Cama e nidificação limitadas como modelo para adversidades no início da vida em camundongos

Resumo

Este protocolo descreve um modelo animal para estudar como a adversidade no início da vida, provocada por um ambiente empobrecido e cuidados maternos imprevisíveis durante o período pós-natal precoce, afeta o desenvolvimento do cérebro e o risco futuro de transtornos mentais.

Resumo

A adversidade no início da vida (ELA), como abuso, negligência, falta de recursos e um ambiente doméstico imprevisível, é um fator de risco conhecido para o desenvolvimento de distúrbios neuropsiquiátricos, como a depressão. Modelos animais para ELA têm sido usados para estudar o impacto do estresse crônico no desenvolvimento do cérebro e normalmente dependem da manipulação da qualidade e/ou quantidade de cuidados maternos, pois esta é a principal fonte de experiências no início da vida em mamíferos, incluindo humanos. Aqui, é fornecido um protocolo detalhado para empregar o modelo Limited Bedding and Nesting (LBN) em camundongos. Este modelo imita um ambiente de poucos recursos, que provoca padrões fragmentados e imprevisíveis de cuidados maternos durante uma janela crítica de desenvolvimento (dias pós-natais 2-9), limitando a quantidade de materiais de nidificação dados à mãe para construir um ninho para seus filhotes e separando os ratos da cama por meio de uma plataforma de malha na gaiola. Dados representativos são fornecidos para ilustrar as mudanças no comportamento materno, bem como a diminuição do peso dos filhotes e as mudanças de longo prazo nos níveis basais de corticosterona, que resultam do modelo LBN. Quando adultos, os filhotes criados no ambiente LBN demonstraram exibir uma resposta aberrante ao estresse, déficits cognitivos e comportamento semelhante à anedonia. Portanto, este modelo é uma ferramenta importante para definir como a maturação dos circuitos cerebrais sensíveis ao estresse é alterada pela ELA e resulta em mudanças comportamentais de longo prazo que conferem vulnerabilidade aos transtornos mentais.

Introdução

O período pós-natal precoce é uma janela crítica de desenvolvimento na qual as influências ambientais podem mudar a trajetória do desenvolvimento. Por exemplo, a adversidade no início da vida (ELA) pode alterar o desenvolvimento do cérebro para provocar mudanças de longo prazo na função cognitiva e emocional. Exemplos de ELA incluem abuso físico ou emocional, negligência, recursos inadequados e um ambiente doméstico imprevisível que ocorre durante a infância ou adolescência¹. Sabe-se que a ELA é um fator de risco para o desenvolvimento de transtornos como depressão, transtorno por uso de substâncias, transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) e ansiedade 2,3,4,5. Isso é importante, uma vez que os níveis de pobreza infantil nos EUA mais que dobraram recentemente, de 5,2% em 2021 para 12,4% em 2022⁶ e, embora a pobreza em si não seja necessariamente ELA, aumenta a probabilidade de vários tipos de ELA⁷.

Os modelos animais têm sido essenciais para entender os efeitos do estresse no início da vida no desenvolvimento do cérebro e nos resultados adultos. Os dois principais modelos animais usados nos últimos anos para dissecar esse fenômeno são a separação materna (EM) e um ambiente empobrecido induzido por materiais de cama e nidificação limitados (LBN). A SM foi desenvolvida como um modelo de privação parental⁸. Nele, as mães de roedores são retiradas de seus filhotes, geralmente por várias horas, todos os dias até o desmame⁸. Descobriu-se que o paradigma da EM resulta em comportamentos depressivos e semelhantes à ansiedade na idade adulta⁹, bem como uma resposta aberrante ao estresse crônico^10,11. Por outro lado, o modelo LBN, desenvolvido pela primeira vez no laboratório de Baram¹², não separa a mãe dos filhotes, mas modifica o ambiente em que os filhotes são criados, mimetizando um ambiente de poucos recursos^12,13. Diminuir a quantidade de material de nidificação e impedir o acesso direto à cama neste modelo resulta em cuidados maternos interrompidos pelas mães³. Uma vez que cuidados maternos robustos e previsíveis são necessários para o desenvolvimento adequado dos circuitos cerebrais cognitivos e emocionais¹⁴, o cuidado materno fragmentado da LBN pode resultar em uma série de resultados, incluindo um eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) hiperativo, equilíbrio excitatório-inibitório alterado em várias regiões do cérebro, aumento dos níveis de hormônio liberador de corticotropina (CRH) e comportamento depressivo na prole^13, 15,16,17,18,19.

O mecanismo exato pelo qual a ELA resulta em aumento do risco de distúrbios neuropsiquiátricos não é completamente compreendido. Acredita-se que esteja relacionado a alterações no circuito do eixo HPA^19,20, e evidências recentes mostram que isso pode ser causado por alterações na poda sináptica microglial¹⁹. O modelo LBN demonstrou ser uma ferramenta crucial para entender o impacto do ambiente perinatal no desenvolvimento do cérebro e nos resultados comportamentais de longo prazo. Embora esse modelo tenha sido inicialmente desenvolvido para ratos, ele também foi adaptado para camundongos, a fim de aproveitar as ferramentas transgênicas existentes ^12,13. Notavelmente, o modelo é muito semelhante em ambas as espécies e provoca resultados altamente convergentes, como alterações no eixo HPA, déficits cognitivos e comportamento depressivo, destacando assim sua utilidade entre espécies e potencial translacional. Este artigo fornecerá uma descrição detalhada de como empregar o modelo limitado de cama e nidificação em camundongos, coletando e analisando o comportamento materno e os resultados da prole para validar a eficácia do modelo e os resultados esperados.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados em conformidade com o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Georgia State University (número de aprovação A24011). Os ratos foram criados e mantidos nas instalações de animais da Georgia State University. Os experimentos foram realizados em uma cepa C57BL/6J durante o período perinatal (dia pós-natal [P] 2-10) e incluíram machos e fêmeas. Os reagentes e equipamentos utilizados para este estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Configuração do material

1. Corte a divisória de malha de acordo com as dimensões da gaiola, deixando um excesso de 3 cm nos lados mais longos.
   NOTA: A malha fornecida na tabela de materiais é cortada pelo fabricante.
2. Dobre as bordas, incluindo o excesso, de forma a criar uma plataforma encaixada com precisão nas bordas da gaiola e com ~2,5 cm de altura acima do chão. Isso permitirá que a urina e as fezes passem pela divisória de malha sem que os animais consigam recuperar a cama de espiga de milho. Por fim, certifique-se de que todas as bordas afiadas estejam dobradas para baixo para evitar danos aos animais.
   NOTA: As divisórias de malha são reutilizáveis e devem ser cuidadosamente limpas entre os usos com água quente e sabão, seguidas de pulverização com etanol 70%.
3. Configure as câmeras em tripés e prepare o sistema de gravação.
   NOTA: Recomenda-se o uso de software de gerenciamento de vídeo. Essas gravações resultam em arquivos .mp4 que são automaticamente agrupados em segmentos de 1 h.
4. Ajuste as configurações para gravação contínua.
   NOTA: As configurações adicionais recomendadas são resolução de 1920 x 1080 e 30 quadros/s.
5. Defina os arquivos de .mp4 resultantes para serem divididos em segmentos de 1 h, se não for feito automaticamente pelo software de gerenciamento de vídeo.
6. Se analisar o período de apagamento, use iluminação infravermelha.
   NOTA: Para reduzir o brilho de gravação na lateral da gaiola, é recomendável desativar o infravermelho (IR) da câmera. Em vez disso, use holofotes infravermelhos na sala durante a gravação em fase escura.

2. Paradigma de acamamento e nidificação limitados (LBN)

1. Emparelhe 1-4 fêmeas com um criador macho de alojamento único.
   NOTA: A idade recomendada para o primeiro emparelhamento em fêmeas experimentais é P75. O uso de fêmeas nulíparas é o ideal, mas em situações em que isso não é viável, como com valiosas linhagens de camundongos transgênicos, as fêmeas multíparas podem continuar se reproduzindo por aproximadamente quatro meses depois. Recomenda-se, embora não seja obrigatório, verificar se há tampões vaginais diariamente para confirmar o dia do acasalamento (dia embrionário [E]0).
   1. Assim que as barragens estiverem grávidas, mantenha os distúrbios mínimos.
      NOTA: As fêmeas multíparas geralmente podem ser reutilizadas para produzir até cinco ninhadas antes que a fertilidade diminua. Se as barragens forem reutilizadas para o experimento, elas devem ser usadas preferencialmente para a mesma condição todas as vezes ou apenas trocadas de Controle para LBN, mas nunca o contrário, a fim de evitar quaisquer efeitos residuais de longo prazo do LBN na barragem.
2. No E17 (ou se os plugues não forem verificados, sempre que as fêmeas parecerem evidentemente grávidas), separe as fêmeas em sua própria gaiola de acrílico padrão e dê a elas um ninho de algodão (5 x 5 cm) para construir um ninho.
   NOTA: É ideal mover as fêmeas separadas para uma sala pequena e silenciosa, longe da sala principal da colônia, com um ciclo claro/escuro de 12 h e interrupções mínimas do pessoal para a configuração de controle e LBN.
3. Registre a data de nascimento (por volta de E19).
4. Em P2, conte e faça o sexo dos filhotes. Atribua aleatoriamente ninhadas às condições LBN ou Controle (se for a primeira ninhada da barragem). Essa interação com os filhotes deve ser concluída entre 1 e 4 h após o acendimento das luzes.
   1. Coloque os filhotes cuidadosamente em uma gaiola nova e limpa para serem classificados por sexo. A distância anogenital entre o ânus e os órgãos genitais é maior nos homens do que nas mulheres e pode ser usada como um identificador.
   2. Separe machos e fêmeas em grupos para contá-los.
   3. Abater ninhadas com mais de 8 filhotes e descartar ninhadas com menos de 4. O tamanho ideal da ninhada é de 4 a 8 filhotes, pois qualquer coisa fora dessa faixa pode interferir na distribuição dos cuidados maternos durante o estudo.
      NOTA: As variáveis que podem ser afetadas devido ao tamanho da ninhada são o peso do filhote, a oportunidade de alimentação e as interações mãe-filhote, o que pode confundir o experimento. Idealmente, os camundongos não serão adotados, pois têm menos probabilidade de sobreviver do que os ratos.
5. Configure as condições de controle e LBN conforme mostrado na Figura 1.
   1. Controle: Use uma gaiola de caixa de sapatos de mouse de tamanho padrão (19,4 cm x 13,0 cm x 38,1 cm) com ~ 220 g de cama de espiga de milho (dependendo das dimensões da gaiola, visando ~ 1 cm de altura) e um ninho de algodão quadrado padrão (5 x 5 cm).
      1. Para ajudar os ratos a se aclimatarem a esse ambiente desconhecido, coloque um de seus pellets fecais de sua gaiola antiga em cada canto da nova gaiola. Além disso, coloque uma pequena quantidade (do tamanho de uma moeda de dez centavos) de ninho de algodão usado da gaiola anterior sobre o novo ninho.
   2. LBN: Coloque o divisor de malha previamente preparado em uma gaiola de caixa de sapatos padrão com ~ 110 g de cama de espiga de milho (visando ~ 0,5 cm de altura). A malha deve evitar o contato direto entre os camundongos e a cama de espiga de milho.
      1. Por fim, adicione metade de um quadrado de ninho de algodão (2,5 x 5 cm). Repita todas as etapas acima para ajudar na aclimatação.
         NOTA: Recomenda-se manter as gaiolas da caixa de sapatos em racks padrão e não ventilados, pois foi demonstrado que essa configuração é silenciosa e não induz hipotermia em filhotes criados em gaiolas LBN²¹. No entanto, este pode não ser o caso com o aumento do fluxo de ar em gaiolas ventiladas; Portanto, os pesquisadores devem medir os níveis de ruído e as temperaturas centrais dos filhotes em seu sistema se estiverem usando gaiolas ventiladas.
6. Adicione os filhotes à gaiola designada e coloque-os em cima do ninho. Em seguida, coloque a barragem na gaiola de frente para os filhotes, pois isso a ajudará a perceber que eles estão presentes mais rapidamente. Certifique-se de que comida e água suficientes sejam incluídas por pelo menos 8 dias para evitar perturbar a gaiola até o final do experimento em P10.
7. Coloque uma câmera em um tripé na frente da gaiola, permitindo uma visão lateral clara da mãe e de seus filhotes. Opcionalmente, coloque espelhos ao redor da gaiola para capturar melhor todos os ângulos. Embora apenas 1 h de gravação de vídeo por dia precise ser analisada, a câmera é configurada para gravar continuamente 24 horas por dia, 7 dias por semana, durante o experimento, para que os distúrbios possam ser monitorados.
   NOTA: Os ratos também podem ser observados pessoalmente e o comportamento materno pode ser pontuado manualmente, embora seja preferível gravar em vídeo para evitar interrupções devido à presença do experimentador na sala. Se forem usados racks ventilados, também pode ser necessário usar um procedimento diferente para organizar câmeras para gravação de cuidados maternos do que o descrito aqui.
8. Na manhã de P10, retorne todos os animais às condições normais de gaiola (idealmente idênticas à condição de controlo acima referida) e pese as crias.
9. Trate todos os filhotes da mesma forma e desmame em P21 em grupos de 2 a 5 irmãos de ninhada do mesmo sexo.
   NOTA: Procure abrigar irmãos de ninhada do mesmo sexo juntos sempre que possível, mas, se necessário, abrigar filhos do mesmo sexo de ninhadas diferentes na mesma condição juntos. Recomenda-se que o controle de alojamento e a prole de LBN juntos sejam evitados (ver Yang et al. para o efeito da composição do cagemato nos fenótipos comportamentais²²).

Figura 1: Exemplo de configuração da gaiola. A gaiola no lado esquerdo da imagem mostra uma gaiola de controle padrão (CTL) contendo uma quantidade total de cama e um ninho completo. A gaiola do lado direito mostra uma configuração limitada de cama e nidificação (LBN) com metade da quantidade de cama, meio ninho e uma divisória de malha para separar os animais da cama. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Pontuação do comportamento materno

1. Embora as gravações contínuas sejam coletadas nesta configuração, analise apenas 1 h de P3 a P6. Recomenda-se analisar os vídeos gravados não antes de 1 h após a mudança das luzes para permitir a habituação e analisar os vídeos de um horário consistente todos os dias.
   NOTA: O período de P3 a P6 normalmente contém as maiores diferenças nos cuidados maternos devido à LBN; Portanto, só é necessário analisar esses dias. O tempo de observação/registro sugerido permite a captura da atividade após a transição do ciclo ativo para o inativo ou vice-versa. No entanto, a fase inativa é quando a mãe tem maior probabilidade de se envolver no cuidado materno e já demonstrou conter as maiores diferenças de grupo no comportamento materno³.
   NOTA: Capture as gravações P2 mais tarde do que em outros dias, pois os camundongos precisam de pelo menos 1 h para se habituar à troca de gaiola. A menos que esta seja uma variável de interesse, descarte este dia da análise.
2. Pontue todos os comportamentos conforme apresentado na Tabela 1. Normalmente, os comportamentos são pontuados nos primeiros 50 minutos após o início do tempo de coleta de dados.
   NOTA: Isso pode ser feito manualmente ou eletronicamente usando o Software Interativo de Pesquisa de Observação Comportamental (BORIS, um software de código aberto) ou um tipo semelhante de software. As instruções abaixo são para pontuação manual e podem ser adaptadas para qualquer software escolhido.
3. Em uma tabela impressa, registre o comportamento observado usando a abreviação, a hora de início e a duração da luta e quaisquer notas descritivas. Por exemplo, se a mãe está amamentando ativamente e depois deixa o ninho, mas os filhotes ainda estão presos a ela, observe isso como AN, seguido por O. A descrição dos filhotes (e quantos) ainda anexados deve ser mantida como uma nota ao lado, caso seja necessário mais tarde.
   NOTA: Qualquer comportamento com menos de 3 s de comprimento não é analisado. Essa regra ajuda a filtrar comportamentos momentâneos devido a distúrbios externos, como ruído ambiental. Uma exceção é feita quando há uma interrupção visível em uma luta de AN (como por um grande movimento ou alongamento) que é rapidamente retomada. Nesse caso, o comportamento observado é AN, seguido por N-AN, conforme descrito na Tabela 1.
4. No caso de vários comportamentos acontecerem ao mesmo tempo, registre o mais ativo. Um exemplo disso é se a mãe está com pouca mama, mas depois começa a lamber e escovar, nota-se que a baixa amamentação pára e o próximo comportamento deve ser marcado como LG com uma nota de que isso ocorreu durante a NL.

Tipo de comportamento		Abreviação	Descrição
Lamber / cuidar		LG	A mãe está envolvida em lamber / cuidar de seus filhotes.
Enfermagem ativa		ANO	A mãe está amamentando seus filhotes em pé, enquanto suas costas estão arqueadas.
Nova enfermagem ativa		N-AN	Esse comportamento é usado especificamente quando a mãe interrompeu a amamentação, mas retoma rapidamente. Esta é uma exceção à regra dos 3s.
Baixa amamentação		EM	A mãe está amamentando ativamente seus filhotes, mas suas costas estão baixas ou quase planas. Esse comportamento geralmente segue AN após um período de tempo.
Acompanhamento de enfermagem		SN	A mãe está deitada de lado durante a amamentação (também conhecida como amamentação passiva).
Fora do ninho		O	A mãe não está no ninho e ela não está comendo / bebendo. Isso pode ser observado em sua caminhada ao redor da gaiola ou explorando.
Comer/beber		E	A mãe está fora do ninho comendo ou bebendo.
Auto-higiene		SG	A mãe está se preparando.
Carregando filhotes		C	A mãe carrega os filhotes, geralmente para realocá-los de volta ao ninho.
Construção de ninhos		NB	A barragem está ativamente construindo ou realocando o ninho.
Seguir em frente ninho		M	A barragem está se movendo no ninho. Isso se apresenta com a mãe interagindo com os filhotes de uma maneira diferente de LG ou qualquer tipo de amamentação, como cheirar, empinar ou pisar nos filhotes.

Tabela 1: Descrição dos comportamentos de cuidado materno.

4. Análise de dados do comportamento materno

1. Compile os resultados da pontuação em uma planilha.
2. Se os vídeos foram analisados eletronicamente, exclua os comportamentos com episódios menores que 3 s, conforme descrito na etapa 3.
3. Calcule a duração média da sessão, a frequência média e a duração total da lambida e da limpeza para cada dia de observação.
   NOTA: Estatísticas descritivas podem ser realizadas em qualquer um dos comportamentos pontuados, mas lamber e escovar normalmente apresentam a interrupção mais evidente em termos de fragmentação por LBN (ou seja, ataques mais curtos e frequentes). Essas variáveis podem ser analisadas como uma média em P3-P6 ou como medidas repetidas por dia para procurar mudanças ao longo do tempo, se isso for de interesse.

5. Cálculo da entropia

NOTA: A entropia, ou imprevisibilidade, dos comportamentos de cuidado materno é calculada com base no método proposto por Vegetabile et ^al.23. Este método baseia-se na suposição de que os comportamentos de cuidado materno atuam como uma cadeia de Markov, que pode ser usada para estimar a taxa de entropia de uma sequência comportamental. A sequência de comportamentos de cada barragem é caracterizada usando a matriz de transição empírica

ij> _{i,j = 1... 7} de probabilidades condicionais de passar de um comportamento (i) para outro comportamento (j), e a taxa de entropia é calculada a partir disso, conforme descrito anteriormente ^3,23 e da seguinte forma:

onde p_ij é a probabilidade condicional de que o comportamento j seja observado em seguida depois que uma mãe é observada executando o comportamento i, π_i é a frequência com que o comportamento i é observado e M (= 7) é o número total de comportamentos diferentes. O leitor é encaminhado para Vegetabile et ^al.23 para uma discussão dos fundamentos teóricos das equações; aqui, o foco está em como aplicar o método no modelo LBN.

1. Para calcular isso, organize o formato necessário para a análise.
   1. Combine AN, LN, SN e N-AN em uma única variável chamada N, somando os tempos, pois todos envolvem enfermagem.
      NOTA: Consulte a Tabela 1 para a descrição dos comportamentos de cuidado materno.
   2. Adicione os comportamentos que não estão relacionados a comportamentos auto-direcionados ou direcionados a filhotes (M e O) em O.
   3. Insira LG, E, SG, C e NB separadamente para resultar em 7 comportamentos no total.
2. Crie uma planilha com colunas seguindo esta ordem: ID do mouse, ID da ninhada, Ninhada #, Tratamento, Dia, Hora, Comportamento e Status.
   1. No ID do mouse, adicione a linha/genótipo do mouse da barragem.
   2. No ID da serapilheira, use o identificador da barragem seguido do número da cama.
   3. Na ninhada #, indique o número de ninhadas que a mãe teve.
   4. Certifique-se de que o tratamento é LBN ou Controle, de acordo com as condições em que os animais foram colocados.
   5. Indique o dia como o dia pós-natal correspondente analisado.
   6. Indique a hora como o carimbo de data/hora no vídeo quando o comportamento começou e terminou (em relação ao início da gravação).
   7. Selecione o comportamento dos sete descritos anteriormente (N, O, LG, E, SG, C e NB) (Tabela 1).
   8. Marque os dois tipos de status, START e STOP. Portanto, cada comportamento aparecerá duas vezes; a primeira notação marca o início e a segunda marca a parada.
3. Seguindo este formato, inclua as informações de todos os dias analisados.
4. No ambiente R, importe os conjuntos de dados que foram formatados como acima.
5. Instale os pacotes disponíveis em https://github.com/bvegetabile/entropyRate.
   NOTA: A execução desse código resulta em uma pasta chamada LBN; Independentemente da condição, esta pasta contém a entropia calculada. Além disso, a entropia de cada dia pode ser calculada pela média do sujeito para P3-P6 e comparada entre as condições.

Resultados

Os resultados representativos demonstram como o ELA, imposto por um ambiente empobrecido em gaiolas LBN, afeta o cuidado materno das mães e os resultados fisiológicos da prole. A entropia diária no comportamento de cuidado materno é maior em LBN nos dias P3-P6 (F_1,58 = 7,21, p = 0,0094; Figura 2A), bem como a entropia média de cada barragem a partir deste período de tempo (t₁₅ = 3,03, p = 0,0085; Figura 2B). Notavelmente, não há diferença significativa na taxa média de entropia entre diferentes serapilheiras da mesma mãe quando mantidas dentro do mesmo grupo de tratamento (F_1,699,4,247 = 0,57, p = 0,58; Figura 2C), sugerindo que a taxa de entropia pode ser uma característica um tanto estável para cada barragem. Dentre todos os comportamentos, lamber e aliciar é o que se mostrou mais fragmentado pelo LBN³. As mães LBN apresentam maior frequência de lamber e escovar seus filhotes (LG) (t₁₆ = 4,04, p = 0,0010; Figura 2D) e em sessões mais curtas (t₁₆ = 3,25, p = 0,0050; Figura 2E). No entanto, não há diferença significativa na duração total do LG entre as barragens Controle e LBN (t₁₆ = 1,52, p = 0,15; Figura 2F).

Figura 2: Análise do comportamento materno. (A) A taxa de entropia diária é maior em barragens de cama e nidificação limitadas (LBN) vs. controle (CTL) analisado pelo modelo de efeitos mistos (F_1,58 = 7,21, p = 0,0094). (B) A taxa média de entropia é maior em barragens LBN vs. CTL (t₁₅ = 3,03, p = 0,0085). (C) A taxa média de entropia (P3-P6) não é significativamente diferente entre várias ninhadas dentro da mesma mãe quando mantida no mesmo grupo de tratamento (F_1,699,4,247 = 0,57, p = 0,58). Cada linha representa uma única barragem. (D) A frequência cumulativa de eventos de lamber e aliciar (LG) é maior para barragens LG vs. CTL (t₁₆ = 4,04, p = 0,0010). (E) O comprimento médio da luta LG é menor para barragens LG vs. CTL (t₁₆ = 3,25, p = 0,0050). (F) O tempo acumulado gasto em LG não é significativamente diferente devido ao LBN (t₁₆ = 1,52, p = 0,15). Os dados são médios ± EPM, * p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os filhotes que foram criados em condições LBN são significativamente menores em P10 (t₆₁ = 6,30, p < 0,0001; Figura 3A). Essa diferença geralmente persiste na idade de desmame (t₆₂ = 6,29, p = <0,0001; Figura 3B) mas não é mais observado na idade adulta (t₃₈ = 1,08, p = 0,29; Figura 3C). No entanto, os níveis de corticosterona estão aumentados na linha de base na idade adulta (t_18,79 = 2,23, p = 0,038; Figura 3D), sugerindo efeitos fisiológicos duradouros da LBN. Essas são as diferenças esperadas em uma configuração experimental bem-sucedida. No caso de uma configuração abaixo do ideal, os valores de comprimento da luta de LG, entropia e pesos dos filhotes podem não apresentar diferenças, provavelmente devido a um grupo "Controle" estressado. Para os propósitos deste artigo, o sexo foi colapsado ao analisar os resultados da prole porque as diferenças sexuais não são normalmente observadas nos resultados fisiológicos descritos aqui; no entanto, diferenças entre os sexos em outros tipos de desfechos, como comportamento cognitivo e emocional, são comumente relatadas neste modelo e devem ser investigadas mais a fundo⁴.

Figura 3: Resultados da prole. (A) Cama e nidificação limitadas (LBN) diminuem o peso do filhote medido em P10, pouco antes do retorno às gaiolas padrão (t₆₁ = 6,30, p < 0,0001). (B) O peso ainda é diminuído pelo LBN na idade de desmame (t₆₂ = 6,29, p < 0,0001). (C) O peso adulto não difere mais devido ao LBN (t₃₈ = 1,08, p = 0,29). (D) A concentração basal de corticosterona na idade adulta é aumentada pelo LBN, conforme analisado pelo teste t de Welch (t_18,79 = 2,23, p = 0,038). Para todos os gráficos, as fêmeas são mostradas com círculos e os machos com triângulos. Os dados são médios ± EPM, *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este artigo fornece um protocolo detalhado para aplicar o modelo LBN em camundongos. Esse modelo é uma ferramenta importante para entender como uma forma etológica e translacionalmente relevante de estresse crônico no início da vida contribui para o desenvolvimento de distúrbios neuropsiquiátricos na prole¹³. Também é útil para estudar o comportamento materno e quaisquer alterações no cérebro das mães de uma perspectiva molecular, neuroendócrina ou baseada em circuitos²⁴. Para esses tipos de perguntas, a multiparidade pode ser uma variável mais importante a ser considerada. Observamos que os escores de entropia do comportamento materno permanecem consistentes em várias ninhadas dentro da mesma mãe (Figura 2C), sugerindo que a entropia pode ser uma característica um tanto estável para cada mãe. Esse achado pode justificar o uso de camundongos fêmeas multíparas quando não é viável usar apenas fêmeas nulíparas, como no caso de camundongos transgênicos caros ou raros. Devido aos possíveis efeitos não intencionais da multiparidade em outras variáveis (por exemplo, ambiente intrauterino), recomenda-se que o experimentador controle estatisticamente o uso de fêmeas multíparas durante a análise dos dados.

É importante notar que este modelo é altamente sensível a distúrbios ambientais. Vários fatores podem perturbar os animais, causando problemas e resultados abaixo do ideal, como inundações em gaiolas ou ruídos altos, como de construções próximas. Normalmente, esses distúrbios resultarão em animais de controle estressados e, portanto, não haverá diferenças entre as condições de controle e LBN. Um indicador desses problemas pode ser pesos semelhantes em filhotes de controle e LBN em P10 e valores de entropia semelhantes no comportamento de cuidado materno. Por isso, a configuração ideal é uma sala de cuidados maternos que seja usada apenas para esse fim, tranquila e longe da colônia e de outros funcionários do laboratório. Distúrbios também podem levar ao canibalismo de filhotes, especialmente em mães menores que P75. O risco de perder filhotes para o canibalismo é menor em mães após P75 e muitas vezes após a primeira ninhada. Uma versão alternativa deste método muda o tempo da manipulação experimental para P4-P11, a fim de diminuir ainda mais o risco de canibalismo^25,26; embora isso não seja necessário nas atuais condições de laboratório. Outra versão do LBN não emprega um divisor de tela, mas ainda limita a quantidade de material de cama e nidificação durante todo o período pós-natal pré-desmame²⁷. É importante ressaltar que a mudança na linha do tempo pode levar a resultados diferentes, como comportamento materno abusivo, que pode, por sua vez, resultar em diferentes desfechos da prole, como comportamentos semelhantes à ansiedade^25,28. Outros problemas comuns incluem a perda de dados de comportamento materno devido ao ângulo da câmera e ao grande tamanho do ninho; Para ajudar com isso, é aconselhável colocar um espelho na parte de trás da gaiola e certificar-se de fornecer apenas um único ninho na condição de controle, a fim de evitar que o ninho se torne muito grande e esconda os filhotes da câmera. Por fim, é essencial garantir que a malha se encaixe corretamente na gaiola para evitar que os filhotes fiquem presos ou se machuquem.

Uma vantagem do modelo LBN é que ele é facilmente personalizado e combinado com outros fatores experimentais. Exemplos das variáveis que podem ser adicionadas a este protocolo são dieta^29,30, desafios imunológicos^30,31, diferentes linhas transgênicas ^32,33 e quimiogenética¹⁹. Além disso, algumas versões desse modelo empregam um período de tempo P10-P17 e o combinam com a separação materna (SM)34,35,36. Esse paradigma também foi adaptado como um estressor pré-natal, onde as mães são alojadas no ambiente LBN de E14 a E19^37,38, mas os filhotes nunca são expostos diretamente ao estresse. Finalmente, alguns estudos usam um modelo de dois acertos que envolve ELA combinado com diferentes testes de estresse na prole quando atingem a idade adulta^19,39.

Uma das limitações desse método é que ele não tem uma alta taxa de transferência. A quantidade de dados que produz é limitada pelo número de câmeras e espaço disponível ao mesmo tempo, embora as ninhadas possam ser facilmente escalonadas ao longo do tempo. A pontuação manual do comportamento materno é especialmente demorada e pode introduzir viés do observador, mas a pontuação automatizada está sendo desenvolvida⁴⁰, graças ao advento de abordagens baseadas em aprendizado de máquina. Se os dados forem pontuados manualmente, recomenda-se que a mesma pessoa pontue todos os vídeos de um experimento para diminuir a variabilidade entre os observadores. Outra limitação é que esse modelo é projetado para roedores que dependem principalmente do cuidado materno, dificultando o estudo do cuidado biparental. No entanto, alguns grupos adotaram a privação paterna como alternativa à EM em espécies biparentais, como o camundongo da Califórnia^41,42, portanto, é concebível que LBN também possa ser adaptado para essas espécies.

Além do LBN, a separação materna é o outro modelo mais proeminente para ELA, porque outras formas de estresse empregadas em adultos (ou seja, estresse de contenção) não são etologicamente relevantes e não afetam os filhotes da mesma maneira. A NMB difere da SM por ser uma forma de estresse crônico que induz um comportamento materno fragmentado e imprevisível, enquanto na SM a privação é intermitente e geralmente ocorre em horários previsíveis todos os dias⁴³. Curiosamente, ambos os modelos podem causar alterações no eixo HPA e comportamentos depressivos em roedores, embora o LBN possa ser um protocolo mais reprodutível com menos interação com o experimentador e maior consistência entre os laboratórios 1,11,13,16. Embora este protocolo seja útil para mitigar algumas fontes de variabilidade (como relacionadas ao experimentador), outros aspectos como diferenças nas instalações dos animais, origem dos animais ou cepa podem influenciar os resultados. Por exemplo, sabe-se que camundongos BALB/c têm uma resposta mais pronunciada ao estresse crônico de contenção e podem ser diferencialmente sensíveis ao ELA do que C57BL/6J^27,44.

Em conclusão, o modelo LBN emprega um ambiente de poucos recursos com cuidados maternos imprevisíveis e é uma abordagem útil para entender como o estresse no início da vida afeta uma ampla variedade de processos, como adaptações fisiológicas ao estresse, comportamento materno e desenvolvimento cerebral. Notavelmente, esse modelo tem sido empregado para entender como e por que a ELA é um fator de risco para transtornos neuropsiquiátricos 1,5,9,12. No futuro, o uso de LBN aumentará nossa compreensão da base biológica dos transtornos mentais e físicos e ajudará a elucidar novos alvos terapêuticos para tratar os efeitos do estresse durante o período perinatal sensível.

Materiais

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