Este protocolo descreve metodologias para estabelecer um modelo simples e eficiente de implantação embrionária in vitro para avaliar as moléculas relevantes que afetam o processo de implantação embrionária.
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Artigo de método
Estabelecimento de um Modelo de Implantação Embrionária In Vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
A implantação do embrião é o primeiro passo para o estabelecimento de uma gravidez bem-sucedida. Um modelo in vitro para implantação de embriões é fundamental para pesquisa biológica básica, desenvolvimento de medicamentos e triagem. Este trabalho apresenta um modelo in vitro simples, rápido e altamente eficiente para implantação embrionária. Neste protocolo, primeiro apresentamos a aquisição de blastocisto de camundongo e a preparação de células de adenocarcinoma endometrial humano (Ishikawa) para implantação, seguida pelo método de co-cultura para embriões de camundongo e células de Ishikawa. Finalmente, realizamos um estudo para avaliar o impacto de concentrações variáveis de 17-β-estradiol (E2) e progesterona (P4) nas taxas de adesão embrionária com base neste modelo. Nossos achados revelaram que altas concentrações de E2 reduziram significativamente a adesão embrionária, enquanto a adição de progesterona poderia restaurar a taxa de adesão. Este modelo oferece uma plataforma simples e rápida para avaliar e rastrear moléculas envolvidas no processo de adesão, como citocinas, drogas e fatores de transcrição que controlam a implantação e a receptividade endometrial.
Introdução
A implantação embrionária, etapa inicial do sucesso da gravidez, é crucial para entender sua base biológica e enfrentar os desafios da infertilidade. No entanto, as restrições éticas representam limitações significativas na coleta de amostras clínicas de embriões humanos, dificultando a pesquisa sobre as intrincadas interações entre embriões humanos e o endométrio durante o início da gravidez1. Uma compreensão profunda desses mecanismos complexos é vital para o avanço da pesquisa biológica fundamental, descoberta de medicamentos e saúde reprodutiva.
Modelos in vitro anteriores empregaram modelos de adesão em que células epiteliais endometriais humanas monocamadas (RL95-2)2 foram co-cultivadas com substitutos embrionários, como células de coriocarcinoma BeWo, JAr ou Jeg-33 . No entanto, a seleção do tamanho dos esferoides, variando de 70 a 100 μm, foi crucial, pois agregados celulares maiores ou menores poderiam comprometer a precisão do experimento. Notavelmente, apenas 25% dos esferoides em cada preparação atenderam ao padrão parao tamanho 4 adequado, e houve diferenças significativas em comparação com as condições fisiológicas dos blastocistos.
Além disso, os sistemas de cultura tridimensionais (3D) para o endométrio e o blastocisto oferecem um ambiente fisiologicamente mais relevante5, mas exigem alto conhecimento técnico, crescimento celular lento, altos custos de recursos e manutenção, dificuldade de padronização e baixa reprodutibilidade6.
Neste protocolo, apresentamos um modelo in vitro de implantação embrionária rápido e econômico que pode ser desenvolvido e utilizado na maioria dos laboratórios. O objetivo geral deste método é fornecer uma plataforma confiável e reprodutível para estudar as interações entre embriões e o endométrio em um ambiente controlado. Ao simular eventos-chave de implantação embrionária in vitro, este modelo visa preencher a lacuna entre modelos animais e ambientes clínicos, permitindo pesquisas mais precisas e direcionadas.
Em comparação com os substitutos embrionários, o uso de blastocistos de camundongo oferece uma representação fisiologicamente mais relevante do processo de implantação embrionária in vivo7. Além disso, a linhagem celular de Ishikawa, derivada do adenocarcinoma endometrial humano, possui características mistas de epitélio glandular e epitélio do lúmenuterino 1, permitindo expressar enzimas, proteínas estruturais e receptores esteroides funcionais semelhantes aos encontrados no endométrio normal, fornecendo assim um substrato fisiologicamente relevante para a implantação embrionária. A simplicidade e rapidez do sistema de co-cultura permitem triagem de alto rendimento e testes de drogas 8,9,10. Ao fornecer uma plataforma robusta e reprodutível, este método oferece uma oportunidade de avançar nossa compreensão da implantação embrionária e seu impacto na saúde humana.
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Protocolo
O manuseio de camundongos e estudos experimentais foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê Animal do Instituto de Tecnologias Biomédicas e Farmacêuticas de Xangai. Garanta os procedimentos de segurança: Sempre use equipamento de proteção individual (EPI) adequado ao manusear produtos químicos ou materiais biológicos.
1. Aquisição de embriões de camundongos
NOTA: Esta seção descreve o processo de obtenção de embriões de camundongos. Camundongos fêmeas adultas (6-8 semanas de idade, híbridos C57BL/6 e DBA/2) foram mantidos em condições ambientais padrão de 12 h de luz e 12 h de escuridão a 20-25 °C e 40-60% de umidade com comida e água fornecidas ad libitum.
- Injetar camundongos fêmeas por via intraperitoneal com 10 UI de gonadotrofina sérica de égua prenhe (PMSG) e, em seguida, injetar 10 UI de gonadotrofina coriônica humana (HCG) em um intervalo de 42-48 horas.
- Acasalar cada camundongo fêmea com um macho de idade comparável e verificar se há um tampão vaginal na manhã seguinte.
NOTA: O tampão vaginal é um nódulo de supositório amarelo claro formado após a solidificação do sêmen na abertura vaginal. - Eutanasiar os camundongos fêmeas com tampões vaginais por inalação de CO2 .
- Abra o abdômen e localize a genitália feminina; estique o oviduto, o ovário e as bolsas de gordura com uma pinça; corte o oviduto e o ovário com uma tesoura; e, em seguida, cortar o oviduto e o útero (Figura 1).
- Transferir o oviduto obtido para uma placa de Petri de 35 mm pré-preenchida com meio M2.
NOTA: O meio M2 deve ser pré-aquecido em uma incubadora (37 °C, 5% CO2) por 30 min. - Perfure a ampola aumentada do oviduto com uma agulha de 25 G para liberar ou beliscar o complexo cumulus-zigoto (Figura 2).
- Use uma pinça para transferir o complexo cumulus-zigoto para uma solução M2 contendo 0,5 mg / mL de hialuronidase e incube por vários minutos até que as células do cumulus se dissociem (Figura 3).
- Colete os zigotos usando uma pipeta de transferência de ovos e lave-os em meio M2 contendo 4 mg / mL de BSA para remover a hialuronidase residual, células do cumulus e impurezas.
2. Cultura in vitro de embriões de ratinhos
NOTA: Esta seção detalha o processo de cultura in vitro de embriões de camundongos de zigotos a blastocistos. As microgotas de cultura KSOM devem ser preparadas com 24 horas de antecedência para garantir o equilíbrio da temperatura e do gás.
- Preparar 12 microgotículas de meio KSOM, cada uma com um volume de 20 μl, no fundo de uma placa de Petri de 35 mm. Cubra as microgotículas com 3-5 mL de óleo mineral (Figura 4) e coloque as placas de Petri em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 para equilíbrio.
- Transferir os embriões de ratinho do meio M2 para o meio KSOM utilizando uma pipeta de transferência para uma lavagem completa.
NOTA: Esta etapa requer um estereomicroscópio com um estágio de aquecimento de 37 °C. Minimize a duração do manuseio do embrião fora da incubadora. - Colocar os embriões lavados nas microgotículas KSOM preparadas e incubá-los a 37 °C com 5% de CO2 durante 4 dias.
NOTA: Para garantir uma nutrição adequada, cultive 5-10 embriões por microgota de 20 μL. - Selecione blastocistos vantajosos de acordo com seu tamanho (100-130 μm), massa celular interna (a massa celular interna é composta por muitas células compactadas), número de células trofoblásticas (a trofectoderme composta por muitas células coesas e compactadas) e o grau de expansão (blastocele ocupa 80-100% do embrião).
3. Preparação de células endometriais
- Dentro de um gabinete de biossegurança, aspire 1 mL de gelatina a 2% usando uma pipeta e distribua-a em uma placa de cultura de 12 poços. Gire suavemente a placa para garantir a cobertura completa do fundo com a gelatina. Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C por 30 min. Depois, aspire o excesso de gelatina e deixe o fundo do prato secar completamente.
- Após a conclusão do processo de revestimento, cultive células de adenocarcinoma endometrial humano (Ishikawa) com DMEM/F12 (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes), 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de L-glutamina, 100 μg/mL de estreptomicina e 100 UI/mL de penicilina, semeie-as nas placas de 12 poços revestidas com gelatina (2 × 105células/poço) e incube por 24 h.
4. Fixação do embrião
- Coloque delicadamente 5-15 blastocistos frescos em cada poço da placa de 12 poços contendo células de Ishikawa preparadas na etapa anterior para co-cultura (Figura 5).
- Após 48 h de incubação, observe os embriões ao microscópio para avaliar seu status de fixação. Para observar a fixação do embrião, mova rapidamente a placa três vezes. Embriões soltos exibirão movimento flutuante ou rolante sobre a superfície das células de Ishikawa.
- Calcular a taxa de implantação embrionária usando a equação (1); Use a taxa de adesão do embrião para representar o efeito de implantação.
Taxa de implantação de embriões = (Embriões anexados/Número total de embriões implantados) × 100% (1)
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Resultados
No processo de técnicas de reprodução assistida, a hiperestimulação ovariana controlada (COH) é uma etapa crucial, levando a níveis significativamente elevados de estrogênio em pacientes em mais de 10 a 20 vezes em comparação com os ciclos naturais11. Diante desse contexto, perguntamos se altas concentrações séricas de estrogênio afetam a implantação do embrião durante a transferência de embriões frescos. Com base nesse modelo de implantação embrionária, estudamos os efeitos de várias concentraçõe...
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Discussão
A simplicidade e rapidez do modelo in vitro proposto para implantação de embriões oferecem vantagens notáveis para a triagem de medicamentos em estágio inicial e outras aplicações de pesquisa. O protocolo simples, juntamente com a natureza de alto rendimento das linhagens celulares de Ishikawa, o torna um candidato ideal para telas em larga escala, particularmente nos estágios iniciais da descoberta de medicamentos. Liang13 descobriu que o knockdown de TAGLN2 diminuiu a capacidade de inva...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesses financeiros ou outros a declarar.
Agradecimentos
Nossos estudos foram apoiados pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82171603), pela Fundação da Comissão Municipal de Saúde de Xangai (202140341), pela Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (23JC1403803) e pelo Programa de Promoção da Inovação do NHC e Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 17-β-estradiol | SIGMA | 3301 | Hormônio estrogênico mamífero mais potente |
| BD Falcon | BD | 353001 | Placas de Petri Bacteriológicas 35 x 10 mm estilo com tampa hermética, poliestireno virgem de grau cristalino, estéril |
| Gabinete de Biossegurança | classe ESCO |  BSC | Operações assépticas, fabricação de placas de cultura, alíquotas de reagentes, etc |
| CO2 Incubadora | Thermo | 8000DH | Cultura de embriões |
| Placa de cultura | Corning | 3506 | Cultura de células |
| DMEM/F12 | Gibco | 1133032 | DMEM/F12 (1x), líquido 1:1, Contém L-glutamina e tampão HEPES 15 |
| mM Soro bovino fetal | Gibco | 10099141 | Soro Fetal Bovino, Qualificado, Origem da Austrália |
| Gelatina | SIGMA | G9391 | Tipo B, pó, BioReagente, adequado para cultura de células |
| HCG | Nanjing Aibei | M2520 | Reagente de esterilização, injeção intraperitoneal, 50 UI/mL |
| Hialuronidase | SIGMA | V900833 | Grau de reagente, pó |
| KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x), Pó, sem Vermelho de Fenol, 5 x 10 mL |
| L-glutamina | Gibco | 25030081 | L-glutamina-200 mM (100x), líquido |
| M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 Médio (1x), Líquido, com Óleo Mineral de Vermelho de Fenol |
| SIGMA | M8410 | é adequado para uso como camada de cobertura para controlar a evaporação e a contaminação cruzada em várias aplicações de biologia molecular | |
| Penicilina-estreptomicina, | Gibco | 15140122 | 10.000 unidades de penicilina (base) e 10.000 unidades de estreptomicina (base), utilizando penicilina G (sal de sódio) e sulfato de estreptomicina em solução salina a 0,85% |
| PMSG | Nanjing Aibei | M2620 | Reagente de esterilização, injeção intraperitoneal, 50 UI/mL |
| Progesterona | SIGMA | 5341 | Hormona esteróide secretada pelo corpo lúteo durante a segunda metade do ciclo menstrual |
| Piruvato de sódio | Gibco | 11360070 | O piruvato de sódio é comumente adicionado aos meios de cultura de células como fonte de carbono, além da glicose |
| Estereomicroscópio | Olympus | SZX7 | Recuperação de embriões e observação do desenvolvimento embrionário |
Referências
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Reimpressões e permissões
