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Artigo de método

Um modelo de lesão pulmonar aguda após isquemia-reperfusão visceral por pinçamento cruzado aórtico supracelíaco em ratos

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DOI:

10.3791/66896

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15 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Rouen University Hospital, 2INSERM U1096, FHU REMOD-VHF, Rouen University Hospital

Neste artigo

Resumo

Este estudo descreve um modelo de lesão pulmonar aguda após isquemia-reperfusão visceral durante pinçamento cruzado da aorta supracelíaca por laparotomia em ratos. Permite a investigação dos efeitos clínicos e biológicos do pinçamento aórtico, bem como o impacto da isquemia-reperfusão nos órgãos subjacentes e lesões pulmonares remotas.

Resumo

A cirurgia aberta para aneurismas da aorta abdominal requer interrupção transitória da circulação sanguínea, causando isquemia-reperfusão dos órgãos a jusante. Artérias renais, mesentéricas e esplâncnicas podem estar envolvidas. Nenhuma terapia se mostrou eficaz na prevenção de lesão pulmonar remota causada por isquemia-reperfusão após pinçamento aórtico supracelíaca. Para estudar as vias fisiopatológicas da lesão pulmonar aguda e os tratamentos farmacológicos, um modelo experimental de pinçamento aórtico foi desenvolvido em ratos.

Analgesia subcutânea com buprenorfina (0,05 mg/kg) é administrada antes do procedimento. A anestesia geral com ventilação espontânea é induzida com gás halogênio (isoflurano 2,5%) por meio de uma máscara. Uma laparotomia xifopúbica é realizada em uma mesa aquecida (temperatura monitorada por via intrarretal). O bloqueio gastroesplênico e os intestinos são retraídos para o flanco direito e o fígado é mobilizado para a parte superior do abdômen. O diafragma e seus pilares são identificados para permitir a liberação passo a passo da aorta supracelíaca de sua passagem intradiafragmática. A dissecção é realizada suavemente para obter o controle circunferencial da aorta entre os pilares do diafragma. O tronco celíaco subjacente e a artéria mesentérica superior são cuidadosamente identificados. Uma pinça microvascular pode ser usada para oclusão aórtica acima das artérias viscerais. O pinçamento adequado é verificado pela ausência de pulsatilidade aórtica, associada à palidez do intestino delgado. O rato permanece anestesiado durante toda a duração da isquemia. Ao final da duração da isquemia, o microclamp é removido e a pulsatilidade aórtica, bem como a recoloração intestinal, são verificadas. A parede abdominal é fechada com uma sutura, seguida pelo fechamento da pele do rato. Ao final do período de reperfusão, o animal é anestesiado da mesma maneira. É sacrificado por exsanguinação durante a amostragem de sangue, e o pulmão pode então ser coletado. A lesão pulmonar pode ser avaliada por meio de gasometria, gravimetria pulmonar e exame histológico. As amostras de pulmão também podem ser utilizadas para análises de RT-PCR e Western blot.

Introdução

Um aneurisma da aorta é uma dilatação focal e permanente da aorta1. A evolução de um aneurisma tende à ruptura, associada a hemorragia maciça, que acarreta mortalidade significativa2. Portanto, o foco do tratamento está na prevenção dessa complicação dramática. Os aneurismas da aorta são mais frequentemente infrarrenais e podem ser tratados com endoprótese aórtica. Uma endoprótese aorto-bi-ilíaca é um stent bifurcado coberto que é introduzido de forma minimamente invasiva através das artérias femorais usando uma abordagem percutânea. Esta técnica não requer pinçamento aórtico e evita causar isquemia visceral. Pode ser realizado sob anestesia local. Em contraste, aneurismas da aorta mais extensos - como aneurismas toracoabdominais e aneurismas complexos da aorta abdominal - são mais difíceis de tratar usando técnicas endovasculares. Isso se deve ao envolvimento das artérias renais, da artéria mesentérica superior e do tronco celíaco dentro do segmento aneurismático (Figura 1). Essas artérias viscerais principais devem ser reconstruídas, além da própria aorta. A abordagem endovascular, minimamente invasiva, portanto, requer um procedimento mais complexo envolvendo o uso de endopróteses fenestradas e/ou ramificadas para reconstrução da artéria visceral. A principal limitação dessas endopróteses é o longo tempo de fabricação - muitas vezes vários meses - tornando-as inadequadas para tratamento de emergência. Nesses casos, o reparo cirúrgico aberto convencional continua sendo uma opção viável e confiável.

O tratamento por reparo aberto requer laparotomia e pinçamento supravisceral, ou seja, isquemia visceral temporária. A taxa de complicações é alta durante o tratamento desses aneurismas toracoabdominais. A mortalidade varia de 5 a 15%3. As complicações pulmonares ocorrem em 60% e as renais em 40%4. Essas complicações, associadas a uma resposta inflamatória sistêmica, podem evoluir para falência multivisceral5. Essa morbimortalidade é multifatorial, envolvendo agressão cirúrgica, anestesia, analgesia, variações hemodinâmicas, choque hemorrágico e fenômenos de isquemia-reperfusão. A agressão cirúrgica contribui para a manifestação de complicações, sejam elas toracotomias, frenotomias, lombotomias ou laparotomias, modificando a mecânica ventilatória, com comprometimento da função diafragmática6.

A reperfusão temporária da isquemia visceral afeta órgãos a jusante, incluindo o trato digestivo, o sistema esplâncnico, os rins e os membros inferiores7. As complicações pulmonares são os eventos adversos mais frequentes após a cirurgia da aorta toracoabdominal. Sua origem é multifatorial. O pinçamento aórtico supracelíaco não causa diretamente isquemia-reperfusão pulmonar. No entanto, a isquemia-reperfusão dos órgãos viscerais a jusante desencadeia uma importante resposta inflamatória sistêmica. A hipótese de um nexo causal entre isquemia-reperfusão visceral e a ocorrência de lesão remota - particularmente dano pulmonar - é bem apoiada. A disfunção endotelial pulmonar, um componente crítico da membrana alvéolo-capilar, parece ser central para o desenvolvimento da Lesão Pulmonar Aguda (LPA). Uma resposta inflamatória sistêmica maciça e a ativação de neutrófilos desempenham um papel fundamental nesse processo.

A LPA é frequentemente definida com base em critérios histológicos e não na apresentação clínica. LPA refere-se a um distúrbio inflamatório agudo caracterizado pela ruptura das barreiras endoteliais e epiteliais pulmonares. A membrana alvéolo-capilar, unidade funcional do pulmão, consiste em três componentes: o endotélio microvascular, o espaço intersticial e o epitélio alveolar.

Uma marca registrada da LPA é o aumento da permeabilidade dessa barreira, impulsionado pela infiltração de neutrófilos e pela liberação de mediadores pró-inflamatórios citotóxicos. O dano epitelial alveolar envolve pneumócitos do tipo I e do tipo II. As células do tipo I, que cobrem 95% da superfície alveolar, são altamente suscetíveis a lesões e desempenham um papel fundamental nas trocas gasosas. As células do tipo II, mais numerosas, mas cobrindo uma área menor, são essenciais para a produção de surfactantes, reparo epitelial e transporte de íons. Após a lesão, as células do tipo II contribuem para a restauração da integridade alveolar por meio de sua capacidade regenerativa e diferenciação em células do tipo I.

Múltiplas vias de morte celular foram implicadas na lesão epitelial durante a LPA, sendo as células do tipo I particularmente vulneráveis. A LPA é comumente avaliada pela avaliação do edema pulmonar, com ou sem medidas de permeabilidade microvascular para refletir a disfunção endotelial.

O objetivo deste modelo é investigar a relação entre isquemia-reperfusão visceral e o desenvolvimento de lesão pulmonar remota, tanto no nível metabólico quanto no mecanicista, conforme ilustrado na Figura 2. Essa conexão específica permanece apenas parcialmente compreendida. Nosso modelo de pinçamento aórtico representa um cenário de isquemia-reperfusão visceral em uma aorta saudável, sem a presença de um aneurisma de aorta abdominal em ratos. Acima do tronco celíaco, não há ramos principais em humanos ou ratos. A aorta acima desse nível corresponde à aorta supra-cœlíaca, que dá origem apenas a pequenos ramos parietais que suprem a parede torácica. Portanto, não há diferença significativa na anatomia vascular dos principais vasos nesse nível entre humanos e ratos.

O uso deste modelo permite uma exploração extensiva. Isso ajudará a identificar biomarcadores precoces no desenvolvimento de lesão tecidual remota. Além disso, esse modelo permite o estudo de potenciais inibidores, incluindo inibidores de mediadores circulantes ou inibidores de lesões específicas de órgãos remotos.

Outros modelos de isquemia-reperfusão são usados para estudar lesões remotas. Modelos de isquemia-reperfusão cerebral, intestinal e renal estão fortemente representados 8,9,10. Há extensas pesquisas sobre danos pulmonares após isquemia-reperfusão intestinal devido à oclusão transitória da artéria mesentérica superior (AMS)11,12,13. As durações de isquemia e reperfusão são extremamente variáveis, variando de minutos a várias horas14,15. A justificativa para a duração da isquemia é induzir agressão suficiente para desencadear uma resposta significativa que leve à ocorrência de lesões remotas. Uma duração muito curta de isquemia pode não causar uma alteração significativa na via metabólica estudada. Em relação à duração da reperfusão, a justificativa está no início precoce das lesões remotas e na natureza potencialmente transitória das alterações fisiopatológicas. A duração ideal da reperfusão não deve ser muito precoce ou muito tardia para caracterizar adequadamente o comprometimento metabólico.

Os modelos são principalmente em roedores. As vantagens dos roedores incluem seu pequeno tamanho, facilidade de manutenção, ciclo de vida curto e recursos genéticos abundantes16. O uso de animais de grande porte, como porcos, cães ou primatas, não parece justificado na ausência de benefícios adicionais, o que se alinha com as regras éticas da experimentação animal em relação ao refinamento. Além disso, devido à sua semelhança anatômica, fisiológica e genética com os humanos, os roedores permitem estudos translacionais16.

Uma das principais limitações dos modelos de clampeamento da AMS é que, na prática clínica, o início do período de isquemia intestinal não é identificável. Isso torna a extrapolação para situações clínicas humanas mais incerta. Em contraste, durante a cirurgia aórtica complexa, os períodos de isquemia e reperfusão de diferentes órgãos são claramente identificados. Além disso, durante o pinçamento aórtico supracelíaca, todas as vísceras subjacentes estão em período isquêmico (trato digestivo, fígado, baço, rins, órgãos pélvicos e membros inferiores). Todos esses órgãos sofrem o fenômeno de isquemia-reperfusão. Por outro lado, modelos de isquemia-reperfusão focados em um órgão específico (intestino, rim, fígado, etc.), modelos de pinçamento aórtico e, portanto, de isquemia-reperfusão de múltiplos órgãos com fisiopatologia metabólica são menos estudados. Da mesma forma, lesões remotas, como lesões pulmonares após pinçamento aórtico, são pouco estudadas em termos de metabolismo17,18.

Os modelos existentes de pinçamento aórtico são focados principalmente no clampeamento da aorta abdominal abaixo das artérias renais. A limitação desse modelo é que ele não induz isquemia-reperfusão visceral. Portanto, não permite a demonstração de uma ligação entre isquemia-reperfusão visceral e possíveis lesões remotas18,19. Além disso, não existe um modelo in vitro que permita o estudo da isquemia-reperfusão por pinçamento aórtico, razão pela qual a análise com modelos in vivo continua sendo necessária.

Portanto, este modelo experimental de pinçamento aórtico supracelíaco em ratos facilita uma investigação abrangente dos mecanismos fisiopatológicos e intervenções farmacológicas direcionadas a lesões pulmonares remotas.

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Protocolo

A criação deste modelo está em conformidade com as diretrizes para cuidados e experimentação animal, bem como com a legislação francesa e europeia. Este modelo foi validado em um estudo experimental em animais que foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Regional da Normandia, Rouen, França (n°APAFIS: #18974).

1. Modelo animal e aclimatação

  1. Período de adaptação do modelo animal
    NOTA: O modelo segue os princípios de refinamento.
    1. Animais domésticos em instalações não superlotadas por uma semana para permitir a adaptação antes da cirurgia.
    2. Alojar os ratos dois por gaiola com acesso ad libitum a água e comida, que serão verificados diariamente por pessoal experiente.
    3. Verifique a limpeza da roupa de cama (tiras de papel) diariamente e troque sistematicamente por pessoal experiente duas vezes por semana ou mais, se necessário.
    4. Após um período de aclimatação de uma semana, durante o qual eles terão contato diário com o experimentador e exposição a ciclos de iluminação de 12 horas, os procedimentos ocorrerão em uma sala separada e silenciosa com o mesmo experimentador.
  2. Espécie modelo animal
    1. Utilizar ratos Wistar ou Sprague Dawley machos para evitar influências hormonais, como o estradiol, na análise da fisiopatologia de isquemia-reperfusão visceral de um criadouro credenciado e certificado11,20.
    2. Determinar previamente os grupos experimentais e o número de animais por grupo.
    3. Escolha a idade, ratos de 6 a 10 semanas (350 g) são recomendados para uso.

2. Anestesia e analgesia

  1. Analgesia
    1. Pese cada animal no dia do procedimento.
    2. Administre buprenorfina (0,05 mg / kg) por via subcutânea ao nível da pele posterior do rato 1 h antes do procedimento para fins analgésicos com agulha 25-G e seringa de 2 mL.
    3. Aplique o gel de cloridrato de lidocaína 1% na pele do abdômen ao nível da futura incisão na pele. Reavalie a dor regularmente (pelo menos duas vezes ao dia) no pós-operatório usando uma escala para avaliar as expressões faciais de dor no rato21.
    4. Administre durante as primeiras 24 h, injeções subcutâneas sistemáticas de buprenorfina (0,01 a 0,05 mg / kg) a cada 8 h.
    5. Em seguida, administrar injeções de buprenorfina (0,01 a 0,05 mg/kg) com base na escala de dor facial do Centro Nacional de Substituição, Refinamento e Redução de Animais em Pesquisa, e repetidas a cada 8 h, se necessário21.
  2. Anestesia geral
    1. Use gases halogenados (isoflurano) para anestesia geral22.
    2. Use uma câmara ventilada com isoflurano (5%) a uma taxa de fluxo de ar de 2 L / min por 2 min para a fase de indução.
    3. Para manutenção da anestesia, troque o rato por uma máscara personalizada para ventilação espontânea com isoflurano (2-2,5%) a uma taxa de fluxo de ar de 2 L/min durante toda a cirurgia.
    4. Limpe as vias aéreas superiores movendo a língua para fora da cavidade oral para permitir a ventilação através da máscara.
    5. Monitore continuamente a profundidade da anestesia durante o procedimento e ajuste a concentração de isoflurano conforme necessário.

3. Colocação do rato durante o procedimento

  1. Coloque o rato em decúbito dorsal com os membros anteriores e posteriores imobilizados com fita adesiva, respeitando as amplitudes de movimento articulares fisiológicas do rato.
  2. Colocar o rato numa almofada de aquecimento regulada para 37 °C com monitorização da temperatura rectal.
  3. Proteja os olhos aplicando dacriogel. Raspe o pelo abdominal e desinfete completamente o abdômen com solução de iodopovidona.

4. Procedimento cirúrgico

  1. Condição do procedimento cirúrgico
    1. Realize o procedimento sob uma lupa microcirúrgica para facilitar manobras delicadas, embora não seja indispensável.
  2. Incisão
    1. Após a palpação do processo xifóide na borda superior da incisão, incisar a pele no centro do abdome, revelando a linha alba dos músculos abdominais.
    2. Incisão central do músculo abdominal na linha alba para evitar sangramento dos músculos abdominais.
  3. Exposição intra-abdominal
    1. Mantenha a parede abdominal em ambos os lados com afastadores auto-retentores.
    2. Garanta a ausência de anomalias (tumores), mobilize as vísceras, estômago, baço e fígado para o lado direito do abdômen e, em seguida, exponha a aorta supracelíaca.
    3. Manteve todas as vísceras dentro do abdômen o máximo possível por meio de uma pequena compressa dobrada longitudinalmente e embebida em solução salina morna (37 ° C).
    4. Cobrir todas as vísceras com uma compressa embebida em solução salina aquecida a 37 °C, para evitar hipotermia e desidratação.
  4. Identificação dos principais vasos intra-abdominais
    1. Identifique a aorta supracelíaca por suas pulsações e sua localização entre os pilares diafragmáticos.
    2. Controle da aorta entre os pilares diafragmáticos com dissecção suave e cuidadosa usando aplicadores com ponta de algodão e pinça dissecante para liberar a aorta da forma mais atraumática possível.
    3. Circundar a aorta supracelíaca usando uma sutura monofilamentar 5-0 com uma pinça de dissecação e ligadura.
    4. Verifique a origem do tronco celíaco e da artéria mesentérica subjacente. A duração deste procedimento cirúrgico é de 10 a 15 minutos por rato.
    5. A identificação subjacente da veia cava inferior sub-renal é fácil devido à transparência do retroperitônio.
    6. Libere a veia cava inferior sub-renal apenas em sua superfície anterior, o que permite a administração intravenosa direta de qualquer agente farmacológico.
  5. Injeção intravenosa
    1. Para isso, use uma agulha 30-G para injeção e coloque alguns milímetros de compressa hemostática para obter hemostasia.
    2. Se estiver realizando pré-condicionamento farmacológico, administre a injeção antes do pinçamento aórtico. Para tratamento pós-condicionamento, administre-o durante ou após o pinçamento aórtico.
    3. Este protocolo estudou o pré-condicionamento farmacológico, portanto, administre 5 min antes do pinçamento aórtico.
  6. Período isquêmico
    1. Clampeie a aorta celíaca com um clamp microvascular atraumático durante todo o período isquêmico de 40 minutos. Verifique a eficácia do clamp pelo desaparecimento das pulsações aórticas subjacentes e pela descoloração das vísceras e membros várias vezes durante o clampeamento.
    2. Feche parcialmente o abdômen com três suturas absorvíveis trançadas simples 5-0 para limitar a perda de água e calor. Cubra a incisão cirúrgica com uma compressa estéril embebida em solução salina morna durante toda a duração da isquemia.
  7. Período de reperfusão
    1. No final do período isquêmico, reabra o abdômen e exponha a aorta da mesma maneira descrita anteriormente.
    2. Remova o grampo vascular e verifique a retomada da pulsatilidade aórtica subjacente e a recoloração das vísceras e membros. O período de reperfusão começa imediatamente após a remoção do microclamp.
  8. Fechamento do abdômen
    1. Retorne as vísceras à sua posição original e feche o abdômen com uma sutura absorvível trançada 5-0 na linha alba e a pele com uma sutura absorvível monofilamentar 5-0.
  9. Despertar animal
    1. Colocar o rato em decúbito lateral esquerdo para evitar a compressão da veia cava inferior pela massa visceral e pelo contexto de hipovolemia. Coloque o rato em uma gaiola individual com uma lâmpada de calor para manter a temperatura até o despertar, aproximadamente 10 minutos depois.
  10. Segunda anestesia geral
    1. Ao final do período de reperfusão de 180 min, anestesiar o rato com a mesma anestesia gasosa através de câmara ventilada com isoflurano (5%) a uma taxa de fluxo de ar de 2 L/min por 2 min para a fase de indução.
    2. Para manutenção da anestesia, troque o rato por uma máscara personalizada para ventilação espontânea com isoflurano (2-2,5%) a uma taxa de fluxo de ar de 2 L / min durante todo o período de coleta de tecido.

5. Amostragem

  1. Amostras de sangue
    1. Colete amostras de sangue usando uma agulha de 23 G e uma seringa de 5 mL por punção direta na veia cava inferior abaixo das veias renais.
    2. Obtenha hemostasia após a punção aplicando um pequeno pedaço de compressa hemostática.
    3. Use uma pequena porção (100 μL) do sangue total para análise de gás e sangue padrão em um único cartão de teste de temperatura ambiente.
    4. Colete o sangue total restante em um tubo de EDTA de 4 mL e centrifugue-o a 1.000 × g por 10 min a +4 ° C.
    5. Congelar o plasma em criotubos em azoto líquido e conservar a -80 °C até à análise.
  2. Amostras de tecido
    1. Amostragem de tecido
      1. Colete amostras de tecido (pulmão, intestino, rim, fígado e coração) durante a eutanásia do animal. Realizar a eutanásia por coleta de sangue levando à exsanguinação após anestesia geral com isoflurano de acordo com o mesmo protocolo mencionado anteriormente.
      2. Através do abdômen aberto, colha 50 mg de cada tecido: o polo superior do rim esquerdo, o lobo hepático esquerdo e o intestino delgado distal 1 cm antes do ceco.
      3. Em seguida, faça uma esternotomia mediana rapidamente para identificar o coração e os pulmões.
      4. Libere o pulmão esquerdo de seu ligamento e remova-o inteiramente para análise histológica. Liberte o pulmão multilóbulo direito de seus ligamentos. Separe o lobo anterior para análises de ácidos nucléicos e proteínas, armazene o restante em um copo com soro fisiológico a 37 ° C por alguns minutos para posteriormente realizar gravimetria.
      5. Extraia o coração como um bloco inteiro com seções da aorta, artéria pulmonar e ambas as veias cavas. Colher uma amostra de um pedaço do ventrículo esquerdo para análises de ácidos nucleicos e proteínas, armazenar o restante num copo com soro fisiológico a 37 °C durante alguns minutos para posteriormente realizar a gravimetria.
    2. Análise de ácidos nucleicos
      1. Para análise de ácidos nucleicos, coletar imediatamente uma porção de 50 g de tecido. Congelá-lo em nitrogênio líquido e armazená-lo a -80 °C até a análise.
      2. Extrair RNA total com reagente pronto para uso para o isolamento de RNA total de alta qualidade de acordo com o protocolo do fabricante.
      3. Determine a concentração e a pureza do RNA com um espectrofotômetro. Meça a concentração de RNA usando 2 μL de amostra, com 2 μL de água livre de RNase como referência em branco. Utilizar a absorvância a 260 nm para determinar a concentração de ARN.
        NOTA: A pureza aceitável do RNA foi definida como uma taxa de absorbância de 260/280 e 260/230 variando entre 1,7 e 2,0.
      4. Use 1 μg de cada amostra de RNA para transcrição reversa.
      5. Meça os níveis de mRNA de citocinas pró-inflamatórias (IL-1beta, TNF-alfa, IL-6) e uma referência interna (beta2-microglobulina), por reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) em um ciclador de bloco térmico rápido, baseado em placa, com recursos integrados de detecção on-line em tempo real usando mistura de reação de início a quente pronta para uso (os primers estão listados na Tabela 1).
      6. Calcule o nível relativo de mRNA usando o método 2-ΔΔCT.
    3. Análise de proteínas
      1. Para análise de proteínas, coloque 50 mg de tecido em um tubo de lise de 2 mL contendo cinquenta esferas de cerâmica de óxido de zircônio de 2,8 mm. Este tubo de lise contém 1 mL de tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) com um comprimido inibidor de protease e um comprimido inibidor de fosfatase.
      2. Extrair proteína das amostras por homogeneização no moinho de tubos de laboratório com 3 repetições de verificação de 5 s, seguidas de um período de repouso de 10 s.
      3. Centrifugar as amostras a 10.000 g a +4 °C durante 10 min e armazenar os sobrenadantes em tubos criogênicos a -20 °C até à análise.
      4. Determine as concentrações de proteínas com um ensaio de proteína baseado no método de Bradford e mantenha as amostras a -80 °C.
      5. Separe uma quantidade igual de proteínas de cada amostra usando SDS-PAGE.
      6. Transfira proteínas separadas em membranas de nitrocelulose de 0,2 μm.
      7. Incube a membrana após o bloqueio com 5% de leite em pó desnatado TBS-Tween por 1 h, com um anticorpo primário contra a proteína específica de escolha. Por exemplo, para explorar a heparanase, use um anticorpo primário policlonal de coelho contra a heparanase humana (diluição 1:2000) e uma proteína de controle como GAPDH, use um anticorpo primário monoclonal de cabra contra GAPDH (diluição 1:5000) durante a noite a 4 ° C.
      8. Lave os borrões três vezes com tampão TBST-Tween 0,1%.
      9. Incubar com um anticorpo secundário conjugado com HRP dirigido contra o anticorpo primário à temperatura ambiente (RT) durante 1 h em solução de bloqueio. Por exemplo, para explorar a heparanase, use o anticorpo secundário de cabra contra coelho (diluição 1:5000) e para explorar GAPDH, use o anticorpo secundário de coelho contra cabra (diluição 1:10000).
      10. Detecte os complexos imunes usando o sistema de detecção de quimioluminescência aprimorada (ECL).
      11. Analisar as membranas usando software dedicado para determinar os valores densitométricos das bandas alvo, usando GAPDH como controle interno. Realize a análise densitométrica da banda correspondente à heparanase (50 kDa) e normalize-a para a banda da proteína GAPDH (35 kDa) para determinar a intensidade relativa do sinal.
    4. Análise histológica
      1. Para análise histológica, retire o pulmão unilobar esquerdo no hilo e, em seguida, infunda através do brônquio principal esquerdo com uma solução de criopreservação usando um cateter 16 G. Congele-o em nitrogênio líquido e armazene-o a -80 °C.
    5. Análise gravimétrica
      1. Após as amostras para análise de ácidos nucléicos e proteínas, analisar-se a porção remanescente do coração e pulmão multilobular direito por gravimetria, com dessecação em fornos a 70°C, permitindo que a relação peso úmido/seco forneça uma estimativa do edema tecidual.

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Resultados

Este protocolo mostrou-se seguro, com perdas mínimas de animais (menos de 5%) durante a anestesia e cirurgia, e eficaz para a indução de lesão pulmonar aguda. A anestesia com isoflurano foi mais segura do que a cetamina combinada com a anestesia com xilazina (perda de aproximadamente 15%), com despertar rápido e melhor recuperação do rato (dados não mostrados). Todos os animais anestesiados foram capazes de realizar pinçamento aórtico seguro e eficaz com este método. Todos os animais (100%) com pinçamento aórtico efetivo...

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Discussão

Este modelo cirúrgico de pinçamento aórtico oferece a vantagem de permitir uma análise abrangente, tanto tecidual quanto plasmática, da lesão pulmonar aguda após isquemia-reperfusão visceral. Também oferece a oportunidade de testar moléculas farmacológicas com administração intraperitoneal, enteral ou intravenosa no pré ou pós-condicionamento.

Uma das etapas críticas continua sendo o pinçamento aórtico supracelíaco durante a cirurgia. Quando dominado, esta eta...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 µ m membranas de nitrocelulose Trans-Blot Turbo Transfert PackBio-Rad16201500,2 µ M Membranas de nitrocelulose pré-cortadas
Seringa Luer Slip 1cc sem agulhaTerumoMDSS01SESeringa Luer Slip 1cc sem agulha
Seringa Luer Slip 2cc sem agulhaBecton DinckinsonSeringa Luer Slip 2cc sem agulha
Tubo EDTA de 4 mL BD K3 13 mm x75 mmBD VacutainerBD368860Tubo EDTA de 5 mL BD K3 13 mm x 75 mm
Sutura trançada 5-0 / Vicryl 5-0 (Ethicon) ou Novosyn (B. Braun)Ethicon - Johnson e JohnsonV7970EVicryl 5-0 Agulha Ponta Cônica 1/2 círculo 13 mm Comprimento 45 cm
5-0 sutura absorvível monofilamentar / Monocryil PoliglecaproneEthicon - Johnson e JohnsonY493GAgulha 3/8 círculo Comprimento 18in
Seringa Luer Slip 5cc sem agulhaTerumoSS-05LE1Seringa Luer Slip 5cc sem agulha
Braçadeira microvascular atraumática / braçadeiras de vasos descartáveis para veiasAROSurgicalTKF-1-20gPinça microvascular atraumática para uso venoso para pinçar a aorta de rato
BD Microlance 3 23 G x 1 0,6 x 25 mmBD Vacutainer300800BD Microlance 3 23 G x 1 0,6 x 25 mm
BD Microlance 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mmBD Vacutainer300600BD Microlance 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mm
BD Microlance 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mmBD Vacutainer304000BD Microlance 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mm
beta-actina InvitrogenCarlsbad, Estados Unidos15G5A11/E2
Ensaio de proteína do método baseado em BradfordBiorad, Marnes-la-Coquette, França5000201
BuprenorfinaBuprenorfina
Centrífuga Sigma 3-30Sigma, Alemanha10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014Centrifugador para eppendorf
Mini completoRoche11836153001Coquetel de Inibidores de Protease 25 Comprimidos
Cotonete
Dacriogel /  Gel ocular Lubrithal 10 gDechra Produtos veterináriosCódigo  ACL7376464Gel ocular Lubrithal 10 g
Bisturi descartávelSupremoPDSS11Lâmina de bisturi descartável n° 11
EletrocautérioDentRMedEMB/87400Caneta hemostática com alta temperatura
Sistema de detecção de ECL aprimoradoBiorad, Hércules, Califórnia, EUA1705060S
Moinho de Contas Fisherbrand 24Fisher científico15515799Usado para  moagem, lise e homogeneização de amostras biológicas antes da extração molecular
Cotonetes de gaze Rafin.010106Cotonetes de gaze 
Software ImageLabTMBioradem unidade USB ou licença
Isoflurano 5%Isoflurano 5%
Lidocaína Prilocaína gel 5% Aguettant, Lyon, FrançaLidocaína Prilocaína gel 5% 
Instrumento LightCycler 480Roche, Bâ le, suíço5015243001termociclador
Geléia Lubrificante Estéril K-Y 82 gRECKITT BENCKISERGeléia Lubrificante Estéril K-Y 82 g
NanoDrop 2000TermoScientific, Waltham, Massachusetts, EUAND-2000espectrofotômetro
Peha Pince anatômicoHartmann991063Alicate anatômico
PhosSTOPRoche4906837001Inibidor de Fosfatase 20 comprimidos 
Gesso/Fita adesivaAnaporo135320Fita adesiva cirúrgica/gesso
Solução de iodopoviona / Vé té Solução dineVé toquinolSolução antisséptica para uso externo
Kit de Lysing Precellys tubo Homogeneização de tecidos duros CK28, BertinCK28Kit de Lysing Precellys tubo 
Prolè sutura de prolipropilenoEthicon - Johnson e Johnson7472HProlè ne 5-0 Agulha Corte cônico 3/8 círculo 13 mm Comprimento 75 cm
Tubos Safe-Lock 1,5 mLEppendorf.0030120086Tubos Safe-Lock 1.5cc sem cor 1000 tubos para centrifugação
Tubos Safe-Lock 2 mLEppendorf.0030120094Tubos Safe-Lock 2.0cc sem cor 1000 tubos para centrifugação
Tubos Safe-Lock 5 mLEppendorf.0030119401Tubos Safe-Lock 5.0cc sem cor 200 tubos para centrifugação
Solução salina NaCl 0,9%Aguettant, Lyon, França600502Solução salina 0,9% 500 mL
PÁGINA SDSSigma-Alrich
Cateter Surflash IV 16 GTerumoSR * FF1651
SurgicelEthicon - Johnson e JohnsonCotonetes reabsorvíveis hemostáticos
Conjunto de sutura n° 12Hartmann4701762Conjunto estéril de sutura com campeão de adesina, cisores, alicate Adson, porta-agulha
SYBR Verde KIT Light Cycler 480 SYBR Verde I MasternRoche4707516001SYBR Verde
TBST-Tween 0,1% de buffer Sigma-Alrich
Cartões de teste Epoc 24 cartões 13 parâmetrosSiemens-Healthineers
Tecido TEKSakura FinetecSolução de criopreservação 
Reagente TRIzol InvitrogenThermo Fisher Scientific, Carlsbad, Califórnia, EUA15596026Reagente de TRIzol

Referências

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