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Elucidando # 946; -1,3-glucanase e propriedades físico-químicas da peroxidase do mecanismo de defesa da parede celular do trigo contra a infestação por Diuraphis noxia

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DOI:

10.3791/66903

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26 de julho de 2024

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1Carbohydrates and Enzymology Laboratory (CHEM-LAB), Department of Plant Sciences, University of the Free State, 2Faculty of Natural and Agricultural Sciences, Department of Plant Science, Botany, Plant Biochemistry and Physiology, University of the Free State, 3Agricultural Research Council - Small Grain Institute

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve procedimentos utilizados para estudar e caracterizar enzimas relacionadas à parede celular, principalmente β-1,3-glucanase e peroxidase, em plantas de trigo. Seus níveis de atividade aumentam durante a interação trigo-RWA e estão envolvidos na resposta de defesa da planta por meio do reforço da parede celular, o que impede a alimentação de pulgões.

Resumo

Plantas de trigo infestadas por pulgões do trigo russo (RWA) induzem uma cascata de respostas de defesa, incluindo as respostas de hipersensibilidade (HR) e indução de proteínas relacionadas à patogênese (PR), como β-1,3-glucanase e peroxidase (POD). Este estudo tem como objetivo caracterizar as propriedades físico-químicas do POD associado à parede celular e da β-1,3-glucanase e determinar seu sinergismo na modificação da parede celular durante a interação RWASA2-trigo. As cultivares suscetíveis Tugela, moderadamente resistente Tugela-Dn1 e resistente Tugela-Dn5 foram pré-germinadas e plantadas em casa de vegetação, adubadas 14 dias após o plantio e irrigadas a cada 3 dias. As plantas foram infestadas com 20 indivíduos partenogenéticos do mesmo clone RWASA2 no estádio de 3 folhas, e as folhas foram colhidas de 1 a 14 dias após a infestação. O fluido de lavagem intercelular (IWF) foi extraído por filtração a vácuo e armazenado a -20 °C. Os resíduos das folhas foram triturados em pó e usados para componentes da parede celular. A atividade e caracterização do POD foram determinadas usando substrato de guaiacol 5 mM e H2O2, monitorando a mudança na absorbância a 470 nm. A atividade da β-1,3-glucanase, o pH e as condições ótimas de temperatura foram demonstrados medindo-se os açúcares redutores totais no hidrolisado com reagente DNS usando substratos de β-1,3-glucano e β-1,3-1,4-glucano, medindo a absorbância a 540 nm e usando a curva padrão de glicose. O pH ótimo foi determinado entre pH 4 a 9, temperatura ótima entre 25 e 50 °C e estabilidade térmica entre 30 °C e 70 °C. A especificidade do substrato β-1,3-glucanase foi determinada a 25 °C e 40 °C usando substratos de coalhada e cevada β-1,3-1,4-glucana. Além disso, o modo de ação da β-1,3-glucanase foi determinado usando laminaribiose para laminaripentaose. Os padrões do produto de hidrólise de oligossacarídeos foram analisados qualitativamente com cromatografia em camada delgada (TLC) e quantitativamente analisados com HPLC. O método apresentado neste estudo demonstra uma abordagem robusta para infestar trigo com RWA, extração de peroxidase e β-1,3-glucanase da região da parede celular e sua caracterização bioquímica abrangente.

Introdução

Os pulgões do trigo russo (RWA) infestam o trigo e a cevada, causando perda significativa de rendimento ou redução da qualidade do grão. O trigo responde à infestação induzindo várias respostas de defesa, incluindo o aumento dos níveis de atividade da β-1,3-glucanase e peroxidase nas cultivares resistentes, enquanto as cultivares suscetíveis reduzem a atividade dessas enzimas no período inicial da infestação 1,2,3,4. As principais funções da β-1,3-glucanase e POD na planta de trigo incluíram a regulação do acúmulo de calose na cultivar resistente e a extinção de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede celular e regiões apoplásticas durante a infestação por RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 demonstraram que houve uma forte correlação entre o aumento da atividade do POD e o aumento do teor de lignina na cultivar de trigo resistente após infestações por RWASA2. Além disso, o aumento do teor de lignina indicou que a parede celular da cultivar de trigo resistente infestada foi reforçada, levando à redução da alimentação com RWA.

A maioria dos grupos de pesquisadores extraiu e estudou a β-1,3-glucanase apoplástica e a POD durante a interação trigo/cevada-RWA; além disso, a maioria desses estudos afirmou que essas enzimas influenciam a parede celular da planta de trigo infestada com RWA sem medir a presença da enzima na região da parede celular. Apenas alguns estudos usaram técnicas microscópicas para mostrar que os níveis de atividade da β-1,3-glucanase estavam ligados à regulação da calose 7,8,9 ou extraíram os principais componentes da parede celular para demonstrar a correlação entre as atividades do POD e a modificação da parede celular no resistente 6,10. A falta de sondagem da associação β-1,3-glucanase e POD à parede celular indica a necessidade de desenvolver métodos que permitam aos pesquisadores medir diretamente as enzimas ligadas à parede celular.

O método atual propõe que é necessário remover o fluido apoplástico do tecido foliar antes de extrair as enzimas ligadas à parede celular. O procedimento de extração do fluido apoplástico deve ser realizado duas vezes do tecido foliar, que é usado para extrair as enzimas ligadas à parede celular. Esse processo reduz a contaminação e a confusão das enzimas apoplásticas com as encontradas nas regiões da parede celular. Assim, neste estudo, extraímos POD ligado à parede celular, β-1,3-glucanase e β-glucanase específica para MLG e realizamos sua caracterização bioquímica.

Protocolo

O estudo foi conduzido com a aprovação e permissão do Comitê de Ética em Pesquisa Ambiental e de Biossegurança da Universidade do Estado Livre (UFS-ESD2022/0131/22). Os detalhes dos reagentes e do equipamento aqui estão listados na Tabela de Materiais.

1. Condições de crescimento das plantas

  1. Germinar 250 sementes de cada cultivar de trigo, ou seja, Tugela suscetível, Tugela-Dn1 moderadamente resistente e Tugela-Dn5 resistente, em placas de Petri separadas.
  2. Adicione 5 mL de água destilada em cada placa de Petri, sele com um filme de parafina e incube na câmara de germinação regulada a 25 ° C por 2 dias.
  3. Transplante as sementes germinadas de cada cultivar em vasos de 15 cm contendo solo 1:1 e turfa (15 plantas por vaso) em condições controladas de estufa.
  4. Defina os regimes de temperatura em 18 °C e 24 °C durante a noite e o dia, respectivamente.
  5. Irrigue as plantas a cada 3 dias com água da torneira e forneça 2 g/L de fertilizante 14 dias após a germinação.
  6. Colocar as plantas em gaiolas envoltas em redes e deixá-las crescer até ao estágio 2,6 da terceira folha (com quatro repetições biológicas de cada cultivar).

2. Infestação de cultivares de trigo com RWASA2

  1. Infestar as cultivares de trigo Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 com RWASA2 de acordo com Jimoh et al.11 e Mohase e Taiwe12.
  2. Mantenha as plantas em dois conjuntos separados em gaiolas; infestar um conjunto com 20 indivíduos partenogenéticos do mesmo clone RWASA2 por planta em cada vaso nas câmaras de crescimento cobertas com redes. Mantenha outro conjunto de plantas de trigo em uma sala separada sob a câmara de crescimento com redes limpas e trate-as como controles.
    NOTA: Mantenha os dois tratamentos em salas separadas e cubra as plantas em gaiolas envoltas em redes. Além disso, no caso de dois biótipos diferentes de RWA serem usados em um estudo, manter as plantas infestadas com um biótipo RWA daquelas infestadas com o segundo biótipo, tanto quanto possível ou em salas separadas sob câmaras de crescimento cobertas com redes para evitar qualquer possível contaminação cruzada do RWASA2.
  3. Para a colheita, selecione a segunda e a terceira folhas em dois regimes de tempo diferentes, período de alimentação de curto prazo (1, 2 e 3 dias) e período de alimentação de longo prazo (7 e 14 dias), e embrulhe-as em papel toalha úmido.
  4. Transfira imediatamente as folhas colhidas para uma caixa contendo gelo para reduzir o metabolismo das folhas antes da extração do fluido de lavagem intercelular (IWF).

3. Extração do fluido de lavagem intercelular (IWF) do apoplasto

  1. Corte as folhas colhidas de cerca de três cultivares de trigo em pedaços de 7 cm.
  2. Enxágue os pedaços de folhas duas vezes em água destilada para remover qualquer contaminação citosólica das extremidades cortadas 6,13.
  3. Insira os pedaços de folha em um tubo de vidro de parede espessa e mergulhe as amostras em tampão de extração (50 mM Tris-HCl, pH 7,8).
  4. Aplique a infiltração a vácuo por 5 min usando uma bomba de jato de água para impregnar as folhas com o tampão de extração.
  5. Em seguida, remova os pedaços de folhas do tubo de vidro e seque-os com uma toalha de papel.
  6. Inserir os pedaços de folhas secas verticalmente em tubos de centrifugação pré-arrefecidos equipados com discos perfurados e centrifugar a 500 x g durante 10 min a 4 °C.
  7. Use uma pipeta de 100 μL para coletar o sobrenadante em tubos de microcentrífuga pré-resfriados de 1,5 mL.
  8. Repita todo o procedimento de extração com o mesmo material foliar.
  9. Combine o sobrenadante coletado e armazene-o a -20 ° C.
    NOTA: As alíquotas sobrenadantes são tratadas como a fonte do conteúdo de apoplast ou IWF. A IWF não foi usada no presente estudo, mas foi importante removê-la dos tecidos foliares antes de extrairmos a β-1,3-glucanase e peroxidase (POD) ligadas à parede celular.

4. Extração da β-1,3-glucanase associada à parede celular e POD

NOTA: Os resíduos foliares deixados após a extração da IWF foram utilizados para extrair a proteína total da parede celular.

  1. Esmague os resíduos das folhas até formar um pó fino com nitrogênio líquido usando um almofariz e pilão.
  2. Transferir aproximadamente 200 mg do tecido foliar em pó para um almofariz contendo 4 mL de tampão de extração (fosfato de sódio 50 mM com 1% (p/v) de polivinilpolipirrolidona (PVPP); pH 5,0) seguido de moagem com um pilão até obter uma pasta lisa, que é então transferida para tubos de microcentrífuga.
  3. Incube a mistura nos tubos de microcentrífuga por 3 min em gelo e depois centrifugue a 10.000 x g por 15 min a 4 °C.
  4. Colete o sobrenadante (extratos de proteínas totais) em tubos de microcentrífuga (alíquotas de 2 mL) e use-o como fonte de β-1,3-glucanase e POD para todo o estudo.

5. Determinação do padrão proteico

  1. Determinar a concentração total de proteínas dos extractos segundo o método de Bradford14.
  2. Preparar as soluções de albumina de soro bovino (BSA) nas concentrações de 0,0 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml e 1,0 mg/ml dissolvidos em tampão fosfato de sódio 50 mM para gerar o padrão proteico.
  3. Prepare o padrão adicionando 10 μL de cada solução BSA na microplaca de 96 poços com 190 μL (0,25% v/v) de reagente de Bradford (consulte a Tabela de Materiais).
  4. Incubar a 25 °C durante 20 min e medir a absorvância a 595 nm utilizando o leitor de microplacas e utilizar os valores de absorvância para preparar a curva-padrão para quantificar a concentração de proteínas.
  5. Quantifique a concentração de proteína
    1. Adicione 10 μL da enzima extraída (etapa 4) em uma microplaca de 96 poços com 190 μL (0,25% v / v) de reagente de Bradford em triplicatas.
    2. Incubar à temperatura ambiente (25 °C) durante 20 min.
    3. Medir a absorvância a 595 nm utilizando o espectrofotómetro com um leitor de microplacas e utilizar os valores de absorvância para determinar a concentração de proteínas utilizando a BSA como padrão de proteínas (preparada no passo 5.4).

6. Prepare o padrão de glicose para a atividade da β-1,3-glucanase

  1. Prepare as soluções-padrão com concentrações entre 0,00 mg/ml e 1,0 mg/ml (0,0 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1,0 mg/ml) com glicose dissolvida em água destilada.
  2. Adicione 300 μL de cada solução de glicose e 600 μL de reagente de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) na proporção de 1:2 em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e incube as reações a 100 °C por 5 min (ver Tabela de Materiais para reagentes DNS) (Miller et al.15).
  3. Deixar arrefecer a mistura à temperatura ambiente antes de medir a absorvância a 540 nm com o espectrofotómetro.
  4. Utilizar os valores médios de absorvância para desenvolver a curva-padrão para determinar a actividade da enzima β-1,3-glucanase.

7. Determinação do ensaio de atividade da β-1,3-glucanase

NOTA: A atividade enzimática da β-1,3-glucanase ligada à parede celular extraída de Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 foi determinada pela quantidade de açúcares redutores totais liberados da hidrólise de 0,5% (p/v) de substratos ligados a 0,5% (p/v) de β-1,3-1,4-glucano (MLG) e 0,4% (p/v) de β-1,3-glucano usando um método modificado conforme descrito por Miller et al.15. Mantenha sempre os tubos com alíquotas de proteína no gelo. Se as amostras foram congeladas, descongele-as no gelo e proceda imediatamente após o descongelamento.

  1. Adicionar 200 μL do extrato enzimático (manter a concentração proteica entre 20 μg/ml e 90 μg/ml em todas as reações, salvo indicação em contrário) e 300 μL do substrato dissolvido em tampão citrato de sódio 50 mM (pH 5,0) nos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
    NOTA: Execute uma reação paralela em branco sem o extrato enzimático para todos os substratos (primeiro branco), e o branco da enzima consiste em extrato enzimático sem substrato (segundo branco). Tanto o substrato quanto o extrato enzimático foram substituídos pelo tampão no primeiro e segundo negros, respectivamente.
  2. Incubar as reações a 37 °C por 24 h e encerrar a reação aquecendo a 100 °C por 5 min, depois centrifugar a 10.000 x g por 10 min a 4 °C.
  3. Misture 300 μL do sobrenadante com 600 μL de reagente DNS (proporção 1:2) em novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e ferva a 100 °C por 5 min.
  4. Deixar arrefecer a solução até à temperatura ambiente e medir a absorvância a 540 nm com o espectrofotómetro.
    NOTA: Se a concentração de açúcares redutores totais for alta na mistura, isso resultará em uma solução marrom-escura, que é difícil de ler usando o espectrofotômetro. Portanto, é necessária uma diluição adicional das amostras antes da leitura da absorbância.
  5. Use a curva padrão de glicose desenvolvida na etapa 6.4 acima para determinar a atividade enzimática nas unidades SI da curva padrão.
  6. Para converter a atividade em uma atividade específica que é expressa em μmol glicose/h/mg de proteína, use a equação abaixo:
    Atividade específica = [(atividade enzimática/180.16)*1000]/tempo/concentração de proteína
    NOTA: Converta a atividade enzimática em mg/mL em g/mL; 180,16 g/mol é o peso molecular da glicose, 1000 é um fator que converte M em micromoles, o tempo é o período de reação e a concentração do extrato proteico é representada em mg/mL. Uma unidade de atividade da β-1,3-glucanase é definida como 1 μmol de glicose liberada do substrato dentro de um período de reação de 1 h.

8. Determinando a atividade da peroxidase (POD)

NOTA: A atividade da peroxidase ligada à parede celular das cultivares de trigo Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 foi determinada quantificando a formação do tetra-guaiacol produzido por unidade de tempo a partir do guaiacol16.

  1. Adicionar 30 μL do extracto enzimático, 30 μL 1% (v/v) H2O2 e 970 μL de guaiacol 5 mM nas cubetas a 25 °C.
    NOTA: Faça a reação em branco sem o extrato enzimático (primeiro branco) e outra em branco para amostras de enzimas sem substrato (segundo branco). As amostras de enzima ou substrato foram substituídas por tampão fosfato de sódio 50 mM no primeiro e segundo brancos, respectivamente.
  2. Utilizar o modo cinético do espectrofotómetro para monitorizar a variação da absorvância a 470 nm.
  3. Determine a inclinação onde o gráfico era linear e use-o como o valor de absorbância.
  4. Calcule a absorbância média e use-a no cálculo da atividade do POD.
  5. Calcular a atividade da peroxidase utilizando o coeficiente de extinção molar do guaiacol (26,6 mM-1 cm-1) e expressar a atividade em μmol tetra-guaiacol/min/mg de proteína.
  6. Calcule a atividade do POD usando a equação usada por Mafa et al.6:
    ATIVIDADE DA CÁPSULA = [(ΔABS × DF) ÷ Concentração de proteína] × 26,6 mM-1 cm-1 × 1 cm
    NOTA: Onde ΔABS = absorbância média; DF = Factor de diluição; 26,6 mM-1 cm-1 = coeficiente de extinção do guaiacol.

9. Caracterização do POD

NOTA: Os ensaios de caracterização de POD foram conduzidos usando extratos enzimáticos 3 dias pós-infestação (dpi) de Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 seguindo métodos semelhantes descritos na etapa 8, com pequenas alterações nos tampões de reação e temperaturas. As amostras de enzimas foram sempre mantidas no gelo enquanto os experimentos estavam sendo conduzidos. Execute as reações em quadruplicados com uma reação paralela em branco.

  1. Para ensaios de pH ideais, execute as etapas a seguir.
    1. Dissolva o substrato de guaiacol em tampões de 50 mM (citrato de sódio, pH 4 e 5), fosfato de sódio (pH 6 e 7) e Tris-HCl (pH 8 e 9) (ver Tabela de Materiais).
    2. Execute as reações a 25 °C conforme descrito na etapa 8.
  2. Para ensaios de temperatura ideais, execute as etapas a seguir.
    1. Execute as reações a 25 °C, 30 °C, 40 °C e 50 °C, respectivamente.
    2. Use substrato de guaiacol dissolvido no tampão pH 5 (pH ótimo) e execute as reações conforme descrito na etapa 8.
  3. Para ensaios de termoestabilidade, execute as etapas a seguir.
    1. Antes de iniciar as reações, incube a enzima a 37 °C, 50 °C e 70 °C por 30 min.
    2. Executar as reacções de acordo com os métodos descritos na etapa 8, utilizando tampão citrato de sódio a 50 mM (pH 5) e a 40 °C (temperatura ótima).

10. Caracterização da β-1,3-glucanase

NOTA: Realizar os ensaios de caracterização seguindo o método descrito na etapa 7 usando extratos enzimáticos de 3 dpi, com algumas modificações nos tampões de reação e temperaturas. Execute as reações em quadruplicados, com uma reação em branco paralela para cada substrato.

  1. Para ensaios de pH ideais, proceda da seguinte forma:
    1. Dissolva os substratos MLG e β-1,3-glucano em tampões 50 mM (citrato de sódio, pH 4 e 5), fosfato de sódio (pH 6 e 7) e Tris-HCl (pH 8 e 9).
    2. Execute a reação conforme descrito na etapa 7.
  2. Para ensaios de temperatura óptimos, proceda da seguinte forma:
    1. Execute as reações a 25 °C, 30 °C, 40 °C e 50 °C, respectivamente.
    2. Utilizar substratos MLG e β-1,3-glucano dissolvidos no tampão citrato de sódio 50 mM (pH 5) com pH óptimo (obtido no passo 10.1) e executar as reacções como descrito no passo 7.
  3. Para os ensaios de termoestabilidade, proceder da seguinte forma:
    1. Antes de iniciar as reações, incube a enzima a 37 °C, 50 °C e 70 °C por 30 min.
    2. Executar as reacções utilizando substratos dissolvidos em tampão citrato de sódio a 50 mM (pH 5) e incubar a 25 °C e 40 °C durante 24 h.

11. Avaliação do mecanismo de ação da β-1,3-glucanase em diferentes substratos de glucano

NOTA: Os substratos de glucano contêm o mesmo resíduo de glicose em sua espinha dorsal, mas as ligações glicosídicas entre as unidades de glicopiranose são diversas e podem assumir a orientação α ou β17. As ligações glicosídicas podem se formar entre vários átomos de carbono de moléculas de glicose, definindo sua estrutura química, por exemplo, β-1,3-glucano, β-1,4-glucano e β-1,3-1,4-glucano ligado misto (MLG) 18 , 19 , 20 . O mecanismo de ação da β-1,3-glucanase foi determinado usando amostras de Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn 5 infestadas por RWASA2 (fontes de enzimas) e os seguintes substratos β-1,3-glucano (CM-coalhada), MLG (de cevada) e β-1,4-glucano (AZO-CM-Celulose). O mecanismo de ação é determinado em condições ótimas de ensaio (25 °C e 40 °C, pH 5,0), usando 0,1% (p/v) β-1,4-glucano, 0,4% (p/v) β-1,3-glucano ou 0,5% (p/v) substratos MLG.

  1. Dissolver os substratos em tampão citrato de sódio a 50 mM (pH 5).
  2. Adicione 200 μL do extrato enzimático e 300 μL do substrato nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Incubar as reações em duas temperaturas separadas, 25 °C e 40 °C por 8 h.
  4. Término das reações por aquecimento a 100 °C.
  5. Centrifugue a mistura de reação de β-1,3-glucano e MLG a 10.000 x g por 10 min a 4 °C e proceda conforme descrito na etapa 7.3.
  6. Para β-1,4-glucano, após terminar a reação a 100 °C, diluir a mistura com 800 μL de etanol absoluto e centrifugar a 4 °C por 10 min a 10.000 x g.
  7. Transferir o sobrenadante para as curvas, medir a absorvância a 590 nm com o espectrofotómetro e calcular a actividade da β-1,3-glucanase no β-1,4-glucano utilizando o procedimento do fabricante (ver quadro de materiais) e exprimir a actividade em unidades/mg de proteína.

12. Determinando o modo de ação da β-1,3-glucanase

NOTA: O modo de ação da β-1,3-glucanase induzido por Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 infestado com RWASA2 foi testado com laminarina-oligossacarídeos (LAMs) com o grau de polimerização (DP) entre 5 e 2. Use cromatografia em camada fina (TLC), cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) e kit de glicose oxidase peroxidase (GOPOD) para determinar o DP necessário para que a β-1,3-glucanase hidrolise o substrato. A CCD foi utilizada para análise qualitativa e a LC-MS para análise quantitativa, que determinou a concentração dos oligossacarídeos no hidrolisado após a reação21.

  1. Prepare as reações do modo de ação β-1,3-glucanase
    NOTA: Prepare o extrato de proteína concentrado com um filtro de membrana concentrador de centrífuga de 10 kDa e, portanto, tenha extratos de proteína infestados de RWASA2 concentrados e não concentrados para o experimento.
    1. Para concentrar as enzimas extraídas de cada cultivar, transferir 5 mL dos extratos para os filtros de membrana concentradores centrífuga de 10 kDa.
    2. Centrifugar os tubos filtrantes de membrana contendo o extracto a 15.000 x g durante 30 min a 4 °C.
    3. Dissolva a laminaripentaose (LAM5), a laminaritetraose (LAM4), a laminaritriose (LAM3) e a laminaribiose (LAM2) (consulte a Tabela de Materiais) em citrato de sódio 50 mM (pH 5) para fazer 10 mg / mL.
    4. Para iniciar a reação, adicione 20 μL do extrato proteico e 40 μL de Laminaripentaose (LAM5), Laminaritetraose (LAM4), Laminaritriose (LAM3) e Laminaribiose (LAM2).
    5. Incubar a reação a 40 °C durante 16 h e terminar fervendo a 100 °C durante 5 min.
  2. Realize cromatografia em camada fina (TLC)
    1. Corte 4 placas de sílica em pedaços de 10 cm2 e desenhe uma linha na superfície da placa, deixando 1 cm de espaço na parte inferior de uma das bordas.
    2. Marque os pontos sobre a linha e marque-os de acordo com diferentes cultivares e DP dos oligossacarídeos laminarinos, separados por 1 cm e. Pegue 2 placas de sílica para extrato de proteína concentrado e as outras 2 para extratos não concentrados.
    3. Adicione 3 μL das misturas de reação 3 a 5 vezes sobre os pontos marcados correspondentes na placa de sílica e deixe os pontos na placa secarem completamente antes de repetir o processo.
    4. Coloque delicadamente as placas de sílica no tanque de TLC contendo a fase móvel de n-butanol: ácido acético: água (2:1:1 v/v/v) com o lado contendo as manchas das amostras na parte inferior.
    5. Deixe a fase móvel se mover da parte inferior para a parte superior da placa.
      NOTA: Esta etapa pode levar aproximadamente 2 h. Não mova ou perturbe o tanque enquanto as amostras estiverem se separando.
    6. Retire as placas da fase móvel e deixe-as secar à temperatura ambiente.
    7. Adicione a solução de coloração no recipiente pequeno, mergulhe suavemente a placa de sílica na solução de coloração de naftol a 0,3% (p / v) em etanol a 95% (v / v) usando ácido sulfúrico a 5% (v / v) por 5 s, remova-o e deixe-o secar em temperatura ambiente.
      NOTA: Nesta etapa, ligue o bloco de aquecimento/forno e ajuste a temperatura para 100 °C.
    8. Coloque as placas de sílica secas no bloco de aquecimento e aqueça a 100 °C por 7-10 min ou até que as manchas azul-violeta apareçam. Tire fotos das placas de sílica mostrando as manchas azul-violeta e documente-as.
  3. Quantificar a concentração de hidrolisados de oligossacarídeos laminarinos
    NOTA: A concentração dos hidrolisados de LAM será quantificada para extratos proteicos concentrados e não concentrados21.
    1. Adicionar 20 μL de cada amostra numa coluna de C18 (hidratos de carbono 4,6 × 250 mm) e deixar separar a um caudal de 500 μL/min utilizando um gradiente de água (solvente A) e acetonitrila (solvente B) de 100% B a 60% B durante 10 min, seguido de etapas de reequilíbrio da coluna com um tempo total de execução de 20 min para permitir o reequilíbrio da coluna.
    2. Ionizar as substâncias a analisar em modo de eletropulverização negativo na fonte iónica de espectrometria de massa com uma temperatura de aquecimento de 400 °C para evaporar o excesso de solvente, gás nebulizador de 30 psi, gás aquecedor de 30 psi e gás de cortina de 20 psi.
    3. Defina o potencial de desagrupamento em 350 V.
    4. Analisar as substâncias a analisar no espectrómetro de massa num modo de varrimento Q1 que varia entre 150 Da e 1000 Da com um tempo de permanência de 3 s.
    5. Registar as concentrações das substâncias a analisar na folha de cálculo.
  4. Quantifique a concentração de glicose
    1. Analisar a concentração de glicose produzida pela hidrólise da laminarina utilizando o reagente GOPOD, seguindo as instruções do fabricante22,23.
    2. Medir a absorvância a 510 nm num modo fixo do espectrofotómetro.

13. Coleta e análise dos dados

  1. Randomize todos os experimentos para evitar viés durante a infestação ou coleta de amostras e conduza a análise em quadruplicados.
  2. Salvo indicação em contrário, use as médias ± desvio padrão para representar os valores nos gráficos e tabelas gerados a partir dos dados experimentais coletados.
  3. Use o Microsoft Excel para analisar todos os dados e gerar gráficos.
  4. Realize análises estatísticas com software compatível.
    NOTA: Realize a Análise Multifatorial de Variância (ANOVA) para testar a significância entre os tratamentos e o LSD de Fisher para testar grupos homogêneos em um valor alfa de 0,05.

Resultados

Quatro repetições biológicas de cultivares de trigo (Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5) foram infestadas com RWASA2 no estádio de crescimento de 3 folhas. Após a infestação, as folhas foram colhidas em 1, 2, 3, 7 e 14 dpi. Os tratamentos controle não foram infestados com RWASA2 para tornar os resultados do experimento comparáveis aos de plantas de trigo não expostas ao estresse. Os experimentos foram conduzidos em quadruplicados, e os resultados foram apresentados como valores médios.

As concentrações proteicas dos extratos infestados por RWASA2 e controle foram quantificadas usando BSA como padrão proteico. Isso foi útil para determinar a atividade enzimática para β-1,3-glucanase e POD e para garantir que as concentrações de proteína usadas em cada reação fossem conhecidas para cada amostra; as diferenças eram insignificantes. Os dados podem ser apresentados em formato de gráfico ou tabela. O primeiro formato de gráfico foi usado para expressar as atividades específicas da enzima (eixo y) plotadas em relação aos dias pós-infestação (eixo x) para a atividade enzimática e os resultados do ensaio de caracterização. O aumento da atividade específica da β-1,3-glucanase, β-glucanase específica de MLG e POD em amostras de Tugela-Dn5 resistentes infestadas por RWASA2 mostrou que as enzimas desempenharam um papel na resposta de defesa (Figura 1 e Figura 2). Além disso, ambas as enzimas perderam significativamente a atividade ao longo do tempo no Tugela suscetível infestado com RWASA2.

A caracterização bioquímica da β-1,3-glucanase e do POD associados à parede celular foi determinada expressando a atividade em porcentagens de atividade relativa ou atividade enzimática específica, que foram representadas por gráficos de linhas e barras, respectivamente (Figura 3). O resultado mostrou que tanto a β-1,3-glucanase quanto a POD apresentaram condições ótimas de pH semelhantes (pH 5) correspondentes às condições ácidas da parede celular (Figura 3). É importante notar que a β-glucanase específica para MLG também apresentou atividade específica em pH 5. No entanto, foi mais estável em condições básicas do que a β-1,3-glucanase, que perdeu até 80% de atividade relativa na mesma condição. Os resultados confirmaram que duas enzimas que catalisaram os substratos MLG e β-1,3-glucano foram extraídas com sucesso da região da parede celular com base no pH ótimo. Essa afirmação foi validada pelos resultados do ensaio de termoestabilidade (Figura 4), que confirmou que a β-1,3-glucanase só tolerava temperaturas de até 50 °C e perdia mais de 80% de atividade relativa a 70 °C (o POD tinha os mesmos perfis). Em contraste, a enzima β-glucanase específica para MLG exibiu a maior atividade a 25 ° C, seguida por uma atividade gradualmente diminuída, mas essa enzima reteve mais de 50% de atividade relativa a 50 ° C e 70 ° C. As observações confirmaram que a β-glucanase específica para MLG exibiu propriedades bioquímicas únicas em comparação com a β-1,3-glucanase e POD extraídas de Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5.

O modo de ação da β-1,3-glucanase foi demonstrado com oligossacarídeos laminarinos com DP entre 5 e 2 (referido como LAM5 a LAM2). Os resultados da TLC mostraram que Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 infestados tinham uma enzima β-1,3-glucanase que hidrolisava principalmente oligossacarídeos mais longos (LAM5 e LAM4) em comparação com os mais curtos (LAM3). A intensidade das manchas azul-violetas visualizadas na placa de CCT mostrou que LAM5 e LAM4 apresentaram bandas menos intensas, seguidas por LAM3 nas cultivares resistente e moderadamente resistente (Figura 5). A cultivar suscetível Tugela mostrou que a β-1,3-glucanase hidrolisou o LAM5 melhor do que outros oligossacarídeos (LAM4-LAM2), que apresentaram bandas mais intensas. O modo de ação também é expresso como as concentrações dos hidrolisados, apresentadas em uma tabela com um mapa de calor mostrando hidrólise eficiente de oligossacarídeos laminarínicos com maior DP e atividade moderada durante a hidrólise de oligossacarídeos mais curtos (LAM3 e LAM2) (Tabela 1).

figure-results-1
Figura 1: A atividade específica da peroxidase extraída de Tugela (A), Tugela-Dn1 (B) e Tugela-Dn5 (C) infestadas por RWASA2 14 dias após a infestação. Os experimentos foram realizados em quadruplicados; os valores e as barras de erro representam médias ± DP, respectivamente. U na proteína U / mg representa μmol tetra-guaiacol / min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: A atividade específica da β-1,3-glucanase medida em cultivares Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 infestadas por RWASA2. A atividade enzimática foi conduzida usando dois substratos de glucano quimicamente distintos, ou seja, β-1,3-1,4-glucano (A-C) e curdlan (D-F) ligados de forma mista. Os experimentos foram realizados em quadruplicados; os valores e as barras de erro representam médias ± DP, respectivamente. U na proteína U / mg representa μmol / h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Os ensaios de pH ótimo da enzima β-1,3-glucanase extraída de Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 infestados por RWASA2 3 dias após a infestação. Os experimentos foram conduzidos usando substratos de ligação mista β-1,3-1,4-glucana (A-C) e curdlan (D-F). Os experimentos foram realizados em quadruplicados; os valores e as barras de erro representam médias ± DP, respectivamente. U na proteína U / mg representa μmol / h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Ensaio de termoestabilidade. Os ensaios de termoestabilidade da β-1,3-glucanase proveniente de Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 infestados por RWASA2 3 dias após a infestação, investigados em β-1,3-1,4-glucano (A-C) e β-1,3-glucano (D-F). Os experimentos foram realizados em quadruplicados; os valores e as barras de erro representam médias ± DP, respectivamente. U na proteína U / mg representa μmol / h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Análise do modo de ação da β-1,3-glucanase em oligossacarídeos laminarina. Os oligossacarídeos laminarínicos foram representados por L5, L4, L3 e L2, que eram equivalentes a Laminaripentaose (LAM5), Laminaritetraose (LAM4), Laminaritriose (LAM3) e Laminaribiose (LAM2), respectivamente. A seta vermelha mostra a glicose (GLU) e a seta azul mostra os perfis da enzima sem os oligossacarídeos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Oligossacarídeos laminarinos produzidos com β-1,3-glucanase concentrada extraída de cultivares de trigo infestadas com RWASA2 por 3 dias. As concentrações dos oligossacarídeos no hidrolisado foram determinadas com LC-MS. LAM5, LAM4, LAM3, LAM2 e GLU representam laminaripentaose, laminaritetraose, laminaritriose, laminaribiose e glicose, respectivamente. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

O trigo e a cevada são culturas de cereais frequentemente infestadas por espécies de pulgões, incluindo pulgões russos do trigo (Diuraphis noxia)7,24. Plantas de trigo resistentes induzem a regulação positiva das atividades de POD e β-1,3-glucanase como respostas de defesa durante todo o período de infestação para modificar a parede celular regulando o acúmulo de calose e lignina 6,25,26,27. É importante notar que a maioria dos estudos extraiu as enzimas POD e β-1,3-glucanase do apoplasto 3,12,28, tornando suas funções de parede celular altamente especulativas. O presente estudo desenvolveu um método que extraiu a β-1,3-glucanase ligada à parede celular, a β-glucanase específica para MLG e o POD como parte da proteína total. Essas enzimas foram altamente ativas nas cultivares de trigo resistentes em comparação com a testemunha, enquanto sua atividade foi retardada nas cultivares suscetíveis. O uso dos controles nos experimentos ajudou a entender os efeitos da infestação nos níveis de atividade das enzimas ligadas à parede. A amostragem do terceiro e segundo tecidos foliares para amostras infestadas ou controle é importante porque traz consistência. Além disso, amostrar o infestado e o controle com o mesmo período, pois a POD, a β-1,3-glucanase e a atividade da β-glucanase específica para MLG aumentam o crescimento das mudas de trigo.

O substrato de curdlan utilizado neste estudo possui estrutura química semelhante à da calose, polímero depositado na região da parede celular durante a interação trigo-RWA 7,24. O substrato MLG de cevada representa a parte da hemicelulose da parede celular presente em baixa proporção em comparação com a xilana na maioria das monocotiledôneas. Os substratos foram dissolvidos em tampão citrato de sódio pH 5 para mimetizar a condição ácida da região da parede celular da planta29. Se a β-1,3-glucanase e a β-glucanase específica para MLG fossem removidas com o IWF, a proteína total extraída do tecido foliar remanescente não teria atividade sobre os substratos MLG e curdlan. Além disso, se os extratos proteicos fossem provenientes da região citoplasmática, eles mostrariam atividade na faixa de pH neutro. Curiosamente, ambas as enzimas estavam presentes no extrato proteico total porque hidrolisaram com sucesso os substratos MLG e curdlan. A hidrólise do MLG e do curdlan pelas respectivas enzimas produziu os açúcares redutores, que foram detectados pelo reagente DNS seguindo um método modificado por Mafa et al.6. Quando as amostras têm maior concentração de açúcares redutores totais, a cor do reagente DNS muda de amarelo para marrom escuro ou a cor muda de amarelo para marrom claro (parece laranja escuro) quando a concentração de açúcares redutores é baixa.

O substrato de guaiacol foi usado para medir a atividade do POD. Devido à alta eficiência catalítica do POD, medimos sua atividade usando o modo cinético do espectrofotômetro. O POD é ativado pela baixa concentração de H2O2 na presença do substrato (Guaiacol). A atividade desta enzima converte o guaiacol para formar tetra-guaiacol, que é um composto de cor marrom-laranja. A produção do tetra-guaiacol confirma que o POD reticula compostos fenólicos para produzir oligômeros ou incorpora compostos fenólicos à lignina. O POD apresentou níveis mais altos de atividade no Tugela-Dn5 resistente infestado por RWASA2, seguido pelo Tugela-Dn1 moderadamente resistente em comparação com os controles. No entanto, os níveis de atividade do POD foram significativamente reduzidos ao longo do tempo no Tugela suscetível infestado. Os resultados deste estudo foram apoiados pela alegação de que cultivares de trigo resistentes infestadas por RWASA2 usam POD para fortalecer sua parede celular por meio da reticulação das conexões lignina ou lignina-hemicelulose6. O POD exigia H2O2 para funcionar, o que indica que reduziu a oxidação ou branqueamento dos carboidratos estruturais da parede celular, regulando os níveis de H2O2 na região da parede celular.

Diferentes condições de pH e temperatura foram usadas para determinar as condições bioquímicas ótimas para essas enzimas ligadas à parede celular. As condições ótimas mostraram que as enzimas têm atividades ótimas em faixas de pH ácido (pH 5), o que sugere que elas estavam associadas à região da parede celular. A temperatura ótima para β-1,3-glucanase foi obtida a 25 °C e 40 °C na hidrólise de substratos de β-1,3-1,4-glucano e β-1,3-glucano, respectivamente. Essa observação confirmou que as β-1,3-glucanases e a β-glucanase específica para MLG foram duas enzimas diferentes induzidas na região da parede celular de cultivares de trigo resistentes durante a infestação por RWASA2. Embora a caracterização bioquímica seja um método promissor para descobrir ou identificar diferentes enzimas com substratos semelhantes, ainda recomendamos o uso de outros métodos trabalhosos, mas precisos, incluindo ensaios de western blotting e zimograma. Por fim, não foi possível quantificar o modo de atividade enzimática da β-glucanase específica para MLG devido à falta de oligossacarídeos de MLG. No entanto, as β-1,3-glucanases extraídas do Tugela-Dn5 e Tugela-Dn1 infestados por RWASA2 apresentaram maior atividade em LAM5, LAM4 e LAM3, enquanto a proveniente de Tugela suscetível apresentou maior atividade em LAM5 e LAM4. Isso confirma que o estudo do modo de atividade enzimática também pode detectar diferenças sutis entre as β-1,3-glucanases induzidas nas cultivares resistentes e suscetíveis infestadas por RWA.

O estudo atual fornece um procedimento detalhado para extrair as enzimas ligadas à parede celular do tecido da folha de trigo. Após a extração, identificamos três enzimas ligadas à parede celular, a saber, β-1,3-glucanase, β-glucanase específica para MLG e POD. Os níveis de atividade dessas enzimas foram significativamente maiores nas cultivares Tugela-Dn1 moderadamente resistentes e Tugela-Dn5 infestadas por RWASA2 do que nos controles. Estes confirmaram que as enzimas ligadas à parede celular contribuíram para a resposta de defesa nas cultivares resistentes. Os resultados da caracterização fornecem uma visão de que o POD da parede celular e a β-1,3-glucanase funcionam nas mesmas condições, sugerindo que eles reforçam sinergicamente a parede celular durante a interação trigo-RWASA2.

Foram identificadas algumas limitações que interferem nos protocolos atuais discutidos. A escassez de plantas de trigo pode limitar o material foliar disponível para extrair as amostras de enzimas. Se o IWF do apoplasto não for extraído com sucesso das amostras de folhas antes de extrair as enzimas da parede celular, isso pode levar à combinação de enzimas do apoplasto e da parede celular. A combinação das enzimas IWF e da região da parede celular dificulta o estudo das enzimas ligadas à parede celular que estão ligadas na parede celular. Nenhuma outra limitação foi identificada no protocolo atual.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses envolvido neste trabalho.

Agradecimentos

M. Mafa recebeu financiamento da NRF-Thuthuka (Número de referência: TTK2204102938). S.N. Zondo recebeu a bolsa de pós-graduação da National Research Foundation para seu mestrado. Os autores agradecem ao Instituto Agricultural Research Council - Small Grain (ARC-SG) por fornecer as sementes utilizadas neste estudo. Quaisquer opiniões, descobertas e recomendações expressas neste material são de responsabilidade do(s) autor(es) e, portanto, os financiadores não aceitam qualquer responsabilidade em relação a isso.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dispositivo de membrana concentradora centrífuga de 10 kDaSigma-AldrichR1NB84206Apenas para uso em pesquisa. Não deve ser usado em procedimentos de diagnóstico. Para concentração e purificação de soluções biológicas.
2 g de LaminaribioseMegazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM2Laminaribiose de alta pureza para uso em pesquisa, ensaios enzimáticos bioquímicos e análises diagnósticas in vitro.
3 g de LaminaritrioseMegazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM3Laminaritriose de alta pureza para uso em pesquisa, ensaios enzimáticos bioquímicos e análise diagnóstica in vitro.
3,5 Dinitro ácido salicílicoSigma-AldrichD0550Usado na determinação colorimétrica de açúcares redutores
4 g Laminaritetraose Megazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM4Laminaritetraose de alta pureza para uso em pesquisa, ensaios enzimáticos bioquímicos e análise de diagnóstico in vitro.
5 g de LaminaripentaoseMegazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM5Laminaripentaose de alta pureza para uso em pesquisa, ensaios enzimáticos bioquímicos e análise de diagnóstico in vitro.
95% Etanol absolutoSigma-Aldrich107017Etanol absoluto para análise
ácido acéticoSigma-AldrichB00063Ácido Acetc glacial 100% para análise (contém ácido acético)
Azo-CM-CeluloseMegazyme (Wicklow, Irlanda)S-ACMCO polissacarídeo é tingido com Remazolbrilliant Blue R a uma extensão de aprox. uma molécula de corante por 20 resíduos de açúcar.
Beta glucano (cevada) Megazyme (Wicklow, Irlanda)G6513Um substrato em pó, menos solúvel em água. Usado na determinação da atividade da β-1,3-glucanase.
Corante de Ensaio de Proteína Bio-RadBio-Rad Laboratories, África do Sul500-0006Corante de ensaio colorimétrico, concentrado, para uso com os Kits de Ensaio de Proteína Bio-Rad I e II 
Albumina de soro bovino (BSA)Gibco Europe810-1018Apenas para uso em laboratório
Ácido citratoSigma-AldrichC0759Apenas para pesquisa em ciências da vida. Não deve ser usado em procedimentos de diagnóstico.
CM-curdlan Megazyme (Wicklow, Irlanda)P-CMCURSubstrato em pó para determinar a atividade da β-1,3-glucanase. Insolúvel em água.
D-GlucoseSigma-AldrichG8270Apenas para pesquisa em Ciências da Vida. Não deve ser usado em procedimentos de diagnóstico.
GuaiacolSigma-AldrichG5502Indicador de oxidação. Usado para determinar a atividade da peroxidase.
Peróxido de hidrogênioBDH Suprimentos de laboratório, Inglaterra10366Poderoso agente oxidante.
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (Estônia)NISubstrato de mudas à base de musgo de turfa.
Adubo multialimentação (5.2.4 (43))Aduboclássico multialimentaçãoB1908248Um adubo solúvel em água para plantas jovens em desenvolvimento e plântulas com uma elevada necessidade de fósforo (P) para assegurar um desenvolvimento radicular óptimo.
NaftolMerck, AlemanhaN2780Sofre hidrogenações na presença de um catalisador.
FenolSigma-Aldrich33517Sensível à luz. Para R& D apenas para uso. Não para uso doméstico, doméstico ou outros. SDS disponível
Tartarato de potássio e sódio tetrahidratado (sal de Rochelle)Sigma-AldrichS2377utilizado na preparação da solução de ácido 3,5-dinitrosalicílico utilizado na determinação do açúcar redutor.
Placa de sílica (TLC Gel de sílica 60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EAMatriz de gel de sílica, com indicador fluorescente 254 nm
Hidróxido de sódioSigma-AldrichS8045Para R& D apenas para uso. Não para uso doméstico, doméstico ou outros.
Metabissulfito de sódioSigma-Aldrich31448Adicionado como antioxidante durante a preparação de soluções de ácido 3,5-dinitrosalicílico.
Fosfato de sódio dibásico heptahidratadoSigma-AldrichS9390Usado como solução tampão em pesquisas biológicas para manter o pH constante.
Fosfato de sódio monobásico heptahidratadoSigma-Aldrich71500Um composto inorgânico, que é solúvel em água. Usado como reagente no desenvolvimento de argamassas à base de silicato.
Software de análise estatísticaTIBCO Statisticaversão 13.1
Ácido sulfúricoMerck, Darmstadt, Alemanha30743Ácido sulfúrico 95-97% para análise de Hg, reagente ACS.
Tris-HClSigma-Aldrich10812846001Agente tampão em misturas de incubação.  Também tem sido usado como um componente de lise e tampão TE (Tris-EDTA). Apenas para pesquisa em ciências da vida. Não deve ser usado em procedimentos de diagnóstico.
UV– Espectrofotômetro VisívelGENESYS 120 
  NI = não identificado.

Referências

  1. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
  2. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
  3. Moloi, M. J., Vander Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
  4. Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
  5. Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
  6. Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
  7. Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects - A review. J Plant Physiol. 269, 153582(2022).
  8. Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
  9. Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
  10. Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
  11. Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
  12. Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
  13. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
  16. Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
  17. Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
  18. Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
  19. Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , Sodertorn University College. Stockholm. (2008).
  20. Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94(2011).
  21. Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
  22. Megazyme. GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
  23. Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under draught stress. Plants. 11 (3), 394(2022).
  24. Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
  25. Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
  26. Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358(2014).
  27. Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747(2021).
  28. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
  29. Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).

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