Artigo de método

Estudando o movimento dentário ortodôntico em camundongos

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DOI:

10.3791/66884

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2 de agosto de 2024

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1Department of Oral Diagnosis and Pathology, School of Dentistry, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry, Universidade Federal de Minas Gerais, 3Department of Physiology and Biophysics, Biological Science Institute, Universidade Federal de Minas Gerais, 4Private Clinic, 5Department of Metallurgical and Materials Engineering, School of Engineering, Universidade Federal de Minas Gerais, 6Laboratory of Immunopharmacology, Department of Biochemistry and Immunology, Biological Science Institute, Universidade Federal de Minas Gerais, 7Department of Orthodontics, School of Dental Medicine, University of Pittsburgh, 8Department of Oral Surgery, Pathology and Clinical Dentistry, School of Dentistry, Universidade Federal de Minas Gerais

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a movimentação dentária ortodôntica (MOT), servindo como um modelo adequado para investigar os mecanismos de adaptação óssea, reabsorção radicular e a resposta das células ósseas a estímulos mecânicos. Este guia abrangente fornece informações detalhadas sobre o modelo OTM, aquisição de microtomografia computadorizada e análise subsequente.

Resumo

A movimentação dentária ortodôntica (MOT) representa um processo dinâmico no qual o osso alveolar sofre reabsorção nos locais de compressão e deposição nos locais de tensão, orquestrados por osteoclastos e osteoblastos, respectivamente. Esse mecanismo serve como um modelo valioso para estudar vários aspectos da adaptação óssea, incluindo a reabsorção radicular e a resposta celular a estímulos de força mecânica. O protocolo descrito aqui oferece uma abordagem direta para investigar OTM, estabelecendo 0,35 N como a força ideal em um modelo de camundongo empregando uma mola helicoidal de níquel-titânio (NiTi). Utilizando análise de microtomografia computadorizada, quantificamos a OTM avaliando a discrepância na distância linear na junção cimento-esmalte. A avaliação também incluiu uma análise da reabsorção radicular inflamatória induzida por ortodontia, avaliando parâmetros como densidade mineral radicular e a porcentagem de volume radicular por volume total. Este protocolo abrangente contribui para o avanço de nossa compreensão dos processos de remodelação óssea e aumenta a capacidade de desenvolver estratégias eficazes de tratamento ortodôntico.

Introdução

A remodelação óssea é um processo contínuo orquestrado por osteoclastos, osteoblastos, células de revestimento ósseo e osteócitos, essenciais para manter a integridade do esqueleto adulto 1,2. Impulsionado principalmente pela diferenciação e atividade de osteoclastos e osteoblastos, esse processo dinâmico envolve a reabsorção e deposição do osso, desencadeada por estresse mecânico e carga 3,4,5.

Experimentos com animais desempenham um papel fundamental na elucidação dos intrincados mecanismos biológicos e celulares que sustentam o movimento dentário ortodôntico (OTM)6,7. Esse processo envolve uma gama diversificada de tipos de células, como osteoblastos, osteoclastos, osteócitos, fibroblastos e células imunes como macrófagos e células T, situadas no maxilar e no ligamento periodontal 7,8. Essas células respondem dinamicamente a estímulos mecânicos e mudanças no meio local, influenciando a composição e a arquitetura do osso circundante 7,8. Além disso, eles também desencadeiam uma resposta inflamatória em nível celular, embora não haja patógenos presentes. Essa resposta inflamatória desempenha um papel no aumento da renovação do tecido ósseo9.

Vários modelos animais, incluindo camundongos, ratos, coelhos, cães e macacos, têm sido utilizados em estudos experimentais de OTM 7,8,10. Dentre estes, os roedores, particularmente os camundongos, são favorecidos para investigar as fases iniciais da movimentação dentária e da remodelação óssea6. Pesquisas anteriores enfatizaram as vantagens do uso de modelos de camundongos em relação aos modelos de ratos, principalmente devido à ampla disponibilidade de cepas geneticamente modificadas, permitindo a exploração detalhada das influências genéticas na OTM 7,11. Atualmente, dois modelos principais são empregados para induzir a movimentação dentária em camundongos. O primeiro método consiste na inserção de uma mola helicoidal de níquel-titânio (NiTi) entre o primeiro molar superior e os incisivos superiores 4,12. A segunda abordagem envolve a colocação de uma faixa elástica dentro do espaço interdental entre o primeiro e o segundo molares superiores13. Os desfechos primários analisados geralmente incluem a magnitude da movimentação dentária e a microarquitetura óssea, preferencialmente avaliada por meio de microtomografia computadorizada (micro-CT)14. Idealmente, avaliar a integridade das raízes dentárias é importante para garantir que as forças apropriadas sejam empregadas para produzir OTM4.

Embora a micro-CT seja amplamente reconhecida como o padrão-ouro para avaliar a microarquitetura de tecidos mineralizados14, a ausência de metodologias e protocolos padronizados para escaneamento, análise e relatório de dados muitas vezes apresenta desafios para discernir os procedimentos precisos empregados, interpretar os resultados e facilitar comparações entre diferentes modelos OTM 14,15.

Aqui, apresentamos um guia passo a passo para o modelo de camundongo OTM, incluindo aquisição de micro-CT e análise de OTM, microestrutura óssea e raízes dentárias. Este método envolve a aplicação de força mecânica controlada ao primeiro molar para induzir o movimento dentro do maxilar. A seleção desse método decorre de vários fatores, incluindo viabilidade, relevância e precisão. Essa abordagem permite uma análise quantitativa detalhada, fornecendo informações valiosas sobre os processos biológicos subjacentes ao movimento dentário ortodôntico e facilitando o desenvolvimento de estratégias de tratamento ortodôntico aprimoradas no futuro.

Protocolo

Todos os procedimentos seguiram rigorosamente os padrões éticos estabelecidos pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Minas Gerais (nº 166/2022). Antes de cada experimento, um cálculo do tamanho da amostra é obrigatório. Use camundongos C57BL6 / J machos de 8 a 10 semanas de idade, pesando aproximadamente 20 a 30 g. Os ratinhos devem ser alojados numa gaiola dentro de uma sala mantida a 25 °C, respeitando um ciclo de 12 h de luz/12 h de escuridão. Após a fixação da bobina, o animal deve ser alimentado com uma dieta leve. O monitoramento diário deve incluir avaliações do peso corporal e da saúde geral.

1. Remodelação óssea alveolar induzida mecanicamente

  1. Usando um alicate de corte distal, corte a mola helicoidal aberta de NiTi de 0,25 x 0,76 polegadas nas seguintes dimensões de seis voltas e duas extremidades em forma de laço posicionadas perpendicularmente à mola usando um alicate Weingart ortodôntico.
  2. Molde o fio redondo de cromo-níquel (CrNi) de 0,20 mm de diâmetro na configuração desejada com extremidades em forma de laço usando uma pinça Mathieu e um instrumento redondo como referência de tamanho.
  3. Junte as extremidades em forma de laço da bobina e o fio CrNi redondo de 0,20 mm.
  4. Anestesiar o animal com uma injeção intraperitoneal de 0,2 mL de solução contendo xilazina (10 mg/Kg) e cetamina (100 mg/Kg). Antes de iniciar o procedimento, avalie a profundidade da anestesia usando o reflexo pedal. Aperte cuidadosamente um dos dedos do animal com uma pinça. A ausência de reflexo indica um plano adequado de anestesia geral. Para evitar lesões na córnea e dor pós-operatória, aplique um lubrificante ocular após a anestesia do animal.
  5. Posicione o animal em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica, imobilizando seus membros para restringir o movimento e permitir o acesso intraoral.
  6. Utilize um abridor de boca, feito de fio de 0,50 mm de diâmetro e preso com um fio de 0,08 mm, para facilitar a visualização completa e evitar o movimento da cabeça. Use o lado direito como lado experimental (lado OTM) e o lado esquerdo como controle sem bobina ortodôntica (lado controle).
    NOTA: A visualização aprimorada das estruturas intraorais deve ser obtida usando um estereomicroscópio e um sistema óptico de luz.
  7. Limpe e condicione as superfícies do primeiro molar e incisivo direito usando acetona e um primer autocondicionante, respectivamente. O sistema é autocondicionante, o que significa que não requer condicionamento ácido prévio.
    1. Aplique o primer em uma única etapa, que também funciona simultaneamente como ácido e adesivo. Usando um microbrush, colete uma pequena quantidade de primer autocondicionante e aplique-o na superfície oclusal do primeiro molar superior e dos incisivos. Deve-se ter cuidado nesta etapa para garantir que o primer autocondicionante não atinja a superfície proximal entre o primeiro e o segundo molares, pois isso pode fazer com que os elementos dentários grudem, impedindo a movimentação dentária. Fotopolimerize o primer na superfície oclusal dos molares e incisivos por 30 s.
  8. Cole a extremidade distal de uma mola helicoidal aberta de NiTi de seis alças à superfície oclusal do primeiro molar maxilar direito com resina fotopolimerizável e fotopolimerizável por 30 s. Adicione mais incremento de resina na borda do fio para evitar danos aos camundongos e fotopolimerize por 30 s.
  9. Ative a bobina usando um aparelho especificamente projetado que consiste em um mecanismo de trilho e manivela preso à mesa cirúrgica. Isso permite que o movimento longitudinal deslize para frente e para trás.
  10. Conecte a extremidade livre em forma de laço do fio redondo de 0.20 mm ao gancho do medidor de tensão.
  11. Ao acionar a manivela, mova a mesa cirúrgica ao longo do trilho até que o dinamômetro registre uma força de 0,35 N.
  12. Cole o fio redondo de 0.20 mm em ambos os incisivos superiores para ancorar a bobina. Nenhuma reativação adicional é realizada durante o período experimental. Corte o fio para separar o animal do dinamômetro.  Adicione outro incremento de resina para que a borda de metal do dispositivo não fique exposta e não machuque o animal. Fotopolimerização por 30 s. Desmonte o animal da mesa.
  13. O primeiro molar superior direito com um dispositivo que impõe uma força de 0,35 N na direção mesial consiste no lado experimental. Use o lado esquerdo da maxila (sem aparelho ortodôntico) como controle 4,16.
  14. Faça a manutenção deste dispositivo por um período de 12 dias sem necessidade de ativação. Não use nenhum medicamento para controle da dor. O movimento ortodôntico ocorre por meio de um processo inflamatório, e a medicação para aliviar a dor pode afetar negativamente a cascata do ácido araquidônico, impactando a taxa de remodelação óssea e potencialmente invalidando os resultados.
  15. Após o término da cirurgia, trate os animais com uma injeção subcutânea de soro fisiológico para evitar a desidratação durante o período de adaptação com o dispositivo. Mantenha o animal em gaiola individual com aquecimento até que esteja totalmente recuperado e somente após esse período coloque o animal em gaiolas coletivas.
  16. Eutanasiar o camundongo no12º dia realizado por sedação com injeção intraperitoneal de uma solução de 0,2 mL contendo xilazina (10 mg/Kg) e cetamina (100 mg/Kg) seguida de decapitação com tesoura afiada.

2. Medições de micro-CT

  1. Colha o osso maxilar com tesoura afiada cortando todo o tecido mole, o osso zigomático no plano sagital e a sutura frontonasal e a sincondrose esfeno-occipital no plano coronal. Mergulhe o osso maxilar em formalina tamponada neutra a 10% (pH = 7,4) por um período de fixação de 48 h. Após este período, troque a solução de formaldeído para álcool 70%.
  2. Realize a microtomografia computadorizada do osso maxilar com os seguintes parâmetros para exames de alta resolução: tamanho de voxel isotrópico de 9 a 18 μm, configurações de raios-X de 50 kV, filtro de alumínio de 0,5 mm e ângulo de rotação de 0,5°. Mais de uma mandíbula pode ser ajustada durante a microtomografia computadorizada.
  3. Reconstruir as imagens adquiridas utilizando o programa de reconstrução por microtomografia indicado pelo fabricante da microtomografia computadorizada (microCT) utilizada17.
  4. Posicione as imagens reconstruídas usando o programa de inspeção 3D indicado pelo fabricante da microtomografia utilizada.
  5. Quantifique a OTM medindo a diferença na distância linear entre a junção cimento-esmalte (CEJ) do primeiro e segundo molares da hemimaxila direita (lado OTM) em relação à hemimaxila esquerda (lado controle). Utilize o software analisador microCT adequado com a ferramenta de linha para esta medição 17,18,19,20.
  6. Verifique as amostras quanto à presença de reabsorção radicular inflamatória induzida por ortodontia (OIIRR). Selecione a região de interesse (ROI) da raiz disto-vestibular do primeiro molar superior usando um método de contorno de região de interesse anatômica irregular desenhada manualmente. Meça os seguintes parâmetros: densidade mineral radicular (RMD; g/cm3) e porcentagem do volume radicular por volume total (VR/VC; %). Utilize o software analisador microCT adequado com a ferramenta volumétrica 3D para esta medição16,21.
  7. Realizar a reconstrução do primeiro molar superior usando o software Mimics e analisar os dados obtidos para tirar conclusões sobre OTM e OIIRR no modelo experimental16,21.

Resultados

Este protocolo permite a investigação de um modelo de camundongo OTM usando uma mola helicoidal de NiTi. Com uma força de 0,35 N aplicada, a distância média da CEJ no lado controle entre o primeiro e o segundo molares foi de 243,69 μm (Figura 1A, linha A), enquanto no lado OTM foi medida em 284,66 μm (Figura 1A, linha B). A diferença entre os lados OTM e controle foi de 40,97 μm (Figura 1B). A distância linear entre a JCE entre o primeiro e o segundo molares da hemimaxila direita (lado OTM) e a hemimaxila esquerda (lado controle) foi medida em pelo menos seis seções diferentes com a ferramenta de linha usando o software analisador microCT adequado. O valor médio das seis medidas do lado OTM foi subtraído do valor médio do lado controle para gerar o resultado OTM (Figura 1).

Em relação ao OIIRR, os valores de VD/VC e RMD odontológicos foram demonstrados tanto no lado controle (71,02 ± 10,11% e 1,071 ± 0,1536 g/cm2, respectivamente) quanto no lado OTM (73,38 ± 6,162% e 1,048 ± 0,2119 g/cm2 μm, respectivamente; Figura 2).

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Figura 1: Movimento dentário ortodôntico (OTM). (A) Imagem representativa dos lados de controle e OTM. (B) Resultados da distância CEJ dos lados de controle e OTM e a diferença entre a distância resultante da distância OTM. Uma força de 0,35 N foi aplicada no sentido mesial do primeiro molar superior direito usando uma mola helicoidal de NiTi, e o desfecho do estudo foi o 12º dia. Média ± desvio padrão dos resultados OTM gerados a partir de 10 camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagem representativa da região de interesse (ROI) selecionada. Mostra-se a ROI da raiz disto-vestibular do primeiro molar superior, que foi selecionada utilizando-se uma região anatômica irregular de interesse desenhada pelo método de contorno manual para análise da densidade mineral radicular (RMD; g/cm3) e porcentagem do volume radicular por volume total (VR/VC; %). Os resultados da média ± do desvio padrão foram gerados a partir de 10 camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo padronizado projetado para elucidar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à remodelação óssea durante a OTM. Uma compreensão completa desses mecanismos em camundongos requer um protocolo meticulosamente planejado para garantir precisão e confiabilidade 7,11. Estudos conduzidos por nosso grupo de pesquisa mostraram que este protocolo reduz efetivamente a variabilidade do operador ao incorporar um medidor de tensão e um aparelho especialmente projetado, estabelecendo 0,35 N como a força ideal para OTM em um modelo de camundongo 4,16,17,18,19,20 . Para melhorar a eficácia dos procedimentos experimentais e maximizar o uso de amostras de animais, os espécimes utilizados para análise de micro-TC também podem ser submetidos a processamento para histologia de rotina. Posteriormente, a OTM pode ser avaliada em cortes de 5 μm, utilizando o CEJ como ponto de referência para medidas 16,19. A coloração de hematoxilina e eosina, juntamente com técnicas especializadas, como fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e tricrômico de Masson, também servem como métodos eficazes para avaliar a integridade radicular e quantificar osteócitos, osteoclastos e osteoblastos nas regiões de interesse 4,5,16.

As alterações dinâmicas na microestrutura do osso alveolar durante a OTM em roedores têm sido investigadas usando sistemas de micro-CT. Essas avaliações visam oferecer informações valiosas para o tratamento ortodôntico clínico14,15. Micro-CT é uma técnica analítica capaz de capturar estruturas internas com alta resolução e precisão em nível de mícron. Este método permite a reconstrução de espécimes em pequena escala em imagens 3D detalhadas, permitindo análises qualitativas e quantitativas precisas das amostras22. Consistente com estudos anteriores, a OTM foi avaliada quantificando a discrepância linear entre a JCE do primeiro e segundo molares da hemimaxila direita em comparação com a hemimaxila esquerda 17,18,19,20. No contexto da imagem dentária, a micro-CT apresenta várias vantagens. Pode identificar pequenos defeitos nas superfícies radiculares, medir com precisão as alterações dentárias lineares e avaliar a morfologia do osso trabecular e cortical22,23. Vale ressaltar que a diretriz atual para avaliação da microestrutura óssea em roedores por meio de micro-CT enfatiza o conjunto mínimo de variáveis recomendadas para descrever a morfometria óssea trabecular e cortical23. Além disso, é fundamental analisar a ocorrência de OIIRR, uma complicação grave durante o tratamento ortodôntico16,21. Os pesquisadores devem avaliar a intensidade da reabsorção radicular, pois a presença de OIIRR indica que a força aplicada pode ser excessiva, necessitando de ajustes16,21.

Aderir a etapas críticas na pesquisa de OTM em modelos animais é essencial para obter resultados confiáveis. Isso inclui a seleção cuidadosa dos animais, considerando fatores como tensão, idade, metabolismo ósseo, taxa de crescimento e histórico genético. A escolha dos modelos animais influencia significativamente os resultados do estudo, pois variações nesses fatores afetam a fisiologia óssea e a resposta às forças ortodônticas6. O tempo de eutanásia dos animais também é crítico porque captura estágios específicos da remodelação óssea em resposta às forças ortodônticas. Por exemplo, Taddei et al.4 realizaram análise molecular em 0, 12 e 72 horas, com análise histopatológica em 6 dias, permitindo a avaliação de alterações temporais nos marcadores de remodelação óssea durante a MOT. Além disso, variações relacionadas à idade na OTM foram investigadas, lançando luz sobre como o envelhecimento afeta os processos de remodelação óssea23.

O uso de uma mola helicoidal de NiTi, embora eficaz na indução do movimento dentário, apresenta certas desvantagens que podem afetar o bem-estar animal e os resultados experimentais. A inserção de uma mola helicoidal de NiTi é considerada mais demorada e tecnicamente exigente em comparação com métodos alternativos, como o uso de faixas elásticas7. Esse aumento da complexidade pode levar a um maior risco de lesão durante a inserção, o que, por sua vez, pode resultar em efeitos adversos, como maior perda de peso corporal após o procedimento e elevada taxa de mortalidade entre os animais7. Em nossa experiência, o monitoramento diário dos animais e a implementação de medidas de suporte, como ração amolecida, provaram ser fundamentais para minimizar os efeitos adversos associados ao uso de molas helicoidais de NiTi para OTM em modelos animais. Essas medidas não apenas contribuem para o bem-estar dos animais, mas também aumentam a confiabilidade e a validade dos resultados experimentais, reduzindo fatores de confusão e garantindo consistência nos protocolos de pesquisa 4,16,17,18,19,20.

O emprego de OTM em camundongos, combinado com a análise de micro-CT, oferece um modelo adequado para sondar mecanismos de adaptação óssea, reabsorção radicular e respostas celulares a estímulos de força mecânica. Essa abordagem integrada fornece informações valiosas sobre os intrincados processos subjacentes ao tratamento ortodôntico e facilita o desenvolvimento de novas estratégias e intervenções terapêuticas.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos sinceramente à Srta. Beatriz M. Szawka por sua contribuição ao diagrama esquemático e à Sra. Ilma Marçal de Souza por seu apoio técnico. J.A.A.A. é bolsista concedida pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, E-26/200.331/2024), Brasil. Este estudo foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (406928/2023-1), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Código de Finanças 001), Brasil. Os autores agradecem ao Prof. Dr. Eduardo H. M. Nunes, do LabBio/UFMG, pela análise da microtomografia de raios X.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alicate deAcetona Sigma-Aldrich67-64-1
QuinelatoQO.700.00
DinamômetroSHIMPOFGE-5XY
Iluminador de Fibra ÓpticaCole-ParmerN/A
cetaminaSyntec100477-72-3
NiTi mola de bobina aberta 0,25 x 0,76Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm redondo cromo-níquel (CrNi)Morelli55.01.208
Redondo CrNi Duro Elástico Ortodôntico Fio Ø 0.50 mm (.020 polegada)Morelli55.01.050
Fio de Amarração Redondo CrNi Ø 0,20 mm (0,008 polegada)Morelli55.01.208
EstereomicroscópioQuimisQ7740SZ
Transbond Plus Primer Auto-Condicionante3MLE-Q100-1004-7
Alicate WeingartQuinelatoQO.120.00
XylazineSyntec23076-35-9
Análise MicroCT
Skyscan 1174v2Bruker1174v2
Software
NReconSkyscanN/A
DataViewerSkyscanN/A
CTAnSkyscanN/A
ImitaMaterializarN/A
corte distal

Referências

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