Demonstração do Transporte de Membrana de Histidina usando Sacos Invertidos de Intestino de Cabra: Uma Ferramenta Pedagógica Experiencial para Alunos de Graduação

Resumo

Aqui, relatamos um método barato e reprodutível que demonstra o transporte de histidina por membrana em um intestino de cabra. Esse processo ocorre pelo co-transporte de íons histidina e sódio possibilitados pelo gradiente de sódio através da membrana do enterócito. Este método explora a pedagogia da aprendizagem experiencial para entender melhor o movimento do soluto através das membranas biológicas.

Resumo

A histidina é um aminoácido essencial que também é um precursor de metabólitos implicados no sistema imunológico, ventilação pulmonar e circulação vascular. A absorção da histidina dietética depende em grande parte do transporte de aminoácidos neutros acoplados ao sódio pelo transportador de aminoácidos neutros largos (B⁰AT) presente na membrana apical do enterócito. Aqui, demonstramos a absorção de histidina pelos enterócitos das vilosidades intestinais a partir do lúmen usando sacos invertidos jejunais de cabra. Os sacos jejunais expostos a concentrações variáveis de sódio e histidina foram testados para determinar a concentração de histidina no interior dos sacos em função do tempo. Os resultados mostram absorção ativa de histidina. O aumento da concentração de sal resultou em maior absorção de histidina, sugerindo um sporte de absorção de sódio e histidina nos sacos invertidos intestinais de cabras. Este protocolo pode ser aplicado para visualizar a mobilidade intestinal de aminoácidos ou outros metabólitos com modificações apropriadas. Propomos este experimento como uma ferramenta pedagógica experiencial que pode ajudar os alunos de graduação a compreender o conceito de transporte de membrana.

Introdução

As células biológicas são circundadas por uma bicamada lipídica de membrana que separa o citosol intracelular do conteúdo extracelular. A membrana serve como uma barreira semipermeável que regula o movimento dos solutos¹. O transporte através das membranas biológicas é afetado pelo coeficiente de permeabilidade de um soluto, que depende de vários fatores, incluindo a concentração e a carga do soluto. Em geral, os solutos se movem através da membrana usando três mecanismos (Figura 1): difusão passiva, difusão facilitada e transporte ativo². A difusão simples é o processo pelo qual solutos solúveis, não carregados e apolares passam por seu gradiente de concentração através de uma membrana semipermeável (Figura 1A). As proteínas de membrana não auxiliam nesse processo, pois envolve o movimento de solutos de uma região de maior concentração para uma região de menor concentração. A taxa de difusão é baseada na Lei de Fick³. Por outro lado, a difusão facilitada é um transporte dependente de proteínas em que a membrana permite que apenas solutos seletivos passem por um gradiente de concentração sem o gasto de energia (Figura 1B). Este tipo de transporte é específico e difere da difusão simples por exibir cinética de saturação.

O transporte ativo é um transporte dependente de proteínas de moléculas contra seu gradiente de concentração, ou seja, da região de menor concentração para uma região de maior concentração com o uso de ATP ou gradientes de íons (Figura 1C). Quando o transportador hidrolisa ATP, o transporte é denominado transporte ativo primário (Figura 1C; painel esquerdo). Outra forma de transporte ativo é o transporte ativo secundário (Figura 1C; painel direito). No transporte ativo secundário, os solutos são movidos com base em um gradiente eletroquímico. Ocorre quando uma proteína transportadora acopla o movimento de um íon (normalmente Na⁺) em seu gradiente de concentração com o movimento de outra molécula ou um íon contra seu gradiente de concentração. Esse tipo de movimento de soluto pode ser um co-transporte (Symport) em que tanto o soluto quanto o íon se movem na mesma direção ou uma troca (Antiport), caso em que o soluto e o íon se movem em direções opostas.

Os aminoácidos e monossacarídeos dietéticos de fontes alimentares são absorvidos no intestino delgado. O intestino delgado pode ser funcionalmente dividido em três segmentos: Duodeno, Jejuno e Íleo (Figura 2). A absorção do soluto ocorre em todo o intestino delgado, com a absorção máxima ocorrendo no jejuno e na extremidade proximal do íleo. Os enterócitos intestinais são células polarizadas e as junções apertadas que conectam duas células adjacentes criam dois locais de membrana distintos - o basolateral e o local da membrana apical (Figura 2). A absorção de solutos luminais gerados pela digestão ocorre no local da membrana apical⁴.

O transporte de histidina nos enterócitos intestinais na membrana apical é um exemplo de um sporte ativo secundário dependente de sódio. Na extremidade basolateral, a histidina que entra no enterócito desce o gradiente de concentração até a circulação portal hepática. As concentrações intracelulares de sódio no interior do enterócito são mantidas em 12 mmoles/L¹, o que é menor do que as concentrações extracelulares/luminais, devido ao bombeamento ativo de sódio para fora da célula pela Na⁺ K⁺ATPase localizada na membrana basolateral (Figura 3). Na membrana apical dos enterócitos, o AT B⁰e o transportador de aminoácidos neutros em sódio (SNAT) 5 são os principais transportadores que transportam não apenas histidina, mas também aminoácidos como asparagina e glutamina em um cotransporte dependente de sódio ^5,6. Outra proteína de transporte chamada Large Amino Acid Transporter (LAT)1 presente na membrana basolateral dos enterócitos transporta grandes aminoácidos neutros, como leucina, triptofano, tirosina e fenilalanina, através da membrana⁷.

Com o objetivo de ensinar o conceito de transporte de membranas integrado a técnicas como espectrofotometria e ensaios bioquímicos de rotina por meio da pedagogia da aprendizagem experiencial, é imperativo desenvolver metodologias que possam não apenas demonstrar o conceito em termos fáceis de entender, mas também possibilitar a aprendizagem participativa para alunos de graduação. Atualmente, existem recursos limitados disponíveis para os alunos para envolvimento prático para aprender esses conceitos de bioquímica. Aqui, relatamos um protocolo simples para demonstrar o transporte de histidina através da membrana intestinal de cabra que é fácil de reproduzir em laboratórios de graduação e pode ser adaptado para avaliar o transporte de outros metabólitos também. Mais importante, o método utiliza materiais baratos em um laboratório de graduação, permitindo assim o aprendizado experimental até mesmo nos ambientes de laboratório mais simples.

Protocolo

Todo o protocolo com todas as etapas é representado como um diagrama esquemático na Figura 4. O método é adaptado de um estudo anterior usando intestinos de ratos⁸. O experimento foi realizado de acordo com as diretrizes institucionais. As amostras utilizadas neste estudo foram adquiridas de um fornecedor comercial.

CUIDADO: Use luvas durante este experimento.

1. Preparação dos sacos do Jejuno invertido

1. Pré-trate e limpe o jejuno da cabra.
   1. Adquira as entranhas de uma cabra saudável recém-sacrificada de um fornecedor licenciado.
   2. Coloque as entranhas em solução salina tampão fosfato (PBS) suficiente para que fiquem completamente imersas para limpeza.
   3. Separe o intestino delgado do intestino grosso e certifique-se de que o tecido conjuntivo externo seja removido com uma tesoura.
   4. Lave suavemente o intestino delgado com 1x PBS usando uma seringa de 10 mL, garantindo a remoção do material alimentar não digerido para obter um saco oco de intestino delgado. Repita este processo pelo menos três vezes para uma limpeza eficaz.
      NOTA: Evite usar força excessiva ou agulhas durante a lavagem. O uso da força pode resultar na perfuração das paredes intestinais e, assim, danificar os enterócitos intestinais.
   5. Meça o comprimento total do intestino delgado usando uma régua para obter as três partes: Duodeno (1/^{4 do intestino} delgado) e o restante dividido igualmente em Jejuno e Íleo.
   6. Prossiga com o experimento usando a parte do Jejuno.
2. Prepare o jejuno invertido.
   1. Limpe a parte do jejuno removendo todo o tecido conjuntivo usando uma lâmina.
   2. Corte o jejuno em porções de 12-15 cm de comprimento, lave com 1x PBS e coloque em uma placa de Petri contendo PBS.
   3. Inverta as porções do jejuno usando uma haste de vidro para permitir que a porção das vilosidades seja exposta do lado de fora.
      CUIDADO: Evite usar uma haste de vidro com bordas afiadas. Além disso, o diâmetro da haste de vidro não deve ser maior que o diâmetro do saco.
      NOTA: Neste ponto, pode-se visualizar as vilosidades sob um microscópio óptico (Figura 4).
   4. Lave suavemente as porções do jejuno invertido com 1x PBS.
   5. Verifique se há vazamentos nas laterais do jejuno invertido.
   6. Corte as porções do jejuno invertido em sacos de 5 cm de comprimento.
   7. Amarre uma extremidade com barbante e verifique novamente se há vazamentos visuais na extremidade amarrada, enchendo os sacos com PBS.
   8. Amarre a outra extremidade para criar um saco invertido vazio com vilosidades na superfície externa.
   9. Verifique novamente se há vazamentos externos dando tapinhas no saco invertido no papel de filtro.
3. Equilibre os sacos invertidos em 1x PBS.
   1. Prossiga com o experimento no mesmo dia ou armazene os sacos durante a noite em 1x PBS a 4 ° C.

2. Configuração experimental para transporte de histidina

1. Monte dois conjuntos de três tubos de 50 mL de acordo com diferentes concentrações de cloreto de sódio, conforme indicado na Tabela 1.
2. Mergulhe os sacos intestinais preparados nos tubos especificados por 30 min e 60 min para cada um dos conjuntos.
3. Após o tempo designado, esvazie a solução dentro do saco em um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mL e determine o volume.
4. Aspire o líquido para dentro do saco usando uma seringa de 2 mL. Alternativamente, desamarre uma extremidade do saco e colete o conteúdo em um novo tubo de 1,5 mL.
5. Analise 0,1 mL das amostras coletadas para estimativa de histidina e calcule a concentração usando o gráfico padrão.

3. Estimativa de histidina usando a reação de Pauly

1. Prepare uma curva padrão para histidina.
   1. Prepare soluções com concentrações variadas de histidina, conforme indicado na Tabela 2 , usando soluções de estoque de histidina (5 mM) e água.
   2. Adicione ácido sulfanílico (0,5 mL) e nitrato de sódio (0,5 mL) a cada tubo.
   3. Incube os tubos por 5 min em temperatura ambiente e, em seguida, adicione 1 mL de carbonato de sódio e etanol a cada tubo.
   4. Incubar os tubos durante 20 min à temperatura ambiente (~20 °C) e observar a absorvância no comprimento de onda de 490 nm.
   5. Traçar uma curva padrão de absorbância versus concentração de histidina .
      NOTA: Este teste para histidina é baseado na propriedade da histidina de formar um composto diazo (Figura 5).

Resultados

O fluxo de trabalho experimental para demonstrar a mobilidade intestinal da histidina através da absorção da histidina pelas vilosidades intestinais no lúmen dos sacos invertidos é ilustrado na Figura 4, Tabela 1 e Tabela 2. Três arranjos experimentais independentes foram realizados e os dados representativos são apresentados na Figura 6.

Sob as condições experimentais dadas, a estimativa de histidina usando a reação de Pauly seguiu a lei de Lambert Beer até 300 μM (Figura 6A). Este teste para histidina baseia-se no acoplamento entre aminoácidos e o íon diazônio no reagente. O reagente de Pauly tem ácido sulfanílico dissolvido em ácido clorídrico concentrado. Este ácido sofre diazotização na presença de nitrato de sódio e HCl. O sal de diazônio p-fenildiazosulfonato reage com moléculas de histidina em condições alcalinas para formar um complexo de cor vermelha escura/laranja a amarela, que pode ser lido espectrofotometricamente a 490 nm (Figura 5)⁹. Pode-se notar que este teste é administrado por histidina e tirosina. O teste usado neste estudo é uma versão ligeiramente modificada da reação original, de modo que o nitrato de sódio seja usado diretamente à temperatura ambiente (~ 20 ° C) em vez de usar nitrito de sódio em condições resfriadas⁹.

A reação positiva de Pauly observada com a amostra recuperada de dentro dos sacos invertidos ilustra a absorção de histidina através das vilosidades intestinais. A Figura 6B mostra uma correlação entre a captação de histidina e as concentrações de sódio nos enterócitos jejunais. Um aumento na absorção de histidina à medida que o tempo de incubação aumenta de 30 para 60 min é indicativo de transporte ativo secundário.

Figura 1: Diferentes tipos de transporte de membrana. Esquema mostrando os vários tipos de sistemas de transporte de membrana. (A) Difusão passiva. (B) Difusão facilitada. (C) Transporte ativo primário (esquerda) e transporte ativo secundário (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Organização dos enterócitos nas vilosidades intestinais. Esta figura se concentra no intestino delgado e ilustra as três partes distintas, ou seja, duodeno, jejuno e íleo. O intestino delgado ainda tem algumas projeções semelhantes a dedos chamadas vilosidades, que aumentam a área de superfície para absorção dos alimentos ingeridos. As microvilosidades possuem células chamadas enterócitos que contêm os transportadores específicos para absorção de aminoácidos. As junções apertadas impedem o movimento de solutos entre as células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Um enterócito com transportadores de aminoácidos. O desenho representa um enterócito mostrando as extremidades apical e basolateral. A extremidade apical possui transportadores como as proteínas B⁰AT e SNAT5, e a membrana basolateral contém o transportador LAT1. Juntas, essas proteínas são responsáveis pela captação de histidina do lúmen intestinal para a circulação portal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Representação esquemática do protocolo demonstrando o transporte de histidina por membrana usando sacos invertidos do intestino de cabra. Os intestinos de cabras foram obtidos, pré-tratados e limpos conforme descrito. Resumidamente, o jejuno foi excisado e sacos invertidos foram preparados. Esses sacos foram usados para configurar o experimento para quantificar a captação de histidina em várias concentrações de sal. As vilosidades foram visualizadas com aumento de 400x usando um microscópio de luz. O texto contém um procedimento pormenorizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Reação para o método de Pauly. O teste de Pauly envolve a formação de íons diazônio em um reagente contendo ácido sulfanílico em ácido clorídrico concentrado. Em condições alcalinas, a histidina reage com o sal de diazônio, resultando na formação de um composto de cor vermelha cuja absorbância pode ser medida a 490 nm usando um espectrofotômetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Estimativa de histidina pelo método de Pauly. (A) Curva padrão para histidina. Concentrações variadas de histidina variando de 0-300 μM foram submetidas à reação de Pauly, e o complexo formado foi medido no comprimento de onda de 490 nm. (B) O transporte de histidina nos sacos intestinais foi seguido por 30 min e 60 min na presença de 150 mM (preto sólido) e 200 mM de solução salina de NaCl (cinza sólido). A concentração de histidina no interior dos sacos invertidos foi estimada por meio da curva padrão (Figura 6A). Os valores são relatados em relação ao controle (NaCl 0 mM). Foram realizadas três réplicas técnicas, sendo apresentados dados representativos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Configuração experimental para mobilidade intestinal da histidina. Esta tabela mostra a incubação de sacos intestinais em diferentes concentrações de cloreto de sódio em dois pontos de tempo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Preparação da curva padrão para histidina. Esta tabela mostra as diferentes etapas e componentes da reação de Pauly com concentrações conhecidas de histidina variando de 0 a 300 μM. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

O transporte por membrana é um dos conceitos mais fundamentais ensinados a estudantes de graduação de todas as principais disciplinas de ciências biológicas, básicas ou aplicadas. Tradicionalmente, o movimento através das membranas tem sido visualizado usando metabólitos marcados com isótopos radioativos. No entanto, esses métodos são extremamente perigosos e inviáveis para o ensino ou aprendizagem. Embora a aprendizagem experiencial seja a melhor técnica pedagógica para entender conceitos tão complexos, é um desafio que é ainda mais agravado pela falta de infraestrutura, corantes/metabólitos caros à base de fluorescência e, o mais importante, a proibição de experimentos de dissecação em animais. Assim, há uma necessidade de desenvolver ferramentas e métodos alternativos que não sejam apenas seguros, mas também baratos e viáveis em um ambiente de laboratório de graduação. Aqui, um novo método para ensinar o transporte de membranas foi desenvolvido para alunos de graduação. O protocolo relatado, uma adaptação de Agar et al. 1954⁸, demonstra o transporte unidirecional de histidina por membrana ativa através das células do intestino de cabra. Este estudo foi realizado para demonstrar o uso de um ensaio baseado em colorimetria para visualizar a absorção de histidina através das membranas intestinais. É simples, reprodutível e compreensível para os alunos e pode ser feito em qualquer ambiente de laboratório.

O modelo de saco intestinal invertido foi desenvolvido pela primeira vez por Wilson e Wiseman¹⁰, que mais tarde foi aprimorado para aumentar a viabilidade dos tecidos. Os mecanismos e a cinética de absorção de drogas foram elucidados usando sacos intestinais invertidos¹¹. As vantagens deste modelo incluem uma grande área para absorção; no entanto, a viabilidade tecidual é um dos parâmetros limitantes. Foi relatado que o tecido intestinal permanece viável e metabolicamente ativo em condições fisiológicas por ~ 2 h¹¹. Outra ressalva potencial dessa abordagem que precisa ser levada em consideração é a incapacidade de remover a mucosa muscular e a serosa das preparações de saco invertido. A ligação de certos compostos à camada muscular pode limitar ou subestimar o transporte desses compostos. Embora o modelo do saco intestinal invertido seja sensível e específico, uma variedade de fatores pode afetar os resultados. Alguns desses fatores incluem idade, sexo, espécie, dieta e estado de doença do animal, bem como o segmento do intestino usado para análise (íleo, jejuno, duodeno e cólon). Fatores ambientais como pH, aeração e temperatura também impactariam os resultados¹².

Foi demonstrado que o atraso na coleta do intestino e o estado do animal (vivo/morto) afetam o transporte ativo nos segmentos duodenais do intestino de ratos. A colheita de animais anestesiados garante um atraso mínimo, evitando a deterioração do transportador¹³. No entanto, à luz da proibição de dissecações de animais nas universidades, intestinos de animais recém-sacrificados foram usados em nossa configuração experimental. Embora este protocolo possa ser usado com sucesso para estabelecer uma captação qualitativa de um metabólito através dos enterócitos, seu uso em estudos envolvendo cinética de transporte de membrana é limitante. A etapa mais crítica deste protocolo é a preparação bem-sucedida de sacos intestinais invertidos à prova de vazamentos com enterócitos viáveis. A natureza delicada e a viabilidade das vilosidades e dos enterócitos representam um desafio, que pode ser superado com a prática. Além disso, dado que o material de partida não é de nenhuma população animal consanguínea e singênica, a variabilidade nos resultados entre os experimentos é uma desvantagem significativa. Isso pode ser superado com o uso de várias réplicas do mesmo animal. Tendo em vista essas considerações, o método apresentado neste estudo deve ser estritamente utilizado como ferramenta pedagógica na formação prática de graduação.

O protocolo descrito foi usado com sucesso para demonstrar o transporte de histidina. A captação unidirecional de sódio e histidina nos sacos invertidos indica um tipo de transporte ativo secundário de santes. A absorção intestinal de aminoácidos neutros segue uma cinética vetorial que depende do gradiente de concentração estabelecido pela Na+ K+ ATPase. Uma configuração semelhante mantém um potencial de membrana intracelular negativo e uma concentração de sódio extracelular de 150 mM. Ambos conduzem o transporte ativo de aminoácidos neutros por B⁰AT na extremidade apical e subsequente movimento para fora do enterócito na extremidade basolateral por LAT1. Curiosamente, em concentrações mais altas de sal (200 mM), não houve diferença significativa na absorção em função do tempo. Neste ponto, não podemos comentar o motivo de tal observação; no entanto, a mesma configuração experimental pode ser expandida para incluir múltiplas concentrações de sódio com pontos de tempo variáveis e controles com 150 mM de cloreto de colina para exibir o transporte dependente de sódio e possível contribuição devido à saturação.

Em princípio, sacos jejuno invertidos de cabra/porco/rato/camundongo podem ser usados para demonstrar a absorção intestinal de uma variedade de metabólitos dietéticos, desde que haja um ensaio bioquímico para estimativa. Além disso, o efeito de outros componentes que podem interferir na absorção intestinal ou inibidores do transporte de membrana também pode ser analisado. Os sacos invertidos têm sido eficientemente utilizados como uma ferramenta na pesquisa farmacêutica para estudar a absorção in vitro de medicamentos, o metabolismo intestinal de medicamentos e o papel do transportador na absorção de medicamentos. Finalmente, esta técnica é um exemplo de demonstração ex vivo do transporte de membrana e não depende de extrato livre de células (in vitro), mas de uma amostra de tecido. No entanto, essa vantagem é compensada pela disponibilidade de intestinos de cabra/porco/rato não infectados, o que pode ser um fator limitante.

Entre as muitas ferramentas pedagógicas disponíveis para um professor aprimorar o processo de aprendizagem, a aprendizagem experiencial ou 'aprender fazendo' está uma filosofia e metodologia de ensino que é o método de instrução mais progressivo e eficaz que oferece aos alunos a oportunidade de obter uma compreensão holística dos tópicos da palestra. A aprendizagem experiencial garante o envolvimento prático dos alunos, bem como do instrutor, que fornece suporte e orientação durante esse processo de aprendizagem ativa¹⁴. Ele serve como uma excelente alternativa ao ensino teórico tradicional em sala de aula, particularmente em certos conceitos pesados e integrativos, como o transporte por membrana, que os alunos muitas vezes acham difícil de imaginar. Esses exercícios também incentivariam o aprendizado interativo e colaborativo de colegas e mentores. A presente iniciativa é um passo à frente na direção de criar e possibilitar uma experiência de aprendizagem que não seja apenas informativa, mas também memorável e possa ser transformadora para um aluno, impactando significativamente a experiência geral de aprendizagem.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	TARSONS	500020
Tubos de ensaio de 10 mL	BOROSIL	9800U04
Tubos de falcão estéreis de 50 mL	TARSONS	546041
Béquer de 500 mL	BOROSIL	10044977
Frasco cônico de 500 mL	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Espectrofotômetro Digital	SYSTRONICS	2710
Etanol	EMSURE	1009831000
Finpipetas	THERMOFISHER	4642090
Haste de Agitador de Vidro	BOROSIL	9850107
L-Histidina	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Luvas de Nitrilo	KIMTECH	112-4847
Placa de Petri	TARSONS	460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4)	SRL	95131
Pontas de Pipeta	ABDOS	P10102
Carbonato de Sódio	SRL	89382
Nitrato de Sódio	SRL	44618
Fosfato de Sódio Dibásico (anidro)	SRL	53046
Fosfato de Sódio Monobásico (anidro)	SRL	22249
Ácido Sulfânico	SRL	15354