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Summary

Aqui, relatamos um método barato e reprodutível que demonstra o transporte de histidina por membrana em um intestino de cabra. Esse processo ocorre pelo co-transporte de íons histidina e sódio possibilitados pelo gradiente de sódio através da membrana do enterócito. Este método explora a pedagogia da aprendizagem experiencial para entender melhor o movimento do soluto através das membranas biológicas.

Abstract

A histidina é um aminoácido essencial que também é um precursor de metabólitos implicados no sistema imunológico, ventilação pulmonar e circulação vascular. A absorção da histidina dietética depende em grande parte do transporte de aminoácidos neutros acoplados ao sódio pelo transportador de aminoácidos neutros largos (B⁰AT) presente na membrana apical do enterócito. Aqui, demonstramos a absorção de histidina pelos enterócitos das vilosidades intestinais a partir do lúmen usando sacos invertidos jejunais de cabra. Os sacos jejunais expostos a concentrações variáveis de sódio e histidina foram testados para determinar a concentração de histidina no interior dos sacos em função do tempo. Os resultados mostram absorção ativa de histidina. O aumento da concentração de sal resultou em maior absorção de histidina, sugerindo um sporte de absorção de sódio e histidina nos sacos invertidos intestinais de cabras. Este protocolo pode ser aplicado para visualizar a mobilidade intestinal de aminoácidos ou outros metabólitos com modificações apropriadas. Propomos este experimento como uma ferramenta pedagógica experiencial que pode ajudar os alunos de graduação a compreender o conceito de transporte de membrana.

Introduction

As células biológicas são circundadas por uma bicamada lipídica de membrana que separa o citosol intracelular do conteúdo extracelular. A membrana serve como uma barreira semipermeável que regula o movimento dos solutos¹. O transporte através das membranas biológicas é afetado pelo coeficiente de permeabilidade de um soluto, que depende de vários fatores, incluindo a concentração e a carga do soluto. Em geral, os solutos se movem através da membrana usando três mecanismos (Figura 1): difusão passiva, difusão facilitada e transporte ativo². A difusão simples é o processo pelo qual solutos solúveis, não carregados e apolares passam por seu gradiente de concentração através de uma membrana semipermeável (Figura 1A). As proteínas de membrana não auxiliam nesse processo, pois envolve o movimento de solutos de uma região de maior concentração para uma região de menor concentração. A taxa de difusão é baseada na Lei de Fick³. Por outro lado, a difusão facilitada é um transporte dependente de proteínas em que a membrana permite que apenas solutos seletivos passem por um gradiente de concentração sem o gasto de energia (Figura 1B). Este tipo de transporte é específico e difere da difusão simples por exibir cinética de saturação.

O transporte ativo é um transporte dependente de proteínas de moléculas contra seu gradiente de concentração, ou seja, da região de menor concentração para uma região de maior concentração com o uso de ATP ou gradientes de íons (Figura 1C). Quando o transportador hidrolisa ATP, o transporte é denominado transporte ativo primário (Figura 1C; painel esquerdo). Outra forma de transporte ativo é o transporte ativo secundário (Figura 1C; painel direito). No transporte ativo secundário, os solutos são movidos com base em um gradiente eletroquímico. Ocorre quando uma proteína transportadora acopla o movimento de um íon (normalmente Na⁺) em seu gradiente de concentração com o movimento de outra molécula ou um íon contra seu gradiente de concentração. Esse tipo de movimento de soluto pode ser um co-transporte (Symport) em que tanto o soluto quanto o íon se movem na mesma direção ou uma troca (Antiport), caso em que o soluto e o íon se movem em direções opostas.

Os aminoácidos e monossacarídeos dietéticos de fontes alimentares são absorvidos no intestino delgado. O intestino delgado pode ser funcionalmente dividido em três segmentos: Duodeno, Jejuno e Íleo (Figura 2). A absorção do soluto ocorre em todo o intestino delgado, com a absorção máxima ocorrendo no jejuno e na extremidade proximal do íleo. Os enterócitos intestinais são células polarizadas e as junções apertadas que conectam duas células adjacentes criam dois locais de membrana distintos – o basolateral e o local da membrana apical (Figura 2). A absorção de solutos luminais gerados pela digestão ocorre no local da membrana apical⁴.

O transporte de histidina nos enterócitos intestinais na membrana apical é um exemplo de um sporte ativo secundário dependente de sódio. Na extremidade basolateral, a histidina que entra no enterócito desce o gradiente de concentração até a circulação portal hepática. As concentrações intracelulares de sódio no interior do enterócito são mantidas em 12 mmoles/L¹, o que é menor do que as concentrações extracelulares/luminais, devido ao bombeamento ativo de sódio para fora da célula pela Na⁺ K⁺ATPase localizada na membrana basolateral (Figura 3). Na membrana apical dos enterócitos, o AT B⁰e o transportador de aminoácidos neutros em sódio (SNAT) 5 são os principais transportadores que transportam não apenas histidina, mas também aminoácidos como asparagina e glutamina em um cotransporte dependente de sódio ^5,6. Outra proteína de transporte chamada Large Amino Acid Transporter (LAT)1 presente na membrana basolateral dos enterócitos transporta grandes aminoácidos neutros, como leucina, triptofano, tirosina e fenilalanina, através da membrana⁷.

Com o objetivo de ensinar o conceito de transporte de membranas integrado a técnicas como espectrofotometria e ensaios bioquímicos de rotina por meio da pedagogia da aprendizagem experiencial, é imperativo desenvolver metodologias que possam não apenas demonstrar o conceito em termos fáceis de entender, mas também possibilitar a aprendizagem participativa para alunos de graduação. Atualmente, existem recursos limitados disponíveis para os alunos para envolvimento prático para aprender esses conceitos de bioquímica. Aqui, relatamos um protocolo simples para demonstrar o transporte de histidina através da membrana intestinal de cabra que é fácil de reproduzir em laboratórios de graduação e pode ser adaptado para avaliar o transporte de outros metabólitos também. Mais importante, o método utiliza materiais baratos em um laboratório de graduação, permitindo assim o aprendizado experimental até mesmo nos ambientes de laboratório mais simples.

Protocol

Todo o protocolo com todas as etapas é representado como um diagrama esquemático na Figura 4. O método é adaptado de um estudo anterior usando intestinos de ratos8. O experimento foi realizado de acordo com as diretrizes institucionais. As amostras utilizadas neste estudo foram adquiridas de um fornecedor comercial. CUIDADO: Use luvas durante este experimento. 1. Preparação dos sacos do Jejuno invertido Pré-trate e limpe o jejuno da cabra.Adquira as entranhas de uma cabra saudável recém-sacrificada de um fornecedor licenciado. Coloque as entranhas em solução salina tampão fosfato (PBS) suficiente para que fiquem completamente imersas para limpeza. Separe o intestino delgado do intestino grosso e certifique-se de que o tecido conjuntivo externo seja removido com uma tesoura. Lave suavemente o intestino delgado com 1x PBS usando uma seringa de 10 mL, garantindo a remoção do material alimentar não digerido para obter um saco oco de intestino delgado. Repita este processo pelo menos três vezes para uma limpeza eficaz.NOTA: Evite usar força excessiva ou agulhas durante a lavagem. O uso da força pode resultar na perfuração das paredes intestinais e, assim, danificar os enterócitos intestinais. Meça o comprimento total do intestino delgado usando uma régua para obter as três partes: Duodeno (1/4 do intestino delgado) e o restante dividido igualmente em Jejuno e Íleo. Prossiga com o experimento usando a parte do Jejuno. Prepare o jejuno invertido.Limpe a parte do jejuno removendo todo o tecido conjuntivo usando uma lâmina. Corte o jejuno em porções de 12-15 cm de comprimento, lave com 1x PBS e coloque em uma placa de Petri contendo PBS. Inverta as porções do jejuno usando uma haste de vidro para permitir que a porção das vilosidades seja exposta do lado de fora.CUIDADO: Evite usar uma haste de vidro com bordas afiadas. Além disso, o diâmetro da haste de vidro não deve ser maior que o diâmetro do saco.NOTA: Neste ponto, pode-se visualizar as vilosidades sob um microscópio óptico (Figura 4). Lave suavemente as porções do jejuno invertido com 1x PBS. Verifique se há vazamentos nas laterais do jejuno invertido. Corte as porções do jejuno invertido em sacos de 5 cm de comprimento. Amarre uma extremidade com barbante e verifique novamente se há vazamentos visuais na extremidade amarrada, enchendo os sacos com PBS. Amarre a outra extremidade para criar um saco invertido vazio com vilosidades na superfície externa. Verifique novamente se há vazamentos externos dando tapinhas no saco invertido no papel de filtro. Equilibre os sacos invertidos em 1x PBS.Prossiga com o experimento no mesmo dia ou armazene os sacos durante a noite em 1x PBS a 4 ° C. 2. Configuração experimental para transporte de histidina Monte dois conjuntos de três tubos de 50 mL de acordo com diferentes concentrações de cloreto de sódio, conforme indicado na Tabela 1. Mergulhe os sacos intestinais preparados nos tubos especificados por 30 min e 60 min para cada um dos conjuntos. Após o tempo designado, esvazie a solução dentro do saco em um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mL e determine o volume. Aspire o líquido para dentro do saco usando uma seringa de 2 mL. Alternativamente, desamarre uma extremidade do saco e colete o conteúdo em um novo tubo de 1,5 mL. Analise 0,1 mL das amostras coletadas para estimativa de histidina e calcule a concentração usando o gráfico padrão. 3. Estimativa de histidina usando a reação de Pauly Prepare uma curva padrão para histidina.Prepare soluções com concentrações variadas de histidina, conforme indicado na Tabela 2 , usando soluções de estoque de histidina (5 mM) e água. Adicione ácido sulfanílico (0,5 mL) e nitrato de sódio (0,5 mL) a cada tubo. Incube os tubos por 5 min em temperatura ambiente e, em seguida, adicione 1 mL de carbonato de sódio e etanol a cada tubo. Incubar os tubos durante 20 min à temperatura ambiente (~20 °C) e observar a absorvância no comprimento de onda de 490 nm. Traçar uma curva padrão de absorbância versus concentração de histidina .NOTA: Este teste para histidina é baseado na propriedade da histidina de formar um composto diazo (Figura 5).

Representative Results

O fluxo de trabalho experimental para demonstrar a mobilidade intestinal da histidina através da absorção da histidina pelas vilosidades intestinais no lúmen dos sacos invertidos é ilustrado na Figura 4, Tabela 1 e Tabela 2. Três arranjos experimentais independentes foram realizados e os dados representativos são apresentados na Figura 6. Sob as condições exp…

Discussion

O transporte por membrana é um dos conceitos mais fundamentais ensinados a estudantes de graduação de todas as principais disciplinas de ciências biológicas, básicas ou aplicadas. Tradicionalmente, o movimento através das membranas tem sido visualizado usando metabólitos marcados com isótopos radioativos. No entanto, esses métodos são extremamente perigosos e inviáveis para o ensino ou aprendizagem. Embora a aprendizagem experiencial seja a melhor técnica pedagógica para en…

Materials

1.5 mL Microcentrifuge Tubes	TARSONS	500020
10 mL Test Tubes	BOROSIL	9800U04
50 mL Sterile Falcon Tubes	TARSONS	546041
500 mL Beaker	BOROSIL	10044977
500 mL Conical Flask	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Digital Spectrophotometer	SYSTRONICS	2710
Ethanol	EMSURE	1009831000
Finpipettes	THERMOFISHER	4642090
Glass Stirrer Rod	BOROSIL	9850107
L-Histidine	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Nitrile Gloves	KIMTECH	112-4847
Petri Dish	TARSONS	460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4)	SRL	95131
Pipette Tips	ABDOS	P10102
Sodium Carbonate	SRL	89382
Sodium Nitrate	SRL	44618
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous)	SRL	53046
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous)	SRL	22249
Sulphanilic Acid	SRL	15354