Preparação de microesferas de alginato de sódio reticulado com diferentes íons metálicos usando a tecnologia de eletrospray microfluídico

Os sistemas de liberação de medicamentos são um hotspot de pesquisa no campo da engenharia de biotecidos, com o objetivo de melhorar a eficiência e eficácia da administração de medicamentos e reduzir reações adversas e efeitos colaterais¹. Dentre esses sistemas, as microesferas de hidrogel, caracterizadas por boa biocompatibilidade, propriedades mecânicas sintonizáveis e plasticidade funcional, são um dos veículos mais comumente utilizados para carregamento e liberação de medicamentos². Eles podem ser usados para liberação lenta e controlada de medicamentos, fornecer bons efeitos protetores para medicamentos, evitar ou minimizar efeitos inespecíficos de medicamentos em outros tecidos e direcionar a entrega de medicamentos a estruturas teciduais específicas³. Portanto, as microesferas de hidrogel tornaram-se um novo e eficiente sistema de liberação de medicamentos, com pesquisas nesse campo surgindo gradualmente⁴.

As microesferas de hidrogel são tipicamente sintetizadas a partir de materiais biodegradáveis, incluindo polissacarídeos, proteínas e polímeros naturais⁵. Entre eles, o ALG é um polissacarídeo biocompatível e biodegradável extraído de algas marrons marinhas⁶. Sua cadeia molecular contém grupos hidroxila e carboxila livres que podem se reticular com a maioria dos cátions divalentes ou multivalentes para formar uma estrutura de hidrogel insolúvel em água com uma rede tridimensional⁵. As microesferas de hidrogel formadas por ALG podem ser convertidas em polieletrólitos carregados negativamente em soluções neutras e alcalinas. Essa repulsão entre cargas negativas faz com que as microesferas inchem, permitindo a liberação do ingrediente ativo encapsulado ou medicamento. Essas propriedades levaram à consideração das microesferas de ALG como promissoras carreadoras de fármacos amplamente utilizadas para carga de fármacos e liberação controlada⁷.

Existem vários métodos para a preparação de microesferas de hidrogel. Os métodos tradicionais de preparação do ALGMS geralmente incluem o método sol-gel ou o método emulsão-sol. Esses métodos envolvem etapas como precipitação, co-precipitação e reações de gelificação para obter as microesferas alvo⁸. Nos últimos anos, com o desenvolvimento contínuo da tecnologia microfluídica, o método de eletrospray microfluídico tornou-se gradualmente um método de preparação de microesferas eficiente e preciso⁹. Este método utiliza tecnologia microfluídica para eletropulverizar uma solução de polímero através de um bico microfino para formar gotículas e microesferas do tamanho de micrômetros durante o processo subsequente de cura ou reticulação¹⁰. Em comparação com o método tradicional, o eletrospray microfluídico oferece controle preciso do tamanho e morfologia das partículas da microesfera, ajustando parâmetros como taxa de fluxo da solução, tensão e tamanho fino do bico¹¹. Ele também permite a preparação contínua de microesferas em alta velocidade, melhorando a eficiência da preparação e mantendo condições de reação suaves. Além disso, o ALGMS pode ser preparado para possuir várias funções, como medicamentos de liberação controlada e catalisadores carregados, possibilitando sua fácil aplicação em diversos campos.

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação de microesferas ALG usando o método de eletrospray microfluídico. O processo envolve passar uma solução ALG por um dispositivo microfluídico e submetê-la a eletrospray. As gotículas resultantes foram coletadas na solução contendo diferentes íons metálicos (Ca²⁺,²⁺, Zn²⁺ e Fe³⁺) para iniciar a reação de reticulação. Essa reação melhora a estabilidade e a adesão das microesferas e as dota de diferentes funcionalidades. Este método é de fácil execução, e as microesferas sintetizadas exibem boa uniformidade de tamanho em sua morfologia. Além disso, investigamos suas propriedades antimicrobianas, capacidade de liberação lenta de medicamentos e biocompatibilidade. Este protocolo será útil para o desenvolvimento e produção de medicamentos.

O sangue utilizado nos experimentos foi obtido de camundongos fêmeas BALB/c de grau SPF, pesando 20-25 g e com aproximadamente 7 semanas de idade. O Comitê de Ética em Experimentação Animal do Zhejiang Shuren College aprovou todos os procedimentos experimentais e de cuidados com animais.

1. Preparação da solução

1. Pese ALG e dissolva em água ultrapura mexendo em banho-maria a 50 °C para obter uma solução ALG a 2%.
2. Prepare separadamente a fração de massa com soluções de 5% (ou concentração de massa molar é 0,3 M) de CaCl₂, FeCl₃, ZnSO₄ e CuSO₄ em água ultrapura. Despeje cada solução separadamente em um prato coletor.

2. Dispositivo de eletrospray microfluídico

1. Pegue um tubo capilar de vidro e coloque-o sobre uma chama de maçarico para amolecer e, em seguida, estique-o em vários diâmetros (50 μm-500 μm). Corte as partes finas com um cortador de vidro e polir suavemente a porta da ponta com uma lixa de carboneto de silício de alta qualidade. Após a limpeza, conecte a extremidade grossa do tubo capilar a um tubo longo e a outra extremidade do tubo a uma agulha dispensadora e uma seringa de 5 mL (Figura Suplementar 1).
   NOTA: As bordas afiadas dos cortes do tubo de vidro são difíceis de inserir na mangueira; assim, a quebra deve ser arredondada na borda da chama.
2. Conecte a seringa à bomba de seringa microfluídica e ao tubo capilar em uma extremidade do suporte. Conecte o clipe final vermelho de alta tensão da fonte de alimentação de alta tensão à agulha dispensadora da seringa e coloque o clipe prateado no fluido de coleta. Essa configuração cria um dispositivo de eletrospray microfluídico simples (Figura 1A).
   NOTA: Coloque o tubo capilar perpendicular à mesa.

3. Preparação de microesferas ALG

1. Coloque os pratos de coleta seletiva contendo diferentes íons metálicos diretamente sob o tubo capilar. Ligue a bomba de seringa microfluídica e selecione Fast Forward para preparar o tubo com o ALG e, em seguida, defina a taxa de fluxo apropriada (2 mL/h).
2. Ligue o interruptor de alimentação de alta tensão e gire o botão para definir a tensão apropriada (5-7 kV).
3. Adicione 20 mL de solução a cada uma das placas de Petri de 90 mm para coletar microesferas ALG para formar ALGMS reticulados com diferentes íons metálicos (Figura 1B).
4. O ALG forma microesferas sob a ação do campo elétrico e da gravidade em diferentes soluções coletoras de íons em poucos segundos. Aspire as microesferas com uma pipeta esterilizada e transfira-as para tubos de centrífuga individuais de 1,5 mL para obter microesferas de hidrogel Zn²⁺, Ca²⁺,²⁺ e Fe³⁺ -ALG (Figura 1C). Rotule os tubos Zn-ALGMS, Ca-ALGMS,-ALGMS e Fe-ALGMS.
   NOTA: Microesferas de diferentes diâmetros podem ser obtidas ajustando parâmetros como tensão, diâmetro da ponta, taxa de fluxo e concentração da solução.
5. Pegue uma pequena quantidade das microesferas preparadas, disperse-as o mais uniformemente possível em PBS e coloque-as sob um microscópio para visualização.
6. Selecione aleatoriamente 10 campos de observação no mesmo lote de microesferas, importe as imagens a serem medidas para o software ImageJ, converta as imagens para o modo de escala de cinza apropriado e use a tecnologia de segmentação de limite para definir com precisão a área das partículas alvo e iniciar a função de análise das partículas para que o ImageJ possa identificar e medir as partículas alvo. Obtenha dados sobre as microesferas e, em seguida, importe os dados para o software Origin para análise e mapeamento de tamanho de partícula.

4. Teste de desempenho antimicrobiano

1. Prepare suspensões de 5 mL de Staphylococcus aureus (S. aureus) e Escherichia coli (E. coli) com uma turbidez bacteriana inicial de 0,2 mcF usando um meio líquido Luria-Bertani (LB).
2. Adicione 10 mL de cada solução bacteriana a 4 tubos de centrífuga estéreis individuais de 15 mL. Em seguida, adicione 0,5 mL de Zn-ALGMS, Ca-ALGMS,-ALGMS e Fe-ALGMS ALG a cada tubo e coloque-os em um agitador de temperatura constante a 37 ° C e 200 rpm por 12 h. Adicione uma quantidade igual de solução salina ao grupo de controle.
3. Dilua cada solução bacteriana para 10⁵ vezes com água estéril. Use uma esfera de vidro estéril para espalhar 200 μL de solução bacteriana em um meio sólido LB.
4. Espalhe a solução de forma rápida e uniforme na placa de revestimento, evitando idas e vindas na mesma área. Em seguida, coloque as placas em uma incubadora a 37 °C por 12 h. Observe as colônias de diferentes grupos.
   NOTA: Todos os procedimentos assépticos devem ser realizados perto de uma lâmpada de álcool. Esterilize vasos de cultura microbiana, utensílios de inoculação e meios de cultura.

5. Teste de liberação de drogas

1. Para avaliar a capacidade de liberação de diferentes microesferas, use albumina de soro bovino (BSA) como um medicamento modelo carregado. Adicione 500 μL de cada microesfera (Ca-ALGMS,-ALGMS, Zn-ALGMS e Fe-ALGMS) a 1 mg/mL de suspensão BSA por 24 h.
2. Para o ensaio de liberação do fármaco, adicione cada amostra saturada a 5,0 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4), seguida de agitação por 15 min a 37 °C com agitação contínua a 80 rpm.
3. Use 100 μL da solução e substitua o meio por um novo em 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 h.
4. Quantifique as concentrações de proteína sobrenadante em momentos específicos usando um kit de BCA de acordo com as instruções do fabricante. Meça quantitativamente o medicamento liberado pelo marcador enzimático para obter a absorbância correspondente e converta o valor medido em concentração real do medicamento de acordo com a curva padrão. Calcule a taxa de liberação do medicamento usando a seguinte fórmula:
   Porcentagem de liberação do medicamento = (concentração do medicamento liberado em um ponto de tempo específico / concentração inicial do medicamento) x 100%
5. Em intervalos regulares, remova um volume igual de PBS de cada poço e substitua-o por um volume igual de meio fresco.

6. Teste de hemólise

1. Colocar os Ca-ALGMS,-ALGMS, Zn-ALGMS e Fe-ALGMS preparados em PBS e incubá-los a 37 °C durante 24 h para formular a solução de incubação.
2. Obter sangue total de camundongos BALB/c saudáveis por flebotomia ocular, coletado em tubos anticoagulados contendo citrato de sódio. Vórtice e centrifugue a 1509 x g por 15 min para obter glóbulos vermelhos.
3. Lave os glóbulos vermelhos 2x-3x com PBS e prepare uma solução de glóbulos vermelhos a 10% com PBS.
4. Preparação de vários ALGMS: Pegue 500 μL de cada microesfera para o grupo experimental, 1 mL de água ultrapura (ddH₂O) para o grupo de controle positivo e 1 mL de solução de PBS para o grupo de controle negativo e misture cada um com 20 μL de solução de células sanguíneas.
5. Incubar as amostras a 37 °C durante 4 h, centrifugar a 1509 x g, 15 min. Mantenha o sobrenadante de lado e fotografe os glóbulos vermelhos em cada grupo após a hemólise.
6. Considere a taxa de hemólise do grupo de controle positivo como 100% e o grupo de controle negativo como 0%. Medir os valores de absorvância dos sobrenadantes em cada grupo e calcular a taxa de hemólise utilizando a fórmula:
   Hemólise (%) = (Valores de absorbância dos sobrenadantes de cada grupo-
   Valores de absorvância da água destilada isoladamente) / (Valores de absorvância do grupo de controle positivo - Valores de absorbância da água destilada isoladamente) x 100

7. Teste de citobiocompatibilidade

1. Lave os diferentes ALGMS 2x com PBS e coloque em uma placa de Petri de 5 mL por 15 min e descarte o sobrenadante.
2. Adicione separadamente diferentes ALGMS a 0,2 mL em meio de cultura completo (DMEM) contendo 10% de FBS, incube a 37 ° C por 24 h e filtre a solução para obter o lixiviado.
3. Cultive células NIH3T3 com aproximadamente 70% de densidade celular em placas de 24 poços, trate as células NIH3T3 com solução de lixiviação de microesferas e continue a cultivar com meio completo por mais 24 horas.
4. Remova o meio de cultura de células e lave as células com PBS.
5. Avalie a viabilidade celular usando o ensaio Calcein-AM/PI. Pegue 2,5 μL de solução de calceína-AM (4 mM) e 12,5 μL de solução de PI (2 mM) e adicione-os a 5 mL de 1x PBS e misture bem para obter uma solução de trabalho com 2 μM de calceína-AM e 5 μM de PI.
6. Adicione a solução de trabalho a placas de cultura de células previamente semeadas a 500 μL por poço, incube a 37 ° C sob proteção contra luz por 15 min e observe e fotografe sob um microscópio de fluorescência invertida. Configure três réplicas para cada grupo.
7. Calcule a viabilidade celular de acordo com a seguinte fórmula:
   Viabilidade celular (%) = número de células viáveis / (número de células viáveis + número de células mortas)

Caracterização de ALGMS reticulado com diferentes íons metálicos
A morfologia óptica de Ca-ALGMS,-ALGMS, Zn-ALGMS e Fe-ALGMS é mostrada na Figura 2, exibindo boa esfericidade, superfície lisa, distribuição uniforme do tamanho das partículas (Figura Suplementar 2) e excelente monodispersidade. Além disso, realizamos a caracterização microscópica usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e análise de espectroscopia de energia dispersiva (EDS). Como mostrado na Figura 3, as microesferas eram geralmente esféricas com arredondamento bem definido. A superfície do Zn-ALGMS foi distribuída de forma desigual, parecendo mais áspera com muitas rugas. Realizamos espectroscopia de energia dispersiva para determinar a distribuição do conteúdo de íons metálicos envolvidos na reação de reticulação no gel. Notavelmente, o tamanho da microesfera pode ser ajustado alterando parâmetros como distância de coleta, concentração de gel e tensão do campo elétrico12. No protocolo delineado, ajustando os parâmetros do dispositivo microfluídico e a concentração do líquido, partículas de diferentes tamanhos podem ser facilmente obtidas de acordo com requisitos específicos.

Avaliação das propriedades antimicrobianas
Avaliamos a capacidade antimicrobiana de diferentes microesferas usando o método da placa, conforme mostrado na Figura 4. Diferentes microesferas exibiram atividade antibacteriana contra E. coli e S. aureus, com-ALGMS e Zn-ALGMS mostrando as propriedades antibacterianas mais fortes. Essa maior eficácia pode ser atribuída à atividade antimicrobiana dos metais, ou seja, cobre () e zinco (Zn)13. Sukhodub et al. demonstraram que Fe3+, Zn2+, Ca2+ e2+ exibiram efeitos antibacterianos sinérgicos com a quitosana, enquanto as amostras sem quitosana não apresentaram tal atividade, validando o efeito antibacteriano sinérgico dos complexos formados14. Os resultados obtidos estão alinhados com este estudo, sendo o-ALGMS e o Zn-ALGMS superiores a outras microesferas de hidrogel no tratamento de doenças infecciosas bacterianas.

Avaliação das propriedades de liberação de fármacos
A avaliação da liberação do fármaco de diferentes microesferas de hidrogel de alginato à base de metal usando BSA como fármaco modelo revelou diferenças em seus perfis de liberação. (Figura 3 suplementar). Os íons exibiram uma melhor capacidade de liberação lenta do medicamento do que os de outros materiais. A taxa de liberação do fármaco de Fe2+ foi relativamente mais rápida do que a dos outros três íons, enquanto a taxa de liberação do fármaco de Ca2+ e Zn2+ foi relativamente mais lenta. Esses resultados destacam as diferenças nos efeitos de diferentes íons na liberação do fármaco. Nossa hipótese é que o Fe2+ possivelmente interage com o medicamento ou se liga de uma forma que facilita a liberação, enquanto o Ca2+ e o Zn2+ se ligam ao medicamento com mais força, ou existem outros fatores que limitam a taxa de liberação. Essa liberação sustentada do medicamento das microesferas de hidrogel pode estar relacionada à força de reticulação entre o metal e o polissacarídeo de alginato. Além disso, a diferença na capacidade de adsorção de diferentes metais em comparação com a BSA provavelmente contribuiu para as diferenças observadas nas habilidades de retardo de drogas.

Avaliação de biocompatibilidade
Uma boa biocompatibilidade é um pré-requisito para os portadores de entrega de medicamentos em aplicações clínicas. Portanto, avaliamos a hemocompatibilidade das microesferas usando um teste de hemólise in vitro . Utilizou-se água pura como controle positivo e solução de PBS como controle negativo. Os resultados experimentais são mostrados na Figura Suplementar 4, revelando que as hemácias na suspensão permaneceram intactas ao contato com diferentes microesferas, indicando hemólise mínima pelas microesferas. Os resultados da citobiocompatibilidade mostraram que as microesferas não afetaram a atividade celular (Figura Suplementar 5). Esses resultados indicaram que as microesferas têm boa compatibilidade com células sanguíneas.

Figura 1: Preparação de microesferas de hidrogel de alginato. (A) Instalação da tecnologia de eletrospray microfluídico. (B) A imagem em tempo real do processo de eletrospray microfluídico. (C) As microesferas de hidrogel de alginato de Ca2+,2+, Zn2+ e Fe3+ preparadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Micrografia de microesferas de hidrogel de alginato. Micrografia de (A) Ca-ALGMS, (B)-ALGMS, (C) Zn-ALGMS e (D) Fe-ALGMS em PBS (pH 7,4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia de energia dispersiva. As imagens mostram a caracterização de (A) Ca-ALGMS, (B)-ALGMS, (C) Zn-ALGMS e (D) Fe-ALGMS com i e ii para dados de microscopia de varredura e iii-v para dados de espectroscopia. As imagens iii-v mostram um mapeamento EDS, no qual o EDS seleciona uma face na superfície da amostra para escanear para obter informações de distribuição elementar em toda a área. O modo de varredura de mapa é usado em aplicativos para análise de composição, análise de zona de fase e distribuição de tamanho de partícula de materiais, onde cada elemento é representado por uma cor diferente, conforme mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Propriedades antimicrobianas das microesferas. (A) As propriedades antimicrobianas dos grupos foram testadas usando o método de esfregaço bacteriano. (B, C) Quantificação dos resultados da contagem da placa de esfregaço bacteriano para cada grupo. As amostras de controle mostram colônias cultivadas em meio LB sem qualquer adição. As colônias relativas para as outras bactérias foram calculadas tomando a contagem de clones do grupo de controle como 100% e usando-a como linha de base. A barra de erro: desvio padrão, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Um tubo de vidro é conectado à seringa por meio de um longo tubo de borracha. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Tamanho de partícula. (A) Zn-ALGMS, (B) Ca-ALGMS, (C)-ALGMS, (D) Fe-ALGMS. Uma concentração molar de 5% foi utilizada para todas as amostras. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3 suplementar: Liberação do medicamento. A curva de liberação do fármaco de Ca-ALGMS,-ALGMS, Zn-ALGMS e Fe-ALGMS em PBS (pH 7,4). A barra de erro: desvio padrão, n = 3 Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Ensaio de hemólise de Ca-ALGMS,-ALGMS, Zn-ALGMS e Fe-ALGMS. PC (Controle Positivo): ddH2O; NC (Controle Negativo): PBS. A barra de erro: desvio padrão, n = 3. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 5: Citotoxicidade de microesferas reticuladas com diferentes íons. A avaliação da biocompatibilidade de Zn-ALGMS, Ca-ALGMS,-ALGMS e Fe-ALGMS foi feita. Calceína-AM/PI foi utilizado para a realização do teste, e para os resultados aqui foram selecionados aleatoriamente 5 campos de visão. O ImageJ foi usado para analisar a proporção de glóbulos vermelhos para células mortas para obter viabilidade celular relativa. 1.PC, Controle Positivo, 2.NC, Controle Negativo, 3. Zn-ALGMS, 4. Ca-ALGMS, 5. -ALGMS, 6. Fe-ALGMS, A barra de erro: desvio padrão, n = 3. Clique aqui para baixar este arquivo.

Nenhum conflito de interesse deve ser divulgado.