não humanos. Aqui, desenvolvemos um método para medir de forma não invasiva o eletroencefalografia (EEG) de primatas não humanos acordados. Esse método de registro permite estudos de longo prazo sem prejudicar os animais e, mais importante, nos permite comparar diretamente os dados de EEG de primatas não humanos com os dados humanos, fornecendo informações sobre a evolução da linguagem humana. No presente estudo, usamos o método de gravação de EEG do couro cabeludo para investigar a atividade cerebral em resposta a vocalizações específicas da espécie em saguis. Este estudo fornece novos insights usando o EEG do couro cabeludo para capturar representações neurais generalizadas em saguis durante a percepção vocal, preenchendo lacunas no conhecimento existente.

Introdução

Os primatas usam vocalizações específicas da espécie para transmitir informações biologicamente importantes, como o estado emocional do chamador ou a intenção de manter laços sociais, a presença de predadores ou outras situações perigosas. A investigação dos mecanismos neurais subjacentes à percepção da vocalização em primatas não humanos ricos em vocais pode nos fornecer pistas críticas para entender melhor as origens evolutivas da linguagem humana.

Os saguis-comuns são pequenos primatas nativos da América do Sul. Nos últimos anos, os saguis têm sido cada vez mais utilizados como animais modelo, ao lado dos macacos, devido à sua alta reprodutividade, facilidade de uso devido ao seu pequeno tamanho e desenvolvimento de técnicas transgênicas úteis 1,2,3. Além de sua utilidade como modelos de doenças, a rica comunicação vocal dentro dos grupos é outra característica única dessa espécie 4,5,6,7. Os saguis rotineiramente trocam sinais vocais para se comunicar com coespecíficos invisíveis na floresta. Ao examinar a atividade cerebral envolvida na percepção e produção vocal em saguis, podemos determinar como eles processam as informações auditivas próprias ou de chamadas coespecíficas no cérebro e identificar quais circuitos neurais estão envolvidos. Estudos anteriores demonstraram atividade neural no córtex auditivo primário8,9,10,11,12 e no córtex frontal13,14 envolvidos na produção vocal em saguis. Além disso, essas respostas neuronais excitadas e suprimidas foram moduladas por interações auditivo-vocais no córtex auditivo primário 8,10. Esses estudos forneceram dados detalhados de atividade neural no nível de um único neurônio usando métodos de registro invasivos. Numerosos estudos examinaram ainda mais a atividade neural envolvida na produção vocal do sagui; no entanto, a percepção vocal permanece pouco compreendida15,16.

Vários estudos não invasivos de imagem cerebral elucidaram os mecanismos neurais do processamento vocal em saguis 17,18,19; Sua alta resolução espacial é uma vantagem, no entanto, manter os animais acordados durante a varredura requer técnicas avançadas. No entanto, mais recentemente, Jafari et al. identificaram regiões frontotemporais envolvidas na percepção vocal em saguis acordados por meio de ressonância magnética funcional (fMRI)19. Quase todos os experimentos para elucidar as funções cerebrais envolvidas na percepção e produção vocal em humanos foram conduzidos usando métodos não invasivos, como eletroencefalografia do couro cabeludo (EEG), magnetoencefalografia (MEG)20,21 e fMRI22,23,24. Numerosos estudos em humanos investigaram a atividade cerebral relacionada à percepção vocal usando EEG. A maioria desses estudos tem se concentrado na informação emocional 25,26,27 e na saliência das palavras emocionais 28, com os resultados revelando mudanças nos potenciais relacionados a eventos durante a percepção vocal29. A eletrocorticografia (ECoG) e os registros de neurônios únicos usando eletrodos implantados intracranialmente em humanos foram conduzidos apenas em um número limitado de experimentos em pacientes submetidos a tratamento neurocirúrgico30,31.

Uma perspectiva evolutiva comparando humanos com macacos é importante para entender os mecanismos neurais únicos subjacentes à percepção e produção vocal que se desenvolveram em humanos. Para comparar diretamente os mecanismos neurais envolvidos na percepção da fala e vocalização em primatas não humanos ricos em vocais, como o sagui, com humanos, é importante comparar os dados entre as duas espécies usando o mesmo método. A ressonância magnética funcional permite imagens de todo o cérebro e tem uma alta resolução espacial. Tem a vantagem de registrar a atividade perpendicular ao crânio ou em regiões profundas que são difíceis de registrar com EEG ou MEG. No entanto, a máquina de ressonância magnética é cara de instalar e manter, e há muitas restrições nos estímulos que podem ser apresentados devido à natureza do dispositivo. Em comparação, EEG, potenciais relacionados a eventos (ERPs) e MEG têm alta resolução temporal, tornando-os úteis para analisar o processamento vocal de séries temporais. Em particular, o EEG tem as vantagens de alta mobilidade e a capacidade de ser usado em uma variedade de ambientes experimentais, custo relativamente baixo e a necessidade de apenas um único operador.

Uma vez que uma grande quantidade de dados de EEG já foi obtida em humanos, métodos de medição de EEG usando paradigmas não invasivos são necessários para primatas não humanos. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um método único de gravação de EEG não invasivo usando tubos32 para macacos e saguis. Aqui, relatamos vários novos achados sobre o processamento auditivo em primatas não humanos 33,34,35,36,37. Para caracterizar a atividade cerebral em resposta a vocalizações específicas da espécie em saguis, construímos um sistema experimental para registrar de forma não invasiva a atividade cerebral usando eletrodos colocados no couro cabeludo. Neste estudo, descrevemos o método de medição de EEG para saguis.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Experimentação Animal do EHUB (nº 2022-003, 2023-104) e conduzidos de acordo com o Guia de Cuidados e Uso de Primatas de Laboratório publicado pelo EHUB. Nove saguis comuns (Callithrix jacchus, seis machos e três fêmeas, de 2 a 12 anos, pesando 330-490 g) foram utilizados para o experimento.

1. Animais

  1. Alojar os saguis em gaiolas individuais equipadas com caixas-ninho, poleiros de madeira e outros dispositivos de enriquecimento.
  2. Manter as divisões em ciclo claro-escuro de 12 h, com temperatura e humidade mantidas a 28 ± 2 °C e 40 ± 20%, respetivamente.
  3. Alimente os animais com 14 g de pellets de macaco do Novo Mundo duas vezes ao dia, complementados com alimentos como goma arábica e larvas de farinha. Forneça água ad libitum.
  4. Realize todos os experimentos em uma caixa com atenuação de som em uma sala experimental.

2. Equipamento (Figura 1B e Tabela de Materiais)

  1. Use eletrodos de prata de 4 mm. O revestimento AgCl na superfície do eletrodo evita a polarização e garante uma gravação estável.
  2. Use um amplificador para gravar os sinais de EEG. Filtro passa-banda (0,016-250 Hz) e amostra dos dados a 1.000 Hz.
  3. Conecte uma caixa de entrada de eletrodo de 64 canais ao amplificador, colocando-o na frente do assunto.
  4. Coloque o alto-falante a 30 cm da cabeça do sagui e controle o nível de som em 65-75 dB, conforme medido na posição do ouvido. Forneça os estímulos auditivos por meio deste alto-falante.
  5. Coloque a câmera na frente do sujeito para monitorar sua condição durante a gravação do EEG.
  6. A cadeira primata é construída com placas de acrílico e postes de resina sintética. Para os experimentos, peça ao pesquisador que segure os animais enquanto eles se sentam na plataforma; Neste ponto, insira um colar e prenda-o ao painel do pescoço e insira e prenda o Certifique-se de que todo o corpo de cada sagui esteja frouxamente preso.

3. Anestesia

  1. Anestesiar os animais com uma injeção intramuscular de alfaxalona (6-8 mg/kg) e atropina (0,05 mg/kg). Este protocolo permite que a anestesia seja mantida por aproximadamente 20 min. Administre doses adicionais de alfaxalona para prolongar a duração da anestesia se o procedimento for mais longo. Administre também agentes antieméticos (Maropitant 1 mg / kg, injeção subcutânea) antes para combater a náusea, que é um efeito colateral da alfaxalona.
    NOTA: Os saguis devem estar sob injeção ou anestesia inalatória durante os procedimentos e devem se recuperar imediatamente após o barbear do cabelo.
  2. Monitore os sinais vitais com um oxímetro de pulso e administre uma mistura de oxigênio-ar (Ø2 0,5 L/min, ar 0,5 L/min) se necessário.
  3. Mantenha a temperatura ambiente acima de 27 °C e enrole um pano de aquecimento ao redor do corpo do sagui para evitar hipotermia.

4. Depilação

  1. Raspe toda a cabeça (inclusive atrás da auricularia) com um barbeador elétrico.
  2. Aplique creme depilatório para peles sensíveis. Limpe o creme com uma gaze úmida após 5 min.

5. Preparação da máscara

  1. Processe uma máscara termoplástica com antecedência para caber no tamanho da cadeira de macaco. Especificamente, perfure a parte das costas que se projeta do comprimento vertical da cadeira com quatro orifícios para parafusos, de modo que possa ser fixada na placa do pescoço da cadeira.
    NOTA: As máscaras termoplásticas são seguras e podem ser usadas para imobilizar a cabeça durante a radioterapia em pacientes. Usamos uma pequena máscara projetada para crianças e a cortamos para caber no tamanho dos saguis. Esta máscara amolece quando colocada em água morna a 75 °C e endurece à medida que a temperatura diminui quando é removida da água.
  2. Para os experimentos, coloque os animais em uma cadeira de primata. Apoie o animal anestesiado usando placas de pescoço e cintura e prenda o animal e essas placas na cadeira.
  3. Aqueça a máscara em água quente e molde-a para caber na cabeça do sagui. Depois de retirar a máscara da água morna, espere que a temperatura caia (aproximadamente na faixa de 50 °C) para evitar queimaduras e, em seguida, coloque-a na cabeça do sujeito para moldar a máscara.
  4. Após o resfriamento e endurecimento, retire a máscara do animal e corte a parte superior da cabeça e as partes da orelha da máscara para expor a área para a fixação do eletrodo.
    NOTA: Uma vez que esta máscara foi feita, ela pode ser usada em outras pessoas.

6. Adaptação da cadeira e da máscara (30 min/dia durante 3 dias)

  1. Habitue o animal à cadeira em condições de vigília, colocando-o em uma cadeira e recompensando-o por aproximadamente 30 minutos. Repita este procedimento por 3 dias.
  2. Habituar o animal à fixação da cabeça com a máscara durante 2 dias.
    NOTA: Este processo de adaptação foi personalizado para a condição do indivíduo. Após a adaptação, os animais podem resistir temporariamente durante a captura e a colocação da máscara de cabeça, mas uma vez que estão sentados na cadeira e sua cabeça está fixa, eles ficam calmos.
  3. Durante a adaptação da cadeira, avaliar os seguintes parâmetros comportamentais: i) emissão de ruídos ansiosos ou alarmantes, ii) rejeição da recompensa oferecida e iii) movimentos violentos. Se algum desses comportamentos for observado, encerre a sessão daquele dia, permitindo que o sagui se adapte gradualmente ao ambiente experimental.

7. Gravação de EEG (2 h/dia)

  1. Preparação do assunto
    1. Prenda uma gaiola de transferência a uma pequena janela da gaiola doméstica e mova o sagui da gaiola doméstica para a gaiola de transferência, geralmente sozinho. Cubra a gaiola de transporte com um pano e transfira-a para a sala experimental.
    2. Fixação da cabeça
      1. Capture o sagui usando luvas de proteção e coloque-o na cadeira especial.
      2. Coloque a máscara preparada na cabeça do sagui. Passe o corpo do parafuso preso à cadeira pelo orifício da máscara e fixe-o com parafusos de aperto manual.
      3. Prenda a cabeça e a máscara levemente com uma faixa logo abaixo do násio.
        NOTA: A cabeça do sujeito não precisava ser completamente fixada, desde que os eletrodos não fossem removidos pelo movimento. Portanto, usamos a mesma máscara em todos os sujeitos.
    3. Definição da localização dos eletrodos
      1. Use o násio, o íon e os lóbulos das orelhas como marcos anatômicos para determinar a localização dos eletrodos de acordo com o método Internacional 10-20 32,33,34,35,36,37. Meça a distância entre o násio e o íon na linha média com uma fita métrica. Defina a localização de Cz no meio da distância. Posicione os outros eletrodos (Fz, Pz, Oz, F3 ou F4) com 20% do comprimento do ion-neion como espaçamento do eletrodo. Marque as posições dos eletrodos no couro cabeludo usando um dermatograma à base de óleo.
    4. Preparação da pele
      1. Esfregue a área marcada com um cotonete fino embebido em álcool isopropílico para remover a sujeira e o sebo do couro cabeludo.
  2. Configurações do eletrodo
    NOTA: Execute as etapas 7.2.1-7.2.3 em todas as posições dos eletrodos para colocar os eletrodos em Fz, Cz, C3, C4, Pz, A1, A2 e F3 (ou F4).
    1. Usando um cortador de tubo, corte um pedaço de tubo de silicone com um diâmetro interno de 4 mm e um diâmetro externo de 7 mm em um comprimento de aproximadamente 20 mm.
    2. Aplique adesivo nas bordas do tubo cortado e cole-o no couro cabeludo.
    3. Encha o interior do tubo com gel de EEG usando uma seringa e uma agulha de seringa não pontiaguda.
    4. Conecte o eletrodo de referência a Pz e os eletrodos de aterramento a F3 ou F4 (Figura 1C).
    5. Insira os eletrodos no tubo e conecte o cabo do eletrodo à caixa de entrada.
    6. Inicie o aplicativo para gravações de EEG para medir a impedância do eletrodo e ajuste os parâmetros para garantir que todos os eletrodos estejam abaixo de 5 kΩ.
    7. Agrupe os cabos do eletrodo para reduzir o ruído.
  3. Dê recompensas durante o procedimento de imobilização da cabeça e entre as sessões de tarefas, administrando manualmente 1-3 mL da recompensa líquida (goma ou nutrição) usando uma seringa.
  4. Especifique o arquivo a ser salvo no software de gravação EEG e pressione o botão Iniciar gravação . Execute o script para apresentação do estímulo imediatamente após o início da gravação do EEG. Pressione o botão de parada na gravação do EEG quando a execução do script de apresentação do estímulo estiver concluída para encerrar todas as gravações. Quando a gravação estiver concluída, remova os eletrodos e a máscara de cabeça.
  5. Capture os animais e devolva-os às gaiolas de transporte. Deixe as trompas no couro cabeludo; Todos os tubos caíram naturalmente em aproximadamente 1 dia.
    NOTA: Nos períodos iniciais, usamos acetona para dissolver a cola adesiva e remover o tubo após as sessões de gravação; no entanto, houve casos de lesão cutânea; portanto, posteriormente devolvemos os animais às gaiolas de suas casas sem remover o tubo. Nas dezenas de experimentos que realizamos até agora, os saguis não demonstraram interesse nos tubos removidos e nenhuma ingestão acidental ocorreu.
  6. Estímulo
    1. Grave chamadas naturais simples e compostas na sala cativa ou experimental de saguis que não são usados em gravações de EEG subsequentes. Extraia três chamadas simples e compostas específicas da espécie (chamadas Phee, Tsik-Ek e Tsik-String5 ) dos arquivos gravados.
    2. Além dos estímulos de chamada, crie ruído branco usando uma função no software de programação e use-o como estímulo.
    3. Para seguir este protocolo, use três arquivos auditivos (16 bits, 48 kHz) de chamadas de saguis no experimento. Controle a tarefa usando um script personalizado.
      NOTA: Cada bloco contém 50 chamadas para cada estímulo, para um total de 200 chamadas. Cada bloco de gravação durará aproximadamente 10 min. Cada participante deve realizar dois blocos. O intervalo entre chamadas é de 3 s. Dos quatro arquivos de estímulo de áudio (ver Arquivo Suplementar 1), o estímulo de chamada Phee tinha aproximadamente 2 s de comprimento, enquanto os outros três tinham aproximadamente 1 s de comprimento. Isso ocorreu porque uma única chamada Phee ainda é uma chamada de longa duração (Figura 1D).
    4. Em cada arquivo de estímulo sonoro, o canal direito contém os dados de chamada ou ruído do sagui e o canal esquerdo contém o sinal de disparo para o início do estímulo. Envie este sinal de disparo para o sistema de gravação de EEG por meio de um dispositivo de sincronização e registre-o como hora do evento.

8. Análise dos dados

NOTA: O código original escrito no software de programação e na caixa de ferramentas foi usado para pós-processar os dados do EEG, conforme descrito abaixo (Arquivo Suplementar 2)37.

  1. Pré-processamento
    1. Refaça referência à referência de orelha vinculada.
    2. Filtro passa-alta a 2 Hz.
    3. Época de 100 ms antes a 1000 ms após o início do estímulo.
    4. Linha de base correta para a média do período pré-estímulo de 100 ms. Rejeite artefatos usando um critério de ±150 μV.
  2. Plotagem do potencial relacionado a eventos (ERP)
    1. Calcule a média de todos os dados do estudo para cada sujeito.
    2. Obtenha formas de onda médias de grupo calculando a média de todos os assuntos.
    3. Para comparar os ERPs médios entre tipos de chamada e estímulos de ruído, aplique uma análise de variância unidirecional (ANOVA) com estímulos como o fator entre os sujeitos na resposta Cz.
    4. Aplicar análise de comparação múltipla post hoc com o método de Tukey.
  3. Plotagem de perturbação espectral relacionada a eventos (ERSP)
    1. Calcule o ERSP para visualizar a mudança média relacionada ao evento na potência espectral ao longo do tempo em uma ampla faixa de frequência usando a Equação (1). Fk (f,t) é a estimativa espectral do ensaio k na frequência f e no tempo t:
      figure-protocol-1Características (1)
    2. Aplicar a decomposição tempo-frequência às atividades utilizando transformadas wavelet senoidais, com três ciclos de duração na frequência mais baixa (10 Hz), aumentando linearmente com frequência até 32 ciclos na frequência mais alta (120 Hz).
    3. Defina as respostas iniciais e transitórias em um período de 150 ms após o início do estímulo em 2-30 Hz, e as respostas sustentadas em um período de 800 ms de 151 a 950 ms após o início do estímulo em 40-100 H.
    4. Para testar as diferenças nas respostas iniciais e sustentadas em Fz e Cz entre as idades dos sujeitos e os tipos de chamada, realize uma ANOVA bidirecional usando o tipo de chamada como o fator dentro do sujeito e as idades como o fator entre os sujeitos.

Resultados

Primeiramente, plotamos os potenciais médios relacionados a eventos (ERPs) para cada estímulo auditivo nos saguis (Figura 2). O potencial evocado auditivo (PEA) foi proeminente na condição Ruído , refletindo o início claro dos estímulos (ver Figura 1D). Para comparar os ERPs médios entre tipos de chamada e estímulos de ruído, aplicamos uma análise de variância unidirecional (ANOVA) com estímulos como o fator entre os sujeitos na resposta Cz. Encontramos um efeito principal significativo dos estímulos na atividade de Cz em 13-18 ms, 28-36 ms e 45-88 ms após o início do estímulo, respectivamente (p < 0,05). A análise de comparação múltipla post hoc com o método de Tukey mostrou que a diferença foi entre o ruído e outros chamados (p < 0,05), mas não houve diferença entre os tipos de chamados dos saguis. O resultado sugere que as diferenças na atividade cerebral por tipo de chamada não puderam ser observadas apenas a partir dos potenciais relacionados ao evento.

Em seguida, foi realizada uma análise de tempo-frequência para cada sujeito. A Figura 3 mostra um exemplo dos mapas de tempo-frequência para o chamado da corda Tsik obtido pelo sujeito R (mais velho, Figura 3A) e pelo sujeito Y (mais jovem, Figura 3B). Descobrimos que a potência espectral relacionada ao evento aumentou em uma frequência mais baixa de aproximadamente 20-50 Hz imediatamente após o início do estímulo. Essas respostas foram observadas com destaque na Cz. Em contraste, a potência da faixa gama (acima de 30 Hz) diminuiu após o início do estímulo em comparação com o período basal. Além disso, esse declínio durou 1 s. Não foi observada diminuição no poder relacionado ao evento em idosos acima de 8 anos. Nesses exemplos, os indivíduos mais velhos tiveram uma resposta inicial mais forte ao chamado na região do vértice (Cz), enquanto os indivíduos mais jovens mostraram uma diminuição sustentada na atividade da banda de γ durante a apresentação do chamado. Os resultados sugerem que existem diferenças nas respostas iniciais e sustentadas dependendo da idade do sujeito.

Finalmente, investigamos a relação entre a idade do sujeito e a potência de perturbação espectral relacionada a eventos (ERSP) na resposta transitória inicial (Figura 4A) e na resposta sustentada (Figura 4B). Uma ANOVA de duas vias com o tipo de estímulo como fator intra-sujeito e a idade como fator inter-sujeito foi realizada para determinar a contribuição do tipo de estímulo auditivo e da idade do sujeito para a atividade do EEG. As respostas iniciais e transitórias no Fz mostraram efeitos principais significativos do tipo de estímulo (F (3,24) = 9,020, p < 0,001) e idade (F (8,24) = 3,934, p = 0,004). No entanto, não houve interação significativa entre o tipo de estímulo e a idade (p = 0,144). Nas respostas transitórias em Cz, houve um efeito principal significativo do tipo de estímulo (F (3,24) = 8,533, p < 0,001), mas nenhum efeito da idade (F (8,24) = 2,215, p = 0,073) e nenhuma interação (p = 0,228). Para as respostas sustentadas, houve efeitos principais significativos tanto do tipo de estímulo quanto da idade (F (3,24) = 9,020, p < 0,001; F (8,24) = 3,934, p = 0,004, respectivamente) em Fz. Não foi observada interação significativa (P = 0,144). As respostas sustentadas em Cz mostraram um efeito principal significativo do tipo de estímulo (F (3,24) = 8,533, p < 0,001), mas nenhum efeito principal da idade (F (8,24) = 2,215, p = 0,073) ou interação (p = 0,228). Esses resultados sugerem que, na área frontal média (Fz), as respostas transitórias iniciais aos estímulos de chamada e ruído variaram muito com o aumento da idade, e as respostas sustentadas foram suprimidas nas faixas etárias mais jovens. Estes podem refletir a maturação funcional da região frontal.

Estudos neurofisiológicos anteriores relataram respostas neuronais no córtex auditivo primário durante a vocalização em saguis 9,38. Além disso, mais da metade desses neurônios exibe uma resposta inibitória que persiste durante a vocalização 9,38. Além disso, estudos eletrofisiológicos anteriores em primatas não humanos e humanos mostraram que a alta atividade da banda gama no potencial de campo local (LFP) e ECoG se correlaciona bem com as taxas de disparo nos neurônios 39,40,41,42. O EEG do couro cabeludo é uma versão espaço-temporalmente suavizada da LFP, integrada em uma área de 1cm2 ou mais43. Embora o componente de alta gama do EEG tenha uma correlação mais baixa com as taxas de disparo do que LFP e ECoG, acredita-se que ele codifique o sinal de saída como uma faixa integrada de vários centímetros. Portanto, a diminuição sustentada na potência da banda gama observada em Cz em nossos experimentos pode refletir a atividade de clusters neuronais que mostram atividade suprimida durante a emissão de chamadas, que é encontrada nos córtices auditivos. Em contraste, estudos eletrofisiológicos anteriores relataram que mais neurônios no córtex frontal, principalmente no córtex pré-motor, exibem respostas excitatórias durante a vocalizaçãode chamada 13. Curiosamente, a atividade inibitória sustentada foi observada mesmo quando o Fz foi colocado na área frontal em nossos experimentos, embora mecanismos neurais distintos tenham sido observados entre a percepção vocal e a produção. Um estudo recente de fMRI identificou ainda várias sub-regiões no córtex frontal, incluindo o córtex cingulado anterior, bem como o córtex pré-motor, como "manchas vocais" que respondem a chamadas específicas da espécie em saguis19. Nossos resultados refletem a atividade cerebral geral nessas regiões.

No experimento atual, usamos apenas as posições da linha média para os eletrodos de exploração (Fz, Cz, Pz e Oz); portanto, não podemos mencionar diferenças entre a atividade do processamento auditivo no EEG direito e esquerdo. No futuro, precisamos investigar a lateralidade da atividade neural subjacente ao processamento vocal.

Estudos anteriores relataram que a baixa atividade gama no LFP e ECoG é gerada por entradas sinápticas para células piramidais. Assim, uma alta atividade gama reflete um componente de sinal mais próximo da saída, enquanto uma baixa atividade gama reflete aqueles mais próximos da entrada39. No presente estudo, observamos atividade transitória nas bandas beta e gama baixa imediatamente após a exposição a um chamado. Essas respostas podem refletir sinais de entrada sensorial para o córtex. A vantagem do nosso método é que ele pode capturar a atividade cerebral de diferentes populações neuronais como mudanças dinâmicas com alta resolução temporal. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a revelar como os sinais de EEG do couro cabeludo mudam durante a percepção vocal específica da espécie em saguis. Os resultados atuais fornecem novos insights sobre a integração de representações neurais por meio de gravações de uma ampla gama de regiões cerebrais.

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Figura 1: Configuração experimental. (A) Uma imagem exemplar de um assunto durante a gravação. O sagui está sentado em uma cadeira e a cabeça é fixada à cadeira por uma máscara. A boca é mantida aberta para facilitar a respiração e beber líquidos de recompensa, e os eletrodos foram presos ao topo da cabeça. (B) Equipamento: Os estímulos sonoros são apresentados por meio de um alto-falante. Um amplificador, uma caixa de entrada de eletrodo e uma câmera de monitoramento também foram instalados. (C) Localização dos eletrodos: Os eletrodos foram colocados em Fz, Cz, Pz, Oz, A1 e A2 de acordo com o Sistema Internacional 10-20. Definimos a localização dos eletrodos usando os pontos de referência, násio e pré-auricular bilateral como pontos anatômicos. O eletrodo C3 ou C4 foi usado como eletrodo terra. (D) Ultrassonografias (painel esquerdo) e espectrogramas (painel esquerdo) para todos os estímulos de áudio. O chamado Phee é um único chamado longo com duração inferior a 2 s. A chamada Tsik-Ek é uma chamada combinada de um Tsik seguida por um Ek. Dois conjuntos do chamado composto apresentaram aproximadamente 1 s. O chamado de corda de Tsik é um chamado repetitivo de Tsik5, e quatro Tsik foram apresentados aproximadamente por 1 s no estímulo. Como estímulo sem chamada, usamos um sinal de ruído branco gerado por um script personalizado que durou cerca de 1 s. As latências de início do som foram inspecionadas visualmente em um editor de áudio digital. As setas vermelhas indicam cada latência, chamada Phee 49 ms, chamada Tsik-Ek 35 ms, chamada Tsik-string 16 ms e ruído branco 0 ms. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Potenciais relacionados a eventos em média grande para as chamadas e ruídos de Phee, Tsik-Ek e Tsik-string. (n = 9) A atividade foi alinhada ao início de cada chamada ou ruído branco. A seta horizontal preta indica o período para a apresentação do estímulo. O chamado Phee durou aproximadamente 2 s, o resto durou 1 s. As linhas horizontais vermelhas em Cz indicam os períodos com diferenças significativas entre os estímulos auditivos. Todos eles foram entre o Noise e as outras chamadas, e não houve diferenças entre as chamadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Exemplo de mapas de tempo-frequência para chamadas. (A) O mapa ERSP para a chamada de string Tsik no sujeito R (145 meses); (B) O mapa EPSP para a mesma chamada de string Tsik no sujeito Y (23 meses). Os painéis esquerdo e direito mostram os dados registrados dos eletrodos Fz e Cz, respectivamente. As linhas verticais vermelhas indicam o momento do início da lima auditiva, não o início da chamada. Abreviatura: EPSP = perturbação espectral relacionada a eventos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Relação entre o poder médio relacionado a eventos e a idade dos sujeitos. (A) Relação entre o poder médio relacionado a eventos em α e a banda β e a idade dos sujeitos. A potência média do ERSP foi calculada em 8-29 Hz a partir de um período de 1-150 ms a partir de cada início do estímulo em comparação com aqueles no período basal (-200 a 0 ms antes do início do estímulo). Os painéis esquerdo e direito mostram os dados registrados dos eletrodos Fz e Cz, respectivamente. (B) Relação entre o poder médio relacionado ao evento na banda γ e a idade dos sujeitos. A potência média do ERSP foi calculada em 30-100 Hz a partir de um período de 151-950 ms a partir de cada início do estímulo em comparação com aqueles no período basal (-200 a 0 ms antes do início do estímulo). Assim, valores negativos de ERSP indicam uma diminuição da potência em relação ao anterior à apresentação do estímulo. Abreviatura: ERSP = perturbação espectral relacionada a eventos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Um arquivo zip contendo quatro arquivos de áudio usados nos experimentos. O arquivo PH.wav inclui um estímulo com uma longa chamada Phee ; TE.wav contém duas chamadas Tsik-Ek com um intervalo entre elas; MB.wav contém um estímulo de chamada de string Tsik com quatro Tsik consecutivos (também chamado de chamada mobbing); NO.wav contém um ruído gaussiano branco gerado pelo programa. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Um arquivo zip contendo código de pós-processamento. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Pontos a serem observados sobre anestesia
Tanto a administração de cetamina quanto a xilazina foram tentadas e, embora sejam analgésicas e, portanto, adequadas para tarefas longas e dolorosas, os saguis tendem a apresentar diminuição nos níveis de oxigênio no sangue sem inalação de oxigênio44. Em suma, o alfaxalon é provavelmente mais adequado para tarefas indolores, como barbear ou fazer máscaras. Além disso, para o barbear, que leva apenas 10-15 min, a anestesia inalatória seria a mais adequada. O isoflurano não foi utilizado durante a intubação devido à sua curta duração e baixa concentração (aproximadamente 1%).

Vantagens da medição do EEG
O EEG do couro cabeludo é um método de registro da atividade cerebral através da pele, crânio e tecidos subcutâneos, que tem uma resolução espacial mais baixa do que os métodos de registro direcionados a neurônios únicos ou eletrodos intracranianos com maior resolução espacial. Apesar dessas desvantagens, existem várias vantagens em medir o EEG do couro cabeludo em primatas não humanos. Primeiro, o método não é invasivo e não fere os animais. Por exemplo, pode-se querer medir a atividade cerebral de modelos animais muito valiosos de uma doença criada usando um procedimento de engenharia genética muito difícil. Nesses casos, essas técnicas podem ser usadas com segurança para medir a atividade cerebral sem a necessidade de intervenção cirúrgica. De fato, esse método nos permitiu adquirir dados neurais do mesmo sujeito por um longo período sem ferimentos. Além disso, o número de indivíduos pode ser aumentado em comparação com métodos neurofisiológicos invasivos porque é mais fácil e menos demorado. Em segundo lugar, os dados de EEG obtidos de primatas não humanos usando essa técnica podem ser comparados diretamente com dados de EEG humanos obtidos anteriormente usando o mesmo paradigma comportamental dos humanos. Essa vantagem nos permitiu examinar a atividade neural cognitiva de uma perspectiva evolutiva. Terceiro, nosso método de gravação permite gravações de primatas acordados. Os agentes anestésicos atenuam significativamente a atividade cortical, embora os efeitos de atenuação, grau e padrão de inibição variem dependendo dos agentes. Este método pode registrar a atividade cerebral enquanto acordado, sem qualquer influência de drogas. Além disso, por meio da administração de drogas que atuam no sistema nervoso central e da observação de alterações na atividade cerebral, essa técnica pode ser aplicada em experimentos envolvendo mecanismos neurais.

A imagem cerebral funcional é outro método não invasivo para explorar os mecanismos cerebrais associados ao processamento vocal em humanos e primatas não humanos. Avanços tecnológicos recentes permitiram a aplicação de fMRI em animais em estado de vigília. A imagem cerebral funcional tem a vantagem de permitir a exploração de todo o cérebro com alta resolução espacial. No entanto, o equipamento e seus custos operacionais são caros para instalar e manter. Por outro lado, o EEG tem a vantagem de alta resolução temporal e revela uma atividade cerebral mais dinâmica específica da frequência. Além disso, o equipamento tem um custo relativamente baixo e alta portabilidade e pode ser realizado por um único experimentador. Além disso, vários estímulos e equipamentos podem ser facilmente introduzidos. Aproveitar esses métodos e integrar os achados de diferentes técnicas fornecerá uma compreensão mais detalhada dos mecanismos neurais envolvidos na percepção vocal em saguis.

Comparação com dados humanos ou de macacos
No EEG, os sinais gerados no cérebro devem passar pela dura-máter, tecido subcutâneo e crânio antes de serem registrados no couro cabeludo. Esses tecidos atuam como filtros passa-baixa. Em particular, os componentes de alta frequência, como picos, são significativamente atenuados em comparação com os componentes das bandas alfa e beta. Portanto, ao contrário da eletrocorticografia (ECoG), alguns componentes da atividade cerebral não podem ser detectados no couro cabeludo. Esta é uma limitação do EEG do couro cabeludo. Os saguis têm crânios mais finos, tecidos subcutâneos e dura-máter do que macacos e humanos, enquanto o tamanho da cabeça também é menor. Portanto, deve-se ter cuidado ao comparar os resultados obtidos em humanos e macacos. Por exemplo, sinais que se originam no cérebro profundo, como o tronco encefálico, podem ser registrados no couro cabeludo como sinais relativamente grandes devido à menor taxa de atenuação e distância relativamente próxima entre a fonte de sinal e os eletrodos.

Além disso, os saguis têm muito poucos, se houver, sulcos cerebrais rasos. Isso os torna bastante distintos dos humanos, que têm muitos sulcos e nos quais o córtex é internalizado como giro. O número e a profundidade dos sulcos cerebrais diferem entre humanos, macacos e saguis. Os sinais elétricos são gerados perpendicularmente ao córtex e medidos usando eletrodos colocados sobre os giros cerebrais, onde os dendritos apicais dos neurônios piramidais, que são as principais fontes de sinais de EEG, estão alinhados perpendicularmente aos eletrodos. Nos sulcos, os sinais são atenuados e projetados em eletrodos distantes porque são gerados horizontalmente em relação à superfície do cérebro. Ao comparar os resultados em humanos com os de macacos e saguis, é necessário considerar a localização dos registros de EEG e a anatomia da área.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Hakubi da Universidade de Kyoto, Subsídio de Ajuda para Pesquisa Desafiadora (Pioneiro) (No.22K18644), Subsídio de Ajuda para Pesquisa Científica (C) (Nº 22K12745), Subsídio de Ajuda para Pesquisa Científica (B) (Nº 21H02851) e Subsídio de Ajuda para Pesquisa Científica (A) (Nº 19H01039). Gostaríamos de agradecer à Editage (www.editage.jp) pela edição em inglês.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AlfaxaloneMeiji Saúde AnimalAlfaxan
AmplificadorBrainAmp
AtropinaFuso Pharmaceutical Industriessulfato de atropina
Editor de áudioAdobeAdobe Audition
Software de processamento de dadosMathWorksMATLABversão R2023a
Caixa de ferramentas de processamento de dadosUniversidade da Califórnia-SanDiegoEEGLAB
Caixa de ferramentas de processamento de dadosUniversidade da Califórnia-DavisERPLAB
Barbeador elétricoPanasonicER803PPA
EletrodoExclusivo MédicoUL-3010AgCl revestido (personalizado)
Gel de eletrodoNeurospec AGV16 SuperVisc
Caixa de entrada de eletrodoBrain ProductsEIB64-DUO64ch
Cola3MScotch 7005S
Creme de depilaçãoKracieepilat para pele
IsofluranoBussan Saúde Animalds isoflurano
Goma líquidaSan-ei Yakuhin BoekiChamada árabe SSGoma arábica + água
NutriçãolíquidaNestlé Health Science CompanyIsocal 1.0 JuniorFórmula Polimérica
MaropitantZoetis injetável Cerenia
CâmeraIntelRealSense LiDAR Camera L515
Pellets de macacoLevedura OrientalSPS
Cadeira de primataNatsume SeisakushoFeito
Oxímetros de pulsoCovidentNellcorPM10N
Massa para preparação de pele Mammendorfer Institut fü r Physik und MedizinNeuPrep
Tubo de fatiamentoAsONE&Phi; 4 x 7mm
Alto-falanteFostexPM0.3
Dispositivo de sincronizaçãoBrain VisionStimTrak
Máscara termoplásticaCIVCOMTAPU Tipo Uniframe Máscara termoplástica 2,4 mm
Produtos cerebrais Injeção de sensívelSolução Monitor sob encomenda

Referências

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Medidas de eletroencefalografia em saguis acordados ouvindo vocalizações coespecíficas
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