Extração aprimorada de DNA de baixo peso molecular de águas residuais para avaliação abrangente da resistência antimicrobiana

Resumo

Aqui, apresentamos uma técnica simples para avaliar a resistência antimicrobiana ambiental (AMR), aumentando a proporção de DNA extracelular de baixo peso molecular. O tratamento prévio com 20%-30% de PEG e 1,2 M NaCl permite a detecção de genes de AMR genômicos e transferidos horizontalmente. O protocolo se presta a um processo sem kit com otimização adicional.

Resumo

A vigilância ambiental é reconhecida como uma importante ferramenta de avaliação da saúde pública na era pós-pandemia. A água, em particular as águas residuais, surgiu como a fonte de escolha para amostrar as cargas de patógenos no meio ambiente. As águas residuais de drenos abertos e estações de tratamento de água comunitárias são um reservatório de patógenos e genes de resistência antimicrobiana (AMR) e frequentemente entram em contato com humanos. Embora existam muitos métodos de rastreamento de AMR da água, isolar DNA de boa qualidade com alto rendimento de amostras heterogêneas continua sendo um desafio. Para compensar, os volumes de amostra geralmente precisam ser altos, criando restrições práticas. Além disso, o DNA ambiental é frequentemente fragmentado e as fontes de AMR (plasmídeos, fagos, DNA linear) consistem em DNA de baixo peso molecular. No entanto, poucos processos de extração se concentraram em métodos para extração de alto rendimento de DNA linear e de baixo peso molecular. Aqui, um método simples para extração linear de DNA de alto rendimento de pequenos volumes de águas residuais usando as propriedades de precipitação do polietilenoglicol (PEG) é relatado. Este estudo defende o aumento do rendimento geral de DNA de amostras de água coletadas para análises metagenômicas, enriquecendo a proporção de DNA linear. Além disso, o aprimoramento do DNA de baixo peso molecular supera o problema atual de subamostragem de AMR ambiental devido ao foco no DNA intracelular e de alto peso molecular. Espera-se que este método seja particularmente útil quando existe DNA extracelular, mas em baixas concentrações, como com efluentes de estações de tratamento. Também deve melhorar a amostragem ambiental de fragmentos do gene AMR que se espalham por meio da transferência horizontal de genes.

Introdução

O SARS-CoV-2 e suas consequências sublinharam a importância da vigilância ambiental no monitoramento e previsão de surtos de doenças infecciosas ^1,2. Embora as pandemias virais sejam aparentes, o aumento da resistência antimicrobiana (RAM) é frequentemente descrito como uma pandemia insidiosa e que constitui uma das principais preocupações de saúde pública em todo o mundo ^3,4. Consequentemente, há uma necessidade urgente de estratégias coordenadas para entender a evolução e a disseminação da RAM. Corpos d'água, assim como águas residuais, podem servir ....

Protocolo

1. Amostragem de águas residuais

1. Mergulhe um béquer de polipropileno de 500 mL no reservatório aberto do dreno ou da estação de tratamento de esgoto (STP) e colete ~ 300 mL de amostra de águas residuais.
2. Transfira ~ 250 mL da amostra para um frasco de polipropileno autoclavado de 250 mL.
3. Enrosque a tampa da garrafa e feche-a com um filme plástico. Mantenha a garrafa na posição vertical em um saco fechado.
4. Transporte a amostra na vertical em um recipiente fechado à temperatura ambiente.
5. Inativar a amostra a 70 °C em estufa de ar quente durante 4 h antes de a processar para extração de ADN.

Resultados

Estabelecimento de um protocolo para extração de DNA de alto rendimento de amostras de águas residuais
Uma versão modificada de protocolos previamente estabelecidos foi usada para a extração de DNA e RNA de alta qualidade de amostras de água¹⁷. As amostras foram provenientes de drenos abertos, bem como de estações de tratamento de esgoto na região de Delhi-NCR, no norte da Índia. Após o pré-processamento utilizando PEG e NaCl (

Discussão

A RAM é uma das 10 principais ameaças à saúde atualmente, conforme listado pela OMS, e a vigilância ambiental da RAM é reconhecida como uma ferramenta importante em todo o mundo. Conforme mencionado na introdução, um registro abrangente de AMR ambiental inclui DNA de baixo peso molecular, fragmentado e extracelular. O protocolo de pré-processamento relatado aqui usando uma alta concentração de PEG combinado com sal (30% de PEG e 1,2 M de NaCl) alcança esse resultado enriquecendo a proporção de DNA de baixo peso molecular.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microcentrífuga de 24 lugares	Eppendorf Centrifuge 5425 R	EP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Etanol absoluto para análise)	Supelco	100983-0511
Avarose	Invitrogen	16500500
Centrífuga refrigerada de bancada	Eppendorf Centrifuge 5920 R	EP5948000131
ChemiDoc Imaging System	BioRad	12003153
DNeasy PowerSoil Pro Kit	Qiagen	47014
DNeasy PowerWater Kit Pro	Qiagen	14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Cada,0.2 mL, R0191)	Thermo Fisher	R0191
DreamTaq DNA Polimerase, 5 U/µ L + 10x DreamTaq Buffer*	Thermofscientific	EP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder	Invitrogen	10488091
Maxiamp Tubos de PCR 0,2 mL	Tarsons	510051
Molecular Grau de Água para PCR	HiMedia	ML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Espectrofotômetro	Thermo Scientific	13400519
Parafilm	Bemis	S37440
PEG-8000	SRL	54866
QIAquick PCR & Kit de limpeza de gel	Qiagen	28506
Qubit 4 Fluorômetro (com WiFi)	Thermofisher	Q33238
Qubit Tubos de ensaio	Thermofisher	Q32856
Qubitt kit de reagentes para ds DNA, ampla gama	Thermo Scientific	Q32853 (500 ensaios)
Cloreto de sódio	HiMedia	TC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel Stain	Termociclador Invitrogen	S33102
T100	BioRad	1861096
Termociclador (Sistema de PCR ProFlex 3 x 32 poços)	de		Applied Biosystems
	Promega	A1125

Kit Purificação de DNA Genômico 4484073 Wizard da