Eletropenetrografia AC-DC para o Estudo dos Comportamentos de Sondagem e Ingestão de Mosquitos Culex tarsalis em Mãos Humanas

Anastasia M. W. Cooper; Kaitlin Pfeiffer; Kathryn Reif; Kristopher Silver; Dana Mitzel

doi:10.3791/66877

Artigo de método

Eletropenetrografia AC-DC para o Estudo dos Comportamentos de Sondagem e Ingestão de Mosquitos Culex tarsalis em Mãos Humanas

DOI:

10.3791/66877

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29 de novembro de 2024

Anastasia M. W. Cooper¹^,² , Kaitlin Pfeiffer¹ , Kathryn Reif² , Kristopher Silver¹ , Dana Mitzel³

¹Department of Entomology, Kansas State University, ²Department of Pathobiology, Auburn University, ³National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

Neste artigo

Resumo

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Os procedimentos são descritos para estudar os comportamentos de sondagem e ingestão de mosquitos Culex tarsalis em mãos humanas usando eletropenetração AC-DC.

Resumo

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Os mosquitos transmitem patógenos que afetam negativamente a saúde humana e animal. Uma maior compreensão de sua biologia de alimentação sanguínea e interações com hospedeiros e patógenos pode ser explorada para desenvolver novos alvos para o controle de doenças transmitidas por mosquitos. Infelizmente, os comportamentos de sondagem (ou seja, picada) dos mosquitos são mal compreendidos porque ocorrem dentro dos tecidos do hospedeiro. Aqui, um procedimento não invasivo é descrito para usar a eletropenetração AC-DC (EPG) para visualizar e quantificar indiretamente os comportamentos de alimentação do mosquito, registrando mudanças nos sinais elétricos gerados ao sondar e ingerir nas mãos humanas. Fios finos de ouro são presos aos mosquitos usando cola de prata condutora e conectados ao instrumento EPG. O hospedeiro humano segura uma sonda de tensão de substrato na mão. A sondagem do hospedeiro pelo mosquito com fio completa o circuito elétrico, e os sinais elétricos são registrados em um computador como "formas de onda" que podem ser medidas e enumeradas para análise. Esta metodologia tem sido utilizada para caracterizar os comportamentos de sondagem e ingestão de mosquitos Aedes aegypti e Culex tarsalis e pode ser aplicada a outras espécies de mosquitos. O EPG pode ser usado para estudar os efeitos de patógenos, inseticidas e outros fatores nos comportamentos alimentares dos mosquitos.

Introdução

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Os mosquitos causam sofrimento e perdas econômicas em todo o mundo devido aos seus papéis como vetores de doenças e pragas incômodas¹. Os mosquitos Anopheles transmitem a malária, que causa anualmente cerca de 219 milhões de casos em todo o mundo, mais de 400.000 mortes² e 12 bilhões de dólares americanos em custos diretos³. Os mosquitos Aedes são os vetores mais notáveis de importância para a saúde pública porque têm uma presença quase global e transmitem agentes de Chikungunya, dengue, filariose linfática, febre do Vale do Rift, febre amarela e Zika, que ceifam vidas, sobrecarregam os sistemas de saúde e resultam em sofrimento crônico, morbidade ao longo da vida e incapacidade⁴^,⁵. Além disso, os mosquitos Culex transmitem agentes de encefalite equina, encefalite japonesa, filariose linfática, encefalite de Saint Louis e febre do Nilo Ocidental, que afetam a saúde humana e animal³^,⁴.

O controle de vetores com abordagens baseadas em inseticidas é o principal método para controlar doenças transmitidas por vetores globalmente⁶^,⁷. No entanto, o número de inseticidas disponíveis para o controle de mosquitos é limitado. Além disso, a resistência a inseticidas está evoluindo em muitas espécies, especialmente em mosquitos Aedes, impactando nossa capacidade de combater doenças transmitidas por vetores e impulsionando a necessidade de novas estratégias de controle⁶^,⁸. Uma melhor compreensão da biologia do mosquito, das interações mosquito-hospedeiro-patógeno e dos processos que regulam a transmissão do patógeno pode facilitar o desenvolvimento de novas ferramentas para o controle vetorial⁶.

Comportamentos de sondagem e ingestão em tecidos hospedeiros podem afetar a transmissão de patógenos e a patologia da doença⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Por exemplo, mais microfilárias foram ingeridas quando o Aedes aegypti se alimentou diretamente dos capilares, em vez de acumular sangue fora dos vasos rompidos¹³. Assim, pesquisas fundamentais e aplicadas sobre esse tópico podem ajudar no desenvolvimento, refinamento e avaliação de estratégias de controle de mosquitos e outras contramedidas para a transmissão de patógenos. No entanto, existem lacunas significativas de conhecimento nos detalhes dos comportamentos crípticos de alimentação de sangue que ocorrem abaixo da superfície da pele do hospedeiro, porque esses comportamentos geralmente requerem procedimentos invasivos em modelos animais vivos ou empregam substratos artificiais transparentes ou dietas líquidas⁹^,¹¹^,¹⁴^,¹⁵. Técnicas de eletropenetração não invasiva (EPG; também chamada de gráfico de penetração elétrica) têm sido usadas para estudar comportamentos alimentares de insetos que se alimentam de plantas relacionados à transmissão de patógenos de plantas, resistência de plantas hospedeiras e modos de ação de inseticidas, pois permitem que os pesquisadores observem, registrem e quantifiquem indiretamente os movimentos e comportamentos do aparelho bucal que ocorrem dentro dos tecidos do hospedeiro¹⁰^,¹².

Desde a década de 1950, técnicas eletrônicas de monitoramento de penetração têm sido aplicadas a artrópodes que se alimentam de sangue, incluindo mosquitos¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. No entanto, o EPG nunca foi amplamente adotado para artrópodes que se alimentam de sangue, pois as atividades biológicas correspondentes às formas de onda nunca foram verificadas²¹. Além disso, os projetos e a eletrônica dos primeiros instrumentos resultaram em ênfase excessiva de alguns sinais elétricos, altas relações ruído-sinal, baixa resolução e distorção das formas de onda e irritação para hospedeiros vertebrados¹²^,²². Um instrumento mais recente, o monitor AC-DC EPG < classe sup = "reff">23, possui configurações variáveis e processamento de sinal aprimorado, tornando-o mais adequado para registrar artrópodes que se alimentam de sangue e decifrar as origens biológicas das formas de onda em estudos experimentais de correlação¹⁰^,¹².

Para EPG, um sinal elétrico é aplicado ao hospedeiro por meio de uma sonda de tensão de substrato (ou seja, eletrodo de referência). O artrópode é conectado a um eletrodo de gravação e colocado no hospedeiro. Quando o artrópode insere suas peças bucais (ou seja, estiletes) no hospedeiro, o sinal elétrico é transmitido ao monitor AC-DC EPG para processamento de sinal. Os sinais elétricos são então exibidos em um computador como "formas de onda" correspondentes a comportamentos específicos, como movimentos do aparelho bucal, ingestão, salivação e aquisição/inoculação de patógenos¹⁰^,¹². Variáveis de resposta sequenciais e não sequenciais relacionadas à duração e contagem das formas de onda²⁴^,²⁵ em diferentes níveis hierárquicos (famílias, tipos e subtipos) podem então ser calculadas com base na frequência e duração das formas de onda para obter informações sobre os comportamentos alimentares que ocorrem dentro e entre as espécies e em resposta a fatores bióticos e abióticos, como hospedeiros, patógenos, pesticidas e condições ambientais¹⁰^,¹².

Até o momento, o monitor de EPG AC-DC tem sido utilizado para caracterizar os comportamentos de sondagem e ingestão de mosquitos Ae. aegypti²⁶ e Culex tarsalis^{27 alimentando-se} de mãos humanas, e carrapatos Dermacentor variabilis e Amblyomma americanum alimentando-se de bezerros bovinos²⁸. Além disso, um modelo murino para EPG²⁹ foi desenvolvido recentemente para facilitar estudos de patógenos usando este instrumento. As mãos humanas são ideais para a caracterização inicial da forma de onda do mosquito porque os hospedeiros humanos podem relatar quando sentem a sondagem do mosquito, bem como outros comportamentos, facilitando a correlação das formas de onda com os comportamentos (Tabela 1). Além disso, uma melhor compreensão da plasticidade nos comportamentos alimentares entre mosquitos em diferentes populações humanas pode contribuir para o desenvolvimento de intervenções de manejo mais especializadas para mosquitos e os patógenos que eles transmitem.

Tabela 1: Descrição das famílias de formas de onda usadas para classificar sinais elétricos registrados de Culex tarsalis em mãos humanas usando AC-DC EPG. A fase de sondagem e as atividades biológicas correspondentes a cada família de formas de onda. Consulte Cooper et al.²⁷ para obter mais informações. Abreviatura: AC = corrente alternada, DC = corrente contínua, EPG = eletropenetrógrafo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Para facilitar o uso do EPG para estudar a biologia do mosquito e as interações hospedeiro-vetor, a metodologia para quantificar os comportamentos alimentares de mosquitos Cx. tarsalis em mãos humanas usando o monitor AC-DC EPG é apresentada aqui. Esses protocolos se baseiam nos procedimentos fundamentais de AC-DC EPG descritos em recursos on-line³⁰ e assumem que os usuários têm um conhecimento básico de trabalho de AC-DC EPG e software associado³¹. Os procedimentos descritos podem ser modificados para outras espécies de mosquitos e hospedeiros e fornecem uma base para facilitar a pesquisa baseada em hipóteses dos comportamentos alimentares dos mosquitos.

Tabela 2: Definições da terminologia comum de EPG AC-DC. As definições são baseadas naquelas fornecidas em recursos online³⁰^,³¹ e literatura científica³². Abreviatura: AC = corrente alternada, DC = corrente contínua, EPG = eletropenetrógrafo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Protocolo

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Este protocolo (IRB-10729) foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) para Pesquisa Humana da Kansas State University²⁷ e destina-se ao uso apenas com mosquitos livres de patógenos. Voluntários humanos deram seu consentimento informado para participar do estudo e publicar seus dados. Antes de iniciar qualquer trabalho com animais, humanos ou riscos biológicos, certifique-se de que todos os procedimentos tenham sido revisados e aprovados pelos comitês regulatórios institucionais apropriados ou indivíduos de supervisão. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os equipamentos e materiais usados neste protocolo.

1. Preparação e configuração iniciais

Configure o monitor AC-DC EPG (Figura 1A), a gaiola de Faraday (Figura 1B,C) e o software conforme descrito anteriormente³⁰^,³¹ usando as modificações descritas abaixo (etapas 1.1.1-1.1.5). Consulte recursos on-line³⁰ para obter tutoriais passo a passo sobre como configurar e usar o equipamento e o software. Salve a configuração desejada como padrão no software de gerenciamento de hardware e revisão de forma de onda. Consulte a Tabela 2 para obter uma lista da terminologia comum de EPG AC-DC e suas definições.
1. Conecte um amplificador de estágio de cabeça (amplificador de cabeça) e uma sonda de tensão de substrato ao Canal 1 da caixa de controle.
  NOTA: A gravação de um único canal é apresentada mesmo que o monitor AC-DC possa acomodar simultaneamente quatro insetos e hospedeiros.
2. Certifique-se de que o canal 1 na caixa de controle esteja ligado e que os canais Pre-1 e Post-1 correspondentes na caixa de interface do switch estejam ligados.
  NOTA: Os canais que não estão sendo usados devem permanecer desligados.
3. Use o software de gerenciamento de hardware para habilitar os canais 1 e 3 na placa DI-710 A/D (mas não outros) para gravar os sinais pré e pós-retificados.
4. Formate o software de gerenciamento de hardware para visualizar/sobrepor as formas de onda pré e pós-retificadas (por exemplo, 1 = 1 para o pré-sinal e 2 = 3 para o pós-sinal).
5. Defina a taxa de amostragem no software de gerenciamento de hardware para 100 amostras por segundo por canal (ou seja, S/s/CHAN: 100).
Construa esboços de insetos²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰:
1. Pré-aqueça o ferro de solda até a temperatura recomendada para a solda específica do núcleo de resina.
2. Use uma ferramenta de descascamento de corte de fio para descascar o revestimento de plástico ~ 6 cm da extremidade de um rolo de fio de cobre 20 AWG, mas evite cortar ou marcar o feixe de fio de cobre dentro (Figura 2A). Em seguida, corte o feixe de fios de cobre exposto e desenrole em fios individuais (Figura 2B).
3. Use um alicate de bico fino para enrolar um fio do fio de cobre ao redor do eixo de um pino de escudo adequado embaixo da cabeça (ou seja, topo plano) de modo que a maior parte do fio de cobre se estenda além da cabeça do pino. Dobre a cauda do fio sobre a cabeça do pino para prendê-lo no lugar (Figura 2C).
  NOTA: Instale os pinos do escudo de teste para identificar aqueles que se encaixam perfeitamente na porta do amplificador da cabeça (quando estiver desligado, desconectado e ajustado para 10⁶ Ohms (Ω)).
4. Prenda o eixo do pino do escudo no auxiliar de solda das mãos amigas para que o fio de cobre aponte para cima. Em seguida, aplique um pequeno pouco (bola de ~ 0,2 cm) de fluxo solúvel em água na junção do pino do escudo e do fio de cobre (Figura 2D).
  CUIDADO: O fluxo é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.
5. Desenrole ~ 10 cm de solda e endireite-o. Segure o ferro de solda quente contra a cabeça do pino por alguns segundos até que o fluxo derreta e o metal esteja quente. Em seguida, pressione a ponta da solda na cabeça do pino ao lado do ferro de solda até que a solda derreta e cubra completamente a junção, fundindo o pino e o fio em um toco de inseto.
6. Enquanto o toco de inseto esfria, limpe a ponta do ferro de solda com palha de aço e uma esponja úmida.
7. Depois de esfriar, remova o toco de inseto das mãos amigas. Enxágue o toco de inseto em etanol a 70% e depois água para remover o fluxo residual. Apare o fio de cobre no comprimento desejado (~3 cm, Figura 2E).
8. Repita as etapas 1.2.3-1.2.7 até que 20-30 tocos de insetos sejam construídos.
Monte um aspirador de insetos²⁶^,²⁷:
1. Passe a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro através de uma chama, girando levemente a pipeta. Repita até que o final da pipeta tenha o tamanho apropriado para caber confortavelmente ao redor do abdômen do inseto.
2. Cubra a extremidade maior da pipeta Pasteur modificada com mosquiteiro, insira-a diretamente no tubo de silicone conectado a um aspirador de laboratório e prenda a junção com fita isolante para formar um aspirador de insetos (Figura 2H).
  NOTA: A pipeta e a rede Pasteur podem ser inseridas em um pequeno pedaço de tubo de plástico equipado com um seccionador rápido para facilitar a troca entre diferentes tamanhos (Figura 2H).

figure-protocol-1
Figura 1: Configuração do equipamento do monitor AC-DC EPG para gravação em mãos humanas. (A) Componentes do EPG, incluindo (1) caixa de controle, (2) caixa de interface do switch, (3) fonte de alimentação, (4) placa DI-710 A/D, (5) computador, (6) regulador de potência e (B) gaiola de Faraday contendo (C) um microscópio digital (7) em um suporte pescoço de ganso, (8) plástico bolha e almofadas de ar, (9) sonda de tensão do substrato e (10) amplificador de estágio de cabeça em um suporte de laboratório. Abreviaturas: AC = corrente alternada, DC = corrente contínua, EPG = eletropenetrógrafo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Eletrodos de gravação para fiação de mosquitos e um aspirador de insetos para manipulação de mosquitos durante a fiação. (A) Fio de cobre 20 AWG com 6 cm de revestimento plástico removido para expor o feixe de fios de cobre dentro. (B) Fios individuais do feixe de fios de cobre. (C) Um fio de cobre enrolado na cabeça de um pino de escudo de latão com a cauda do fio dobrada sobre a cabeça do pino. (D) Um pouco de fluxo na junção do pino do escudo de latão e do fio de cobre preso por um auxiliar de solda de mãos amigas em preparação para a soldagem. (E) Um toco de inseto completo construído a partir de um prego de latão soldado a um fio de cobre. (F) Um eletrodo de gravação construído a partir de um fio de ouro enrolado na ponta do fio de cobre de um toco de inseto e preso no lugar com cola de prata. (G) Um close-up do laço de ouro na ponta do eletrodo de registro. (H) Um aspirador de insetos montado (superior) e desmontado (inferior) feito de pipetas Pasteur modificadas, mosquiteiros, tubos de plástico, fita isolante e seccionadores rápidos machos, ao lado do tubo aspirador de laboratório equipado com o seccionador rápido fêmea (canto superior direito). Barras de escala = 1 cm (A-F), 200 μm (G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Fiação de mosquitos

Prepare mosquitos e cola de prata (à tarde/noite antes do EPG):
1. Crie e mantenha os mosquitos da cepa Cx. tarsalis KNWR conforme descrito anteriormente²⁷.
2. Mosquitos fêmeas adultas rápidas, 5-17 dias após a eclosão, por 8-12 h para aumentar as taxas de sondagem, mas permitir o acesso à água para evitar a mortalidade.
3. Prepare cola de prata fresca²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰:
  1. Adicione 510 mg de flocos de prata de 4-8 μm a um copo de 20 ml. Tara a balança e adicione 1.100 mg de cola escolar não tóxica ao copo em cima do floco de prata.
  2. Tara a balança, adicione 510 mg de flocos de prata de 8-10 μm ao copo em cima da cola e, em seguida, adicione 1.000 μL de água usando uma pipeta.
  3. Adicione delicadamente uma barra de agitação ao copo e coloque-a na placa de agitação. Comece a mexer lentamente, aumente gradualmente para a configuração 'rápida' e mexa por 4 min. Certifique-se de que todo o conteúdo esteja incorporado.
  4. Use uma pipeta de transferência (com a ponta cortada) para transferir a cola de prata para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
  5. Enrole as tampas dos tubos de cola prateada com Parafilm e guarde na bancada até o uso.
    NOTA: A cola prateada tem a consistência correta por até 2 dias, mas recomenda-se fazer cola fresca na noite anterior ao uso³⁰.
Prepare eletrodos de gravação²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰:
1. Vortex vigorosamente a cola de prata antes de usar.
2. Enrole um bloco de espuma com filme plástico fresco para segurar os tocos de insetos preparados e os mosquitos com fio.
  NOTA: A espuma deve ser grande o suficiente para permitir que os mosquitos com fio fiquem na superfície sem se tocar, mas pequena o suficiente para caber dentro de uma caixa de armazenamento. CUIDADO: As gotículas excretoras, liberadas após a alimentação sanguínea, podem conter patógenos. Descarte o filme plástico/bloco de espuma adequadamente após o uso.
3. Remova a mancha (e cola de prata velha se estiver reutilizando tocos de insetos) da ponta do fio de cobre raspando o 1 cm superior do fio de cobre com uma lâmina de barbear até brilhar por todos os lados. Prepare um toco de inseto para cada mosquito, além de alguns extras.
4. Corte o fio de ouro de 0,025 mm de diâmetro em pedaços de 4-5 cm de comprimento. Sempre segure o fio em uma pinça de fechamento automático mascarada com fita adesiva para evitar amassar o fio.
  NOTA: O fio de ouro é muito mais fácil de ver contra um fundo preto.
5. Coloque a ponta do fio de ouro ao longo da ponta limpa do fio de cobre do toco de inseto e enrole suavemente o fio de ouro 3x ao redor do fio de cobre.
6. Use uma sonda de dissecação para aplicar cola de prata para manter o fio de ouro no lugar. Certifique-se de que não haja cauda ou ponta solta. Coloque o toco de inseto na espuma até que a cola seque.
7. Passe suavemente o fio de ouro preso ao toco de inseto para alisá-lo e moldá-lo em um arco longo e suave (Figura 2F). Apare o fio no comprimento desejado (~2,5-3 cm).
8. Trabalhando sob um microscópio de dissecação, use uma pinça de ponta fina para fazer um laço de ouro na ponta do fio de ouro e dobre o laço em um ângulo de 90° conforme descrito abaixo (etapas 2.2.8.1-2.2.8.4; Figura 2E, F). Certifique-se de que o laço dourado esteja totalmente fechado. Retorne o toco de inseto para o bloco de espuma.
  1. Usando a mão não dominante, segure o toco de inseto pelo prego de latão, com a ponta do fio de ouro tocando o microscópio stage. Usando a mão dominante, segure a ponta do fio de ouro com uma pinça de ponta fina.
  2. Usando a pinça de ponta fina, cruze a ponta do fio de ouro sobre o fio de cobre do toco de inseto perto de onde o fio de ouro está colado. Toque a extremidade da pinça de ponta fina e o fio de ouro contra o microscópio platina
  3. Puxe suavemente o toco de inseto até que o fio de ouro forme um pequeno laço de ouro ao redor da ponta da pinça de ponta fina (não puxe com muita força). Solte o fio de ouro e remova cuidadosamente a pinça.
  4. Enquanto ainda segura o toco de inseto na mão não dominante, segure o laço de ouro com a pinça de ponta fina de modo que a pinça fique em um ângulo perpendicular ao pescoço do fio e a ponta da pinça se estenda pelo meio do laço de ouro, agarrando assim os dois lados do laço. Puxe suavemente o toco de inseto enquanto gira levemente a pinça para longe do toco de inseto até que o laço esteja dobrado em um ângulo de 90° em relação ao pescoço do fio (Figura 2G).
Conecte os eletrodos de gravação aos mosquitos²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰ (na manhã do EPG):
1. Anestesie os mosquitos em jejum com gás CO₂ até que todo o movimento pare. Posicione os mosquitos de costas na almofada de anestesia, com o abdômen voltado para o pesquisador.
2. Coloque um pedaço de fita adesiva de laboratório de ~ 2 cm sob um microscópio de dissecação, com o lado adesivo voltado para baixo. Coloque uma gota de 0,5 cm (~ 10 μL) de cola de prata na fita.
3. Aspire o abdômen de um mosquito anestesiado para a pipeta de Pasteur modificada usando a sucção apenas o tempo suficiente para assentar o abdômen no lugar. Segure o mosquito sob o escopo de dissecação acima da cola de prata usando o aspirador.
  NOTA: As asas podem estar dentro ou fora da ponta da pipeta Pasteur modificada, mas tê-las dentro ajudará a evitar que o mosquito caia. Evite dobrar ou danificar as asas.
4. Trabalhando rapidamente, mergulhe um alfinete minucienal na cola de prata e aplique uma camada fina no pronoto do mosquito (ou seja, a superfície dorsal do tórax). Prossiga imediatamente para a próxima etapa, se possível (ou reanestesiar o mosquito, se necessário).
  NOTA: Recomenda-se remover as escamas do pronoto esfregando o pino para frente e para trás para ajudar a garantir a penetração da cola nos poros da cutícula. Evite colocar cola em qualquer outra parte do mosquito.
5. Mergulhe rapidamente o laço de ouro na ponta do eletrodo de gravação na cola de prata e coloque-o no ponto de cola de prata no pronoto do mosquito. Balance o laço para frente e para trás para garantir que ele fique nivelado com o pronoto. Segure o fio até que a cola seque (~20-25 s).
6. Recoloque o toco de inseto na espuma em um ângulo que permita que o mosquito com fio fique confortavelmente em pé quando acordar. Prossiga com a fiação do próximo mosquito.
  NOTA: É aconselhável fazer anotações sobre a qualidade de cada trabalho de fiação.
7. Assim que o número desejado de mosquitos estiver conectado, coloque o bloco de espuma em uma caixa de armazenamento. Mantenha os mosquitos em condições normais de criação até o uso.

3. Configuração e preparação do EPG (na manhã anterior ao EPG)

Ligue o monitor AC-DC EPG (ligando o interruptor na fonte de alimentação) pelo menos 30 minutos antes da gravação para permitir o equilíbrio do instrumento e qualquer solução de problemas.
NOTA: Os canais em uso na caixa de controle e na caixa de interface do interruptor podem ser deixados ligados.
Ligue o computador e abra o software de gerenciamento de hardware.
NOTA: Se os sinais não aparecerem como linhas finas planas, é necessária a solução de problemas (consulte a seção de discussão).
Execute o teste de toque²⁷^,³⁰ para verificar a funcionalidade do equipamento:
1. Enquanto estiver aterrado (ou seja, tocando a gaiola de Faraday com a pele nua), gire o botão do cabeçote amp para 10⁶ Ω e insira o eixo de um toco de inseto na porta.
  NOTA: Realizar o teste de toque em um nível mais alto de resistência de entrada (Ri) pode danificar o amplificador da cabeça.
2. Enquanto estiver aterrado, ligue o amplificador da cabeça e segure firmemente o fio de cobre do toco de inseto entre o dedo indicador e o polegar três vezes. Se o EPG estiver funcionando corretamente, três grandes picos aparecerão nos pré e pós-sinais na tela. Se esse não for o caso, a solução de problemas é necessária (consulte a seção de discussão).
Ajuste as configurações do instrumento para corrente alternada (CA) de 150 mV com um Ri de 10⁷ Ω, um ganho de hardware de 20-40x, um deslocamento negativo, uma linha de base nativa e um ganho de software de 8-16x²⁷^,³⁰, conforme descrito abaixo (etapas 3.4.1-3.4.3).
1. Defina a tensão, o tipo de corrente, o ganho de hardware (intervalo, ganho e multiplicador), o deslocamento e a linha de base (zero) usando as chaves e mostradores no Canal 1 da caixa de controle.
  NOTA: A configuração de ganho de hardware apropriada depende da qualidade do trabalho de fiação e da cola de prata, portanto, espera-se variação nas configurações de ganho ideais de mosquito para mosquito e dia-a-dia. O ganho de hardware pode precisar ser ajustado no meio da gravação se o sinal atingir o pico (definido na Tabela 2 e mostrado em Figura 3A,C) ou for muito pequeno para visualizar. Quaisquer alterações de ganho de hardware afetarão permanentemente a gravação (mostrada em Figura 3A,C).
2. Defina o nível Ri usando o dial no amplificador principal.
3. Defina e ajuste o ganho de software usando o software de gerenciamento de hardware (por exemplo, selecione o sinal pré ou pós e clique com o botão esquerdo para aumentar o ganho de software ou clique com o botão direito do mouse para diminuir o ganho de software).
  NOTA: Quaisquer alterações de ganho feitas no software NÃO afetarão permanentemente a gravação.
Configure uma nova gravação no software de gerenciamento de hardware, mas não inicie a gravação até a etapa 4.3 na próxima seção.

4. EPG em mãos humanas²⁶^,²⁷ :

Após a obtenção do consentimento informado (conforme especificado pelo IRB da instituição de origem), faça com que o anfitrião se sente ao lado da gaiola de Faraday com um braço dentro enquanto segura a sonda de tensão do substrato e a segura abaixo do cabeçote amp.
NOTA: O braço deve repousar confortavelmente sobre plástico bolha ou substrato não condutor semelhante. A sonda de tensão manual e subestadual não deve entrar em contato com a gaiola de Faraday ou o amplificador de cabeçote durante a gravação. Para evitar danos, é imperativo que o voluntário não toque no amplificador de cabeçote depois de ligado. Se o amplificador da cabeça for tocado acidentalmente, execute o teste de toque descrito acima para avaliar sua funcionalidade.
Quando o host estiver em posição, gire o amplificador da cabeça para o lado. Remova um mosquito com fio da caixa de armazenamento e conecte-o ao instrumento inserindo o pino de latão do toco de inseto na porta do amplificador principal. Deixe o mosquito pendurado.
NOTA: Mantenha um borrifador de etanol a 70% por perto para controlar quaisquer mosquitos que se desprendam do fio.
Inicie a gravação usando o software de gerenciamento de hardware. Posicione o amplificador de cabeça acima da mão para que o mosquito possa ficar de pé e sondar confortavelmente.
Ligue o amplificador da cabeça enquanto estiver aterrado. Inicie um cronômetro de 10 minutos. Ajuste a posição da mão do host conforme necessário para ajudar no sucesso da sondagem.
NOTA: Ao usar mosquitos inclinados a sondar imediatamente, ligue o amplificador de cabeçote antes de posicionar o mosquito na mão. Um pino de madeira fino ou cabo de pincel não condutor pode ser usado para dobrar o fio de cobre do toco do inseto para ajustar ainda mais a posição do mosquito. Uma lupa ou microscópio digital em um suporte pescoço de ganso pode ajudar na observação do mosquito durante o EPG, especialmente para estudos de correlação comportamental.
Use o software de gerenciamento de hardware para fazer observações com carimbo de data/hora (por exemplo, marcadores de eventos) durante a gravação sobre respostas do hospedeiro, comportamentos de mosquitos, alterações de ganho, etc.). Ajuste a posição dos sinais na tela e o ganho do software conforme necessário para manter ambos os sinais claramente visíveis na tela. Ajuste o ganho de hardware se o(s) sinal(is) atingir o pico (Figura 3A,C e Tabela 2) ou se as ondas parecerem muito pequenas quando o ganho de software estiver no máximo. Ajuste o deslocamento se for observada dobra do retificador (Figura 3C,C' e Tabela 2). Consulte o manual do software³¹ e recursos online³⁰ para obter instruções detalhadas sobre como fazer esses ajustes.
1. Para ajustar a posição dos sinais na tela, selecione o sinal pré ou pós (por exemplo, clicando em
  1 = 1 ou 2 = 3) e, em seguida, arraste o sinal para a posição desejada na tela (idealmente perto do meio da tela, mas não sobreposto).
2. Para ajustar o ganho de software, use o software de gerenciamento de hardware descrito na etapa 3.4.3.
3. Para ajustar o ganho de hardware, comece girando o botão de ganho do canal 1 para a direita ou esquerda para aumentar ou diminuir o ganho, respectivamente. Se esse ajuste não for suficiente para eliminar o pico (ganho muito alto; Figura 3A,C) ou permitir que os detalhes do sinal sejam claramente visualizados (ganho muito baixo), inverta a faixa do canal 1 e as chaves multiplicadoras para ajustar ainda mais o ganho.
  NOTA: Recomenda-se o uso de marcadores de eventos para registrar quando o ganho de hardware foi ajustado para auxiliar na interpretação dos dados da forma de onda.
4. Para ajustar o deslocamento, gire a chave de deslocamento do canal 1 na caixa de controle para neg e, em seguida, gire o botão de deslocamento do canal 1 até que os picos nos sinais pré e pós ocorram na mesma direção na tela do computador. Se o Offset Dial for girado muito longe, o pós-sinal será invertido novamente.
Se o mosquito não sondar dentro de 10 min (ou outro ponto de tempo definido), desligue o amplificador da cabeça. Se o mosquito estiver no meio da sonda na marca de tempo, deixe-o terminar de sondar antes de desligar o amplificador da cabeça. Peça ao hospedeiro que remova cuidadosamente a mão e, em seguida, remova o mosquito com o toco de inseto anexado. Recoloque o mosquito na caixa de armazenamento.
Pare/feche a gravação usando o software de gerenciamento de hardware. Prossiga com o EPG no próximo mosquito (Etapa 4.2).
NOTA: Lembre-se de alterar o nome do arquivo após cada mosquito.
Desligue o amplificador da cabeça e a fonte de alimentação no final da sessão e feche o software.
Revise a Declaração de Interrogatório do Participante ou similar com o voluntário, conforme especificado no IRB aprovado.
Descarte os mosquitos de acordo com os requisitos do protocolo. Remova o filme plástico do bloco de espuma e descarte-o adequadamente.
Após a conclusão de toda a coleta de dados, revise e meça as formas de onda e analise os dados conforme descrito anteriormente²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰. Consulte recursos on-line³⁰ para obter tutoriais passo a passo para usar o software de revisão de formas de onda, fazer figuras representando as formas de onda, medir as formas de onda, exportar os dados para análise, conduzir a análise estatística e uma explicação detalhada das variáveis comuns de resposta da forma de onda.

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Figura 3: Exemplos de gravações abaixo do ideal devido a picos, alterações de ganho da caixa de controle, alterações de tensão pouco claras da fiação inferior, dobra do retificador e ruído. Formas de onda de mosquitos Culex tarsalis alimentando-se até a plenitude nas mãos humanas, distorcidas por (A) pico (seta horizontal azul) e subsequentes mudanças de ganho da caixa de controle de 100x para 80x para 40x para 60x para 40x a 20x (setas verticais laranja), (B) mudanças de tensão pouco claras e (C) retificador dobrado no sinal pós (preto) em comparação com o sinal pré (vermelho) (ver forma de onda J, close-up mostrado no painel C'), ruído de linha (onda senoidal de 11 Hz visível apenas no sinal de pré-retificação (vermelho), close-up mostrado no painel C'), pico (seta horizontal azul) e uma mudança de ganho da caixa de controle de 500x para 200x (seta vertical laranja). Os nomes das formas de onda são mostrados na parte superior de cada painel. As setas roxas no canto inferior direito do painel C indicam quando o amplificador do cabeçote foi desligado após a conclusão da sonda e fornecem outro exemplo de dobra do retificador. As linhas horizontais vermelhas associadas ao sinal de pré-retificação no painel C indicam quando os marcadores de eventos foram usados para registrar notas com carimbo de data/hora. Os níveis de Ri, sinais aplicados, escalas de tempo e ganhos de software são (A) 10⁷ Ω, 150 mV DC, 13,2 s/div, 8x; (B) 10⁷ Ω, 150 mV DC, 4,4 s/div, 128x; e (C) 10⁷ Ω, 150 mV AC, 7,4 s/div, 2x; (C') 0,2 s/div, 8x. Abreviaturas: AC = corrente alternada, DC = corrente contínua, Ri = resistência de entrada, mV = milivolts, Ω = Ohms, s/div = segundos por divisão. Esta figura foi preparada com dados de Cooper et al.²⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

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AC-DC gravações de EPG de mosquitos Cx. tarsalis alimentando-se de sangue em mãos humanas (Figura 4) geraram formas de onda interpretáveis adequadas para análise e publicação²⁷. As formas de onda interpretáveis continham padrões repetitivos distintos e distinguíveis que podiam ser classificados em famílias de formas de onda (Tabela 1 e Figura 4), tipos e subtipos quando a compressão (definida na Tabela 2) e o ganho do software foram ajustados no software de revisão de forma de onda²⁷^,³¹. Todas as famílias de formas de onda (J, K, L, M, N) e tipos (L1, L2, M1, M2) previamente descritas em Ae. aegypti alimentando-se de mãos humanas²⁶ foram identificadas nas formas de onda geradas por Cx. tarsalis alimentando-se de mãos humanas, verificando-se a validade dos métodos aqui descritos. Além disso, três novos tipos de formas de onda (M3, N1, N2) e vários subtipos de L1, L2, M1 e M2 foram identificados²⁷. Além disso, a queda de tensão de volta à linha de base quando as peças bucais são retiradas do hospedeiro foi denominada família de formas de onda W²⁷.

A variação sistemática das configurações do instrumento (tipo de corrente e níveis de Ri), seguindo os procedimentos descritos aqui, permitiu determinar as configurações ideais para registrar Cx. tarsalis alimentando-se de mãos humanas, as origens elétricas de cada forma de onda, a duração média em segundos de sondas completas e incompletas por mosquito e para comparação estatística da duração da forma de onda em segundos por inseto (WDI), o número de eventos de forma de onda por inseto (NWEI) e a duração da forma de onda em segundos por evento por inseto (WDEI) nas configurações²⁷. Os mosquitos também foram interrompidos durante diferentes formas de onda e dissecados para determinar qual forma de onda estava correlacionada com a ingestão de sangue²⁷. Uma investigação semelhante foi realizada para Ae. aegypti usando metodologia comparável²⁶.

Devido à natureza sensível e intrincada do EPG, nem todas as gravações eram tão puras quanto as mostradas em Figura 4. Pico (Figura 3A,C), alterações de ganho de hardware (Figura 3A,C), trabalhos de fiação inferiores (Figure 3B), dobramento do retificador na forma de onda J (Figure 3C,C') e ruído elétrico (Figure 3C,C') ocasionalmente distorcia e mascarava as formas de onda, tornando-as inadequadas para uso em números de qualidade de publicação e dificultando a pontuação e a análise. Assim, o esforço de front-end é recomendado para aperfeiçoar as habilidades de fiação, otimizar as configurações de ganho e tensão, ajustar o deslocamento e controlar o ruído elétrico. Curiosamente, a dobra do retificador foi observada apenas na família de formas de onda J para Cx. tarsalis (Figura 3C,C') e não se repetiu uma vez que o deslocamento foi inicialmente ajustado, mesmo quando outras espécies de mosquitos (Ae. aegypti e Culex quinquefasciatus) foram usadas (dados não mostrados). Além disso, a solução de problemas revelou que o ruído elétrico não controlado mostrado em Figura 3 (painéis C e C') resultou de uma gaiola de Faraday defeituosa. As gravações feitas na gaiola de Faraday defeituosa ainda podiam ser usadas, mas os problemas de ruído foram resolvidos quando uma gaiola de Faraday aprimorada foi construída (Figura 1B).

Mesmo quando todas as precauções e otimizações front-end foram tomadas, pequenas variações na qualidade da fixação do eletrodo ao mosquito e outros fatores desconhecidos que distorceram o sinal e alteraram a relação sinal-ruído periodicamente tornaram necessário ajustar o ganho de hardware no meio da gravação para garantir que o sinal estivesse na faixa visível e a resolução dos picos em cada forma de onda fossem suficientes para a identificação e caracterização da forma de onda. Infelizmente, ajustar o ganho de hardware no meio da gravação pode resultar em mudanças abruptas de tensão (Figura 3A, C), tornando as formas de onda inadequadas para publicação, mas ainda utilizáveis (no todo ou em parte) para medição e análise.

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Figura 4: Formas de onda representativas de uma sonda Culex tarsalis em uma mão humana registrada com um Ri de 10⁷ Ω usando um sinal aplicado de 250 mV AC. Os nomes das formas de onda de nível de família (NP, J, K, L, M, W) são mostrados na parte superior de cada painel. Os painéis inferiores mostram ampliações de regiões selecionadas no painel A. Os painéis inseridos mostram ampliações das regiões indicadas. As escalas de tempo e os ganhos de software são (A) 7,0 s/div,16x; (B) 1,0 s/div, 64x; (B') 0,2 s/div, 64x; (C) 1,0 s/div, 64x; (C') 0,2 s/div, 32x; (D) 1,0 s/div, 64x; (D') 0,2 s/div, 64x. Abreviaturas: AC = corrente alternada, Ri = resistência de entrada, mV = milivolts, Ω = Ohms, s/div = segundos por divisão. Essa figura foi elaborada com dados de Cooper et al.²⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Ao usar o AC-DC EPG, é fundamental ter uma compreensão básica da operação de hardware e software³⁰ e seguir cuidadosamente os protocolos aqui descritos para evitar danos ao equipamento. Mais notavelmente, evite tocar no amplificador de cabeçote quando estiver ligado, a menos que esteja aterrado na gaiola de Faraday. Recomenda-se gravar o mais longe possível na gaiola de Faraday³⁰. As portas da gaiola não precisam necessariamente ser fechadas para obter formas de onda interpretáveis, a menos que sejam gravadas em um ambiente com ruído elétrico ambiente excessivo. Nada motorizado pode estar na gaiola de Faraday. É importante observar que a própria gaiola de Faraday deve ser aterrada eletricamente apenas através do amplificador principal para que funcione corretamente. Isso é feito conectando o amplificador de cabeçote a um suporte de laboratório de metal com a tinta lixada de um pé do suporte para permitir um caminho condutor para a eletricidade capturada pela gaiola de Faraday fluir para o suporte de laboratório, para o invólucro de metal do amplificador de cabeçote, descendo o cabo até a caixa de controle, através da fonte de alimentação em uma tomada de parede devidamente aterrada e na terra através do aterramento^{do edifício 30}. Um multímetro pode ser usado para verificar a qualidade da conexão entre os componentes dentro da gaiola, medindo a resistividade (que é o inverso da condutividade) entre vários pontos. Um rádio AM sem fio também pode ser colocado dentro da gaiola de Faraday para verificar se o som é significativamente reduzido (ou idealmente eliminado) quando as portas são fechadas, confirmando que a gaiola de Faraday está capturando adequadamente sinais elétricos aéreos (E. Backus per. Comm.).

A preparação adequada e padronizada da cola de prata e a fixação dos eletrodos de gravação aos insetos são essenciais para a obtenção de gravações utilizáveis. A cutícula do inseto é um isolante e atua como um capacitor se a cola de prata não penetrar adequadamente nos poros da cutícula para criar um caminho para a eletricidade viajar de dentro do inseto para o fio de ouro na superfície do pronoto³⁰. Prepare a cola de prata ao mesmo tempo antes de cada sessão de EPG, trabalhe com cola de prata fresca do tubo e substitua-a por cola de prata vigorosamente ventilada com frequência durante o procedimento de fiação. Certifique-se de que o laço de ouro esteja posicionado contra o tórax de forma que todo o laço fique em contato com a cutícula e não inclinado para um lado ou separado por uma espessa camada de cola prateada e escamas para ajudar a formar uma conexão elétrica forte, bem como evitar o desprendimento e a fuga do mosquito do fio.

Os protocolos descritos aqui devem ser otimizados ao trabalhar com diferentes espécies de mosquitos. As configurações ideais de EPG (nível de Ri, tensão, tipo de corrente e ganho de hardware) para gravação em um determinado artrópode devem ser determinadas experimentalmente^12,30. No entanto, uma vez que o deslocamento é ajustado, ele não precisará ser reajustado ao trabalhar com mosquitos semelhantes. As configurações ideais foram determinadas para AC-DC EPG com Ae. aegypti²⁶ e Cx. tarsalis²⁷. Bibliotecas de formas de onda (definidas na Tabela 2) para espécies adicionais facilitarão a adoção de EPG para mosquitos. Também é necessário otimizar a anestesia para o mosquito de interesse, pois o comportamento de alimentação sanguínea pode ser afetado diferencialmente com base na espécie de mosquito e na escolha da anestesia. Por exemplo, Cx. tarsalis requer um período de recuperação de 4 h após 15 min de anestesia com CO₂, enquanto para Ae. aegypti, um período de recuperação de 15 min é suficiente após um período de anestesia de 15 min com gelo. Culex tarsalis, no entanto, é difícil de derrubar com a exposição ao frio, então o CO₂ é predominantemente usado, apesar do longo período de recuperação.

Embora o monitor AC-DC EPG seja simples de usar após a revisão dos recursos on-line^30,31 ou treinamento com um usuário experiente, é necessária alguma solução de problemas. Inicialmente, as gravações de EPG do autor de sondas de mosquitos tinham uma onda de sinal inesperada de 11 Hz no pré-sinal que não havia sido observada ou relatada por Wayadande e colegas²⁶. A consulta com E. Backus indicou que a gaiola de Faraday era provavelmente o problema por causa da interferência nas alças de aterramento. Uma nova gaiola de Faraday construída a partir de uma tela de cobre altamente condutora conectada a uma estrutura de alumínio aparafusada a uma grande placa de piso de alumínio suportada por pés de borracha para isolá-la da tabela abaixo (Figura 1B), resolveu o sinal de ruído de 11 Hz (Figura 3C, C '). Além disso, ocasionalmente, quando a fonte de alimentação EPG era ligada pela primeira vez, os sinais pré e pós-retificação apareciam como linhas grossas e difusas em vez de linhas retas, suaves e finas. Isso geralmente era corrigido desligando o instrumento e verificando todas as conexões do cabo. Se isso falhasse, desconectar o instrumento por 1-3 minutos geralmente ajudava. Muito raramente, os pré e pós-sinais tornam-se espessos e confusos durante a operação, o que foi resolvido desligando o instrumento e conectando-o a uma tomada diferente ou usando um regulador de tensão e condicionador de energia para conectar o EPG antes de conectá-lo à parede. Idealmente, uma linha dedicada para o monitor EPG eliminaria o ruído de linha proveniente de refrigeradores e outros equipamentos conectados ao mesmo circuito elétrico que o EPG³⁰.

Atualmente, existem duas limitações principais para o uso de EPG para estudar mosquitos. Primeiro, poucos estudos de correlação foram realizados para verificar quais comportamentos de sondagem correspondem às formas de onda. Embora existam fortes hipóteses sobre o que está acontecendo durante cada família de formas de onda (Tabela 1) e alguns dos tipos de formas de onda (M1 e M2), poucas dessas hipóteses foram confirmadas experimentalmente, exceto que a ingestão de sangue está correlacionada com a família de formas de onda M^26,27. Mais importante ainda, as formas de onda correspondentes a eventos de salivação devem ser identificadas porque muitos patógenos são transmitidos na saliva. A correlação das formas de onda do EPG com as atividades biológicas em mosquitos será necessária para interpretar significativamente as diferenças significativas na duração da forma de onda e nas contagens entre os grupos de tratamento. Em segundo lugar, as taxas de sondagem e ingestão durante o EPG podem ser muito menores do que o esperado²⁷. Amarrar individualmente os mosquitos a fios curtos e colocá-los diretamente no hospedeiro pode evitar comportamentos de busca de hospedeiros e alimentação social de longa distância, o que pode afetar os comportamentos de sondagem e ingestão. Insetos corretamente conectados podem andar e voar normalmente. Ainda assim, os mosquitos costumam puxar os fios e às vezes se enroscam ou se mantêm em ângulos não naturais, indicando que o fato de estarem conectados afeta seu comportamento até certo ponto. Os autores testaram muitas estratégias para aumentar as taxas de sondagem durante o EPG, e jejuar os mosquitos durante a noite, usando indivíduos mais velhos, expondo-os à respiração humana imediatamente antes de colocá-los na mão e aplicando saliva humana na mão foram os mais eficazes, bem como usando hospedeiros que constantemente faziam ajustes em escala fina na posição de suas mãos para garantir que o mosquito estivesse na posição ideal para sondar²⁷.

Apesar dessas limitações, o AC-DC EPG tem inúmeras vantagens sobre outras abordagens para estudar comportamentos de sondagem e ingestão. Sistemas como o BiteOScope¹¹, o flyPAD¹⁵ e a Plataforma Automatizada de Biomateriais¹⁴, projetados para quantificar comportamentos de sondagem e ingestão e secreções salivares durante a alimentação sanguínea, utilizam substratos artificiais transparentes e dietas líquidas que não possuem sistemas normais de tecido hospedeiro e pistas do hospedeiro. Embora essas plataformas sintéticas sejam úteis para muitos fins experimentais, uma clara vantagem do AC-DC EPG é a capacidade de estudar esses comportamentos e variáveis de interesse de artrópodes em sistemas hospedeiros naturais. Além disso, a adaptabilidade definida pelo usuário do sistema AC-DC EPG oferece uma vantagem adicional sobre outros instrumentos EPG^22,33 e dispositivos de monitoramento eletrônico semelhantes a EPG^16,21, que não possuem níveis de Ri ajustáveis, tipos de corrente e níveis de tensão necessários para obter formas de onda com a quantidade máxima de informações e minimizar os efeitos adversos em uma ampla gama de hospedeiros e artrópodes²²^,²³. Técnicas de eletromiografia (EMG) também são usadas para estudar a alimentação sanguínea. No entanto, o circuito elétrico geralmente inclui apenas o artrópode e apenas os potenciais musculares mais próximos do eletrodo de registro são registrados, de modo que as formas de onda não fornecem informações sobre atividades detalhadas que ocorrem na interface hospedeiro-inseto, como rupturas celulares, localizações e atividades do estilete e potenciais de fluxo através do aparelho bucal^28,34. As técnicas de microscopia intravital podem ser usadas para visualizar diretamente os movimentos e atividades detalhados do aparelho bucal em tecidos hospedeiros vivos, mas essas técnicas envolvem procedimentos invasivos em modelos animais vivos⁹. Somente o monitor de EPG AC-DC pode fornecer informações altamente detalhadas em tempo real sobre os comportamentos de sondagem, ingestão e salivação que ocorrem em tecidos hospedeiros opacos vivos sem a necessidade de procedimentos invasivos e é adaptável para uso em uma ampla variedade de artrópodes^10,12.

Este é o primeiro procedimento passo a passo detalhado para conectar mosquitos, construir um aspirador de insetos e realizar EPG em hospedeiros humanos. Espera-se que esses protocolos facilitem a adoção do AC-DC EPG em mosquitos que se alimentam de hospedeiros humanos. Exemplos de esforços de pesquisa futuros empregando AC-DC EPG podem incluir estudos sobre mecanismos fundamentais de alimentação sanguínea e danos ao tecido do hospedeiro¹⁰, incluindo a identificação de sequências estereotipadas de comportamentos de sondagem que precedem a ingestão de sangue, investigação do fluxo sanguíneo através do aparelho bucal e comparação da plasticidade alimentar dentro e entre espécies de artrópodes / estágios de desenvolvimento²⁶. O EPG também pode ser usado para quantificar os efeitos de inseticidas, antifeedants e repelentes¹². Os procedimentos apresentados aqui para usar o AC-DC EPG para estudar mosquitos em mãos humanas acelerarão esses estudos e permitirão novos insights sobre a biologia do mosquito que se alimenta de sangue.

Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente para fins de fornecimento de informações específicas e não implica recomendação ou endosso do Departamento de Agricultura dos EUA. As conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões do USDA.

Agradecimentos

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Somos gratos ao Prof. Astri Wayadande da Oklahoma State University pelo pioneirismo no procedimento de fiação de mosquitos, e à Dra. Elaine Backus do USDA-ARS em Parlier, CA, e ao Sr. Andrew Dowell da EPG Technologies Inc. em Gainesville, FL, pela assistência na solução de problemas do equipamento EPG. Também agradecemos ao Dr. Dustin Swanson e ao Sr. William Yarnell do USDA-ARS Insectary em Manhattan, KS, por fornecer mosquitos, e à Srta. Miriam Ruhinda da Kansas State University em Manhattan, KS por sua assistência nas filmagens dos vídeos processuais. Este trabalho foi possível graças ao acesso ao Integrated Molecular Entomology Core (IEMC) da Kansas State University. Esta pesquisa foi apoiada pelo Acordo de Desenvolvimento da Força de Trabalho de Pesquisa, Educação e Economia do USDA (# 58-3022-0-002) e pelo Projeto Multiestadual Hatch (NE1943). Este manuscrito é a contribuição nº 24-194-J da Estação Experimental Agrícola do Kansas, Universidade Estadual do Kansas, Manhattan, KS, EUA.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Instrumentação
AC-DC Eletropenetrógrafo de 4 canais	EPG Technologies, Inc.		Para EPG, inclui a fonte de alimentação, caixa de controle, caixa de interface de comutação, quatro amplificadores de estágio de cabeça, quatro sondas de tensão de substrato e cabos associados Almofadas
ar	Amazon.com		para o hospedeiro humano descansar a mão/braço durante o EPG
DI-710 Hardware de aquisição de dados (placa AD)	DATAQ Instruments Inc.		para digitalizar os sinais analógicos de EPG para que possam ser visualizados em um computador
Lâmpada de Aumento LED Regulável, Lupa Grande 5X com Luz e Suporte para Leitura Hobbies Artesanato Costura Bancada de Trabalho	Amazon.com		para observação comportamental durante o EPG; use apenas desconectado durante o EPG ou pode resultar ruído
Microscópio Digital de Borda Dino-Lite (ampliação de 250x)	Dino-Lite	AF4915ZT	para observação comportamental durante o EPG
Dino-Lite Suporte de mesa de braço flexível	Dino-Lite	MS22B	para segurar e manipular a câmera
Eisco Steel Retort Base Stand and Rod Set	Fisher Scientific	S41740	para segurar o amplificador do estágio principal e aterrar a gaiola de Faraday (deve ser feita de metal)
Workshop Online EPG Extensão		UF IFAShttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022	também conhecido como "recursos online" para aprender EPG (configuração de instrumentos, coleta e análise de dados, construção de Faraday, preparação de cola de prata, construção de tocos de insetos, etc.)
Furman P-1800 AR Regulador de Potência / Condicionador de Potência	Amazon.com		para reduzir o ruído da linha
Small Bubble Cushioning Wrap	Amazon.com		para uso como uma barreira entre o hospedeiro e a gaiola de Faraday
Suporte de grampo regular Troemner Talboys Labjaws	Fisher Scientific	02-217-121	para segurar o amplificador do estágio principal e aterrar a gaiola de Faraday (deve ser feito de metal e não revestido de plástico)
Computador Windows	Best Buy		para EPG & análise estatística
Software
Backus 2.0 Data Analysis SAS program	Extensão UF IFAS	https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/	para análise estatística de dados de forma de onda
Ebert 1.0 File Manipulator e Error Checker Programas SAS	UF IFAS	Extension https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/	para preparação de arquivos para análise estatística de dados de forma de onda
SAS versão 9.4	SAS Institute Inc.		para análise estatística de dados de forma de onda
WinDaq Lite	DATAQ Instrumentos Inc.		para registrar e revisar dados de EPG. Inclui o software WinDaq Hardware Manager (também conhecido como "software de gerenciamento de hardware") e o software WinDaq Waveform Browser (também conhecido como "software de revisão de forma de onda"). Para uso apenas em computadores Windows.
Gaiola de FaradayEstrutura de
tela de alumínio	Home Depot	MSCF5167	para as paredes da gaiola de Faraday
Folha de alumínio, 0.125 (1/8) de espessura 3003-H14	Metals Depot	S318	para a base da gaiola de Faraday
Suportes de canto, 1"	Home Depot	339547	para as paredes da gaiola de Faraday
Parafusos de máquina Phillips de cabeça chata, #6-32 x 1"	Home Depot	459999	para construção de gaiola de Faraday
Arruelas planas, #6	Home Depot	638977	para construção de gaiola de Faraday
Multímetro digital Fluke 15B+, para aplicações elétricas, mede medições de tensão e corrente CA/CC de até 1000 V e 10 A, juntamente com recursos de resistência, continuidade, diodo e capacitância	Amazon.com		para testar a gaiola
de FaradayRádio Portátil AM FM, Rádio Transistor Goodes com Alto-falante, Jack para Fone de Ouvido, Rádio Operado por Bateria 2AA para Recepção de Longo Alcance, Rádio de Bolso para Uso Interno, Externo e de Emergência	Amazon.com		para testar a Gaiola de Faraday
Tela de cobre puro, malha 16 x 16 com diâmetro de fio de 0,11, 36" x 12'Metro	Screenworks		para as paredes da gaiola de Faraday
Parafusos de máquina combinados de cabeça redonda, #6-32 x 3/4"	Home Depot	528466	para construção de gaiola Faraday
Lixa, 1/2" por 1", 150 Grit	Home Depot	19036-20-CC	para remover a tinta da parte inferior do suporte de laboratório Cantos da
moldura da tela, 5/16"	A Home Depot	WCORN516	para as paredes da gaiola de Faraday
Tela estriada, 0,14"	A Home Depot	3034719	para as paredes da gaiola de Faraday
Insect Stubs
Brass Escutcheon Pinos Home	Depot	801294	para a construção de tocos de insetos
Fio de cobre, 20 AWG	Amazon.com		para construção de tocos de insetos
Harris flu solúvel em água	Home Depot	355398	para ajudar a soldar a revestir o fio do toco de inseto e formar uma conexão forte
Alicate de ponta fina	Home Depot		para dobrar o fio ao construir pontas de insetos
Kit 900-015 do Pro Helping Hands	Amazon.com		para segurar os pinos do escudo durante a soldagem
Solda (com núcleo de breu)	Home Depot	296497	para a construção de tocos de insetos
Ferramenta de descascador de cortador de fio	Home Depot		para descascar e cortar fio de cobre ao construir pontas de insetos
YIHUA 928D-III Ferro de solda, 110W de alta potência, totalmente digital Display Amazon.com			para construção de pontas de insetos; vem com um suporte, esponja e lã de aço para limpeza
Aspirador de insetos
Aspirador de laboratório Accuris ASPIRE	Instrumentos Accuris	V0020	para aplicação de sucção ao aspirador de insetos; inclui o controlador de vácuo portátil, o adaptador de ponta fina (40 mm) de aço inoxidável e o adaptador de ponta de pipeta
Pipetas Pasteur da Chemglass Life Sciences, 5 3/4" de comprimento	Fisher Scientific	NC0230004	para uso como aspirador de insetos ao conectar mosquitos
Fita Elétrica Comercial de Vinil Colorido	Home Depot		para anexar a pipeta Pasteur modificada à linha de vácuo
Tecido utilitário de mosquiteiro, 10 x 10 cm quadrado	Joann Fabrics	16651622	para prevenir que mosquitos sejam aspirados para a bomba de vácuo
Tubo Saint Gobain Performance Plastics Tygon 1/4 x 7/16	Fisher Scientific	50-206-8914	para alternar rapidamente e facilmente entre diferentes pipetas Pasteur modificadas
Thermo Scientific Nalgene HDPE Quick Disconnects (3/8 a 7/16 pol. Identificação.)	Fisher Scientific	15-315B	para troca rápida e fácil entre diferentes pipetas Pasteur modificadas
Silver Glue
Elmer's Glue-All Multi Purpose White Glue	Amazon.com		para preparação de cola de prata
Silver Flake 99,9% puro, 4-8 µ m	ThermoFisher	786.09	para preparação de cola de prata
Silver Flake 99.95% puro, 8-10 µ m	Inframat Advanced Materials	47MR-12F	para preparação de cola de prata
Insect Anesthesia
CO₂ kit de borbulhador, 1000 mL, #9 Rolha de Borracha	FlyStuff	59-181	para prevenir a dessecação de insetos ao usar o flypad
Flypad FlyStuff		59-118	para evitar que os mosquitos caiam do flypad
Flystation Brush	FlyStuff	59-205	para reduzir a estática ao trabalhar em um fly pad
Flystuff Flypad tamanho padrão	FlyStuff	59-114	AKA "almofada de anestesia" para anestesiar mosquitos
Funil (4 polegadas de diâmetro)	Amazon.com		para gaseificação de copos de mosquitos antes de transferir para o flypad
Vidro Plexi ou uma tampa de plástico plana (cortada no tamanho)	Home Depot	MC-27	para cobrir o flypad se os mosquitos começarem a acordar
Braçadeiras de mangueira de tubo de plástico de corte Posição única e ajustável aberto (variedade 1/8" a 1/2")	Amazon.com		para desviar o gás entre o flypad e o funil
Regulador de CO₂ de estágio único	FlyStuff	59-142	para regular o fluxo de gás do CO₂tanque
" T” Encaixe para Tubulação de 1/8in ID	FlyStuff	59-123	para conectar tanto o flypad quanto o funil ao tanque de CO₂
Tubulação, transparente	FlyStuff	59-124C	para conectar o funil e o flypad ao regulador no tanque de CO₂
Insect Wiring
Cartolina preta, (65Lb, 176 g/m²) 8.5" x 11"	Michael's Stores Inc.	327826	para facilitar a visualização do fio de ouro
Quadrado de papel de construção preto 3.5" x 4.0"	Grampos	956221	para facilitar a visualização do fio de ouro
Bolas de algodão	Amazon.com		para mosquitos em jejum
Bloco de espuma de artesanato #12 (3.1 cm x 17.2 cm x 30.2 cm)	Loja de Tecidos e Artesanato Joann	1941079	para segurar mosquitos com fio
Fita Deflecto Dispensador, Amazon.com			para armazenar fio de ouro
Pinça de entomologia Featherweight	Fisher Scientific	S72110	para manipulação de insetos
Pinça fina (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)	Ferramentas de Ciência Fina	91150-20	para fazer um laço de ouro ao conectar mosquitos
Pincel de ponta fina	Amazon.com		para manipular mosquitos durante a fiação e EPG; deve ter um cabo de plástico ou madeira se usado para EPG
Pipetas de transferência padrão de ponta fina, estreitas, 5,8 mL	Thomas Scientific	7761D21	para preparação de cola de prata
Fio de ouro, 99,99% puro, 0,025 mm de espessura	Goodfellow	AU005121	para fiação de mosquitos
Pinos Minutien, ponta 0,2 mm, 1 cm	Fisher Scientific	NC9681411	para aplicação de cola nos mosquitos
Copos de papel	Tubo de Papel Rígido		para mosquitos em jejum
Torno de pino	Fisher Scientific	50-996-811	para segurar o pino minuciense durante a fiação de insetos
Caixa de armazenamento de plástico com tampa (7 polegadas x 9 polegadas x 14 polegadas)	Amazon.com		para transportar mosquitos com fio
Vidro Plexi ou uma tampa de plástico plana (cortada no tamanho)	Home Depot	MC-27	para cobrir a almofada de mosca se os mosquitos começarem a acordar
Pinça de fechamento automático	Fisher Scientific	08-906	para segurar e manipular fio de ouro
Compressed Gas
CO₂tanque de gás	Gás		para anestesiar mosquitos com um flypad
*Common Lab Items*
Sacos de autoclave descartáveis Biohazard, 8 1/2" x 11"	Fisher Scientific	03-410-591	para descarte de mosquitos alimentados com sangue
Bico de Bunsen ou maçarico de propano	Amazon.com		para modificação de pipetas Pasteur
Fita de laboratório colorida	Daigger Fornece	EF9763R	para rotular, preparar cola de prata e mascarar pinças
Pontas de pipeta descartáveis, 1000 µ L	Fisher Scientific		para aliquotar água ao fazer cola de prata
Microscópio de dissecação	Leica Microsystems		para fiação de mosquitos
Sonda de dissecação	Fisher Scientific	NC9109673	para agitar e aplicar cola de prata
Erlenmeyer frasco, 1000 mL	Fisher Scientific		para prevenir a dessecação de insetos ao usar o flypad
Etanol, 70%	Fisher Scientific	04-355-122	para recuperar mosquitos que escaparam
Placas de vidro Petri	Fisher Scientific	08-747B	para anestesiar mosquitos com gelo
Luvas	Fisher Scientific		para proteção pessoal
Kimwipes KimTech Science marca delicada tarefa limpadores	Fisher Scientific	06-666	para esmagar mosquitos
Jalecos Fisher	Scientific		para proteção pessoal
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Referências

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