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Artigo de método

Desenvolvimento de Terapêutica Combinatória para Lesão Medular usando Entrega de Células-Tronco

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⸱

DOI:

10.3791/66872

⸱

7 de junho de 2024

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Neste artigo

Resumo

Neste estudo, foram desenvolvidos e caracterizados hidrogéis compostos miméticos de nervos que podem ser utilizados para investigar e capitalizar o comportamento pró-regenerativo de células-tronco derivadas do tecido adiposo para reparo de lesões medulares.

Resumo

A lesão medular traumática (LM) induz deficit sensório-motor permanente abaixo do local da lesão. Afeta aproximadamente um quarto de milhão de pessoas nos EUA e representa uma preocupação imensurável de saúde pública. Pesquisas foram conduzidas para fornecer terapia eficaz; no entanto, a LM ainda é considerada incurável devido à natureza complexa do local da lesão. Uma variedade de estratégias, incluindo administração de medicamentos, transplante de células e biomateriais injetáveis, são investigadas, mas uma estratégia sozinha limita sua eficácia para a regeneração. Como tal, as terapias combinatórias ganharam recentemente atenção e podem atingir características multifacetadas da lesão. Foi demonstrado que as matrizes extracelulares (MEC) podem aumentar a eficácia do transplante de células para LME. Para tanto, hidrogéis 3D constituídos por medula espinhal descelularizada (dSCs) e nervos ciáticos (dSNs) foram desenvolvidos em diferentes proporções e caracterizados. A análise histológica de dSCs e dSNs confirmou a remoção de componentes celulares e nucleares, e as arquiteturas de tecido nativo foram mantidas após a descelularização. Posteriormente, hidrogéis compostos foram criados em diferentes proporções volumétricas e submetidos a análises de cinética de gelificação de turbidez, propriedades mecânicas e viabilidade de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASC) incorporadas. Não foram encontradas diferenças significativas nas propriedades mecânicas entre as diferentes proporções de hidrogéis e matrizes medularizadas descelularizadas. As ASCs humanas incorporadas nos géis permaneceram viáveis durante toda a cultura de 14 dias. Este estudo fornece um meio de gerar hidrogéis combinatórios de engenharia de tecidos que apresentam ECM específica do nervo e células-tronco mesenquimais pró-regenerativas. Esta plataforma pode fornecer novos insights sobre estratégias neuro-regenerativas após a LME com investigações futuras.

Introdução

Aproximadamente 296.000 pessoas sofrem de LME traumática e, a cada ano, ocorrem cerca de 18.000 novos casos de LME nos EUA1. A LME traumática é comumente causada por quedas, ferimentos por arma de fogo, acidentes com veículos e atividades esportivas e geralmente causa perda permanente da função sensório-motora abaixo do local da lesão. As despesas estimadas ao longo da vida para o tratamento da LME variam entre um a cinco milhões de dólares por indivíduo, com expectativas de vida significativamente mais baixas1. No entanto, a LM ainda é pouco compreendida e em grande parte incurável, principalmente devido às complexas consequências fisiopatológicas após a lesão2. Várias estratégias foram investigadas, incluindo transplante de células e andaimes baseados em biomateriais. Embora o transplante de células e biomateriais tenha demonstrado potencial, a natureza multifacetada da LME sugere que abordagens combinatórias podem ser mais benéficas3. Como resultado, muitas estratégias combinatórias foram investigadas e demonstraram melhor eficácia terapêutica do que os componentes individuais. No entanto, mais estudos são necessários para fornecer novos biomateriais para a entrega de células e fármacos3.

Uma abordagem promissora para a fabricação de hidrogéis naturais é a descelularização do tecido. O processo de descelularização utiliza métodos iônicos, não iônicos, físicos e combinatórios para remover todos ou a maioria dos materiais celulares e nucléicos, preservando os componentes da MEC. Ao remover todos ou a maioria dos componentes celulares, os hidrogéis derivados da MEC são menos imunorreativos para o hospedeiro após a implantação/injeção4. Existem vários parâmetros a serem medidos para avaliar a qualidade dos tecidos descelularizados: remoção do conteúdo celular/nucléico, propriedades mecânicas e preservação da MEC. Os seguintes critérios foram estabelecidos para evitar respostas imunes adversas: 1) menos de 50 ng de DNA de fita dupla (dsDNA) por mg de peso seco da MEC, 2) menos de 200 pb de comprimento de fragmento de DNA e 3) quase ou nenhum material nuclear visível corado com 4'6-diamidino-2-fenuilindol (DAPI)5. As propriedades mecânicas podem ser quantificadas por testes de tração, compressão e/ou reologia, e devem ser semelhantes ao tecido original6. Além disso, a preservação proteica pode ser avaliada por proteômica ou ensaios quantitativos com foco nos principais componentes dos tecidos descelularizados, por exemplo, laminina, glicosaminoglicano (GAG) e proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG) para a medula espinhal 7,8. Os hidrogéis derivados de ECM verificados podem ser recelularizados com diferentes tipos de células para auxiliar na terapia baseada em células9.

Uma variedade de tipos de células, como células de Schwann, células de revestimento olfatório, células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (MSCs) e células-tronco neurais/progenitoras, foram estudadas para reparo de LME 10,11,12. No entanto, o uso clínico dessas células é limitado devido a preocupações éticas, integração esparsa com células/tecidos vizinhos, falta de fontes teciduais para alto rendimento, incapacidade de auto-renovação e/ou capacidade proliferativa limitada 13,14,15. Ao contrário desses tipos celulares, as CTMs derivadas do tecido adiposo humano (hASCs) são candidatas atraentes porque são facilmente isoladas de maneira minimamente invasiva usando lipoaspirados, e um grande número de células pode ser obtido16. Além disso, as hASCs têm a capacidade de secretar fatores de crescimento e citocinas que têm o potencial de neuroproteção, angiogenética, cicatrização de feridas, regeneração tecidual e imunossupressão 17,18,19,20,21.

Como foi descrito, vários estudos foram realizados 22,23,24, e muito foi aprendido com eles, mas as características heterogêneas da LM limitaram sua eficácia na promoção da recuperação funcional. Como tal, abordagens combinatórias foram propostas para aumentar a eficácia do tratamento para LM. Neste estudo, hidrogéis compostos foram desenvolvidos combinando medula espinhal descelularizada e nervos ciáticos para uma cultura tridimensional (3D) de hASC. A descelularização bem-sucedida foi confirmada por análises histológicas e de DNA, e diferentes proporções de hidrogéis compostos nervosos foram caracterizadas por cinética de gelificação e testes de compressão. A viabilidade de hASCs nos hidrogéis compostos de nervos foi investigada para provar que este hidrogel pode ser utilizado como uma plataforma de cultura de células 3D.

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Protocolo

Os tecidos suínos foram obtidos comercialmente, portanto, a aprovação não foi exigida pelo comitê de ética animal.

1. Descelularização da medula espinhal suína (Tempo estimado: 5 dias)

NOTA: Realizar a descelularização utilizando protocolos previamente estabelecidos com modificações25,26. Todos os procedimentos devem ser feitos em um gabinete de biossegurança estéril à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Todas as soluções devem ser filtradas estéreis usando um filtro superior de frasco (tamanho de poro de 0,2 μm) em frascos autoclavados. Os procedimentos a serem realizados a 37 °C podem ser feitos dentro de uma incubadora ou de um forno limpo regulado para 37 °C.

  1. Preparação de soluções de descelularização
    NOTA: Todas as soluções são calculadas para 1 L. Os usuários podem precisar ajustar o volume final necessário de acordo com suas necessidades experimentais.
    1. Dilua 500 mL de tripsina a 0,05% / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) com 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para produzir 0,025% de tripsina / EDTA.
    2. Dilua 300 mL de Triton X-100 a 10% com 700 mL de PBS para fazer 3% de Triton X-100. Misture 0,56 g de NaCl, 1,31 g de NaH2PO4H2O e 10,85 g de HNa2O4P·7H2O em 1 L de água deionizada para fazer 100 mM de tampão Na/50 mM phos.
    3. Misture 32,4 g de sacarose em 1 L de água deionizada para fazer 1 M de sacarose. Misture 40 g de desoxicolato de sódio (SD) em 1 L de água deionizada para fazer uma solução de 4% de SD. Diluir 6,7 mL de ácido peracético a 15% com 993,3 mL de etanol a 4%.
  2. Preparação da medula espinhal suína
    NOTA: As medulas espinhais foram enviadas congeladas sem qualquer solução e mantidas a -80 °C até o uso.
    1. Descongele a medula espinhal a 4 °C na geladeira por 18-24 h antes da descelularização. Use uma tesoura estéril para remover a dura-máter com cuidado.
    2. Corte a medula espinhal em pedaços pequenos (aproximadamente 1 cm de comprimento). Coloque uma peça em um tubo de 15 mL ou no máximo três peças em um tubo de 50 mL.
  3. Descelularização da medula espinhal
    NOTA: Após cada etapa, as soluções de descelularização são despejadas manualmente em um béquer grande para serem descartadas. Um pequeno filtro de aço inoxidável autoclavável pode ser usado para ajudar a descartar soluções de descelularização sem perder os tecidos necessários para cada etapa. A medula espinhal foi agitada a 83 rpm, salvo indicação em contrário.
    1. Enxágue a medula espinhal com água deionizada por 18-24 h a 4 °C e 60 rpm.
    2. Enxágue a medula espinhal com 0,025% de tripsina / EDTA por 1 h a 37 ° C e 40 rpm. Em seguida, enxágue a medula espinhal com PBS por 15 min, 2x.
    3. Enxágue a medula espinhal com Triton X-100 a 3% por 2 h. Enxágue a medula espinhal com 100 mM de tampão-foso por 15 min, 2x.
    4. Enxágue a medula espinhal com sacarose 1 M por 1 h. Em seguida, enxágue a medula espinhal com água deionizada por 1 h.
    5. Enxágue a medula espinhal com 4% de SD por 2 h. Em seguida, enxágue a medula espinhal com 100 mM de tampão de Na / 50 mM de fósforo por 15 min, 2x.
    6. Enxágue a medula espinhal com ácido peracético a 0,1% em etanol a 4% por 4 h. Em seguida, enxágue a medula espinhal com PBS por 1 h.
    7. Enxágue a medula espinhal com água deionizada por 1 h, 2x. Em seguida, enxágue a medula espinhal com PBS por 1 h.
    8. Liofilizar a medula espinhal a 0,01 mbar e -56 °C por 3 dias e armazenar seco até o uso.

2. Descelularização do nervo ciático suíno (Tempo estimado: 5 dias)

NOTA: Realizar a descelularização utilizando protocolo previamente estabelecido27. Todos os procedimentos devem ser feitos em um gabinete de biossegurança estéril à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Todas as soluções devem ser filtradas estéreis usando um filtro superior de frasco (tamanho de poro de 0,2 μm) em frascos autoclavados. Os procedimentos a serem realizados a 37 °C podem ser feitos dentro de uma incubadora ou de um forno limpo regulado para 37°C.

  1. Preparação de soluções de descelularização
    NOTA: Todas as soluções são calculadas para 1 L. Os usuários podem precisar ajustar o volume final necessário de acordo com suas necessidades experimentais.
    1. Prepare 50 mM de tampão Na/10 mM phos misturando 1,86 g de NaCl, 0,262 g de d NaH2PO4H2O e 2,17 g de HNa2O4P·7H2O em 1 L de água deionizada.
    2. Prepare a solução de sulfobetaína-10 (SB-10) a 125 mM misturando 38,4 g de SB-10 em 1 L de tampão foso 50 mM Na/10 mM.
    3. Preparar a solução de sulfobetaína-16 (SB-16) a 3 % SD/0,6 mM misturando 30 g de SD e 0,24 g de SB-16 em 1 l de tampão fosfo-50 mM Na/10 mM.
  2. Preparação do nervo ciático suíno
    NOTA: Os nervos ciáticos foram enviados congelados com PBS e mantidos a -80 ° C até o uso.
    1. Descongele o nervo ciático a 4 °C na geladeira 18-24 h antes da descelularização.
    2. Corte o nervo ciático em pedaços pequenos (aproximadamente 1 cm de comprimento). Coloque uma peça em um tubo de 15 mL ou no máximo três peças em um tubo de 50 mL.
  3. Descelularização do nervo ciático
    NOTA: Após cada etapa, as soluções de descelularização são despejadas manualmente em um béquer grande para serem descartadas, e um pequeno filtro autoclavável de aço inoxidável pode ser usado para ajudar a descartar as soluções de descelularização sem perder os tecidos necessários para cada etapa. O nervo ciático foi agitado a 15 rpm, salvo indicação em contrário.
    1. Enxágue o nervo ciático com água deionizada por 7 h. Em seguida, enxágue o nervo ciático com sulfobetaína-10 125 mM (SB-10) em tampão fosfós 50 mM / 10 mM por 18 h.
    2. Enxágue o nervo ciático com 100 mM de tampão Na/50 mM de phos por 15 min. Em seguida, enxágue o nervo ciático com 3% de SD / 0,6 mM de sulfobetaína-16 (SB-16) em tampão foso 50 mM de Na / 10 mM por 2 h.
    3. Enxágue o nervo ciático com 100 mM de tampão de Na/50 mM de phos por 15 min, 3x. Em seguida, enxágue o nervo ciático com 125 mM SB-10 em tampão 50 mM Na/10 mM phos por 7 h.
    4. Enxágue o nervo ciático com 100 mM de tampão Na/50 mM de phos por 15 min. Em seguida, enxágue o nervo ciático com 3% de SD / 0,6 mM de SB-16 em 50 mM de tampão de phos de Na / 10 mM por 1,5 h.
    5. Enxágue o nervo ciático com 50 mM de tampão de Na / 10 mM de phos por 15 min, 3x. Em seguida, enxágue o nervo ciático com 75 U / mL de desoxirribonuclease (DNase) por 3 h sem agitação.
    6. Lave o nervo ciático com 50 mM de tampão de Na / 10 mM de phos por 1 h, 3x. Em seguida, enxágue o nervo ciático com 0,2 U / mL de Condroitinase ABC por 16 h sem agitação a 37 ° C.
    7. Enxágue o nervo ciático com PBS por 3 h, 3x. Liofilize o nervo ciático a 0,01 mbar e -56 °C por 3 dias e armazene seco até o uso.

3. Digestão de tecidos descelularizados e fabricação de hidrogéis compostos (Tempo estimado: 4 dias)

  1. Pique ou triture os tecidos descelularizados em pó usando uma tesoura ou homogeneizador. Esterilize as ferramentas para picar ou triturar os tecidos usando uma autoclave a 121 °C por 45 min. O método do óxido de etileno também é aplicável.
  2. Digerir os tecidos separadamente em solução de ácido clorídrico (HCl) 0,01 N contendo 1 mg/ml de pepsina a uma concentração de 15 mg/ml. Os pesos estimados da medula espinhal descelularizada e do nervo ciático são de 50-100 mg e 100-150 mg por peça, respectivamente.
  3. Coloque a barra magnética e mexa a 500 rpm e 4 °C por pelo menos 4 dias para gerar soluções de pré-gel.
  4. Misture o pré-gel do nervo ciático e da medula espinhal nas seguintes proporções volumétricas: 2:1, 1:1 e 1:2. Ajuste o pH 7,4 usando hidróxido de sódio (NaOH) 1 N e HCl e dilua até a concentração desejada usando meio M199 e 1x PBS. Incubar a 37 °C durante 30 min.
    NOTA: Adicione NaOH 1 μL de cada vez. O meio M199 pode ser usado como um indicador de pH, pois fica rosa claro quando o pH é 7,4, mas as tiras de pH devem ser usadas para confirmar o nível de pH.

4. Verificação da descelularização

  1. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E; Tempo estimado: 8 dias)
    NOTA: Após cada etapa de enxágue, as soluções são despejadas manualmente em um béquer grande para serem descartadas.
    1. Fixe a medula espinhal e o nervo ciático frescos e descelularizados em formaldeído a 3,7% a 4 ° C por 18 h. Coloque uma peça em um tubo de 15 mL.
    2. Retire o formaldeído e coloque os tecidos em sacarose a 10% por 1 dia. Retire 10% de sacarose e coloque os tecidos em 30% de sacarose por 6 dias.
    3. Encha um criomoldor de tamanho apropriado com temperatura de corte ideal (OCT) até a metade. Coloque os tecidos descelularizados, cubra-os com OCT e deixe-os absorver o OCT por 1 dia.
    4. Após 1 dia, congele os tecidos durante a noite a -80 °C. Criosecção dos tecidos com 10 μm de espessura usando um criostato.
    5. Enxágüe com 1x PBS por 5 min, 2x. Em seguida, enxágue com água da torneira por 5 min.
    6. Manchar com solução de hematoxilina por 1 min. Enxágüe com água da torneira por 1 min, 3x.
    7. Manchar com solução de eosina por 1 min. Enxágue com etanol a 95% por 1 min, 2x e com etanol a 100% por 1 min, 3x.
    8. Enxágüe com xileno por 1 min, 2 min e depois 1 min. Deixe as lâminas secarem por 5 min.
    9. Use um cotonete para pingar 3 a 4 gotas de solução de montagem de dibutilftalato poliestireno xileno (DPX) nas lâminas. Coloque as lamínulas em cima dos slides cobertos com DPX. Deixe as lâminas secarem durante a noite.
  2. Análise de DNA (Tempo estimado: 1 h)
    1. Pesar tecidos descelularizados e liofilizados. Isole e quantifique o DNA usando kits disponíveis comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.

5. Caracterização de hidrogéis compósitos

  1. Teste de turbidez de gelificação (Tempo estimado: 1 h)
    1. Coloque 100 μL de soluções de pré-gel em cada poço de uma placa de 96 poços no gelo. Leia a absorbância a 405 nm a cada 2 minutos por 45 minutos usando um leitor de placas.
    2. Calcular a absorbância normalizada utilizando a seguinte equação:
      (Absorbância - AbsorbânciaInicial) / (AbsorbânciaMáxima - AbsorbânciaInicial)
    3. Calcule a inclinação da curva e o tempo para atingir 50% e 95% de gelificação, t1/2 e t95, respectivamente.
  2. Teste de compressão (tempo estimado: 1 min por hidrogel)
    1. Fabricar hidrogéis compósitos na concentração de 12 mg/mL com 8 mm de diâmetro e 2 mm de altura.
    2. Use um reômetro para comprimir as amostras com uma carga de 250 N entre placas paralelas de aço inoxidável a uma taxa de deformação de 10% da altura da amostra/min. O software que fornece leituras do reômetro fornecerá uma curva tensão-deformação aplicando a força e medindo a deformação até que os hidrogéis se quebrem.
    3. Calcule o módulo de Young a partir da inclinação da região linear das curvas tensão-deformação.

6. Cultura tridimensional de ASCs humanos em hidrogéis compostos de nervos

  1. Preparação de plataforma tridimensional (3D) (Tempo estimado: 3 h)
    1. Gravura em àgua forte a bolacha de silicone com SU-8 fotorresistente para gerar testes padrões circulares de 200 μm na profundidade e de 4 milímetros no diâmetro.
    2. Misture a base de polidimetilsiloxano (PDMS) e o agente de cura na proporção de 10:1. Despeje a mistura no wafer de silício e deixe descansar por 20 min para remover todas as bolhas que surgem da mistura da base PDMS e do agente de cura.
    3. Leve ao forno e catalise durante 2 h a 70 °C. Desenforme a folha de PDMS curada e perfure usando um punção de biópsia de 8 mm de diâmetro para fazer micropoços PDMS.
    4. Coloque os micropoços em uma placa de 96 poços e coloque a placa de poço em um limpador de plasma de ar para esterilizar os micropoços PDMS.
    5. Funcionalize micropoços PDMS com 1% de polietilenoimina (PEI) e 0,1% de glutaraldeído (GA) por 10 min e 20 min, respectivamente. Lave os micropoços com água destilada, 2x.
  2. Preparação de hASCs (Tempo estimado: 7 dias)
    1. Células de passagem de cultura por 2-5 passagens em meios de crescimento de hASCs (meios basais de hASCs suplementados com soro fetal bovino (FBS) e penicilina/estreptomicina (Pen-strep)) até confluentes. Passe e calcule o número de células usando um hemacitômetro ou contador de células.
  3. Hidrogéis compostos de nervo carregados de ASC (Tempo estimado: 2 h)
    1. Misture o pré-gel do nervo ciático e da medula espinhal em uma proporção volumétrica de 2:1, 1:1, 1:2 e prepare o hidrogel somente da medula espinhal sem misturar nenhum pré-gel do nervo ciático.
    2. Adicione o meio M199 e ajuste o pH 7,4 usando 1 N NaOH e HCl. Ressuspenda os hASCs com meio de crescimento no pré-gel a uma densidade de 1 x 106 células / mL.
      NOTA: A quantidade de M199 e suspensão celular deve ser de 10% de pré-gel.
    3. Dilua o pré-gel para 12 mg/mL usando 1x PBS. Coloque o pré-gel em micropoços e incube por 30 min. Cultura de hidrogéis carregados de ASC em meios de crescimento de hASCs.
  4. Teste de viabilidade celular (Tempo estimado: 4 h por dia)
    1. Preparar soluções de teste de viabilidade usando reagentes disponíveis comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Aspire a média nos dias 1, 4, 7 e 14. Adicionar o reagente aos alvéolos e incubar a 37 °C durante 3 h, seguindo as instruções do fabricante.
    3. Ler fluorescência com excitação/emissão de 560/590 nm utilizando um leitor de placas. Calcule a diferença percentual usando a seguinte equação:
      [(amostra de fluorescência -branco de fluorescência) /branco de fluorescência] x 100

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Resultados

Os tecidos descelularizados foram preparados usando protocolos previamente estabelecidos com pequenas modificações26,27. Após a descelularização, liofilização e digestão, foram fabricados hidrogéis compostos nervosos nas proporções de SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 e hidrogéis somente da medula espinhal (Figura 1). A remoção dos componentes nucleares foi confirmada pela coloração H&E (Fig...

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Discussão

Acredita-se amplamente que a fisiopatologia da LM é complexa e multifacetada. Embora terapias únicas, como transplante de células, administração de medicamentos e biomateriais, tenham fornecido informações valiosas sobre a LME, a natureza complicada da LME pode limitar sua eficácia individual 28,29,30,31. Portanto, os esforços para desenvolver terapias combinat...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação PhRMA e pelos Institutos Nacionais de Saúde por meio do prêmio número P20GM139768 e R15NS121884 concedido à YS. Queremos agradecer ao Dr. Kartik Balachandran e ao Dr. Raj Rao, do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Arkansas, por nos deixarem usar seus equipamentos. Além disso, queremos agradecer ao Dr. Jin-Woo Kim e ao Sr. Patrick Kuczwara, do Departamento de Engenharia Biológica e Agrícola da Universidade de Arkansas, por fornecerem treinamento em reômetro.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3-(Decildimetilamonio)sulfonato de propano sal internoSigma-AldrichD4266Usado durante a descelularização do nervo ciático, SB-10
3-(N,N-Dimetilpalmitilammonio)sulfonato de propanoSigma-AldrichH6883Usado durante a descelularização do nervo ciático, SB-16
Reagente AlamarBlueFisher ScientificDAL1100Usado durante o teste de viabilidade das células AlamaBlue
Condroitinase ABCSigma-AldrichC3667Usado durante a descelularização do nervo ciático
CriostatoLeicaCM1860
DesoxirribonuclásioSigma-AldrichD4263Usado durante a descelularização do nervo ciático
Fosfato de hidrogênio dissódico heptahidratadoVWRBDH9296Químico para 100 mM Na/50 mM de phos e 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Blood Kit de papel de sedaQiagen69506Usado durante a análise de DNA
Montagem DPX para histologia, meio de montagem do ferrolhoSigma-Aldrich6522Usado durante H& Coloração por E
EosinaSigma-AldrichHT110216Usado durante H& Coloração por E
EtanolVWR89125-172
FormaldeídoSigma-Aldrich252549Usado durante H& Coloração por E
Glutaraldeído (GA)Sigma-AldrichG6257Usado durante a funcionalização da superfície do PDMS
Mídia de crescimento hASCLonzaPT-4505Usado para cultivar hASCs, contendo soro bovino fetal e penicilina/estreptomicina
HematoxilinaVWR26041-06Usado durante H& Coloração por E
Células-tronco humanas derivadas do adiposoLonzaPT-5006
Ácido clorídrico (HCl)Sigma-Aldrich320331Usado para digerir tecidos descelularizados e ajustar soluções de Pregel
Mídia M199Sigma-AldrichM0650Usado para diluir pregels até a concentração desejada
Composto temperatual de corte ótimoTecido-tecido4583
PepsinaSigma-AldrichP7000Usado para digerir tecidos descelularizados
Ácido peracéticoBeco do LaboratórioPAA1001Usado durante a descelularização da medula espinhal
Soro salino tamponado com fosfato (PBS)VWR97062-948
Leitor de placasBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polietileneimina (PEI)Sigma-Aldrich181978Usado durante a funcionalização da superfície do PDMS
Nervo ciático suínoTissue Source LLCPorcos vivos, sem informações identificáveis e sem detalhes de rastreabilidade
Medula espinhal suínaTissue Source LLCPorcos vivos, sem informações identificáveis e sem detalhes de rastreabilidade
Sistema dsDNA QuantiFluorPromegaE2670Usado para analisar o conteúdo do DNA
ReômetroTA InstrumentsDHR 2
Rotador robustoGlas-co099A RD4512Usado durante a descelularização da medula espinhal
Cloreto de sódio (NaCl)VWRBDH9286Químico para 100 mM Na/50 mM de phos e 50 mM Na/10 mM phos buffer
Desoxicolato de sódioSigma-AldrichD6750
Monohidratado de fosfato de dihidrogênio de sódioVWRBDH9298Químico para 100 mM Na/50 mM de phos e 50 mM Na/10 mM phos buffer
Solução de hidróxido de sódio (NaOH)Sigma-Aldrich415443Usado para ajustar as soluções de Pregel
SU-8Materiais recomendados por KayakuSU8-100Usado para revestir pastilha de silício
SacaroseSigma-AldrichS8501Usado durante a descelularização da medula espinhal
Kit de elastomer de silicone Sylgard 184DOW1317318Base e agente de cura do polidimetilxiloxano (PDMS)
Triton X-100Sigma-AldrichX100Usado durante a descelularização da medula espinhal
Tripsina-EDTA (0,05%), fenol vermelhoThermo Fisher25300062Usado durante trabalhos com hASC e durante a descelularização da medula espinhal
Rotador de revólver tubularThermo Fisher88881001Usado durante a descelularização do nervo ciático
XilenoVWRMK866816Usado durante H& Coloração por E

Referências

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