Um pipeline versátil para analisar mudanças dinâmicas em corpos nucleares em uma variedade de tipos de células

Resumo

Este método descreve um protocolo de imunofluorescência e pipeline de quantificação para avaliar a distribuição de proteínas com padrões variados de organização nuclear em linfócitos T humanos. Este protocolo fornece orientação passo a passo, começando pela preparação da amostra e continuando com a execução da análise semiautomatizada em Fiji, concluindo com o tratamento de dados por um notebook Google Colab.

Resumo

Vários processos nucleares, como o controle transcricional, ocorrem dentro de estruturas discretas conhecidas como focos que são discerníveis através da técnica de imunofluorescência. Investigar a dinâmica desses focos sob diversas condições celulares por meio de microscopia produz informações valiosas sobre os mecanismos moleculares que governam a identidade e as funções celulares. No entanto, a realização de ensaios de imunofluorescência em diferentes tipos de células e a avaliação de alterações na montagem, difusão e distribuição desses focos apresentam inúmeros desafios. Esses desafios abrangem complexidades na preparação de amostras, determinação de parâmetros para análise de dados de imagem e gerenciamento de volumes substanciais de dados. Além disso, os fluxos de trabalho de imagem existentes geralmente são adaptados para usuários proficientes, limitando assim a acessibilidade a um público mais amplo.

Neste estudo, apresentamos um protocolo de imunofluorescência otimizado adaptado para investigar proteínas nucleares em diferentes tipos de células T primárias humanas que podem ser personalizadas para qualquer proteína de interesse e tipo de célula. Além disso, apresentamos um método para quantificar de forma imparcial a coloração de proteínas, quer elas formem focos distintos ou exibam uma distribuição nuclear difusa.

Nosso método proposto oferece um guia abrangente, desde a coloração celular até a análise, aproveitando um pipeline semiautomatizado desenvolvido em Jython e executável em Fiji. Além disso, fornecemos um script Python fácil de usar para simplificar o gerenciamento de dados, acessível publicamente em um notebook do Google Colab. Nossa abordagem demonstrou eficácia em produzir análises de imunofluorescência altamente informativas para proteínas com diversos padrões de organização nuclear em diferentes contextos.

Introdução

A organização do genoma eucariótico é governada por múltiplas camadas de modificações epigenéticas¹, coordenando várias funções nucleares que podem ocorrer dentro de compartimentos especializados chamados corpos nucleares ou condensados². Dentro dessas estruturas, ocorrem processos como iniciação da transcrição³, processamento de RNA ^4,5,6, reparo de DNA ^7,8, biogênese do ribossomo ^9,10,11 e regulação da heterocromatina^12,13. A regulação dos corpos nucleares se ajusta às dimensões espaciais e temporais para acomodar as necessidades celulares, guiada pelos princípios de separação de fases^14,15. Consequentemente, esses corpos funcionam como fábricas transitórias onde os componentes funcionais se montam e se desmontam, sofrendo mudanças de tamanho e distribuição espacial. Portanto, entender as características das proteínas nucleares por microscopia, incluindo sua propensão a formar corpos e seu arranjo espacial em diferentes condições celulares, oferece informações valiosas sobre seus papéis funcionais. A microscopia de fluorescência é um método amplamente utilizado para o estudo de proteínas nucleares, permitindo sua detecção por meio de anticorpos fluorescentes ou expressando diretamente alvos com um repórter de proteína fluorescente^16,17.

Nesse contexto, os corpos nucleares aparecem como focos ou pontos brilhantes, com notável grau de esfericidade, tornando-os facilmente distinguíveis do ambiente circundante^16,18. Técnicas de super-resolução como STORM e PALM, ao fornecer resolução aprimorada (até 10 nm) ¹⁹, permitem uma caracterização mais precisa da estrutura e composição de condensados específicos²⁰ . No entanto, sua acessibilidade é limitada pelas despesas com equipamentos e pelas habilidades especializadas necessárias para a análise de dados. Portanto, a microscopia confocal continua popular devido ao seu equilíbrio favorável entre resolução e uso mais amplo. Essa popularidade é facilitada pela remoção inerente da luz fora de foco, o que diminui a necessidade de extensos procedimentos de pós-processamento para segmentação precisa, sua ampla disponibilidade em institutos de pesquisa, seu tempo efetivo de aquisição e preparação de amostras que normalmente é eficiente. No entanto, medir com precisão a distribuição, montagem ou difusão de proteínas usando ensaios de imunofluorescência em diversas condições celulares apresenta desafios, pois muitos métodos existentes carecem de orientação sobre a seleção de parâmetros adequados para proteínas com padrões de distribuição variados²¹. Além disso, lidar com o grande volume de dados resultante pode ser assustador para usuários com experiência limitada em análise de dados, comprometendo potencialmente o significado biológico dos resultados.

Para enfrentar esses desafios, introduzimos um protocolo passo a passo detalhado para preparação de imunofluorescência e análise de dados, com o objetivo de fornecer um método imparcial para quantificar a coloração de proteínas com vários padrões de organização (Figura 1). Este pipeline semiautomatizado foi projetado para usuários com experiência limitada em análise computacional e de imagem. Ele combina as funcionalidades de dois plug-ins estabelecidos em Fiji: FindFoci²² e 3D suite²³. Ao integrar a capacidade precisa de identificação de focos do FindFoci com os recursos de identificação e segmentação de objetos no espaço 3D oferecidos pelo 3D suite, nossa abordagem gera dois arquivos CSV por canal para cada campo de aquisição. Esses arquivos contêm informações complementares que facilitam o cálculo de métricas adequadas para vários tipos de distribuição de sinal, como a contagem de focos por célula, a distância dos focos do centróide nuclear e o coeficiente de heterogeneidade (IC), que introduzimos para a coloração difusa de proteínas. Além disso, reconhecemos que a extrapolação de dados pode ser demorada para usuários com habilidades limitadas de manuseio de dados. Para agilizar esse processo, fornecemos um script Python que compila automaticamente todas as medidas coletadas em um único arquivo para cada experimento. Os usuários podem executar este script sem a necessidade de instalar nenhum software de linguagem de programação. Disponibilizamos um código executável no Google Colab, uma plataforma baseada em nuvem que permite a escrita de scripts Python diretamente no navegador. Isso garante que nosso método seja intuitivo e prontamente acessível para uso imediato.

Demonstramos a eficácia do nosso protocolo na análise e quantificação de alterações na distribuição de sinal de duas proteínas nucleares: proteína 4 contendo bromodomínio (BRD4) e supressor de zeste-12 (SUZ12). BRD4 é uma proteína coativadora bem documentada dentro do complexo Mediador conhecida por formar condensados associados à iniciação transcricional dependente da polimerase II^24,25. SUZ12 é um componente proteico do Complexo Repressivo Polycomb 2 (PRC2) responsável por regular a deposição da modificação da histona H3K27me3^26,27. Essas proteínas exibem padrões diferentes dentro de dois tipos distintos de células: células T CD4⁺ virgens humanas recém-isoladas, que são quiescentes e exibem taxas lentas de atividade transcricional, e células T_H1 CD4⁺ diferenciadas in vitro, que são células efetoras especializadas em proliferação mostrando transcrição aumentada²⁸.

Protocolo

O uso de amostras humanas para fins de pesquisa foi aprovado pelos Comitês de Ética da Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milão), e o consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos (números de autorização: 708_2020). O protocolo é organizado em três seções principais: execução de imunofluorescência, aquisição de imagem e análise de imagem. Em média, são necessários 4 dias úteis para ser concluído (Figura 1).

1. Preparação de imunofluorescência

NOTA: Este protocolo de imunofluorescência pode ser facilmente personalizado para vários tipos de células e alvos de proteínas, ajustando as condições de fixação e permeabilização. A preparação da imunofluorescência normalmente leva menos de 3 dias para ser concluída, com a duração da incubação do anticorpo primário variando com base na qualidade do anticorpo e na proteína alvo (Figura 1).

1. Preparação da amostra
   1. Isole as células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) por meio de uma centrifugação com gradiente de densidade por meio de aproximadamente 1.077 g/mL de densidade de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
   2. Isole as células T CD4⁺ de PBMCs com esferas magnéticas, seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
   3. Corar as células com anticorpos para CD4, CD45RA e CD45RO (Tabela de Materiais) e proceder à classificação FACS de células T CD4⁺ virgens ^{como células} CD4⁺/CD45RA⁺/CD45RO-, conforme descrito em outro lugar^29,30.
      NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter especificações do classificador FACS usado neste protocolo.
   4. Induzir a diferenciação de células T CD4⁺ virgens em T helper 1 (células T_H1 CD4⁺ ), conforme descrito em ²⁹. Resumidamente, cultive 1,5 x 10⁶ células/mL de células T CD4⁺ virgens classificadas por FACS em meio T_H1, estimulando-as com esferas magnéticas anti-CD3/anti-CD28 na proporção de 1:1. Conte as células e divida-as quando atingirem 1,5 × 10⁶ células / mL a cada 2-3 dias (consulte a Tabela 1 para a composição do meio_TH1).
   5. Avalie a secreção de citocinas da função efetora após 7 dias de diferenciação, conforme descrito em ²⁹.
2. Fixação e permeabilização celular
   NOTA: Todos esses procedimentos foram descritos em ^30,31 com pequenas adaptações.
   1. Para garantir a adesão ideal das células, trate as lamínulas de vidro (10 mm, espessura 1,5 H) com solução de revestimento (Tabela 1) da seguinte forma:
      1. Limpe as lamínulas de vidro lavando-as inicialmente com água destilada (ddH₂O), seguida de um enxágue com etanol a 70% (EtOH) e deixando-as secar ao ar.
      2. Coloque as lamínulas lavadas em uma placa de 24 poços múltiplos para as etapas 1.2.1.3-1.3.
      3. Aplique uma gota de 200 μL de solução de revestimento na lamínula de vidro. Após 5 min, retire a gota e deixe secar ao ar.
      4. Lave as lamínulas aplicando uma gota de 200 μL de ddH₂O. Após 5 min, retire a gota e seque ao ar.
      5. Repita 3 etapas 1.2.1.3-1.2.1.4.
   2. Ressuspenda células T CD4⁺ virgens e células T_H1 CD4⁺ em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 2 × 10⁶ células/mL.
      NOTA: A concentração indicada é recomendada especificamente para células pequenas, como linfócitos T primários humanos. Para células aderentes, o tratamento de revestimento de vidro é desnecessário. Em vez disso, prossiga diretamente com o cultivo das células na superfície do vidro usando o meio de cultura de células apropriado.
   3. Aplique uma gota de 200 μL da suspensão da célula na lamínula de cobertura. Deixe as células semearem à temperatura ambiente (RT) por 30 min; Em seguida, remova a gota.
   4. Fixe as células com paraformaldeído a 3% recém-filtrado (solução PFA, Tabela 1) por 10 min em RT.
   5. Lave a lamínula de vidro com TPBS (Tabela 1) por 3 x 5 min em RT.
   6. Remover o TPBS e adicionar a solução de permeabilização (Tabela 1) durante 10 min à RT.
   7. Rejeitar a solução de permeabilização e incubar a amostra em solução de armazenamento (quadro 1) durante 1 h até uma noite (ON) a 4 °C.
      NOTA: Nesta fase, o protocolo pode ser interrompido com segurança e as lamínulas de vidro podem ser preservadas em solução de armazenamento em uma placa de 24 multipoços por 3-4 semanas.
3. Imunofluorescência
   1. (Opcional) Remova a lamínula da placa de 24 poços múltiplos e congele rapidamente em gelo seco por 30 s, descongele em RT e, em seguida, lave a lamínula de vidro em um poço pré-preenchido com solução de armazenamento.
   2. (Opcional) Repita 3 x passo 1.3.1.
   3. Lavar em solução de permeabilização durante 5 min à RT. Em seguida, lave por 2 x 5 min com TPBS em RT.
   4. Incubar em HCl 0,1 N por 12 min em RT.
   5. Realize duas lavagens rápidas em 1x PBS.
      NOTA: As condições de permeabilização celular especificadas, incluindo etapas de congelamento e descongelamento e tratamento com HCl, são ideais para a coloração de componentes nucleares em células caracterizadas por cromatina densamente compactada. No entanto, ao lidar com células caracterizadas por cromatina menos compactada, é aconselhável reduzir ou evitar essas etapas. Além disso, para direcionar os componentes citoplasmáticos, considere reduzir ou eliminar o tratamento com HCl.
   6. Incubar as células com anticorpo primário (BRD4, 1:500 ou SUZ12, 1:100) diluído em tampão de diluição de anticorpos (Tabela 1) (200 μL para cada lamínula de vidro) ON a 4 °C.
      NOTA: A imunofluorescência pode ser realizada por multiplexação de mais de um anticorpo primário, dependendo das necessidades experimentais, anticorpos secundários e sistemas de detecção.
   7. Lave 3 x 5 min com PBS-T (Tabela 1) em RT com agitação suave.
   8. Incubar as células com anticorpo secundário diluído em tampão de diluição de anticorpos (200 μL para cada lamínula de vidro) durante 1 h em RT.
      NOTA: Escolha o anticorpo secundário que melhor se adapta às necessidades experimentais e aos sistemas de detecção disponíveis. Certifique-se de que cada anticorpo secundário tenha como alvo a espécie da qual o anticorpo primário é derivado. Além disso, selecione fluoróforos compatíveis com os filtros e a fonte de luz do microscópio. É crucial evitar a sobreposição espectral entre o fluoróforo escolhido e o espectro de emissão da mancha nuclear.
   9. Lave 3 x 5 min com PBS-T em RT com agitação suave.
   10. Coloração com 1 ng/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluído em 1x PBS por 5 min em RT.
       NOTA: Corantes alternativos podem ser usados para coloração nuclear, desde que não se sobreponham ao espectro de emissão de anticorpos secundários.
   11. Execute várias lavagens rápidas em 1x PBS.
   12. Monte a lamínula de vidro em uma lâmina de microscopia com mídia de montagem antidesbotamento.

2. Aquisição de imagem

NOTA: A duração da aquisição da imagem depende do instrumento e das configurações selecionadas.

1. Aquisição de microscópio confocal
   1. Capture imagens 3D usando um microscópio confocal, definindo um tamanho de passo de 0,25 μm em z e tamanho de pixel de 0,1-0,2 μm.
      NOTA: Para obter a resolução ideal limitada por difração de luz com nossa objetiva de óleo de 63x 1,4 NA, definimos o tamanho do orifício em 0,8 UA, média de linha de 2x e tamanho do quadro de 1024 × 1024 pixels. O laser de excitação, bem como a sequência de aquisição do canal, foram selecionados deliberadamente para evitar interferência ou diafonia entre os fluoróforos usados. No entanto, o ajuste dos parâmetros deve ser adaptado às características específicas do microscópio e da amostra. Consulte a Tabela de Materiais para obter especificações do microscópio confocal usado neste protocolo.
   2. Adquira um número consistente de campos aleatórios para abranger aproximadamente 50 células por réplica biológica.

3. Análise de imagem

1. Instalação de software
   1. Baixe e instale a última versão disponível do Fiji na página oficial de download do Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   2. Instale o 3D Suite por meio do site de atualização de Fiji ou manualmente seguindo as instruções no site do 3D Suite (https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download).
   3. Instale o GDSC (FindFoci) por meio do site de atualização de Fiji ou manualmente seguindo as instruções no repositório GitHub (https://github.com/aherbert/gdsc).
2. Conversão de TIFF
   1. Baixe o script "convert_to_TIFF.py" (Arquivo Suplementar 1).
   2. Arraste e solte o script em Fiji e execute o código.
   3. No painel exibido, navegue até o caminho em que o experimento está armazenado. A subpasta que contém os arquivos TIFF convertidos é criada na mesma pasta do experimento.
3. Inicialize as configurações no 3D Manager.
   1. Abra o painel de opções do 3D Manager clicando em Plugins | 3DSuite | Opções do 3D Manager.
   2. Na janela de opções do 3D Manager, marque as caixas de seleção correspondentes às seguintes medidas: Volume (unidade), Valor médio de cinza, Caixa delimitadora (pix), Valor de cinza padrão de desenvolvimento, Centroide (pix) e Centroide (unidade).
   3. Marque as seguintes opções: Excluir objetos nas arestas XY e Excluir objetos nas arestas Z e clique em OK.
      NOTA: Esta etapa precisa ser feita apenas uma vez para configurar inicialmente as métricas que serão armazenadas nos arquivos de informações espaciais e quantitativas. As métricas selecionadas são essenciais para garantir o funcionamento adequado do pipeline. Métricas adicionais opcionais podem ser incluídas nesta etapa, conforme descrito em mais detalhes na seção Discussão.
4. Defina parâmetros na GUI do FindFoci.
   NOTA: Esta etapa precisa ser feita apenas uma vez para configurar o pipeline semiautomatizado com parâmetros ideais, que serão incorporados aos scripts.
   1. Abra a imagem de teste. Duplique o canal de proteína, incluindo a pilha (Ctrl + Shift + D), marque a caixa de seleção hyperstack e especifique o número do canal apropriado na caixa Canais (c) e renomeie-o de acordo.
   2. Inicie o gravador de macro Fiji navegando até Plugins | Macros | Registro.
   3. Abra o plugin FindFoci (clique em Plugins | GDSC | FindFoci | FindFoci GUI) e selecione a imagem a ser analisada no menu suspenso "Imagem".
   4. Defina os parâmetros da seguinte forma (Figura 2A): Desfoque gaussiano = 1,5; método de fundo = DP acima da média; parâmetro de fundo = 9; método de pesquisa = fração de pico - fundo; parâmetro de pesquisa = 0,7; método do pico = relativo acima do fundo; parâmetro de pico = 0,2; tamanho mínimo = 5; picos máximos = 1.000.000.
      NOTA: Os parâmetros indicados foram selecionados com base em nossos estudos de caso e podem não ser adequados para outros procedimentos de coloração.
   5. Para melhorar a identificação de focos, ajuste os seguintes parâmetros:
      1. O desfoque gaussiano define a extensão da suavização para melhores focos de segmento. Mantenha-o próximo ao diâmetro do foco (pixel).
      2. O parâmetro de plano de fundo define um limite para distinguir o sinal de fundo do foco. Aumente os valores para impor limites mais rigorosos.
      3. O parâmetro de pesquisa define a porcentagem de fluorescência do pico que está incluída no reconhecimento do sinal. Diminua os valores para incluir áreas mais distantes do pico de fluorescência.
      4. O parâmetro de pico determina o grau em que dois picos de sinal são considerados contínuos ou separados. Diminuir o valor resultará na separação dos picos.
      5. Picos máximos especifica o número máximo de focos identificáveis. Defina números altos para incluir todos os focos na imagem.
   6. Execute FindFoci e copie a cadeia de caracteres que aparece na janela do gravador (Etapa 3.4.2, Figura 2B) que contém os parâmetros selecionados, excluindo as aspas. Para obter mais informações relacionadas às configurações, consulte as instruções ²² do manual do plug-in.
5. Pipeline de quantificação de proteínas nucleares
   1. Baixe o script "nuclear_prot_q.py" (Arquivo Suplementar 2).
   2. Arraste e solte o script em Fiji e clique em executar para executar o código.
   3. Siga as instruções na caixa de diálogo exibida para processar as imagens.
      1. Canal do núcleo: insira o número correspondente ao canal de DAPI (ou qualquer coloração nuclear).
      2. Desfoque gaussiano do núcleo: insira o valor de sigma necessário para desfocar a imagem para segmentação.
         NOTA: Mantenha este parâmetro mais próximo do diâmetro do núcleo (ou seja, 5-6 μm). Valores sigma mais altos são indicados para coloração não homogênea.
      3. Canal de proteína: insira o número correspondente ao canal da coloração de interesse.
      4. Parâmetro FindFoci: cole a string obtida da etapa de gravação de macro na passagem 3.4.6 (Figura 2B).
      5. (Opcional) Controle de qualidade: verifique a qualidade dos núcleos segmentados. Isso pausará o script e permitirá a verificação manual de cada região nuclear de interesse (ROI) gerada.
      6. Selecione um diretório de imagem: clique no botão Procurar para navegar até a pasta que contém os arquivos TIFF a serem analisados.
   4. Depois que todas as caixas forem compiladas, clique em OK para continuar a execução.
   5. Se um núcleo não estiver segmentado corretamente e não atender aos requisitos de qualidade, exclua-o ou modifique-o conforme indicado na Figura 2C.
      1. Verifique a lista de ROI na janela ROIManager3D; se a lista estiver vazia, selecione a janela de mesclagem e clique em Quantificar 3D para atualizar o gerenciador. Em seguida, feche a tabela de resultados Quantificar 3D. Selecione o canal de núcleos e clique em Live-ROI para ON.
      2. Selecione o ROI pertencente ao mesmo núcleo e pressione Mesclar ou pressione Delete no caso de núcleos indesejados.
      3. Clique em selecionar tudo e prossiga com a análise clicando em OK na janela Verificação de máscara .
      4. Para obter resultados, procure na pasta Quantification dentro do caminho do arquivo indicado na etapa 3.5.3.6, contendo um arquivo txt com registros do parâmetro usado para a análise.
6. Pipeline no Google Colab
   1. Faça download do bloco de anotações "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" (Arquivo Suplementar 3).
   2. Abra o notebook no Google Colab (https://colab.research.google.com/).
   3. Faça upload de todas as pastas que contêm os arquivos .csv de cada campo de imagem para uma pasta de sua preferência no Google Drive.
   4. Indique no notebook o caminho da pasta onde as subpastas de resultados estão armazenadas e execute todas as células. Quando o código termina de compilar, o arquivo de planilha final contendo todos os dados compilados é criado na mesma pasta em que os arquivos .csv foram carregados.

Resultados

O protocolo descrito neste método facilita a visualização e quantificação de alterações na coloração de proteínas nucleares em células T primárias humanas e pode ser personalizado para diversos tipos de células e alvos de proteínas. Como estudos de caso, conduzimos e analisamos a coloração de BRD4 e SUZ12 em células virgens e T_H1 CD4⁺ .

O BRD4 exibe um padrão de coloração bem pontilhado em células T_H1 CD4 ⁺ virgens quiescentes e diferenciadas, permitindo o uso de parâmetros projetados para identificação de focos para ambos os tipos de células ( Figura 3A ). Nosso pipeline permite a quantificação de vários parâmetros, incluindo o número, volume, sinal de fluorescência (expresso como intensidade média de fluorescência (MFI)), cobertura e arranjo espacial dos focos BRD4 dentro do núcleo (Figura 3B-F). Além disso, introduzimos um cálculo automático para determinar a porcentagem dos focos do volume nuclear, facilitando a comparação entre células com diferentes tamanhos nucleares (Figura 3E).

Por fim, oferecemos a opção de mapear as distâncias dos focos do centro nuclear, auxiliando na compreensão de seu posicionamento nuclear (Figura 3F). Os resultados obtidos a partir da quantificação destacam alterações notáveis nos focos de BRD4 entre células T_H1 e células T CD4⁺ quiescentes, abrangendo um aumento no número, tamanho, brilho e volume dos focos, bem como diferenças em sua distribuição e localização. Esses achados são consistentes com a atividade transcricional aumentada das células T ativadas / proliferantes em comparação com sua contraparte quiescente²⁸.

Em contraste, o SUZ12 não participa da formação de condensado. Em nossa investigação, observamos uma disparidade significativa no padrão de coloração de SUZ12 entre os dois estados celulares: um padrão pontilhado em células T virgens faz a transição para um padrão difuso em células T_H1 CD4 ⁺ ( Figura 4A ). Essa mudança significativa no comportamento da proteína dificulta a comparabilidade das características dos focos usando parâmetros idênticos, uma vez que a identificação de pontos em células T_H1 CD4 ⁺ é amplamente malsucedida ( Figura 4A ). Embora seja geralmente recomendado manter a consistência nos parâmetros de aquisição e análise ao comparar a coloração por imunofluorescência em condições celulares distintas, ajustes tornam-se necessários em casos de mudanças substanciais no alvo de interesse.

Nesse cenário específico, conforme ilustrado na Figura 4B, apesar de experimentar várias combinações de parâmetros, incluindo ajuste de parâmetros de fundo, desfoque gaussiano e parâmetros de pesquisa (conforme sugerido na etapa 3.4.5 do protocolo), o FindFoci encontra dificuldades em distinguir picos de sinal verdadeiros de insignificantes devido à natureza de distribuição inerente da proteína. Além disso, enfatizamos que medições convencionais como a IMF nuclear podem ser enganosas (Figura 4C), deixando de considerar alterações na distribuição do sinal.

Assim, para medir tais alterações, sugerimos o uso do coeficiente de variação, uma métrica que introduzimos neste protocolo para caracterizar a difusão de proteínas, referido como coeficiente de heterogeneidade (IC). O IC captura com precisão a difusão de focos SUZ12 em células T_H1 CD4 ⁺ sem forçar sua identificação com abordagens de segmentação incorretas (ver Figura 4D). Finalmente, usando o DAPI como controle, que permanece uniformemente distribuído em ambas as condições celulares, validamos ainda mais a eficácia desse parâmetro (Figura 4E).

Figura 1: Representação esquemática da preparação da imunofluorescência e análise dos dados. O protocolo de coloração e análise da imunofluorescência de proteínas nucleares consiste em três fases primárias: preparo da amostra, aquisição e análise da imagem, abrangendo aproximadamente 4 dias úteis. O script utiliza dois plug-ins, o 3D Suite para realizar a segmentação de núcleos e o FindFoci para processar o canal de proteínas. As informações espaciais e quantitativas sobre os focos e o núcleo são coletadas em arquivos csv separados. Um script executável no Google Colab vincula as medições de focos aos núcleos correspondentes usando a caixa delimitadora de núcleo e calcula as medições derivadas com base nos dados coletados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Representação das configurações do pipeline de quantificação de proteínas nucleares. (A) Janela pop-up FindFoci ilustrando parâmetros para identificação de focos (seção 3.4.3 do protocolo). (B) Janela pop-up que representa a macro que grava os parâmetros selecionados do FindFoci. A string copiada é colada na janela de inicialização (etapas de protocolo 3.4.6-3.5.3.4). (C) Painel mostrando a etapa de controle de qualidade de segmentação de núcleos para remover ou modificar manualmente regiões nucleares de interesse usando o gerenciador 3D (etapas de protocolo 3.5.5.1 -3.5.5.3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Comparações entre condições celulares distintas com base em análises de focos BRD4. (A) Imagens representativas de microscopia de fluorescência confocal da coloração de imunofluorescência de BRD4 (cinza) em células T CD4⁺ primárias primárias humanas e células T_H1 CD4⁺. Os núcleos são contracorados com DAPI (azul). Ampliação original 63x; barra de escala = 5 μm. Na parte inferior, os focos BRD4, identificados pelo oleoduto, são marcados com pontas de seta brancas e contrariados em amarelo (parte inferior). (B) Gráfico de caixa representando o número/núcleo de focos BRD4 em células CD4⁺ virgens e T_H1 (n = 2 indivíduos). (C) Representação do gráfico de caixa do volume (μm³) dos focos BRD4 em células CD4 ⁺ virgens e T_H1 (n = 2 indivíduos). (D) Representação do gráfico de caixa dos focos MFI de focos BRD4 ^{em células} CD4+ virgens e T_H1 (n = 2 indivíduos). (E) Gráfico de caixa representando a porcentagem do volume nuclear ocupado pelos focos BRD4 em relação ao volume total do núcleo (n = 2 indivíduos). (F) Representação das frequências de distância dos focos BRD4 do centróide nuclear para a periferia nuclear (n = 2 indivíduos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Coeficiente de heterogeneidade, uma métrica para quantificar a transição de um padrão pontilhado para um padrão disperso em sinais de imunofluorescência SUZ12. (A) Imagens representativas de microscopia de fluorescência confocal da coloração de imunofluorescência para SUZ12 (magenta) em células T CD4⁺ primárias primárias humanas e T_H1 CD4⁺ Células. Os núcleos são contracorados com DAPI (azul). Ampliação original 63x; barra de escala = 5 μm. Na parte inferior, os focos SUZ12 identificados pelo oleoduto são marcados com uma ponta de seta branca e contrariados em laranja (B). Exemplos de identificação incorreta de focos em células T_H1 CD4⁺ mostradas por setas brancas e máscara laranja com duas configurações de parâmetros diferentes. (C) Representação do gráfico de caixa do MFI nuclear de SUZ12 em células CD4 ⁺ virgens e T_H1 (n = 2 indivíduos). (D) Representação do gráfico de caixa de SUZ12 IC em células CD4 ⁺ virgens e T_H1 (n = 2 indivíduos). (E) Representação do gráfico de caixa de DAPI IC em células CD4 ⁺ virgens e T_H1 (n = 2 indivíduos). Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo; IFM = intensidade média de fluorescência; IC = coeficiente de inomogeneidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Solução	Composição		Comentários/Descrição
TH1 médio	RPMI com GlutaMAX-I, 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 1% (v/v) de aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio, 50 UI/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 20 UI/mL de IL-2 recombinante, 10 ng/mL de IL-12 recombinante, 2 mg/mL de anti-IL-4 neutralizante.		Etapa 1.1.4.
Solução de revestimento	0,1% de poli-L-lisina em ddH2O		Etapa 1.2.1.
PBS-T	1x PBS/0,1% TWEEN 20 pH 7,0		Etapa 1.3.
Solução de PFA para fixação	3% de paraformaldeído (PFA) diluído em 0,1% de PBS-TWEEN		Etapa 1.2.4.
TPBS	0,05% Triton X-100 diluído em 1x PBS		Etapa 1.2., 1.3.
Solução de permeabilização	0,5% TPBS diluído em 1x PBS		Etapa 1.2., 1.3.
Solução de armazenamento	20% de glicerol / 1x PBS		Etapa 1.2.7., 1.3.1.
Tampão de diluição de anticorpos	0,1% PBS-TWEEN/2% Soro de Cabra/1% BSA		Etapa 1.3.6., 1.3.8.

Tabela 1: Composição da mídia e buffers usados neste protocolo.

Arquivo suplementar 1: "convert_to_TIFF.py". Este arquivo contém o script para converter qualquer arquivo de imagem (por exemplo, ND2, LIF, etc.) em arquivos TIFF necessários para processos de quantificação precisos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: "nuclear_prot_q.py". Este arquivo contém o script que permite medir e quantificar imagens contendo pelo menos dois canais (coloração de núcleo, coloração de proteína nuclear). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 3: "final_nuclear_protein metrics.ipynb". Esse arquivo contém um bloco de anotações Jupyter que extrai e compila um resumo de todos os parâmetros relevantes em um único arquivo do Excel, usando a saída de "nuclear_prot_q.py" como entrada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Neste estudo, apresentamos um método para a realização de experimentos de imunofluorescência em proteínas nucleares em linfócitos T humanos. Esse método oferece flexibilidade para uso com vários tipos de células por meio de pequenas modificações nas etapas de fixação e permeabilização, conforme descrito anteriormente^30,31.

Nosso fluxo de trabalho de imagem baseia-se em técnicas estabelecidas descritas na literatura, especificamente FindFoci e 3D Suite^22,23. Ao contrário das publicações anteriores, fornecemos um código Jython executável integrado ao Fiji para um pipeline semiautomatizado, permitindo rastreamento meticuloso de parâmetros e verificações de qualidade visual. Notavelmente, introduzimos a capacidade opcional de regular a qualidade da segmentação de núcleos na seção 3.5.3.5 do protocolo e implementamos uma etapa corretiva na seção 3.5.5 do protocolo. Com o script executável no Google Colab, os usuários podem recuperar medições abrangentes e escolher as mais adequadas para seus cenários biológicos específicos.

O pipeline de análise fornecido é escrito em Jython (Java + Python) e requer a instalação do Fiji para execução, juntamente com dois plug-ins distintos: 3D Suite e FindFoci (Figura 1). O pipeline começa com a conversão da imagem para o formato TIFF e o pré-processamento do canal que contém os núcleos com um filtro de desfoque gaussiano para aprimorar a segmentação dos núcleos. Direcionamos o 3D Suite para capturar i) informações espaciais, como volume nuclear, coordenadas de centróide e caixa delimitadora (representando a menor caixa que envolve o objeto e usada para associar focos ao núcleo direito) e ii) informações quantitativas, incluindo MFI e desvio padrão do sinal. Posteriormente, o pipeline emprega FindFoci para identificar máximos locais no sinal de focos, eliminando a dependência de métodos de limiar global (que geralmente dependem da discrição do usuário e podem não ter precisão) e registra informações espaciais e quantitativas relativas aos focos. A pasta de saída conterá, portanto, dois arquivos CSV por canal, abrangendo métricas espaciais ("M_.csv") e quantitativas ("Q_.csv").

O arquivo final, contendo todas as medições coletadas e derivadas, é gerado executando um script Python no Google Colab. Este arquivo inclui métricas como o número de focos por núcleo, MFI de focos, coeficiente de heterogeneidade (IC), MFI nuclear, distância dos focos do centróide nuclear e porcentagem de volume nuclear ocupado. Estimamos um tempo de processamento de aproximadamente 1 minuto por imagem, incluindo etapas de controle de qualidade visual. Esse tempo de processamento pode ser ainda mais acelerado por meio da otimização das configurações de imunofluorescência e dos parâmetros de análise.

O pipeline calcula parâmetros para proteínas nucleares exibindo padrões bem pontilhados e difusos, permitindo que os usuários selecionem o parâmetro mais apropriado. Recomendamos a utilização do coeficiente de heterogeneidade para descrever a dissolução de focos de proteínas.

Uma etapa crítica para garantir a identificação adequada dos focos envolve a configuração de parâmetros para discriminar picos de sinal genuínos do ruído de fundo. É crucial realizar testes completos em imagens aleatórias antes de executar o pipeline. Embora nosso estudo se concentre principalmente em um único canal, o pipeline apóia a introdução de várias combinações de corantes direcionadas a diferentes proteínas em experimentos de imunofluorescência. Ele não suporta análise simultânea de vários canais e deve ser executado separadamente para cada canal. Além disso, optamos por apresentar medidas específicas neste protocolo; No entanto, métricas adicionais, como intensidade integrada para avaliar mudanças absolutas no sinal de fluorescência ou parâmetros físicos como circularidade e compacidade, também podem ser incorporadas ao pipeline na seção 3.3.2. A inclusão de métricas não integradas atualmente a esse pipeline requer proficiência em programação Python para integrá-las no arquivo de métricas final; caso contrário, eles serão automaticamente incluídos nos arquivos de informações espaciais ("M_.csv") e quantitativas ("Q_.csv").

O tempo desse pipeline depende de fatores como tamanho e quantidade da imagem, número de canais por análise e configurações do microscópio. Além disso, o desempenho da máquina influencia o tempo de execução, com etapas visuais potencialmente retardando o processo.

Vale a pena notar que, embora a microscopia confocal ofereça informações valiosas, ela continua sendo uma tecnologia limitada por difração que pode limitar a precisão das estruturas nucleares observadas ou focos de proteínas. Para aumentar a robustez da análise, sugerimos aumentar o número de núcleos e amostras biológicas examinadas. À medida que o número de núcleos analisados aumenta, quaisquer mudanças notáveis na morfologia nuclear ou na distribuição de proteínas tornam-se mais evidentes, independentemente das limitações de resolução.

Em termos de potenciais aplicações futuras, este método apresenta versatilidade e adaptabilidade a vários tipos de células e protocolos de coloração. Por exemplo, pode ser prontamente empregado em experimentos de radiobiologia, onde a quantificação precisa de focos induzidos por radiação ionizante (IRIFs) serve como um indicador direto de danos ao DNA³². Embora nossa ênfase principal esteja na análise nuclear, o protocolo pode ser facilmente personalizado incorporando um corante citoplasmático e substituindo-o pelo canal nuclear dentro do script. Além disso, a análise pode se integrar perfeitamente a outras metodologias experimentais, como DNA e RNA FISH^30,31, aproveitando os parâmetros padrão para análise de topologia nuclear.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos Safe-Lock de 1,5 mL	Eppendord	#0030121503	Secção do protocolo 1
Pipetas serológicas de 10 mL	VWR	#612-3700	Secção do protocolo 1
20 µ Ponta de pipeta de barreira L	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocolo seção 1
50 mL Polipropileno Tubo Cônico	Falcon	#352070	Protocolo seção 1
200 µ Ponta de pipeta de barreira L	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocolo seção 1
solução antidesbotamento - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Etapa 1.3.12
BSA (Albumina de Soro Bovino)	Sigma	#A7030	Etapa 1.3.6., 1.3.8.
Kit de isolamento de células CD4+ T	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Etapa 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol)	Invitrogen	Cat#D1306	Etapa 1.3.10.
Gelo			Etapa 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	contas magnéticas passo 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Passo 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Etapa 1.1.3. Equipado com o software BD FACSDiva versão 8.0.3
FBS (Soro Fetal Bovino)	Life Technologies	#10270106	Etapa 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Etapa 1.1.1.
Versão FIJI 2.14.0	-	de	protocolo 3
Lamínula de vidro (10 mm, espessura 1,5 H)	Ciências de Microscopia Eletrônica	# 72298-13	Etapa 1.2.1.
Glicerol	Sigma	#G5516	Etapa 1.2.7-1.3.1.
Anticorpo secundário anti-coelho de cabra AF568	Invitrogen	A11036	Etapa 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Etapa 1.3.4.
anti-IL-4 neutralizante humano	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Etapa 1.1.4.
IL-12 recombinante humano	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Etapa 1.1.4.
IL-2 recombinante humana	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Etapa 1.1.4.
Microscópio confocal Leica TCS SP5	do	Leica Microsystems	, equipado com objetiva de imersão em óleo HCX PL APO 63x, 1,40 NA, com zoom adicional de 3x. Tamanho do furo : 0,8 UA. Média de linha 2 vezes;. Tamanho do quadro 1024&vezes; 1024 pixels.
Tecnologias de vida da solução de aminoácidos não essenciais MEM		# 11140035	Etapa 1.1.4.
Lâminas de microscópio	VWR	#631-1552	Passo 1.3.12.
Camundongo monoclonal anti-CD4 humano APC-Cy7 (clone RPA-T4)	BD Bioscience	#557871	Etapa 1.1.3.
Camundongo monoclonal anti-humano CD45RA PECy5 (clone 5H9)	BD Bioscience	#552888	Etapa 1.1.3.
APC monoclonal de camundongo anti-CD45RO humano (clone UCHL1)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Etapa 1.1.3.
Falcon	353047	de 24 poços Multiwell	Seção 1 do protocolo
Soro de cabra normal	PCN5000	Invitrogen	Etapa 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocolo seção 1
Solução de penicilina/estreptomicina	Life Technologies	#15070063	Etapa 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Etapa 1.2.4.
poli-L-lisina	Sigma	#P8920	1.2.1.
Anticorpo primário - BRD4	Abcam	#ab128874	Etapa 1.3.6.
Anticorpo primário - SUZ12	Cel Signalling	mAb # 3737	Etapa 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Etapa 1.1.4.
Tecnologias de vida de	piruvato de sódio	# 11360039	Etapa 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Etapa 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Etapa 1.3.
Pinças	-		Seção de protocolo 1