Artigo de método

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

DOI:

10.3791/66881

⸱

24 de julho de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Stanford School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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A Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) é um método optogeneticamente ativado inovador desenvolvido para marcar e purificar populações subcelulares de ribossomos para sequenciamento a jusante e análise proteômica.

Resumo

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Evidências crescentes sugerem que a tradução de mRNA é um processo altamente compartimentado dentro de uma célula, e que o tráfego subcelular e a localização de mRNAs específicos são fundamentais para garantir que proteínas com funções específicas de compartimento sejam produzidas no ambiente ideal e em quantidades apropriadas. No entanto, técnicas para isolamento subcelular e caracterização dos ribossomos que traduzem esses mRNAs têm sido limitadas até o momento, de modo que muito permanece desconhecido sobre como a composição da maquinaria translacional contribui para a regulação da tradução localizada de mRNA.

Aqui, demonstramos Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) do AviTag, um método que combina marcação de epítopos, uma ligase de biotina dividida optogeneticamente ativada recém-desenvolvida e purificação por afinidade para marcar e isolar ribossomas localizados em qualquer compartimento subcelular de interesse. Primeiro, a edição CRISPR/Cas9 é usada para fundir um peptídeo AviTag, um sítio de clivagem de protease por vírus do tabaco (TEV) e uma etiqueta de epítopo FLAG a uma proteína ribossômica. A ligase de biotina dividida, fundida a um domínio que dirige organelas, é expressa nessa linhagem celular e permanece inativa sob concentrações normais de biotina. Após ativação por biotina suplementar e iluminação com luz azul, a ligase biotinila ribossomas marcados com AviTag nas proximidades imediatas, permitindo a purificação de afinidade dos ribossomos biotinilados e proteínas e mRNAs associados em esferas revestidas com estreptavidina. A elusão não desnaturante via clivagem da protease TEV fornece amostras adequadas para caracterização posterior de proteínas ribossomas centrais, proteínas associadas a ribossomos e mRNAs ligados a ribossomos por meio de sequenciamento de RNA ou proteômica por espectrometria de massas.

Neste protocolo, revisamos os princípios de projeto para fundir AviTag a uma proteína ribossomal e direcionar a enzima ligase de biotina dividida para o organelo de interesse. Demonstramos ativação do sistema ALIBi, lise celular, purificação de afinidade e elução da amostra. Por fim, discutimos resultados típicos e a solução de problemas.

Introdução

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Há uma necessidade importante de ferramentas que possam isolar amostras biológicas de compartimentos subcelulares específicos para investigar melhor como a organização subcelular e o tráfego influenciam os processos celulares. A tradução de mRNA é um exemplo-chave desse processo: evidências crescentes sugerem que a tradução é altamente compartimentada e, em particular, que muitos mRNAs estão localizados nas organelas onde suas proteínas codificadasresidirão 1,2. No entanto, sabe-se menos sobre a localização subcelular da maquinaria translacional. Os ribossomos começam sua existência no nucléolo e núcleo, onde começa a montagem a partir de proteínas ribossomal (RPs) e RNAs ribossomal (rRNAs). Eles são então exportados para o citoplasma para as etapas finais de montagem, após as quais começam a traduzir osmRNAs 3,4. Os sítios canônicos de tradução incluem o citoplasma e o retículo endoplasmático; este último é onde proteínas integrais de membrana e proteínas destinadas a organelas ligadas à membrana ou secreção extracelular sãosintetizadas 5. Locais mais recentemente identificados de tradução localizada incluem as mitocôndrias, peroxissomos e processosneuronais 6,7,8,9,10,11,12. Curiosamente, também estão surgindo evidências de que características da maquinaria translacional, como proteínas associadas a ribossomos, modificações pós-traducionais, modificações de rRNA e estequiometria não canônica de proteínas ribossomas centrais, estão envolvidas em mecanismos regulatórios que regem a tradução de mRNAs específicos e parâmetros como fidelidade e taxa detradução 13,14,15,16,17.18, 19, 20. Por exemplo, centenas de proteínas foram identificadas que interagem com o ribossomo e podem potencialmente levar a diferenças na composição subcelular doribossomo 13. No entanto, técnicas para isolar populações subcelulares de ribossomos têm sido limitadas até o momento; assim, muito permanece desconhecido sobre como a composição da maquinaria translacional contribui para regular a tradução localizada de mRNA. O advento de métodos versáteis para isolar populações subcelulares de ribossomos, especialmente aquelas compatíveis com sistemas modelo de mamíferos, permitirá a exploração dessas características da máquina de tradução no nível subcelular.

Os primeiros métodos para isolar frações subcelulares contendo ribossomos baseavam-se em princípios de lise sequencial ecentrifugação 21,22. Normalmente, esses métodos são limitados a certos organelos e frequentemente exigem longos tempos de processamento. Um método mais recente é baseado na ligase de biotina BirA, que biotinila especificamente um substrato peptídicoAviTag 10,23,24. O BirA pode ser geneticamente localizado no organelo de interesse em células onde os ribossomos foram marcados com AviTag. No entanto, como a BirA está ativa em concentrações fisiológicas de biotina, é necessário cultivar células sob condições de depleção da biotina para evitar a biotinilação constitutiva e inespecífica dos ribossomos portadores deAviTags 10,24. Isso limita o uso de BirA em tipos celulares sensíveis à depleção debiotina 25. Por fim, métodos promíscuos de biotinilação foram desenvolvidos que utilizam enzimas engenheiradas como BioID, TurboID eAPEX 26,27,28. Após a indução, essas enzimas produzem um intermediário biotino reativo que modifica covalentemente quaisquer resíduos de lisina dentro de um raio da enzima. Métodos de biotinilação promíscua são altamente úteis para mapear proteomas subcelulares, mas menos informativos para distinguir proteínas na vizinhança geral de ribossomos localizados em comparação com proteínas que estão mais próximas a eles.

Aqui, demonstramos nosso método recentemente desenvolvido para marcar e isolar populações subcelulares de ribossomos, chamado Biotinilação Iluminada por Restrição por Localização específica do AviTag (ALIBi). Esse método utiliza um BirA dividido engenheirado fundido a interruptores de ímã (eMag) optogeneticamente aprimorados (Figura 1A) que heterodimerizam sob iluminação de luzazul 29; e uma etiqueta peptídica composta pelo epítopo FLAG, o sítio de clivagem da protease do vírus do tabaco (TEV) e o AviTag (FTA) fundido à proteína ribossomal Rpl31 (Figura 1B). A enzima dividida pode ser geneticamente direcionada a organelas selecionadas, é inativa em concentrações fisiológicas de biotina e pode ser reconstituída em minutos após iluminação de luz azul e adição de biotina suplementar (Figura 1C-E). A lise celular subsequente, purificação de afinidade e eluição enzimática não desnaturante via clivagem da protease TEV geram ribossomos e moléculas co-purificadoras como mRNAs e proteínas associadas a ribossomos, que são adequadas para métodos analíticos posteriores como sequenciamento de RNA e proteômica em espectrometria de massa (Figura 1A). Portanto, esse método revela não apenas a composição dos ribossomosmos, mas também os mRNAs aos quais os ribossomas estão ligados. Em um artigo recente que descreve a aplicação seminal do ALIBi para caracterizar populações de ribossomos subcelulares, selecionamos com sucesso a enzima dividida para o citoplasma, nucléolo, núcleo, retículo endoplasmático, membrana plasmática e mitocôndrias (Tabela 1)30. A comparação resultante da maquinaria translacional entre esses compartimentos subcelulares levou a descobertas novas e inesperadas sobre a tradução no retículo endoplasmático e nas mitocôndrias, bem como potenciais pistas para futuras investigações dos fatores de biogênese do ribossomo no núcleo e no nucléolo.

Este protocolo contém uma demonstração detalhada da transfecção e ativação do sistema ALIBi, lise celular, purificação de afinidade e eluição da amostra. Também discutimos como verificar a purificação bem-sucedida de afinidade via western blot e fazemos recomendações para realizar sequenciamento de RNA a jusante ou análise proteômica por espectrometria de massa (MS) (ver Arquivo Suplementar 1). Este protocolo foi desenvolvido para experimentos usando células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) que expressam Rpl31 fundido à FTA (L31-FTA) homoziginamente a partir do locus endógeno Rpl31; Esta linha celular está disponível pelos autores mediante solicitação. A estratégia para gerar essa linhagem celular é descrita no Arquivo Suplementar 1 e na Figura Suplementar S1 e Figura Suplementar S2. Plasmídeos que codificam as enzimas divididas direcionadas a vários organelos estão disponíveis no Addgene (números de catálogo #235608 a 235643). Os princípios de projeto para direcionar as enzimas divididas a esses organelos são descritos no Arquivo Suplementar 1. O protocolo assume que cada amostra se origina de mESCs cultivados em uma placa de 10 cm. Descobrimos que a escala de 10 cm fornece material suficiente para a proteômica de espectrometria de massas, enquanto a escala de 6 poços é suficiente para Western blots ou sequenciamento de RNA.

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Protocolo

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1. cultura celular mESC

NOTA: Antes da ativação do ALIBi e da lise celular, os mESCs devem ser manuseados usando a técnica estéril padrão para cultura celular. A centrifugação de mESCs intactos deve ser realizada a 200 × g por 3 minutos à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Pré-aqueça o meio a 37 °C em banho-maria antes do uso, salvo indicação em contrário. Os mESCs devem ser conduzidos para uma nova placa de cultura de tecidos que tenha sido gelatinizada durante a noite (veja o passo 1.1).

  1. No dia anterior ao descongelamento dos mESCs L31-FTA, recubra a base de uma placa de 10 cm com 5 mL de gelatina 0,1%. Incube a 37 °C durante a noite.
  2. Combine componentes do meio mESC (Tabela 2) e passe por um filtro de 0,2 μm. Armazene a 4 °C por até 1 mês.
  3. No dia do descongelamento, aqueça uma aliquota de 5 mL de meio para diluir as células descongeladas e uma aliquota de 10 mL para emplacá-las.
  4. Recupere um cryovial contendo ~5 × 106 MESCs L31-FTA do armazenamento de nitrogênio líquido. Descongele imediatamente girando o fundo do frasco em um banho-maria a 37 °C.
  5. Misture suavemente de 0,5 a 1 mL de meio da alíquota de 5 mL com o conteúdo criovial conforme a capacidade do frasco permitir, depois transfira o conteúdo criovial de volta para a aliquota do meio de 5 mL.
  6. Faça pellets nas células por centrifugação. Aspire o sobrenadante.
  7. Resuspenda o pellet celular com a aliquota de 10 mL de mídia.
  8. Aspire a gelatina da placa de 10 cm e transfira imediatamente a suspensão celular para dentro da placa. Incubar a 37 °C.
  9. A cada 24 horas (exceto nos dias de passagem), aspire substrato antigo da placa e substitua por 10 mL de substrato fresco.
  10. Quando as colônias estiverem 70%–80% confluentes (tipicamente 48 h após a placagem), aspire o meio antigo e enxágue duas vezes com 10 mL de soro salino tamponado com fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  11. Após aspirar o DPBS, revesta a placa com 2 mL de tripsina 0,05% (Tabela 2). Incube a 37 °C por 5 minutos.
  12. Neutralize a tripsina adicionando 4 mL de meio mESC frio à placa. Imediatamente use uma pipeta sorológica de 5 ou 10 mL para subir e descer 15 vezes na placa e dissociar as colônias em uma suspensão unicelular.
  13. Transfira a suspensão para um tubo cônico. Opcionalmente, remova uma alíquota para contar células usando um hemocitômetro.
  14. Faça pellets nas células por centrifugação. Aspire o sobrenadante.
  15. Resuspenda o pellet celular em meio fresco. A placa 5 × 10106 células (tipicamente proporção de passagem de 1:6) em uma placa gelatinizada fresca de 10 cm e incubam a 37 °C. Repita os passos 1.9–1.15 conforme necessário até estar pronto para prosseguir com a transfecção.
  16. Para fabricar estoques celulares congelados, tripsinize uma placa de mESCs (como nos passos 1.10–1.14). Resuspenda o pellet celular em meio congelante (250–500 μL por 5 × 106 células), aliquota em crioviais e congele lentamente em um recipiente de congelamento de células a -80 °C durante a noite antes de transferir para o armazenamento de nitrogênio líquido.

2. Transfecção

NOTA: Realize a transfecção em um dia em que os mESCs estejam prontos para a passagem. Plasmídeos podem começar a se expressar tão cedo quanto 3-5 horas após a transfecção. Após a expressão, recomendamos manusear células no escuro e minimizar a exposição a temperaturas abaixo de 37 °C para evitar ativação prematura, já que trabalhos anteriores mostraram que domínios optogenéticos magnetizados se dimerizam não apenas sob luz azul, mas também sob exposição aofrio 31. Mantenha os pratos em uma incubadora dedicada ou proteja uma prateleira em uma incubadora compartilhada da luz com papel alumínio. Ao manusear células fora da incubadora, desligue ou bloqueie todas as luzes e janelas do ambiente antes e use um farol de luz vermelha para enxergar. Não deixe a porta da incubadora aberta por mais tempo do que o necessário. Retire apenas pequenos lotes de placas da incubadora de cada vez e apoie as placas sobre uma superfície isolante (ou seja, uma tampa limpa de uma caixa de isopor) enquanto manuseio para minimizar o contato com superfícies de trabalho em temperatura ambiente. Aqueça totalmente o material antes de usar. Não inspecione as placas sob um microscópio emissor de luz.

  1. No dia anterior à transfecção, gelatinize uma placa de 10 cm.
  2. No dia da transfecção, aspire a gelatina da placa e adicione 7,5 mL de substrato para pré-aquecer a 37 °C. Meio sérico reduzido pré-aquecido a 37 °C para células em ressistência.
  3. Dilua 18,75 μL do reagente de transfecção em 250 μL de meio sérico reduzido. Bata suavemente para misturar e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
  4. Se coexpressar dois plasmídeos codificando os fragmentos N e C, adicione 3,75 μg de cada plasmídeo a 250 μL de meio sérico reduzido. Se expressar apenas um plasmídeo (ou seja, um controle negativo GFP ou um controle positivo BirA de comprimento total), adicione 7,5 μg do plasmídeo único em vez disso.
  5. Adicione a mistura de plasmídeo/meio sérico reduzido à mistura de reagente de transfecção/meio sérum reduzido e bata/inverta para misturar. Incube em temperatura ambiente por 15 minutos.
  6. Enquanto isso, tripsinize e faça pellets de mESCs (etapas 1.10–1.14). Resuspenda o pellet em meio sérico reduzido aquecido até uma concentração de 10 × 106 células/mL.
  7. Adicione 7,5 × 10células ressuspensas de 6 (750 μL) à mistura plasmídeo/reagente de transfecção/meio sérico reduzido. Inverta o tubo para misturar. Incube por 10 minutos na RT, invertendo os tubos ocasionalmente para manter as células suspensas.
  8. Inverta os tubos novamente brevemente e adicione a mistura mESC/plasmídeo/reagente de transfecção/meio de soro reduzido à placa que contém o meio aquecido. Balance suavemente a placa para distribuir as células de forma uniforme.
  9. Incube a placa a 37 °C por 3–5 horas, permitindo que as células aderam dentro desse tempo.
    NOTA: A partir deste ponto, recomendamos observar as precauções acima contra exposição à luz e temperaturas abaixo de 37 °C.
  10. Aspire suavemente a mídia antiga. Adicione um substrato quente fresco, pipetando pela lateral da placa para evitar que as células desaloquem. Retomar a incubação a 37 °C.
  11. Se ativar/lisar 24 horas após a transfecção, prossiga para a seção 3. Se planejar ativar/lisar 48 h após a transfecção, troque o meio ~24 h após a placagem das células transfectadas.

3. Ativação do ALIBi e lise celular

NOTA: Continue manuseando células/amostras no escuro até o início da elução (passo 5.4). Depois que as células tenham sido resfriadas no gelo (passo 3.15), mantenha as amostras frias e use apenas reagentes resfriados até o início da elução. Certifique-se de que superfícies de trabalho, equipamentos, reagentes e plásticos estejam livres de RNAse, utilizando itens recém-abertos e limpando ou enxaguar superfícies duras com uma solução descontaminante de RNAse e 70% de etanol. Use luvas sempre que manusear amostras ou equipamentos. Para amostras destinadas à proteômica da EM, também minimize a contaminação por queratina mantendo o espaço de trabalho livre de poeira; Cubra a pele nua e prenda o cabelo comprido.

  1. Pré-resfrie a centrífuga a 4 °C.
  2. Com as luzes apagadas, mova as placas transfectadas para uma incubadora temporária de 37 °C para que não sejam expostas a flutuações de temperatura na incubadora principal após a colocação do transiluminador dentro.
  3. Limpe o transiluminador de luz azul com etanol 70% e conecte à energia. Coloque o transiluminador na incubadora principal e permita que as condições da incubadora se reequilibrem enquanto continua a configuração.
  4. Aqueça uma alíquota de substrato para ser dosada com biotina e cicloheximida (CHX) (10 mL de meio por placa de 10 cm) a 37 °C. Se fizer amostras de controle sem biotina suplementar, também aqueça uma alíquota separada para ser dosada apenas com CHX.
    NOTA: Alguns componentes do tampão podem ser misturados no dia anterior ao uso e armazenados durante a noite a 4 °C (veja a Tabela 2). Note que diferentes receitas de lise e wash buffer foram usadas para experimentos destinados à proteômica western blot ou MS e para sequenciamento de RNA.
  5. Resfrie uma alíquota de DPBS para ser dosada com CHX (20 mL por placa de 10 cm).
  6. Prepare o tampão de remoção de RNAse, lavagem de sal, tampão de lise e tampão de lavagem (veja a Tabela 2). Para tampões com componentes densos/viscosos, como glicerol e Triton X-100, pipete-se o tampão completo para garantir uma mistura uniforme. Resfrie os buffers no gelo antes do uso.
    NOTA: Para as etapas de lavagem das contas, gire brevemente o tubo contendo as esferas no buffer atual em uma centrífuga de bolso para coletar o conteúdo na parte inferior. Coloque o tubo em um suporte magnético por 1 minuto ou até que as contas tenham migrado completamente. Aspire o sobrenadante sem tocar no pellet de contas. Sem deixar o pellet de conta secar, adicione o próximo buffer. Para resuspender a pastilha de contas, pipeteie suavemente ou role o tubo fechado entre os dedos enquanto o segura contra o suporte magnético, de modo que as contas sejam rapidamente puxadas em várias direções pelo ímã. Por fim, inverta as esferas ressuspensas várias vezes para garantir que as paredes internas do tubo sejam lavadas.
  7. Suspenda novamente a garrafa de contas de estreptavidina com pipeteamento suave ou balanço. Transfira 450 μL de esferas para um tubo de baixa ligação proteica para cada placa de 10 cm de mESCs.
  8. Seguindo a NOTA acima sobre lavagem das esferas, descarte o buffer de armazenamento das esferas e lave as esferas 2x com 900 μL de buffer de remoção de RNAse.
    NOTA: Prossiga para a próxima etapa sem demora; o tempo prolongado no buffer de remoção de RNAse pode diminuir a capacidade de ligação das esferas.
  9. Lave as esferas 1x com 900 μL de lavagem salina.
  10. Lave as esferas 2x com 900 μL de Wash I Buffer. Após resuspender as esferas na segunda rodada do buffer Wash I, armazene-as no buffer Wash I a 4 °C enquanto realiza ativação e lise celular.
  11. Adicione biotina (concentração final de 50 μM; diluição 1:1.000 do estoque de 50 mM) e CHX (concentração final de 100 μg/mL; diluição 1:1.000 do estoque de 100 mg/mL) conforme apropriado a(s) alíquota(s) aquecida(s) do meio. Mantenha a 37 °C até o uso.
  12. Adicione CHX (concentração final de 100 μg/mL; diluição 1:1.000 do estoque de 100 mg/mL) à alíquota fria do DPBS e mantenha refrigerada até o uso.
    NOTA: As duas etapas seguintes descrevem a ativação do ALIBi por meio de biotina suplementar e iluminação com luz azul. Uma duração ideal de ativação é longa o suficiente para gerar uma quantidade adequada de biotinilação do ribossomo para ensaios posteriores, mas curta o bastante para preservar a resolução espaço-temporal. O tempo ideal de ativação pode variar com base em parâmetros como o tipo celular, escala do experimento, nível de expressão das enzimas divididas, abundância de ribossomos próximos ao organelo de interesse e sensibilidade da técnica de análise. Recomendamos 15 minutos como ponto de partida, que é o tempo de ativação usado em nossos resultados representativos (Figura 2) e em nosso trabalhoacompanhante 30.
  13. Aspire a mídia das placas transfectadas. Adicione imediatamente 10 mL do meio morno contendo CHX ± biotina por placa.
  14. Para que placas de controle negativas não sejam iluminadas, coloque-as em uma incubadora escura. Para que as placas sejam iluminadas, coloque-as diretamente sobre o transiluminador, ligue-o e incube por 15 minutos.
  15. Quando a iluminação estiver concluída, lave imediatamente as placas duas vezes com 10 mL de DPBS frio + CHX por placa. Coloque os pratos no gelo entre e após as lavagem. Após aspirar a segunda lavagem, incline a placa e aspire qualquer DPBS residual.
  16. Mantendo cada placa o mais plana possível sobre gelo, proceda à lise adicionando 2 mL de tampão de lise gelada. Incube a placa no gelo por 5 minutos, batendo na placa para desalojar as células 2–3 vezes durante esse tempo.
    NOTA: se mantidas escuras sob papel alumínio e no gelo, as placas podem ser movidas para fora da área de cultura celular para outro espaço escuro durante esse período.
  17. Desaloje quaisquer células restantes usando uma micropipeta para pipetar o lisado para cima e para baixo na superfície da placa, evitando a formação de bolhas, e então transfira o lisado para um tubo de baixa ligação proteica resfriado e marcado.
    NOTA: OPCIONAL: Para alguns organelos difíceis de lisar, como o núcleo e o nucléolo, a sonicação pode ajudar.
  18. No caso de organelas de difícil lisis, sonice todas as amostras do experimento por 45 s a 4 °C (configuração de potência de 3 watts). Se o projeto do sonicador exigir a inserção de uma sonda em um tubo de amostra aberto, transfira o lisado inicialmente da placa para um tubo maior para evitar transbordamento durante a sonicação; depois, transfira para um tubo de 2 mL.
  19. Incube o lisado no gelo por 15 minutos.
  20. Centrifuge o lisado a 17.000 × g por 3 minutos a 4 °C. Transfira o sobrenadante (lisado clarificado) para um tubo de baixa ligação proteica refrigerada sem perturbar o pellet de detritos celulares.
    NOTA: Se a análise RNA-seq for intencional, uma alíquota do lisato clarificado pode agora ser coletada como fração total de RNA (veja Arquivo Suplementar 1, "Recomendações para sequenciamento de RNA" passo 1.1) para detalhes.
    NOTA: Se as quantidades celulares, condições de transfecção/cultura e condições de lise foram uniformes para todas as amostras, normalmente assumimos que as concentrações de lisado são comparáveis entre amostras e seguimos sem quantificar a concentração total de proteínas. Isso minimiza o tempo decorrido entre a ativação e a purificação de afinidade.

4. Purificação de afinidade

  1. Faça pellets nas contas lavadas de estreptavidina usando o suporte magnético. Aspire o buffer Wash I.
  2. Transfira 1.200 μL de lisato clarificado para o tubo contendo as esferas lavadas. Pipete suavemente para resuspender as contas. Armazene o restante do lisado clarificado a -80 °C.
  3. Incube o lisado com esferas a 4 °C no escuro por 1 hora no rotador do tubo.
  4. Durante essa incubação, prepare o tampão de elução do TEV (Tabela 2).

5. Elução

  1. Seguindo as anotações sobre lavagem de contas na seção 3, faça pellets nas bolas em um suporte magnético e transfira o sobrenadante para um tubo de baixa ligação proteica gelada. Armazene o sobrenadante a -80 °C.
  2. Lave as esferas 2x com 900 μL de buffer Wash I.
  3. Lave as esferas 1x com 900 μL de buffer Wash II.
    NOTA: Após a conclusão desta etapa, as amostras não precisam mais ser manuseadas no escuro.
  4. Adicione 450 μL de buffer de elução TEV às contas.
  5. Incube as esferas no tampão de elução TEV por 1 hora em temperatura ambiente no rotador do tubo. Para experimentos de menor escala usando baixos volumes de buffer de elução TEV, incube os tubos em um shaker a 1.000–2.000 rpm.
  6. Faça pellets nas contas no suporte magnético. Transfira o eluato para um tubo de baixa ligação proteica. Se a análise proteômica ou western blot for intencional, armazene o eluato a -80 °C. Se a análise de RNA-seq for intencional, veja o Arquivo Suplementar 1 "Recomendações para sequenciamento de RNA" passo 1.2 para instruções de armazenamento de eluatos.
  7. OPCIONAL: Para determinar preliminarmente se a purificação de afinidade produziu rRNA/mRNA apreciável (indicando que ribossomas foram isolados), analise eluados em um espectrofotômetro de microvolume usando o tampão de elução TEV como um branco.
    NOTA: Eluados de células que contêm o sistema ativado devem ter maior absorção a 260 nm do que eluados de células que não possuem enzimas divididas, luz azul/biotina ou L31-FTA.

6. Western blot

NOTA: Até que o lisado e as amostras de fluxo contínuo sejam desnaturadas no tampão de Laemmli, recomendamos continuar evitando a exposição à luz. Usamos géis pré-fabricados, buffer de transferência comercialmente disponível e buffer de corrida, além de um sistema de transferência semi-seco (veja a Tabela de Materiais). SDS-PAGE e western blot são realizados de acordo com as instruções do fabricante para esses componentes, salvo indicação em contrário abaixo.

  1. Adicione 6x amostras de tampão de Laemmli ao lisado, fluxo e/ou eluado até uma concentração final de 1x tampão de Laemmli. Aqueça a 95 °C em um bloco térmico ou termociclador por 10 minutos. Se houver condensação na tampa ou paredes dos tubos, faça os tubos girar brevemente.
  2. Configure um gel com buffer funcionando no tanque de gel, conforme as instruções do fabricante do tanque. Carregue as amostras e a escada.
  3. Faça o gel funcionar a 125 V por 45–75 minutos até a frente do corante chegar ao fundo do gel. Enquanto isso, prepare PBST e buffers de bloqueio (Tabela 2).
  4. Realize uma transferência semi-seca conforme as instruções do fabricante do sistema de transferência.
    NOTA: Para todas as etapas de lavagem/incubação da membrana, certifique-se de que a membrana esteja totalmente submersa e coloque a bandeja de membrana sobre um balancim orbital ou basculante. Para uma bandeja de 10 x 15 cm, isso requer 25–50 mL de tampão.
  5. Remova a membrana da pilha de transferência e prossiga imediatamente para a próxima etapa para garantir que a membrana não seque.
    NOTA: OPCIONAL: Manchas secas na membrana podem resultar em bloqueios irregulares ou ligação à sonda, especialmente em sondas que têm incubações curtas, como estreptavidina-peroxidase de rába-forte. Para evitar esse problema, molhamos novamente as membranas após a transferência em metanol 100% por 30 segundos, depois em água por 5 minutos. Essa medida é semelhante às recomendações gerais para reumedecer membranas PVDF que secaram apóstransferência 32,33.
  6. Lave a membrana em PBST por 3 x 10 minutos em temperatura ambiente.
  7. Seguindo as condições especificadas na Tabela 3 para cada sonda western blot, realize o bloqueio, lavagem, incubação da sonda e incubações secundárias de anticorpos.
  8. Após a lavagem final no passo 6.7, misture os componentes do substrato ECL conforme as instruções do fabricante e recubra a membrana de forma uniforme com ela. Capture a imagem em um sistema de imagem em gel de quimioluminescência.

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Resultados

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Western blot (protocolo seção 6) é a forma mais rápida de avaliar preliminarmente o sucesso de um experimento. Quando as membranas são sondadas com estreptavidina-HRP, o lisado das células onde todos os componentes do sistema estavam presentes deve conter uma faixa correspondente à L31-FTA biotinilada (Figura 2A, pista 20). A mesma faixa deve estar presente, geralmente em maior intensidade, se as células foram transfectadas com BirA de comprimento total como...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ALIBi oferece várias vantagens em relação às técnicas existentes para estudar a tradução subcelular e tem potencial para aplicações futuras na biologia dos ribossomos e além. Esse protocolo requer tempo semelhante ou menor em comparação com lisis sequencial ecentrifugação 21,22 e é potencialmente aplicável a qualquer compartimento subcelular que possa ser geneticamente direcionado com uma sequência peptídica localizadora. Compa...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Os autores agradecem aos membros do Barna Lab pelas discussões úteis.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
-80 °C armazenamentoPara cultura celular
0,1% gelatina em águaMilliporeSigmaES-006-BPara cultura celular
Unidades de filtro de 0,2 µmFisher04-977-158Para cultura celular
0,5% tripsina-EDTA (10X)ThermoFisher15400-054Para cultura celular
1 M MgCl2ThermoFisherAM9010Para lise & purificação por afinidade
1 M Tris pH 7,5ThermoFisher15567027Para lise & purificação por afinidade
1 M Tris pH 8ThermoFisherAM9855GOpcional: para inserir FTA em um locus de proteína ribossômica endógena
Tubos de microcentrífuga de 1,5 e 2 mL, autoclavadosPara transfecção
Tubos de microcentrífuga de 1,5, 2 mL e 5 mL de ligação de proteína baixaEppendorf022431081, 022431102,
0030108302		Para lise & purificação por afinidade
Placas de cultura de tecido de 10 cmPara cultura celular
10 M NaOHMilliporeSigma72068-100MLPara lise & purificação por afinidade
Concentrado de tampão de corrida Tris/glicina/SDS 10xBio-Rad1610772Para Western blot
Incubadora de cultura de tecido de 37 °C x 2Para cultura celular. Um destes serve como a principal incubadora para cultura celular e iluminação das células transfectadas. Espaço temporário é necessário em um segundo incubadora no dia da ativação ALIBi para abrigar as células transfectadas enquanto se configura o transiluminador na incubadora principal.
Banho de água de 37 °CPara cultura celular
5 M NaClThermoFisherAM9010Para lise & purificação por afinidade
50 mM biotinaThermoFisherB20656Para lise & purificação por afinidade
Buffer Laemmli 6xFIsher50-196-784Para Western blot
Etanol 70%Para desinfecção
AcetonitrilFisherA955Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa
Kit de protease AcTEVThermoFisher12575015Para lise & purificação por afinidade
Plasmid de fragmento C-ALIBiAddgene#235615, 235636 – 235641Escala midi-prep é necessária para transfecção
Plasmid de fragmento N-ALIBiAddgene#235614, 235635, 235642, 235643Escala midi-prep é necessária para transfecção
Folha de alumínioPara lise & purificação por afinidade
Bicarbonato de amônioMilliporeSigma5.3305Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa
Anticorpo anti-FLAGMilliporeSigmaF3165Para Western blot
Anticorpo anti-GAPDHCell Signaling5174Para Western blot
Anticorpo secundário anti-mouseGE HealthcareNA931VPara Western blot
Anticorpo secundário anti-coelhoGE HealthcareNA934VPara Western blot
Anticorpo anti-Rpl12Abcamab175219Para Western blot
Anticorpo anti-Rpl31Abcamab103991Para Western blot
Anticorpo anti-Rpl5ProteinTech15430-1-APPara Western blot
Anticorpo anti-V5ThermoFisherR960-25Para Western blot
ApyraseNEBM0398LPara lise & purificação por afinidade
Beta-mercaptoetanol (55 mM)ThermoFisher21985-023Para cultura celular
Transiluminador de luz azulClare Research ChemicalDR46B (pequeno) ou DR196 (grande)Para lise & purificação por afinidade
Álbumina sérica bovina (BSA)FisherBP1600-100Para Western blot
Dicas C18 (dicas OMIX C18)AgilentA57003100Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa
Recipiente de congelamento de célulasPara cultura celular
Centrífuga adaptada para tubos cônicos de 15 mL e/ou 50 mLPara cultura celular
Centrífuga para tubos de microcentrífuga de 1,5-2 mLPara lise & purificação por afinidade. Deve ser capaz de refrigeração até 4 C e velocidades de até 17.000 g. Idealmente, está localizado em uma sala que pode ser temporariamente escurecida ao transferir tubos para dentro e para fora.
Kit Clarity ECLBio-Rad170-5061Para Western blot
Tanque de gel CriterionBio-Rad1656001Para Western blot
Gels pré-moldados Criterion TGX, 4-20%Bio-Rad5671095Para Western blot. Tamanhos e layouts de poços adicionais disponíveis
CicloheximidaMilliporeSigmaC7698-5GPara lise & purificação por afinidade
DesoxicolatoMilliporeSigmaS1827Para lise & purificação por afinidade
DitiotritolThermoFisherPIA39255Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa
DPBS, sem cálcio, sem magnésioThermoFisher14190-250Para cultura celular
FBS qualificado para ESMilliporeSigmaES-009-BPara cultura celular
EtanolGold Shield412828Para Western blot
EtanolMilliporeSigma459828Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa
Ácido fórmicoMilliporeSigmaA117Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa
Analisador de tamanho de fragmento

Referências

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