Artigo de método

Eletropenetrografia AC-DC para o Estudo dos Comportamentos de Sondagem e Ingestão de Mosquitos Culex tarsalis em Mãos Humanas

1.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/66877

⸱

29 de novembro de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

Neste artigo

Resumo

Os procedimentos são descritos para estudar os comportamentos de sondagem e ingestão de mosquitos Culex tarsalis em mãos humanas usando eletropenetração AC-DC.

Resumo

Os mosquitos transmitem patógenos que afetam negativamente a saúde humana e animal. Uma maior compreensão de sua biologia de alimentação sanguínea e interações com hospedeiros e patógenos pode ser explorada para desenvolver novos alvos para o controle de doenças transmitidas por mosquitos. Infelizmente, os comportamentos de sondagem (ou seja, picada) dos mosquitos são mal compreendidos porque ocorrem dentro dos tecidos do hospedeiro. Aqui, um procedimento não invasivo é descrito para usar a eletropenetração AC-DC (EPG) para visualizar e quantificar indiretamente os comportamentos de alimentação do mosquito, registrando mudanças nos sinais elétricos gerados ao sondar e ingerir nas mãos humanas. Fios finos de ouro são presos aos mosquitos usando cola de prata condutora e conectados ao instrumento EPG. O hospedeiro humano segura uma sonda de tensão de substrato na mão. A sondagem do hospedeiro pelo mosquito com fio completa o circuito elétrico, e os sinais elétricos são registrados em um computador como "formas de onda" que podem ser medidas e enumeradas para análise. Esta metodologia tem sido utilizada para caracterizar os comportamentos de sondagem e ingestão de mosquitos Aedes aegypti e Culex tarsalis e pode ser aplicada a outras espécies de mosquitos. O EPG pode ser usado para estudar os efeitos de patógenos, inseticidas e outros fatores nos comportamentos alimentares dos mosquitos.

Introdução

Os mosquitos causam sofrimento e perdas econômicas em todo o mundo devido aos seus papéis como vetores de doenças e pragas incômodas1. Os mosquitos Anopheles transmitem a malária, que causa anualmente cerca de 219 milhões de casos em todo o mundo, mais de 400.000 mortes2 e 12 bilhões de dólares americanos em custos diretos3. Os mosquitos Aedes são os vetores mais notáveis de importância para a saúde pública porque têm uma presença quase global e transmitem agentes de Chikungunya, dengue, filariose linfática, febre do Vale do Rift, febre amarela e Zika, que ceifam vidas, sobrecarregam os sistemas de saúde e resultam em sofrimento crônico, morbidade ao longo da vida e incapacidade4,5. Além disso, os mosquitos Culex transmitem agentes de encefalite equina, encefalite japonesa, filariose linfática, encefalite de Saint Louis e febre do Nilo Ocidental, que afetam a saúde humana e animal3,4.

O controle de vetores com abordagens baseadas em inseticidas é o principal método para controlar doenças transmitidas por vetores globalmente6,7. No entanto, o número de inseticidas disponíveis para o controle de mosquitos é limitado. Além disso, a resistência a inseticidas está evoluindo em muitas espécies, especialmente em mosquitos Aedes, impactando nossa capacidade de combater doenças transmitidas por vetores e impulsionando a necessidade de novas estratégias de controle6,8. Uma melhor compreensão da biologia do mosquito, das interações mosquito-hospedeiro-patógeno e dos processos que regulam a transmissão do patógeno pode facilitar o desenvolvimento de novas ferramentas para o controle vetorial6.

Comportamentos de sondagem e ingestão em tecidos hospedeiros podem afetar a transmissão de patógenos e a patologia da doença9,10,11,12. Por exemplo, mais microfilárias foram ingeridas quando o Aedes aegypti se alimentou diretamente dos capilares, em vez de acumular sangue fora dos vasos rompidos13. Assim, pesquisas fundamentais e aplicadas sobre esse tópico podem ajudar no desenvolvimento, refinamento e avaliação de estratégias de controle de mosquitos e outras contramedidas para a transmissão de patógenos. No entanto, existem lacunas significativas de conhecimento nos detalhes dos comportamentos crípticos de alimentação de sangue que ocorrem abaixo da superfície da pele do hospedeiro, porque esses comportamentos geralmente requerem procedimentos invasivos em modelos animais vivos ou empregam substratos artificiais transparentes ou dietas líquidas9,11,14,15. Técnicas de eletropenetração não invasiva (EPG; também chamada de gráfico de penetração elétrica) têm sido usadas para estudar comportamentos alimentares de insetos que se alimentam de plantas relacionados à transmissão de patógenos de plantas, resistência de plantas hospedeiras e modos de ação de inseticidas, pois permitem que os pesquisadores observem, registrem e quantifiquem indiretamente os movimentos e comportamentos do aparelho bucal que ocorrem dentro dos tecidos do hospedeiro10,12.

Desde a década de 1950, técnicas eletrônicas de monitoramento de penetração têm sido aplicadas a artrópodes que se alimentam de sangue, incluindo mosquitos16,17,18,19,20. No entanto, o EPG nunca foi amplamente adotado para artrópodes que se alimentam de sangue, pois as atividades biológicas correspondentes às formas de onda nunca foram verificadas21. Além disso, os projetos e a eletrônica dos primeiros instrumentos resultaram em ênfase excessiva de alguns sinais elétricos, altas relações ruído-sinal, baixa resolução e distorção das formas de onda e irritação para hospedeiros vertebrados12,22. Um instrumento mais recente, o monitor AC-DC EPG < classe sup = "reff">23, possui configurações variáveis e processamento de sinal aprimorado, tornando-o mais adequado para registrar artrópodes que se alimentam de sangue e decifrar as origens biológicas das formas de onda em estudos experimentais de correlação10,12.

Para EPG, um sinal elétrico é aplicado ao hospedeiro por meio de uma sonda de tensão de substrato (ou seja, eletrodo de referência). O artrópode é conectado a um eletrodo de gravação e colocado no hospedeiro. Quando o artrópode insere suas peças bucais (ou seja, estiletes) no hospedeiro, o sinal elétrico é transmitido ao monitor AC-DC EPG para processamento de sinal. Os sinais elétricos são então exibidos em um computador como "formas de onda" correspondentes a comportamentos específicos, como movimentos do aparelho bucal, ingestão, salivação e aquisição/inoculação de patógenos10,12. Variáveis de resposta sequenciais e não sequenciais relacionadas à duração e contagem das formas de onda24,25 em diferentes níveis hierárquicos (famílias, tipos e subtipos) podem então ser calculadas com base na frequência e duração das formas de onda para obter informações sobre os comportamentos alimentares que ocorrem dentro e entre as espécies e em resposta a fatores bióticos e abióticos, como hospedeiros, patógenos, pesticidas e condições ambientais10,12.

Até o momento, o monitor de EPG AC-DC tem sido utilizado para caracterizar os comportamentos de sondagem e ingestão de mosquitos Ae. aegypti26 e Culex tarsalis27 alimentando-se de mãos humanas, e carrapatos Dermacentor variabilis e Amblyomma americanum alimentando-se de bezerros bovinos28. Além disso, um modelo murino para EPG29 foi desenvolvido recentemente para facilitar estudos de patógenos usando este instrumento. As mãos humanas são ideais para a caracterização inicial da forma de onda do mosquito porque os hospedeiros humanos podem relatar quando sentem a sondagem do mosquito, bem como outros comportamentos, facilitando a correlação das formas de onda com os comportamentos (Tabela 1). Além disso, uma melhor compreensão da plasticidade nos comportamentos alimentares entre mosquitos em diferentes populações humanas pode contribuir para o desenvolvimento de intervenções de manejo mais especializadas para mosquitos e os patógenos que eles transmitem.

Tabela 1: Descrição das famílias de formas de onda usadas para classificar sinais elétricos registrados de Culex tarsalis em mãos humanas usando AC-DC EPG. A fase de sondagem e as atividades biológicas correspondentes a cada família de formas de onda. Consulte Cooper et al.27 para obter mais informações. Abreviatura: AC = corrente alternada, DC = corrente contínua, EPG = eletropenetrógrafo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Para facilitar o uso do EPG para estudar a biologia do mosquito e as interações hospedeiro-vetor, a metodologia para quantificar os comportamentos alimentares de mosquitos Cx. tarsalis em mãos humanas usando o monitor AC-DC EPG é apresentada aqui. Esses protocolos se baseiam nos procedimentos fundamentais de AC-DC EPG descritos em recursos on-line30 e assumem que os usuários têm um conhecimento básico de trabalho de AC-DC EPG e software associado31. Os procedimentos descritos podem ser modificados para outras espécies de mosquitos e hospedeiros e fornecem uma base para facilitar a pesquisa baseada em hipóteses dos comportamentos alimentares dos mosquitos.

Tabela 2: Definições da terminologia comum de EPG AC-DC. As definições são baseadas naquelas fornecidas em recursos online30,31 e literatura científica32. Abreviatura: AC = corrente alternada, DC = corrente contínua, EPG = eletropenetrógrafo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Protocolo

Este protocolo (IRB-10729) foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos (IRB) da Universidade Estadual do Kansas27 e destina-se ao uso exclusivo com mosquitos livres de patógenos. Os voluntários humanos deram seu consentimento informado para participar do estudo e para a publicação de seus dados. Antes de iniciar qualquer trabalho com animais, seres humanos ou agentes biológicos, certifique-se de que todos os procedimentos foram analisados e aprovados pelos comitês regulatórios institucionais ou indivíduos responsáveis apropriados. Veja a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os equipamentos e materiais utilizados neste protocolo.

1. Preparação inicial e configuração

  1. Configure o monitor EPG AC-DC (Figura 1A), a gaiola de Faraday (Figura 1B,C) e o software conforme descrito anteriormente30,31, utilizando as modificações descritas abaixo (etapas 1.1.1-1.1.5). Consulte os recursos online30 para tutoriais passo a passo sobre a montagem e utilização do equipamento e software. Salve a configuração desejada como padrão no software de gerenciamento de hardware e de análise de formas de onda. Consulte a Tabela 2 para obter uma lista de terminologias comuns em EPG AC-DC e suas definições.
    1. Conecte um amplificador de estágio inicial (head amp) e uma sonda de tensão do substrato ao Canal 1 da caixa de controle.
      NOTA: Apresenta-se a gravação de um único canal, mesmo que o monitor AC-DC possa acomodar simultaneamente quatro insetos e hospedeiros.
    2. Verifique se o Canal 1 da caixa de controle está ligado e se os canais correspondentes Pre-1 e Post-1 na caixa de interface comutadora também estão ligados.
      NOTA: Os canais não utilizados devem permanecer desligados.
    3. Utilize o software de gerenciamento de hardware para habilitar os canais 1 e 3 na placa A/D DI-710 (e nenhum outro) para gravar os sinais pré e pós-retificados.
    4. Configure o software de gerenciamento de hardware para visualizar/sobrepor as formas de onda pré e pós-retificadas (por exemplo, 1 = 1 para o sinal pré e 2 = 3 para o sinal pós).
    5. Defina a taxa de amostragem no software de gerenciamento de hardware para 100 amostras por segundo por canal (ou seja, S/s/CHAN: 100).
  2. Construa os suportes para insetos26,27,29,30:
    1. Pré-aqueça o ferro de solda à temperatura recomendada para a solda específica com núcleo de resina.
    2. Use uma ferramenta de corte e descarnamento de fios para remover o revestimento plástico a aproximadamente 6 cm da extremidade de um rolo de fio de cobre 20 AWG, evitando cortar ou danificar o feixe interno de fios de cobre (Figura 2A). Em seguida, corte o feixe de fios de cobre exposto e desfaça-o em fios individuais (Figura 2B).
    3. Use um alicate de ponta fina para enrolar um fio de cobre ao redor do eixo de um pino escutcheão adequado, logo abaixo da cabeça (ou seja, topo plano), de modo que a maior parte do fio de cobre se estenda além da cabeça do pino. Dobre a ponta do fio sobre a cabeça do pino para fixar o fio no lugar (Figura 2C).
      NOTA: Teste pinos escutcheões para identificar aqueles que se encaixam firmemente na porta do amplificador de cabeça (quando estiver desligado, desconectado e ajustado para 106 Ohms (Ω)).
    4. Prenda o eixo do pino escutcheão na ajuda de mãos para soldagem, de modo que o fio de cobre fique voltado para cima. Em seguida, aplique uma pequena quantidade (~0,2 cm de diâmetro) de fluxo solúvel em água na junção entre o pino escutcheão e o fio de cobre (Figura 2D).
      ATENÇÃO: O fluxo é tóxico e deve ser manipulado com cuidado.
    5. Desenrole cerca de 10 cm de solda e alise-o. Segure o ferro de solda aquecido contra a cabeça do pino por alguns segundos até que o fluxo derreta e o metal esteja quente. Em seguida, pressione a ponta da solda contra a cabeça do pino, ao lado do ferro de solda, até que a solda derreta e cubra completamente a junção, fundindo o pino e o fio em um suporte para inseto.
    6. Enquanto o suporte para inseto esfria, limpe a ponta do ferro de solda com lã de aço e uma esponja úmida.
    7. Quando estiver frio, remova o suporte para inseto da ajuda de mãos. Enxágue o suporte em etanol 70% e, em seguida, em água, para remover o fluxo residual. Corte o fio de cobre ao comprimento desejado (~3 cm, Figura 2E).
    8. Repita as etapas 1.2.3-1.2.7 até que 20-30 suportes para insetos sejam construídos.
  3. Monte um aspirador de insetos26,27:
    1. Passe a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro por uma chama, girando ligeiramente a pipeta. Repita até que a extremidade da pipeta tenha o tamanho adequado para se encaixar firmemente ao redor do abdômen do inseto.
    2. Cubra a extremidade larga da pipeta de Pasteur modificada com tela de mosquito, depois insira-a diretamente no tubo de silicone conectado a um aspirador de laboratório e fixe a junção com fita isolante para formar um aspirador de insetos (Figura 2H).
      NOTA: A pipeta de Pasteur e a tela podem ser inseridas em um pequeno trecho de tubo plástico equipado com um conector rápido para facilitar a troca entre diferentes tamanhos (Figura 2H).

Configuração do laboratório de eletrofisiologia para gravação de EEG; inclui amplificador, computador, gaiola de Faraday e sensores.
Figura 1: Configuração do equipamento do monitor EPG AC-DC para gravação em mãos humanas. (A) Componentes do EPG, incluindo (1) caixa de controle, (2) caixa de interface comutadora, (3) fonte de alimentação, (4) placa A/D DI-710, (5) computador, (6) regulador de tensão e (B) gaiola de Faraday contendo (C) um microscópio digital (7) em um suporte flexível, (8) plástico bolha e travesseiros de ar, (9) sonda de tensão do substrato e (10) amplificador de estágio primário em um suporte de laboratório. Abreviações: AC = corrente alternada, DC = corrente contínua, EPG = eletropenetrogafia. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Processo de montagem do cateter com tubos, fios e ferramentas; diagrama da configuração experimental para transferência de fluido.
Figura 2: Eletrodos de gravação para conexão de mosquitos e um aspirador de insetos para manipulação dos mosquitos durante a conexão. (A) Fio de cobre 20 AWG com 6 cm do revestimento plástico removido para expor o feixe de fios de cobre interno. (B) Fios individuais do feixe de fios de cobre. (C) Um fio de cobre enrolado ao redor da cabeça de um pino de latão com a ponta do fio dobrada sobre a cabeça do pino. (D) Uma pequena quantidade de fluxo na junção entre o pino de latão e o fio de cobre, mantida por um auxílio para soldagem com braços auxiliares, em preparação para a soldagem. (E) Um suporte para inseto concluído, construído a partir de um prego de latão soldado a um fio de cobre. (F) Um eletrodo de gravação construído com um fio de ouro enrolado ao redor da ponta do fio de cobre de um suporte para inseto e fixado com cola de prata. (G) Uma ampliação do laço de ouro na ponta do eletrodo de gravação. (H) Um aspirador de insetos montado (superior) e desmontado (inferior), feito a partir de pipetas Pasteur modificadas, tela para mosquitos, tubo plástico, fita isolante e conectores rápidos macho, ao lado do tubo de aspirador de laboratório equipado com o conector rápido fêmea (canto superior direito). Barras de escala = 1 cm (A-F), 200 µm (G). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

2. Fiação de mosquitos

  1. Prepare mosquitos e cola de prata (na tarde/à noite anterior ao EPG):
    1. Crie e mantenha mosquitos da linhagem KNWR de Cx. tarsalis conforme descrito anteriormente27.
    2. Deixe fêmeas adultas de mosquitos, com 5 a 17 dias após a ecdise, em jejum por 8 a 12 h para aumentar as taxas de sondagem, mas permita acesso à água para evitar mortalidade.
    3. Prepare cola de prata fresca26,27,28,29,30:
      1. Adicione 510 mg de flocos de prata de 4-8 µm a um béquer de 20 mL. Zere a balança e adicione 1.100 mg de cola escolar não tóxica ao béquer, por cima dos flocos de prata.
      2. Zere a balança, adicione 510 mg de flocos de prata de 8-10 µm ao béquer por cima da cola e, em seguida, adicione 1.000 µL de água usando uma pipeta.
      3. Adicione suavemente uma barra de agitação ao béquer e coloque-o na placa de agitação. Inicie a agitação lentamente, aumente gradualmente até o nível "rápido" e agite por 4 min. Certifique-se de que todos os componentes estejam incorporados.
      4. Use uma pipeta de transferência (com a ponta cortada) para transferir a cola de prata para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
      5. Envolva as tampas dos tubos de cola de prata com Parafilm e armazene em bancada até o uso.
        NOTA: A cola de prata mantém a consistência adequada por até 2 dias, mas recomenda-se preparar cola fresca na noite anterior ao uso30.
  2. Prepare os eletrodos de gravação26,27,29,30:
    1. Vortexe vigorosamente a cola de prata antes do uso.
    2. Envolva um bloco de espuma com filme plástico novo para acomodar os suportes de insetos preparados e os mosquitos com fio.
      NOTA: A espuma deve ser grande o suficiente para permitir que os mosquitos com fio fiquem em pé na superfície sem tocar uns nos outros, mas pequena o suficiente para caber dentro de uma caixa de armazenamento. CUIDADO: Gotículas excretadas após a alimentação com sangue podem conter patógenos. Descarte o filme plástico e o bloco de espuma adequadamente após o uso.
    3. Remova a oxidação (e a cola de prata antiga, se estiver reutilizando os suportes de insetos) da ponta do fio de cobre raspando os primeiros 1 cm do fio de cobre com uma lâmina de barbear até que fique brilhante em todos os lados. Prepare um suporte de inseto para cada mosquito, além de alguns extras.
    4. Corte fio de ouro de diâmetro 0,025 mm em pedaços de 4-5 cm de comprimento. Segure sempre o fio com pinças auto-fecháveis revestidas com fita para evitar amassá-lo.
      NOTA: O fio de ouro é muito mais visível sobre um fundo preto.
    5. Coloque a extremidade do fio de ouro ao longo da ponta limpa do fio de cobre do suporte de inseto e enrole suavemente o fio de ouro 3 vezes ao redor do fio de cobre.
    6. Use uma sonda de dissecação para aplicar cola de prata e fixar o fio de ouro no lugar. Certifique-se de que não haja ponta solta ou sobra. Coloque o suporte de inseto na espuma até que a cola seque.
    7. Passe suavemente sobre o fio de ouro preso ao suporte de inseto para alisar e moldar um arco longo e suave (Figura 2F). Corte o fio no comprimento desejado (~2,5-3 cm).
    8. Trabalhando sob um microscópio de dissecação, use pinças de ponta fina para formar uma alça de ouro na ponta do fio de ouro e dobre a alça em um ângulo de 90° conforme descrito abaixo (passos 2.2.8.1-2.2.8.4; Figura 2E,F). Certifique-se de que a alça de ouro esteja completamente fechada. Devolva o suporte de inseto ao bloco de espuma.
      1. Com a mão não dominante, segure o suporte de inseto pelo prego de latão, com a ponta do fio de ouro tocando a platina do microscópio. Com a mão dominante, segure a extremidade do fio de ouro com pinças de ponta fina.
      2. Usando as pinças de ponta fina, cruze a ponta do fio de ouro sobre o fio de cobre do suporte de inseto próximo ao ponto onde o fio de ouro está colado. Toque a extremidade das pinças e do fio de ouro contra a platina do microscópio.
      3. Puxe suavemente o suporte de inseto até que o fio de ouro forme uma pequena alça de ouro ao redor da ponta das pinças de ponta fina (não puxe muito forte). Solte o fio de ouro e remova cuidadosamente as pinças.
      4. Enquanto ainda segura o suporte de inseto com a mão não dominante, segure a alça de ouro com as pinças de ponta fina de modo que as pinças fiquem em um ângulo perpendicular ao pescoço do fio e a ponta das pinças cubra o centro da alça de ouro, segurando assim ambos os lados da alça. Puxe suavemente o suporte de inseto enquanto gira levemente as pinças para longe do suporte de inseto até que a alça fique dobrada em um ângulo de 90° em relação ao pescoço do fio (Figura 2G).
  3. Conecte os eletrodos de gravação aos mosquitos26,27,29,30 (na manhã do EPG):
    1. Anestesie os mosquitos em jejum com gás CO2 até que todo movimento cesse. Posicione os mosquitos de costas sobre o suporte de anestesia, com os abdômenes voltados para o pesquisador.
    2. Coloque um pedaço de fita laboratorial de ~2 cm sob um microscópio de dissecação, com o lado adesivo para baixo. Coloque uma gota de ~0,5 cm (~10 µL) de cola de prata sobre a fita.
    3. Aspire o abdômen de um mosquito anestesiado para dentro da pipeta de Pasteur modificada, usando a sucção apenas o tempo suficiente para fixar o abdômen no lugar. Segure o mosquito sob o microscópio estereoscópico acima da cola de prata usando o aspirador.
      NOTA: As asas podem estar dentro ou fora da ponta da pipeta de Pasteur modificada, mas mantê-las dentro ajudará a evitar que o mosquito caia. Evite dobrar ou danificar as asas.
    4. Trabalhando rapidamente, mergulhe um pino minutien na cola de prata e aplique uma camada fina sobre o pronoto do mosquito (ou seja, a superfície dorsal do tórax). Prossiga imediatamente para o próximo passo, se possível (ou reanestesie o mosquito, se necessário).
      NOTA: Recomenda-se remover as escamas do pronoto esfregando o pino para frente e para trás para garantir melhor penetração da cola nos poros da cutícula. Evite colocar cola em qualquer outra parte do mosquito.
    5. Mergulhe rapidamente a alça de ouro na ponta do eletrodo de gravação na cola de prata e coloque-a sobre o ponto de cola de prata no pronoto do mosquito. Balance a alça para frente e para trás para garantir que ela fique bem assentada contra o pronoto. Segure o fio até que a cola seque (~20-25 s).
    6. Reposicione o suporte de inseto na espuma em um ângulo que permita ao mosquito com fio ficar em pé confortavelmente quando acordar. Prossiga com a conexão do próximo mosquito.
      NOTA: É aconselhável anotar observações sobre a qualidade de cada conexão realizada.
    7. Após conectar o número desejado de mosquitos, coloque o bloco de espuma em uma caixa de armazenamento. Mantenha os mosquitos em condições normais de criação até o uso.

3. Configuração e preparação do EPG (na manhã anterior ao EPG)

  1. Ligue o monitor EPG AC-DC (acionando o interruptor na fonte de alimentação) pelo menos 30 minutos antes da gravação para permitir a equilibração do instrumento e qualquer solução de problemas necessária.
    NOTA: Os canais em uso na caixa de controle e na caixa de interface de comutação podem permanecer ligados.
  2. Ligue o computador e abra o software de gerenciamento de hardware.
    NOTA: Se os sinais não aparecerem como linhas finas e planas, será necessário realizar solução de problemas (ver seção de discussão).
  3. Realize o teste de toque27,30 para verificar o funcionamento do equipamento:
    1. Enquanto estiver aterrado (ou seja, tocando a gaiola de Faraday com a pele nua), gire o botão do amplificador de cabeça para 106 Ω e insira o eixo de uma ponta de inseto na porta.
      ​NOTA: Realizar o teste de toque em um nível mais alto de resistência de entrada (Ri) pode danificar o amplificador de cabeça.
    2. Enquanto estiver aterrado, ligue o amplificador de cabeça e segure firmemente o fio de cobre da ponta de inseto entre o indicador e o polegar três vezes. Se o EPG estiver funcionando corretamente, três picos grandes aparecerão nos sinais pré e pós na tela. Caso contrário, será necessário realizar solução de problemas (ver seção de discussão).
  4. Ajuste as configurações do instrumento para 150 mV de corrente alternada (CA) com um Ri de 107 Ω, um ganho de hardware de 20-40x, um deslocamento negativo, uma linha de base nativa e um ganho de software de 8-16x27,30, conforme descrito abaixo (etapas 3.4.1-3.4.3).
    1. Defina a tensão, o tipo de corrente, o ganho de hardware (faixa, ganho e multiplicador), o deslocamento e a linha de base (zero) usando os interruptores e botões do Canal 1 da caixa de controle.
      NOTA: A configuração apropriada do ganho de hardware depende da qualidade do trabalho de fiação e da cola de prata; portanto, espera-se variação nas configurações ideais de ganho de mosquito para mosquito e de dia para dia. O ganho de hardware pode precisar ser ajustado durante a gravação se os picos do sinal forem saturados (definido na Tabela 2 e mostrado na Figura 3A,C) ou forem muito pequenos para visualização. Quaisquer alterações no ganho de hardware afetarão permanentemente a gravação (mostrado na Figura 3A,C).
    2. Defina o nível de Ri usando o botão no amplificador de cabeça.
    3. Defina e ajuste o ganho de software usando o software de gerenciamento de hardware (por exemplo, selecione o sinal pré ou pós e clique com o botão esquerdo para aumentar o ganho de software ou com o botão direito para diminuí-lo).
      NOTA: Quaisquer alterações de ganho feitas no software NÃO afetarão permanentemente a gravação.
  5. Configure uma nova gravação no software de gerenciamento de hardware, mas não inicie a gravação até a etapa 4.3 na próxima seção.

4. EPG em mãos humanas26,27 :

  1. Após obter o consentimento informado (conforme especificado pelo comitê de ética da instituição de origem), posicione o voluntário ao lado da gaiola de Faraday com um braço no interior, segurando a sonda de tensão do substrato e mantendo-a abaixo do amplificador de cabeça.
    NOTA: O braço deve repousar confortavelmente sobre uma camada de plástico bolha ou outro substrato não condutor. A mão e a sonda de tensão do substrato não devem tocar a gaiola de Faraday ou o amplificador de cabeça durante a gravação. Para evitar danos, é imperativo que o voluntário não toque o amplificador de cabeça após ele ser ligado. Caso o amplificador de cabeça seja tocado acidentalmente, realize o teste de toque descrito anteriormente para avaliar sua funcionalidade.
  2. Uma vez que o voluntário esteja posicionado, vire o amplificador de cabeça para o lado. Retire um mosquito com fio da caixa de armazenamento e conecte-o ao instrumento inserindo o pino de latão do suporte do inseto na porta do amplificador de cabeça. Deixe o mosquito pendurado.
    NOTA: Mantenha um frasco com spray de etanol 70% por perto para controlar mosquitos que se soltarem do fio.
  3. Inicie a gravação utilizando o software de gerenciamento de hardware. Posicione o amplificador de cabeça acima da mão de modo que o mosquito possa ficar em pé e realizar a punção com conforto.
  4. Ligue o amplificador de cabeça enquanto estiver aterrado. Inicie um cronômetro de 10 minutos. Ajuste a posição da mão do voluntário conforme necessário para auxiliar no sucesso da punção.
    NOTA: Ao usar mosquitos propensos a punçar imediatamente, ligue o amplificador de cabeça antes de posicionar o mosquito sobre a mão. Um palito de madeira fino ou o cabo de um pincel não condutor pode ser usado para dobrar o fio de cobre do suporte do inseto e ajustar ainda mais a posição do mosquito. Uma lupa ou microscópio digital montado em um braço flexível pode auxiliar na observação do mosquito durante a EPG, especialmente em estudos de correlação comportamental.
  5. Utilize o software de gerenciamento de hardware para fazer observações com carimbo de tempo (por exemplo, marcadores de evento) durante a gravação, referentes às respostas do hospedeiro, comportamentos do mosquito, mudanças de ganho, etc. Ajuste a posição dos sinais na tela e o ganho do software conforme necessário para manter ambos os sinais claramente visíveis na tela. Ajuste o ganho de hardware se os sinais atingirem pico (Figura 3A,C e Tabela 2) ou se as ondas parecerem muito pequenas quando o ganho do software estiver no máximo. Ajuste o offset se for observado dobramento do retificador (Figura 3C,C' e Tabela 2). Consulte o manual do software31 e os recursos online30 para obter instruções detalhadas sobre como realizar esses ajustes.
    1. Para ajustar a posição dos sinais na tela, selecione o sinal pré ou pós (por exemplo, clicando em
      1 = 1       ou 2 = 3) e então arraste o sinal para a posição desejada na tela (idealmente próximo ao centro da tela, mas sem sobreposição).
    2. Para ajustar o ganho do software, utilize o software de gerenciamento de hardware descrito na etapa 3.4.3.
    3. Para ajustar o ganho de hardware, comece girando o botão de ganho do canal 1 para a direita ou para a esquerda para aumentar ou diminuir o ganho, respectivamente. Se esse ajuste não for suficiente para eliminar o pico (ganho muito alto; Figura 3A,C) ou permitir que os detalhes do sinal sejam claramente visualizados (ganho muito baixo), altere as chaves de faixa e multiplicador do canal 1 para ajustar ainda mais o ganho.
      NOTA: Recomenda-se o uso de marcadores de evento para registrar quando o ganho de hardware foi ajustado, a fim de auxiliar na interpretação dos dados das formas de onda.
    4. Para ajustar o offset, altere a chave de offset do canal 1 na caixa de controle para neg, depois gire o botão de offset do canal 1 até que os picos nos sinais pré e pós ocorram na mesma direção na tela do computador. Se o botão de offset for girado demais, o sinal pós irá inverter novamente.
  6. Se o mosquito não realizar a punção dentro de 10 minutos (ou outro ponto temporal definido), desligue o amplificador de cabeça. Se o mosquito estiver em meio à punção no momento marcado, permita que ele conclua a punção antes de desligar o amplificador de cabeça. Peça ao voluntário que retire cuidadosamente a mão, depois remova o mosquito com o suporte do inseto acoplado. Devolva o mosquito à caixa de armazenamento.
  7. Encerre/feche a gravação utilizando o software de gerenciamento de hardware. Prossiga com a EPG no próximo mosquito (Etapa 4.2).
    NOTA: Lembre-se de alterar o nome do arquivo após cada mosquito.
  8. Desligue o amplificador de cabeça e a fonte de alimentação ao final da sessão e feche o software.
  9. Revise a Declaração de Debriefing do Participante ou documento similar com o voluntário conforme especificado pelo comitê de ética aprovado.
  10. Descarte os mosquitos conforme exigido pelo protocolo. Remova o plástico aderido ao bloco de espuma e descarte-o adequadamente.
  11. Após a conclusão de toda a coleta de dados, revise e meça as formas de onda e analise os dados conforme descrito anteriormente24,25,26,27,29,30. Consulte os recursos online30 para tutoriais passo a passo sobre o uso do software de revisão de formas de onda, criação de figuras que representem as formas de onda, medição das formas de onda, exportação dos dados para análise, realização da análise estatística e uma explicação detalhada das variáveis comuns de resposta das formas de onda.

Gráfico de dados eletrofisiológicos ilustrando mudanças transitórias na amplitude do sinal ao longo do tempo.
Figura 3: Exemplos de gravações subótimas devido a pico excessivo, alterações no ganho da caixa de controle, mudanças de tensão pouco claras causadas por fiação inferior, dobramento do retificador e ruído. Formas de onda de mosquitos Culex tarsalis se alimentando até a saciedade em mãos humanas, distorcidas por (A) pico excessivo (seta horizontal azul) e alterações subsequentes no ganho da caixa de controle de 100x para 80x, para 40x, para 60x, para 40x e para 20x (setas verticais laranja), (B) mudanças de tensão pouco claras e (C) dobramento do retificador no sinal pós- (preto) em comparação com o sinal pré- (vermelho) (ver forma de onda J, ampliação mostrada no painel C'), ruído de linha (onda senoidal de 11 Hz visível apenas no sinal pré-retificação (vermelho), ampliação mostrada no painel C'), pico excessivo (seta horizontal azul) e alteração no ganho da caixa de controle de 500x para 200x (seta vertical laranja). Os nomes das formas de onda são mostrados na parte superior de cada painel. As setas roxas no canto inferior direito do painel C indicam quando o amplificador de cabeça foi desligado após a conclusão da sonda e fornecem outro exemplo de dobramento do retificador. As linhas horizontais vermelhas associadas ao sinal pré-retificação no painel C indicam quando os Marcadores de Evento foram usados para registrar anotações com carimbo de tempo. Os níveis de Ri, sinais aplicados, escalas de tempo e ganhos de software são: (A) 107 Ω, 150 mV CC, 13,2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV CC, 4,4 s/div, 128x; e (C) 107 Ω, 150 mV CA, 7,4 s/div, 2x; (C') 0,2 s/div, 8x. Abreviações: CA = corrente alternada, CC = corrente contínua, Ri = resistência de entrada, mV = milivolt, Ω = Ohms, s/div = segundos por divisão. Esta figura foi preparada com dados de Cooper et al.27. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados

Gravações EPG AC-DC da alimentação com sangue de mosquitos Cx. tarsalis em mãos humanas (Figura 4) geraram formas de onda interpretáveis adequadas para análise e publicação27. As formas de onda interpretáveis continham padrões repetitivos distintos e diferenciáveis que podiam ser classificados em famílias de formas de onda (Tabela 1 e Figura 4), tipos e subtipos quando a compressão (definida na Tabela 2) e o ganho de software eram ajustados no software de revisão de formas de onda27,31. Todas as famílias de formas de onda (J, K, L, M, N) e tipos (L1, L2, M1, M2) previamente descritos em Ae. aegypti alimentando-se em mãos humanas26 foram identificados nas formas de onda geradas por Cx. tarsalis alimentando-se em mãos humanas, confirmando a validade dos métodos aqui descritos. Além disso, foram identificados três novos tipos de formas de onda (M3, N1, N2) e numerosos subtipos de L1, L2, M1 e M227. Adicionalmente, a queda de tensão de volta à linha de base quando as peças bucais são retiradas do hospedeiro foi denominada família de formas de onda W27.

Variar sistematicamente as configurações do instrumento (tipo de corrente e níveis de Ri) enquanto se seguia os procedimentos descritos aqui permitiu determinar as configurações ideais para registrar a alimentação de Cx. tarsalis em mãos humanas, as origens elétricas de cada forma de onda, a duração média em segundos de picadas completas e incompletas por mosquito e a comparação estatística da duração da forma de onda em segundos por inseto (WDI), do número de eventos de forma de onda por inseto (NWEI) e da duração da forma de onda em segundos por evento por inseto (WDEI) entre as diferentes configurações27. Os mosquitos também foram interrompidos durante diferentes formas de onda e dissecados para determinar qual forma de onda estava correlacionada com a ingestão de sangue27. Uma investigação semelhante foi realizada para Ae. aegypti, utilizando metodologia comparável26.

Devido à natureza sensível e complexa do EPG, nem todas as gravações foram tão nítidas quanto as mostradas na Figura 4. Picos (Figura 3A,C), alterações no ganho do hardware (Figura 3A,C), conexões elétricas inferiores (Figura 3B), sobreposição do retificador na forma de onda J (Figura 3C,C') e ruído elétrico (Figura 3C,C') ocasionalmente distorceram e mascararam as formas de onda, tornando-as inadequadas para uso em figuras de qualidade para publicação e dificultando a pontuação e a análise. Assim, recomenda-se esforço inicial para aperfeiçoar as habilidades de fiação, otimizar os ajustes de ganho e tensão, ajustar o offset e controlar o ruído elétrico. Curiosamente, a sobreposição do retificador foi observada apenas na família de formas de onda J para Cx. tarsalis (Figura 3C,C') e não se repetiu após o ajuste inicial do offset, mesmo quando outras espécies de mosquitos (Ae. aegypti e Culex quinquefasciatus) foram utilizadas (dados não mostrados). Além disso, o diagnóstico revelou que o ruído elétrico não controlado mostrado na Figura 3 (painéis C e C') resultou de uma gaiola de Faraday defeituosa. As gravações realizadas na gaiola de Faraday defeituosa ainda eram utilizáveis, mas os problemas de ruído foram resolvidos ao construir uma gaiola de Faraday aprimorada (Figura 1B).

Mesmo quando todas as precauções e otimizações iniciais foram tomadas, pequenas variações na qualidade da fixação do eletrodo ao mosquito e outros fatores desconhecidos que distorciam o sinal e alteravam periodicamente a relação sinal-ruído tornaram necessário ajustar o ganho do hardware durante a gravação, a fim de garantir que o sinal estivesse na faixa visível e que a resolução dos picos em cada forma de onda fosse suficiente para a identificação e caracterização das formas de onda. Infelizmente, ajustar o ganho do hardware durante a gravação pode resultar em deslocamentos abruptos de tensão (Figura 3A, C), tornando as formas de onda inadequadas para publicação, mas ainda utilizáveis (no todo ou em parte) para medição e análise.

Diagramas de equilíbrio estático mostrando análise de forças; os gráficos destacam as equações ΣFx=0, ΣFy=0.
Figura 4: Formas de onda representativas de um inseto Culex tarsalis em um contato com a mão humana, registradas com um Ri de 107 Ω utilizando um sinal aplicado de 250 mV AC. Os nomes das formas de onda no nível de família (NP, J, K, L, M, W) são mostrados ao longo da parte superior de cada painel. Os painéis inferiores mostram ampliações de regiões selecionadas no painel A. Os painéis inseridos mostram ampliações das regiões indicadas. As escalas de tempo e os ganhos do software são: (A) 7,0 s/div, 16x; (B) 1,0 s/div, 64x; (B') 0,2 s/div, 64x; (C) 1,0 s/div, 64x; (C') 0,2 s/div, 32x; (D) 1,0 s/div, 64x; (D') 0,2 s/div, 64x. Abreviações: AC = corrente alternada, Ri = resistência de entrada, mV = milivolt, Ω = Ohms, s/div = segundos por divisão. Esta figura foi preparada com dados de Cooper et al.27. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Discussão

Ao usar o AC-DC EPG, é fundamental ter uma compreensão básica da operação de hardware e software30 e seguir cuidadosamente os protocolos aqui descritos para evitar danos ao equipamento. Mais notavelmente, evite tocar no amplificador de cabeçote quando estiver ligado, a menos que esteja aterrado na gaiola de Faraday. Recomenda-se gravar o mais longe possível na gaiola de Faraday30. As portas da gaiola não precisam necessariamente ser fechadas para obter formas de onda interpretáveis, a menos que sejam gravadas em um ambiente com ruído elétrico ambiente excessivo. Nada motorizado pode estar na gaiola de Faraday. É importante observar que a própria gaiola de Faraday deve ser aterrada eletricamente apenas através do amplificador principal para que funcione corretamente. Isso é feito conectando o amplificador de cabeçote a um suporte de laboratório de metal com a tinta lixada de um pé do suporte para permitir um caminho condutor para a eletricidade capturada pela gaiola de Faraday fluir para o suporte de laboratório, para o invólucro de metal do amplificador de cabeçote, descendo o cabo até a caixa de controle, através da fonte de alimentação em uma tomada de parede devidamente aterrada e na terra através do aterramentodo edifício 30. Um multímetro pode ser usado para verificar a qualidade da conexão entre os componentes dentro da gaiola, medindo a resistividade (que é o inverso da condutividade) entre vários pontos. Um rádio AM sem fio também pode ser colocado dentro da gaiola de Faraday para verificar se o som é significativamente reduzido (ou idealmente eliminado) quando as portas são fechadas, confirmando que a gaiola de Faraday está capturando adequadamente sinais elétricos aéreos (E. Backus per. Comm.).

A preparação adequada e padronizada da cola de prata e a fixação dos eletrodos de gravação aos insetos são essenciais para a obtenção de gravações utilizáveis. A cutícula do inseto é um isolante e atua como um capacitor se a cola de prata não penetrar adequadamente nos poros da cutícula para criar um caminho para a eletricidade viajar de dentro do inseto para o fio de ouro na superfície do pronoto30. Prepare a cola de prata ao mesmo tempo antes de cada sessão de EPG, trabalhe com cola de prata fresca do tubo e substitua-a por cola de prata vigorosamente ventilada com frequência durante o procedimento de fiação. Certifique-se de que o laço de ouro esteja posicionado contra o tórax de forma que todo o laço fique em contato com a cutícula e não inclinado para um lado ou separado por uma espessa camada de cola prateada e escamas para ajudar a formar uma conexão elétrica forte, bem como evitar o desprendimento e a fuga do mosquito do fio.

Os protocolos descritos aqui devem ser otimizados ao trabalhar com diferentes espécies de mosquitos. As configurações ideais de EPG (nível de Ri, tensão, tipo de corrente e ganho de hardware) para gravação em um determinado artrópode devem ser determinadas experimentalmente12,30. No entanto, uma vez que o deslocamento é ajustado, ele não precisará ser reajustado ao trabalhar com mosquitos semelhantes. As configurações ideais foram determinadas para AC-DC EPG com Ae. aegypti26 e Cx. tarsalis27. Bibliotecas de formas de onda (definidas na Tabela 2) para espécies adicionais facilitarão a adoção de EPG para mosquitos. Também é necessário otimizar a anestesia para o mosquito de interesse, pois o comportamento de alimentação sanguínea pode ser afetado diferencialmente com base na espécie de mosquito e na escolha da anestesia. Por exemplo, Cx. tarsalis requer um período de recuperação de 4 h após 15 min de anestesia com CO2, enquanto para Ae. aegypti, um período de recuperação de 15 min é suficiente após um período de anestesia de 15 min com gelo. Culex tarsalis, no entanto, é difícil de derrubar com a exposição ao frio, então o CO2 é predominantemente usado, apesar do longo período de recuperação.

Embora o monitor AC-DC EPG seja simples de usar após a revisão dos recursos on-line30,31 ou treinamento com um usuário experiente, é necessária alguma solução de problemas. Inicialmente, as gravações de EPG do autor de sondas de mosquitos tinham uma onda de sinal inesperada de 11 Hz no pré-sinal que não havia sido observada ou relatada por Wayadande e colegas26. A consulta com E. Backus indicou que a gaiola de Faraday era provavelmente o problema por causa da interferência nas alças de aterramento. Uma nova gaiola de Faraday construída a partir de uma tela de cobre altamente condutora conectada a uma estrutura de alumínio aparafusada a uma grande placa de piso de alumínio suportada por pés de borracha para isolá-la da tabela abaixo (Figura 1B), resolveu o sinal de ruído de 11 Hz (Figura 3C, C '). Além disso, ocasionalmente, quando a fonte de alimentação EPG era ligada pela primeira vez, os sinais pré e pós-retificação apareciam como linhas grossas e difusas em vez de linhas retas, suaves e finas. Isso geralmente era corrigido desligando o instrumento e verificando todas as conexões do cabo. Se isso falhasse, desconectar o instrumento por 1-3 minutos geralmente ajudava. Muito raramente, os pré e pós-sinais tornam-se espessos e confusos durante a operação, o que foi resolvido desligando o instrumento e conectando-o a uma tomada diferente ou usando um regulador de tensão e condicionador de energia para conectar o EPG antes de conectá-lo à parede. Idealmente, uma linha dedicada para o monitor EPG eliminaria o ruído de linha proveniente de refrigeradores e outros equipamentos conectados ao mesmo circuito elétrico que o EPG30.

Atualmente, existem duas limitações principais para o uso de EPG para estudar mosquitos. Primeiro, poucos estudos de correlação foram realizados para verificar quais comportamentos de sondagem correspondem às formas de onda. Embora existam fortes hipóteses sobre o que está acontecendo durante cada família de formas de onda (Tabela 1) e alguns dos tipos de formas de onda (M1 e M2), poucas dessas hipóteses foram confirmadas experimentalmente, exceto que a ingestão de sangue está correlacionada com a família de formas de onda M26,27. Mais importante ainda, as formas de onda correspondentes a eventos de salivação devem ser identificadas porque muitos patógenos são transmitidos na saliva. A correlação das formas de onda do EPG com as atividades biológicas em mosquitos será necessária para interpretar significativamente as diferenças significativas na duração da forma de onda e nas contagens entre os grupos de tratamento. Em segundo lugar, as taxas de sondagem e ingestão durante o EPG podem ser muito menores do que o esperado27. Amarrar individualmente os mosquitos a fios curtos e colocá-los diretamente no hospedeiro pode evitar comportamentos de busca de hospedeiros e alimentação social de longa distância, o que pode afetar os comportamentos de sondagem e ingestão. Insetos corretamente conectados podem andar e voar normalmente. Ainda assim, os mosquitos costumam puxar os fios e às vezes se enroscam ou se mantêm em ângulos não naturais, indicando que o fato de estarem conectados afeta seu comportamento até certo ponto. Os autores testaram muitas estratégias para aumentar as taxas de sondagem durante o EPG, e jejuar os mosquitos durante a noite, usando indivíduos mais velhos, expondo-os à respiração humana imediatamente antes de colocá-los na mão e aplicando saliva humana na mão foram os mais eficazes, bem como usando hospedeiros que constantemente faziam ajustes em escala fina na posição de suas mãos para garantir que o mosquito estivesse na posição ideal para sondar27.

Apesar dessas limitações, o AC-DC EPG tem inúmeras vantagens sobre outras abordagens para estudar comportamentos de sondagem e ingestão. Sistemas como o BiteOScope11, o flyPAD15 e a Plataforma Automatizada de Biomateriais14, projetados para quantificar comportamentos de sondagem e ingestão e secreções salivares durante a alimentação sanguínea, utilizam substratos artificiais transparentes e dietas líquidas que não possuem sistemas normais de tecido hospedeiro e pistas do hospedeiro. Embora essas plataformas sintéticas sejam úteis para muitos fins experimentais, uma clara vantagem do AC-DC EPG é a capacidade de estudar esses comportamentos e variáveis de interesse de artrópodes em sistemas hospedeiros naturais. Além disso, a adaptabilidade definida pelo usuário do sistema AC-DC EPG oferece uma vantagem adicional sobre outros instrumentos EPG22,33 e dispositivos de monitoramento eletrônico semelhantes a EPG16,21, que não possuem níveis de Ri ajustáveis, tipos de corrente e níveis de tensão necessários para obter formas de onda com a quantidade máxima de informações e minimizar os efeitos adversos em uma ampla gama de hospedeiros e artrópodes22, 23. Técnicas de eletromiografia (EMG) também são usadas para estudar a alimentação sanguínea. No entanto, o circuito elétrico geralmente inclui apenas o artrópode e apenas os potenciais musculares mais próximos do eletrodo de registro são registrados, de modo que as formas de onda não fornecem informações sobre atividades detalhadas que ocorrem na interface hospedeiro-inseto, como rupturas celulares, localizações e atividades do estilete e potenciais de fluxo através do aparelho bucal28,34. As técnicas de microscopia intravital podem ser usadas para visualizar diretamente os movimentos e atividades detalhados do aparelho bucal em tecidos hospedeiros vivos, mas essas técnicas envolvem procedimentos invasivos em modelos animais vivos9. Somente o monitor de EPG AC-DC pode fornecer informações altamente detalhadas em tempo real sobre os comportamentos de sondagem, ingestão e salivação que ocorrem em tecidos hospedeiros opacos vivos sem a necessidade de procedimentos invasivos e é adaptável para uso em uma ampla variedade de artrópodes10,12.

Este é o primeiro procedimento passo a passo detalhado para conectar mosquitos, construir um aspirador de insetos e realizar EPG em hospedeiros humanos. Espera-se que esses protocolos facilitem a adoção do AC-DC EPG em mosquitos que se alimentam de hospedeiros humanos. Exemplos de esforços de pesquisa futuros empregando AC-DC EPG podem incluir estudos sobre mecanismos fundamentais de alimentação sanguínea e danos ao tecido do hospedeiro10, incluindo a identificação de sequências estereotipadas de comportamentos de sondagem que precedem a ingestão de sangue, investigação do fluxo sanguíneo através do aparelho bucal e comparação da plasticidade alimentar dentro e entre espécies de artrópodes / estágios de desenvolvimento26. O EPG também pode ser usado para quantificar os efeitos de inseticidas, antifeedants e repelentes12. Os procedimentos apresentados aqui para usar o AC-DC EPG para estudar mosquitos em mãos humanas acelerarão esses estudos e permitirão novos insights sobre a biologia do mosquito que se alimenta de sangue.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente para fins de fornecimento de informações específicas e não implica recomendação ou endosso do Departamento de Agricultura dos EUA. As conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões do USDA.

Agradecimentos

Somos gratos ao Prof. Astri Wayadande da Oklahoma State University pelo pioneirismo no procedimento de fiação de mosquitos, e à Dra. Elaine Backus do USDA-ARS em Parlier, CA, e ao Sr. Andrew Dowell da EPG Technologies Inc. em Gainesville, FL, pela assistência na solução de problemas do equipamento EPG. Também agradecemos ao Dr. Dustin Swanson e ao Sr. William Yarnell do USDA-ARS Insectary em Manhattan, KS, por fornecer mosquitos, e à Srta. Miriam Ruhinda da Kansas State University em Manhattan, KS por sua assistência nas filmagens dos vídeos processuais. Este trabalho foi possível graças ao acesso ao Integrated Molecular Entomology Core (IEMC) da Kansas State University. Esta pesquisa foi apoiada pelo Acordo de Desenvolvimento da Força de Trabalho de Pesquisa, Educação e Economia do USDA (# 58-3022-0-002) e pelo Projeto Multiestadual Hatch (NE1943). Este manuscrito é a contribuição nº 24-194-J da Estação Experimental Agrícola do Kansas, Universidade Estadual do Kansas, Manhattan, KS, EUA.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Instrumentação
AC-DC Eletropenetrógrafo de 4 canaisEPG Technologies, Inc.Para EPG, inclui a fonte de alimentação, caixa de controle, caixa de interface de comutação, quatro amplificadores de estágio de cabeça, quatro sondas de tensão de substrato e cabos associados Almofadas
arAmazon.compara o hospedeiro humano descansar a mão/braço durante o EPG
DI-710 Hardware de aquisição de dados (placa AD)DATAQ Instruments Inc.para digitalizar os sinais analógicos de EPG para que possam ser visualizados em um computador
Lâmpada de Aumento LED Regulável, Lupa Grande 5X com Luz e Suporte para Leitura Hobbies Artesanato Costura Bancada de TrabalhoAmazon.compara observação comportamental durante o EPG; use apenas desconectado durante o EPG ou pode resultar ruído
Microscópio Digital de Borda Dino-Lite (ampliação de 250x)Dino-LiteAF4915ZTpara observação comportamental durante o EPG
Dino-Lite Suporte de mesa de braço flexívelDino-LiteMS22Bpara segurar e manipular a câmera
Eisco Steel Retort Base Stand and Rod SetFisher ScientificS41740para segurar o amplificador do estágio principal e aterrar a gaiola de Faraday (deve ser feita de metal)
Workshop Online EPG ExtensãoUF IFAShttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022também conhecido como "recursos online" para aprender EPG (configuração de instrumentos, coleta e análise de dados, construção de Faraday, preparação de cola de prata, construção de tocos de insetos, etc.)
Furman P-1800 AR Regulador de Potência / Condicionador de PotênciaAmazon.compara reduzir o ruído da linha
Small Bubble Cushioning WrapAmazon.compara uso como uma barreira entre o hospedeiro e a gaiola de Faraday
Suporte de grampo regular Troemner Talboys LabjawsFisher Scientific02-217-121para segurar o amplificador do estágio principal e aterrar a gaiola de Faraday (deve ser feito de metal e não revestido de plástico)
Computador WindowsBest Buypara EPG & análise estatística
Software
Backus 2.0 Data Analysis SAS program Extensão UF IFAShttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/para análise estatística de dados de forma de onda
Ebert 1.0 File Manipulator e Error Checker Programas SASUF IFASExtension https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/para preparação de arquivos para análise estatística de dados de forma de onda
SAS versão 9.4SAS Institute Inc.para análise estatística de dados de forma de onda
WinDaq Lite DATAQ Instrumentos Inc.para registrar e revisar dados de EPG.  Inclui o software WinDaq Hardware Manager (também conhecido como "software de gerenciamento de hardware") e o software WinDaq Waveform Browser (também conhecido como "software de revisão de forma de onda"). Para uso apenas em computadores Windows. 
Gaiola de FaradayEstrutura de
tela de alumínioHome DepotMSCF5167para  as paredes da gaiola de Faraday
Folha de alumínio, 0.125 (1/8) de espessura 3003-H14Metals DepotS318para a base da gaiola de Faraday
Suportes de canto, 1" Home Depot339547para  as paredes da gaiola de Faraday
Parafusos de máquina Phillips de cabeça chata, #6-32 x 1"Home Depot459999para construção de gaiola de Faraday
Arruelas planas, #6 Home Depot638977para construção de gaiola de Faraday
Multímetro digital Fluke 15B+, para aplicações elétricas, mede medições de tensão e corrente CA/CC de até 1000 V e 10 A, juntamente com recursos de resistência, continuidade, diodo e capacitânciaAmazon.compara testar a gaiola
de FaradayRádio Portátil AM FM, Rádio Transistor Goodes com Alto-falante, Jack para Fone de Ouvido, Rádio Operado por Bateria 2AA para Recepção de Longo Alcance, Rádio de Bolso para Uso Interno, Externo e de EmergênciaAmazon.compara testar a Gaiola de Faraday
Tela de cobre puro, malha 16 x 16 com diâmetro de fio de 0,11, 36" x 12'MetroScreenworkspara  as paredes da gaiola de Faraday
Parafusos de máquina combinados de cabeça redonda, #6-32 x 3/4"Home Depot528466para construção de gaiola Faraday
Lixa, 1/2" por 1", 150 GritHome Depot19036-20-CCpara remover a tinta da parte inferior do suporte de laboratório Cantos da
moldura da tela, 5/16" A Home DepotWCORN516para as paredes da gaiola de Faraday
Tela estriada, 0,14" A Home Depot3034719para  as paredes da gaiola de Faraday
Insect Stubs
Brass Escutcheon Pinos HomeDepot801294para a construção de tocos de insetos   
Fio de cobre, 20 AWGAmazon.compara construção de tocos de insetos   
Harris flu solúvel em água Home Depot355398para ajudar a soldar a revestir o fio do toco de inseto e formar uma conexão forte
Alicate de ponta finaHome Depotpara dobrar o fio ao construir pontas de insetos
Kit 900-015 do Pro Helping HandsAmazon.compara segurar os pinos do escudo durante a soldagem
Solda (com núcleo de breu)Home Depot296497para a construção de tocos de insetos  
Ferramenta de descascador de cortador de fioHome Depotpara descascar e cortar fio de cobre ao construir pontas de insetos
YIHUA 928D-III Ferro de solda, 110W de alta potência, totalmente digital Display Amazon.compara construção de pontas de insetos; vem com um suporte, esponja e lã de aço para limpeza
Aspirador de insetos
Aspirador de laboratório Accuris ASPIREInstrumentos AccurisV0020para aplicação de sucção ao aspirador de insetos; inclui o controlador de vácuo portátil, o adaptador de ponta fina (40 mm) de aço inoxidável e o adaptador de ponta de pipeta
Pipetas Pasteur da Chemglass Life Sciences, 5 3/4" de comprimentoFisher ScientificNC0230004para uso como aspirador de insetos ao conectar mosquitos
Fita Elétrica Comercial de Vinil ColoridoHome Depotpara anexar a pipeta Pasteur modificada à linha de vácuo
Tecido utilitário de mosquiteiro, 10 x 10 cm quadradoJoann Fabrics16651622para prevenir que mosquitos sejam aspirados para a bomba de vácuo
Tubo Saint Gobain Performance Plastics Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914para alternar rapidamente e facilmente entre diferentes pipetas Pasteur modificadas
Thermo Scientific Nalgene HDPE Quick Disconnects (3/8 a 7/16 pol. Identificação.)Fisher Scientific15-315Bpara troca rápida e fácil entre diferentes pipetas Pasteur modificadas
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Multi Purpose White GlueAmazon.compara preparação de cola de prata
Silver Flake 99,9% puro,  4-8 µ mThermoFisher786.09para preparação de cola de prata
Silver Flake 99.95% puro, 8-10 µ mInframat Advanced Materials47MR-12Fpara preparação de cola de prata
Insect Anesthesia
CO2 kit de borbulhador, 1000 mL, #9 Rolha de BorrachaFlyStuff59-181para prevenir a dessecação de insetos ao usar o flypad
Flypad  FlyStuff59-118para evitar que os mosquitos caiam do flypad
Flystation BrushFlyStuff59-205para reduzir a estática ao trabalhar em um fly pad
Flystuff  Flypad  tamanho padrãoFlyStuff59-114AKA "almofada de anestesia" para anestesiar mosquitos
Funil (4 polegadas de diâmetro)Amazon.compara gaseificação de copos de mosquitos antes de transferir para o flypad
Vidro Plexi ou uma tampa de plástico plana (cortada no tamanho)Home DepotMC-27para cobrir o flypad se os mosquitos começarem a acordar
Braçadeiras de mangueira de tubo de plástico de corte Posição única e ajustável aberto (variedade 1/8" a 1/2")Amazon.compara desviar o gás entre o flypad e o funil
Regulador de CO2 de estágio únicoFlyStuff59-142para regular o fluxo de gás do CO2 tanque
" T” Encaixe para Tubulação de 1/8in IDFlyStuff59-123para conectar tanto o flypad quanto o funil ao tanque de CO2
Tubulação, transparente FlyStuff59-124Cpara conectar o funil e o flypad ao regulador no tanque de CO2
Insect Wiring
Cartolina preta, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11"Michael's Stores Inc.327826para facilitar a visualização do fio de ouro
Quadrado de papel de construção preto 3.5" x 4.0"Grampos956221para facilitar a visualização do fio de ouro
Bolas de algodãoAmazon.compara mosquitos em jejum
Bloco de espuma de artesanato #12 (3.1 cm x 17.2 cm x 30.2 cm)Loja de Tecidos e Artesanato Joann1941079para segurar mosquitos com fio
Fita Deflecto Dispensador, Amazon.compara armazenar fio de ouro
Pinça de entomologia FeatherweightFisher ScientificS72110para manipulação de insetos
Pinça fina (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)Ferramentas de Ciência Fina91150-20para fazer um laço de ouro ao conectar mosquitos
Pincel de ponta finaAmazon.compara manipular mosquitos durante a fiação e EPG; deve ter um cabo de plástico ou madeira se usado para EPG
Pipetas de transferência padrão de ponta fina, estreitas, 5,8 mLThomas Scientific7761D21para preparação de cola de prata
Fio de ouro, 99,99% puro, 0,025 mm de espessuraGoodfellowAU005121para fiação de mosquitos
Pinos Minutien, ponta 0,2 mm, 1 cmFisher ScientificNC9681411para aplicação de cola nos mosquitos
Copos de papel Tubo de Papel Rígidopara mosquitos em jejum     
Torno de pinoFisher Scientific50-996-811para segurar o pino minuciense durante a fiação de insetos
Caixa de armazenamento de plástico com tampa (7 polegadas x 9 polegadas x 14 polegadas)Amazon.compara transportar mosquitos com fio
Vidro Plexi ou uma tampa de plástico plana (cortada no tamanho)Home DepotMC-27para cobrir a almofada de mosca se os mosquitos começarem a acordar
Pinça de fechamento automáticoFisher Scientific08-906para segurar e manipular fio de ouro
Compressed Gas
CO2 tanque de gásGáspara anestesiar mosquitos com um flypad
Common Lab Items
Sacos de autoclave descartáveis Biohazard, 8 1/2" x 11"Fisher Scientific03-410-591para descarte de mosquitos alimentados com sangue
Bico de Bunsen ou maçarico de propanoAmazon.compara modificação de pipetas Pasteur
Fita de laboratório coloridaDaigger ForneceEF9763Rpara rotular, preparar cola de prata e mascarar pinças
Pontas de pipeta descartáveis, 1000 µ LFisher Scientific para aliquotar água ao fazer cola de prata
Microscópio de dissecaçãoLeica Microsystemspara fiação de mosquitos
Sonda de dissecaçãoFisher ScientificNC9109673para agitar e aplicar cola de prata
Erlenmeyer frasco, 1000 mLFisher Scientific para prevenir a dessecação de insetos ao usar o flypad
Etanol, 70% Fisher Scientific04-355-122para recuperar mosquitos que escaparam
Placas de vidro PetriFisher Scientific08-747Bpara anestesiar mosquitos com gelo
LuvasFisher Scientificpara proteção pessoal
Kimwipes KimTech Science marca delicada tarefa limpadoresFisher Scientific06-666para esmagar mosquitos
Jalecos FisherScientificpara proteção pessoal
LiBa Spray Bottles, Garrafas de Spray Vazias Recarregáveis (seguro para álcool em massa)Amazon.compara recuperar mosquitos que escaparam
Barra de agitação magnética, 2 cm de comprimentoFisher Scientific para misturar cola de prata
Pipeta Mecânica de Canal Único, 1000 µ LFisher Scientific 13-690-032para alíquotas de água ao fazer cola de prata
Tubos de microcentrífuga, 1,5 mLFisher Scientific 780420para armazenar cola de prata
Parafilm M Fisher Scientific50-998-944para selar tubos de cola de prata Amazon.com
plásticopara cobrir o bloco de espuma
Pyrex 20 mL copoFisher Scientific 07-250-051para misturar cola de prata
Semi-Micro BalanceFisher Scientific 10-919-370para pesagem de cola e flocos de prata
Caneta Sharpie, ponta finaAmazon.compara rotulagem
Lâmina de barbear de borda únicaMicroscopia Eletrônica Sciences71980para limpeza de tocos de insetos
Pipetas de Transferência Descartáveis PadrãoFisher Scientific 133-711-7mLpara transferir cola de prata para um tubo de armazenamento 
Placa de agitaçãoFisher Scientific para misturar cola de prata
Cronômetro/cronômetroFisher Scientificpara cronometrar quanto tempo o hospedeiro é exposto a cada inseto
Água ultrapura (18 MΩ)Fisher Scientific para preparação de cola de prata
Tesoura utilitáriaFisher Scientific08-945para cortar fio de ouro
Misturador de vórticeFisher Scientific para misturar cola de prata
Study Organisms<
em>Culex tarsalis mosquitosUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research em Manhattan KSpara uso como sujeitos de estudo
de auxiliar de solda ferro de solda transparente Matheson de

Referências

  1. Becker, N., et al. Medical importance of mosquitoes in Mosquitoes and their control. , 2nd ed, Springer. Los Angeles, CA. 25-42 (2010).
  2. World Health Organization. Vector-borne diseases. , (2024).
  3. Woodstream Corporation, Inc. The economic cost of mosquito-borne diseases. AMosquito Magnet. , (2022).
  4. Bartlow, A. W., et al. Forecasting zoonotic infectious disease response to climate change: Mosquito vectors and a changing environment. Vet Sci. 6 (2), 40(2019).
  5. Naslund, J., et al. Emerging mosquito-borne viruses linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global status and preventive strategies. Vector Borne Zoonotic Dis. 21 (10), 731-746 (2021).
  6. Shaw, W. R., Catteruccia, F. Vector biology meets disease control: Using basic research to fight vector-borne diseases. Nat Microbiol. 4 (1), 20-34 (2019).
  7. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Negl Trop Dis. 14 (1), e0007831(2020).
  8. Dusfour, I., et al. Management of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses: Advances and challenges. PLoS Negl Trop Dis. 13 (10), e0007615(2019).
  9. Choumet, V., et al. Visualizing non infectious and infectious Anopheles gambiae blood feedings in naïve and saliva-immunized mice. PLoS ONE. 7 (12), e50464(2012).
  10. Backus, E. A., Cervantes, F. A., Guedes, R. N. C., Li, A. Y., Wayadande, A. C. AC-DC electropenetrography for in-depth studies of feeding and oviposition behaviors. Ann Entomol Soc Am. 112 (3), 236-248 (2019).
  11. Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. Elife. 9, e56829(2020).
  12. Backus, E. A., Guedes, R. N., Reif, K. E. AC-DC electropenetrography: Fundamentals, controversies, and perspectives for arthropod pest management. Pest Manag Sci. 77 (3), 1132-1149 (2021).
  13. Gordon, R. M., Lumsden, W. H. R. A study of the behavior of the mouthparts of mosquitoes when taking up blood from living tissue; together with some observations on the ingestion of microfilariae. Ann Trop Med Parasitol. 33, 259-278 (1939).
  14. Janson, K. D., et al. Development of an automated biomaterial platform to study mosquito feeding behavior. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1103748(2023).
  15. Henriques-Santos, B. M., Xiong, C., Pietrantonio, P. V. Automated analysis of feeding behaviors of females of the mosquito Aedes aegypti using a modified flyPAD system. Sci Rep. 13, 20188(2023).
  16. Kashin, P., Wakeley, H. G. An insect 'Bitometer. Nature. 208 (5009), 462-464 (1965).
  17. Kashin, P. Electronic recording of the mosquito bite. J Insect Physiol. 12, 281-286 (1966).
  18. Kashin, P. Development of an orally effective insect repellent. IIT Research Institute. , (1967).
  19. Kashin, P., Arneson, B. E. An automated repellency assay system. II. a new electronic "Bitometer-timer.". J Econ Entomol. 62 (1), 200-205 (1969).
  20. Shieh, J. -N. Salivation and engorgement parameters of sucking insect vectors: Implications in pathogen transmission. , Oregon State University. (1994).
  21. Kimsey, R. B. Measuring and recording arthropod blood feeding. History, Development, and Applications of AC Electronic Insect Feeding Monitors. , Entomological Society of America. 122-128 (1994).
  22. Backus, E. A., Devaney, M. J., Bennett, W. H. Comparison of signal processing circuits among seven AC electronic monitoring systems for their effects on the emf and R components of aphid (Homoptera: Aphididae) waveforms. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  23. Backus, E. A., Bennett, W. H. The AC-DC correlation monitor: New EPG design with flexible input resistors to detect both R and emf components for any piercing-sucking hemipteran. J Insect Physiol. 55 (10), 869-884 (2009).
  24. Backus, E. A., Cline, A. R., Ellerseick, M. R., Serrano, M. S. Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding on cotton: New methods and parameters for analysis of nonsequential electrical penetration graph data. Annals of the Entomological Society of America. 100, 296-310 (2007).
  25. Ebert, T. A., Backus, E. A., Cid, M., Fereres, A., Rogers, M. E. A new SAS program for behavioral analysis of electrical penetration graph data. Comput Electron Agr. 116, 80-87 (2015).
  26. Wayadande, A. C., et al. Waveforms from stylet probing of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) measured by AC-DC electropenetrography. J Med Entomol. 57 (2), 353-368 (2020).
  27. Cooper, A. M. W., et al. An electropenetrography waveform library for the probing and ingestion behaviors of Culex tarsalis on human hands. Insect Sci. 31 (4), 1165-1186 (2024).
  28. Reif, K. E., Backus, E. A. AC-DC electropenetrography unmasks fine temporal details of feeding behaviors for two tick species on unsedated hosts. Sci Rep. 11 (1), 2040(2021).
  29. Vaughan, L. D., et al. Electropenetrography as a tool to quantify probing and injection behaviors of mosquitoes (Aedes aegypti) in mice under biocontainment housing. Comp Med. 73 (6), 25(2023).
  30. Backus, E. A., Shugart, H. Electropenetrography (EPG) Online Workshop. Hosted by L. Diepenbrock at the University of Florida. Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022 (2022).
  31. Dataq Instruments Inc. WinDaq recording and playback software. , (2024).
  32. Backus, E. A. Our own jabberwocky: clarifying the terminology of certain piercing-sucking behaviors of homopterans. Principles and applications of electronic monitoring and other techniques in the study of homopteran feeding. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  33. Tjallingii, W. F. Comparison of AC and DC systems for electronic monitoring of stylet penetration activities by homopterans. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America. 41-69 (2000).
  34. Mizrahi, J. Advances in Applied Electromyography. , IntechOpen. Rijeka, Croatia. (2011).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Comportamento Alimentar de MosquitosComportamento de SondagemComportamento de IngestãoAlimentação SanguíneaRegistro de Sinais ElétricosTransmissão de PatógenosEletrodo de Fio de OuroInteração com Hospedeiro Humano
Eletropenetrografia AC-DC para o Estudo dos Comportamentos de Sondagem e Ingestão de Mosquitos Culex tarsalis em Mãos Humanas
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.