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Usando um modelo isolado de coração de rato de trabalho para testar estratégias de preservação do coração do doador

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DOI:

10.3791/66910

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4 de outubro de 2024

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1Cardiac Physiology and Transplantation, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent's Healthcare Clinical Campus, University of New South Wales, 3Heart and Lung Transplant Unit, St Vincent's Hospital, 4Faculty of Medicine, University of New South Wales

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo de coração de rato isolado ex vivo para testar estratégias de preservação do coração do doador. Este trabalho descreve o protocolo para uso em armazenamento estático a frio de corações de doadores de roedores; no entanto, o protocolo também pode ser usado para corações de doadores obtidos após doação após morte circulatória e morte encefálica.

Resumo

A otimização das soluções de preservação do coração do doador tem desempenhado um papel fundamental na redução da lesão de isquemia-reperfusão em corações de doadores durante a recuperação, transporte e transplante de órgãos. Trabalhos anteriores de nosso laboratório mostraram que a adição de trinitrato de glicerila e eritropoietina às soluções de preservação cardíaca do doador poderia melhorar significativamente a recuperação funcional cardíaca após armazenamento refrigerado prolongado e na doação após morte circulatória de corações. Este protocolo de suplementação foi implementado em uso clínico em unidades de transplante na Austrália, Bélgica e Reino Unido. Aqui, descrevemos um protocolo para testar estratégias de suplementação usando um circuito de perfusão de coração de rato (IWRH) isolado ex vivo . Usando essa metodologia, as estratégias de suplementação podem ser testadas no contexto de armazenamento estático prolongado a frio, doação após morte encefálica e doação após preservação do coração do doador de morte circulatória. A recuperação funcional cardíaca, medida pelo fluxo aórtico, fluxo coronariano, débito cardíaco, pressão de pulso e frequência cardíaca, pode ser usada para determinar se uma estratégia de preservação específica pode minimizar a lesão de isquemia-reperfusão do coração doador.

Introdução

O sucesso de um transplante de coração pode ser muito influenciado pelo método de preservação usado para o coração do doador. Os corações dos doadores são submetidos a insultos isquêmicos durante todo o processo de recuperação, transporte e transplante de órgãos. O grau de dano isquêmico ao órgão doador pode ser mitigado selecionando uma estratégia apropriada de preservação do coração do doador. O armazenamento estático a frio (CSS) continua sendo o método mais viável e comum para a preservação do coração do doador; no entanto, o CSS pode não ser necessariamente a melhor opção para todas as vias de doação de coração. Por exemplo, os corações obtidos por meio da via de doação após morte circulatória (DCD) são mantidos e avaliados quanto à viabilidade usando perfusão de máquina normotérmica, enquanto os corações obtidos por meio da via de doação após morte encefálica (DBD) podem ser preservados usando CSS ou perfusão de máquina hipotérmica. Outro determinante importante para a estratégia de preservação utilizada é a quantidade de isquemia quente (para DCD) ou isquemia fria (para DBD) a que o coração é submetido durante a obtenção e transporte de órgãos.

Muitos centros usam suplementação farmacológica adicional da solução de preservação do coração para aumentar a tolerância isquêmica e melhorar a função cardíaca pós-transplante. Estudos com roedores de nosso laboratório mostraram que a suplementação de cardioplegia com eritropoietina e trinitrato de glicerila foi capaz de melhorar significativamente a recuperação funcional cardíaca após armazenamento prolongado no coração do doador 1,2. Esses estudos então progrediram para estudos suínos de preservação do coração do doador e forneceram a base pré-clínica que levou à incorporação de eritropoietina e trinitrato de glicerila na solução de cardioplegia de corações obtidos por meio de uma via DCD utilizando perfusão normotérmicada máquina 3,4,5. Atualmente, a suplementação com eritropoietina e trinitrato de glicerila também é usada em unidades de transplante australianas para recuperações cardíacas clínicas de DBD incorporando CSS. O objetivo geral do protocolo de perfusão de coração de rato de trabalho isolado (IWRH) descrito abaixo é testar estratégias de preservação do coração do doador em um ambiente de laboratório e testar sua eficácia para preservar a função cardíaca do doador após a reperfusão. O protocolo de coração de rato de trabalho isolado descrito tem sido usado há mais de duas décadas em nosso laboratório e tem se mostrado extremamente útil na triagem de potenciais suplementos e/ou estratégias que podem melhorar a preservação do coração do doador 2,7,8,9.

Protocolo

Todos os animais receberam cuidados humanitários em conformidade com as diretrizes do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (Austrália). Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto Garvan de Pesquisa Médica (Sydney, Austrália).

1. Preparação do tampão Krebs-Henseleit (KH)

  1. Prepare 2 L de uma solução estoque 20x de tampão KH contendo 2,36 M NaCl, 0,094 M KCl, 0,024 M MgSO4, 0,024 M KH2PO4. Alíquota em tubos de 50 mL e armazenar a -20 °C.
  2. Antes do experimento, prepare dois frascos Erlenmyer de 2 L de tampão KH 1x contendo 1900 mL de água deionizada, 100 mL de tampão KH estoque 20x, 4,20 g de NaHCO3 (25 mM) e 3,96 g de glicose (11 mM).
    1. Colocar os balões tampão num banho-maria a 37 °C e aplicar gás à solução com carbógeno (oxigénio a 95%, dióxido de carbono a 5%, caudal regulado para 2 l/min) através de pedras de ar (filtro de entrada de encaixe) durante 5 min, depois adicionar 2,8 ml de CaCl2 1 M (1,4 mM). Continue borbulhando a solução por pelo menos 1 h antes do início do experimento. O uso de uma pedra de ar auxilia na aeração uniforme do amortecedor.
    2. Coloque um pequeno volume (~ 50 mL) de tampão em um prato redondo de metal a -20 ° C para esfriar e formar uma camada de tampão gelado.

2. Preparação do circuito de perfusão

  1. Certifique-se de que todos os tubos e vidrarias estejam limpos, sem crescimento/contaminação visível.
  2. Configure as alturas das câmaras de vidro para corresponder às pressões de perfusão necessárias com base em 1 cm H2O sendo equivalente a 1.36 mmHg: Langendorff-to-heart 100 cm (aproximadamente 75 mmHg), pré-carga trabalhando lado a coração 15 cm (aproximadamente 11 mmHg), câmara coração-pós-carga 100 cm (aproximadamente 75 mmHg).
  3. Inicie a circulação de água quente ao redor do circuito pelo menos 10 minutos antes da perfusão cardíaca.
  4. Coloque filtros de microfibra (1.2 μm) nos porta-filtros e prenda-os firmemente.
  5. Prepare o circuito com tampão KH, garantindo que todo o ar seja removido, e use uma braçadeira de tubulação de controle de fluxo para ajustar o fluxo no lado de Langendorff (Figura 1A, B) para ~ 50 mL / min. O fluxo mais lento permite facilitar a canulação da aorta e evita que o coração seja desalojado antes de amarrar. Coloque um termômetro dentro do circuito por meio de um conector de tubulação em forma de T para monitorar a temperatura do buffer em ~ 37 °C.

3. Configuração do software Lab Chart (análise de dados)

  1. Certifique-se de que o Powerlab (sistema de aquisição de dados) e o medidor de vazão estejam ligados e conectados ao computador antes de abrir o software de análise de dados.
  2. Abra um novo arquivo.
  3. Configure a coleta de dados selecionando o menu suspenso Configurações e selecionando Configurações do canal. Selecione Pressão Aórtica, Fluxo Aórtico e Frequência Cardíaca (Figura 2A).
  4. Configure cada canal com as configurações mostradas na Figura 2B.

4. Preparação do animal para isolamento do coração do rato

NOTA: A metodologia para isolamento e perfusão de coração de rato para corações não DBD e não DCD para armazenamento estático a frio é descrita abaixo. Os métodos de instrumentação cardíaca no circuito de perfusão são relativamente semelhantes, independentemente do método de doação usado. As diferenças no protocolo para doação de coração de rato DBD e DCD ocorrem principalmente desde o momento em que a anestesia animal faz efeito até quando o coração é excisado do animal.

  1. Pese o animal, certificando-se de que seu peso seja de >330 g. A faixa de peso ideal para ratos machos é de 330-420 g.
  2. Administre uma injeção intraperitoneal de cetamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Garanta um plano cirúrgico adequado de anestesia com base na ausência de reflexo podal (reflexo de pinça do dedo do pé) e reflexo de piscar os olhos.
  3. Coloque o animal em decúbito dorsal, prendendo os membros com fita adesiva. Administre oxigênio ao animal por meio de um cone nasal.
  4. Tenha o recipiente de metal de lama de gelo KH e um pequeno recipiente de metal com gelo na estação de dissecação. Mergulhe uma gaze de 7,5 cm x 7,5 cm em tampão KH e coloque-a no recipiente com gelo.
  5. Uma vez confirmado o plano cirúrgico adequado da anestesia, raspe a pele no local da incisão cirúrgica e limpe a pele com asséptico, como betadine ou álcool a 70%. Faça uma incisão lateral no abdômen (laparotomia) e mova o estômago e os intestinos para o lado para permitir o acesso à veia renal esquerda. Injete 1500 UI de heparina e aplique pressão no local da injeção até que o sangramento pare. Aguarde 1-2 minutos para que a heparina circule antes de continuar com a recuperação cardíaca.
  6. Abra a cavidade torácica cortando a caixa torácica de ambos os lados e cortando o diafragma. Segure e levante cuidadosamente o bloco coração-pulmão enquanto corta ao longo da aorta descendente, garantindo que o arco aórtico permaneça intacto. Isso permitirá que o comprimento da aorta permaneça suficiente para a canulação.
  7. O rato é sacrificado pela remoção do coração e dos pulmões sob anestesia. Mergulhe o bloco coração-pulmão na lama de gelo tampão KH para permitir que o coração pare.

5. Canulação do coração no circuito de perfusão cardíaca de trabalho isolado

  1. Transfira o bloco coração-pulmão para uma gaze no gelo. Disseque o excesso de gordura ao redor da aorta, apare a aorta para deixar 3-5 mm de comprimento para a canulação e faça uma pequena incisão ~ 1-2 mm na artéria pulmonar. Isso permitirá um caminho para o efluente coronário.
  2. Coloque o bloco coração-pulmão aparado (ainda no gelo) diretamente sob as cânulas. Ajuste o fluxo do lado de Langendorff usando uma braçadeira de tubo de controle de fluxo para facilitar a canulação aórtica. Canule cuidadosamente a aorta na cânula esquerda, segure-a com uma pinça preta e amarre-a com uma sutura de seda 2-0.
  3. Aumente o fluxo da perfusão de Langendorff abrindo completamente a braçadeira da tubulação de controle de fluxo. Abra o grampo de pós-carga. Certifique-se de que haja fluxo contínuo da câmara de Langendorff. Comece a monitorar a atividade cardíaca com software.
    NOTA: se o valor do fluxo aórtico no visor do medidor de vazão for <10 mL/min, certifique-se de que a arteriotomia pulmonar seja de tamanho suficiente. Um traço/valor de fluxo aórtico baixo também pode indicar que a cânula aórtica foi inserida demais.
  4. Ajuste o bloco coração-pulmão de modo que a superfície anterior dos pulmões fique voltada para o operador. Amarre o lobo do pulmão esquerdo com uma sutura de seda 2-0 e corte o excesso de tecido do pulmão esquerdo. Amarre os lobos pulmonares restantes de uma só vez com uma sutura de seda 2-0 e corte o tecido. Gire o coração para que os pulmões amarrados fiquem voltados para trás.
  5. Usando uma pequena tesoura Vannas, corte uma borda de 2-3 mm do apêndice atrial esquerdo, garantindo que uma pequena abertura nos átrios seja alcançada. Canine cuidadosamente o apêndice atrial esquerdo à cânula esquerda, segure-o com uma pinça preta e amarre-o com uma sutura de seda 2-0. A Figura 3A mostra a colocação de ambas as cânulas.
  6. Ajuste a camisa de água da câmara cardíaca para que o coração fique no centro da câmara.
  7. Abra o transdutor de pressão para ar e zere o transdutor de pressão no software selecionando o menu suspenso Pressão Aórtica > Bridge Amp > Zero. Clique em OK.
  8. Perfunda o coração no modo Langendorff por 10 min. Certifique-se de que o fluxo aórtico de Langendoff mede entre 10-20 mL / min (ideal 20 mL / min).
  9. Antes de alternar o modo de trabalho, certifique-se de que a pedra de ar (filtro de entrada deslizante) do reservatório de buffer Langendorff KH seja colocada no reservatório de buffer KH em funcionamento.
  10. Coloque o coração no modo de trabalho fechando a pinça grande que leva à cânula aórtica e abrindo o fluxo que leva ao apêndice atrial esquerdo. Abra a torneira de três vias que sai do perfusato de trabalho. Transfira a tubulação de retorno comum (levando o tampão KH de volta ao reservatório) do reservatório de Langendorff para o reservatório de trabalho.
  11. Perfunda o coração no modo de trabalho por 15 min. Os valores do fluxo aórtico devem ser idealmente >30 mL/min ao final de 15 min de perfusão. Assim que o coração se estabilizar, comece a registrar os dados no software de análise de dados.
  12. Meça o efluente coronário (fluxo coronário) em 1 min, 5 min, 10 min e 15 min.
    NOTA: Os valores do fluxo coronariano devem estar entre 10-20 mL / min. Fluxo coronariano maior que 22 mL/min geralmente indica um vazamento originado de um vaso pulmonar desamarrado. A frequência cardíaca deve estar entre 200-300 bpm. O efluente coronariano pode ser coletado para análise a jusante de marcadores de lesão tecidual (por exemplo, troponina-I, liberação de lactato desidrogenase).

6. Administração de cardioplegia para armazenamento estático frio do coração

  1. Encha a câmara de cardioplegia (posicionada a uma altura de 60 cm para produzir pressão de perfusão de aproximadamente 40 mmHg) com 50 mL de solução de preservação cardíaca designada (com ou sem suplementação).
  2. Abaixe a camisa de água e feche a torneira de três vias no lado do modo de trabalho.
  3. Pare o fluxo em direção à cânula atrial esquerda fechando a pinça.
  4. Abra o fluxo para a cânula aórtica.
  5. Feche o grampo do lado de Langendoff e na pós-carga.
  6. Abra a pinça da linha de cardioplegia e elimine 15 mL de cardioplegia da linha de pressão. Feche a torneira na linha de pressão.
  7. Permita que o coração seja lavado com cardioplegia através da cânula aórtica e colete o efluente coronário. Execute a cardioplegia por 3 min e registre o volume de cardioplegia administrado.
  8. Pare de gravar dados no software e salve o arquivo.
  9. Após 3 min, feche a pinça de cardioplegia e a pequena pinça azul que leva à cânula aórtica.
  10. Coloque uma pinça de buldogue na cânula aórtica e uma segunda pinça de buldogue na cânula esquerda. Desconecte o bloco da cânula cardíaca do circuito e coloque-o em um béquer contendo cardioplegia em uma caixa de gelo (Figura 3B, C).
  11. Guarde o coração na geladeira por 6 h (ou tempo de armazenamento refrigerado desejado).

7. Reperfusão cardíaca após armazenamento estático a frio

  1. Prepare o tampão KH de acordo com a seção 1.
  2. Prepare o circuito de perfusão conforme a seção 2.
  3. Abra o arquivo salvo da perfusão da linha de base.
  4. Remova cuidadosamente o bloco da cânula cardíaca da caixa de gelo e prenda-o no circuito de perfusão. Antes de reconectar a cânula aórtica, use uma seringa de ponta romba 18 G cheia de tampão KH para remover qualquer ar da cânula. Conecte a cânula aórtica primeiro, abra a braçadeira da tubulação no lado Langendorff e certifique-se de que a braçadeira da tubulação de pós-carga esteja aberta.
  5. Reconecte a cânula atrial esquerda, certificando-se de que o ar foi removido da cânula antes de conectá-la ao circuito de perfusão. Mantenha o lado de trabalho clamp fechado até que seja hora de mudar do modo Langendorff para o modo de trabalho.
  6. Perfunda o coração no modo Langendorff por 15 min. Certifique-se de iniciar o registro de dados no início da reperfusão de Langendorff.
  7. Antes de mudar para o modo de trabalho, coloque as duas pedras borbulhantes no buffer KH, abra a torneira de 3 vias no lado de trabalho e transfira a tubulação de retorno comum para o reservatório de trabalho.
  8. Feche o grampo Langendorff branco, abra o grampo lateral de trabalho branco e perfunda o coração por 30 min. Meça e colete efluentes coronários em pontos de tempo designados para análise a jusante (por exemplo, marcadores de lesão cardíaca). Certifique-se de parar e reiniciar a gravação do software para iniciar um novo segmento (ou, alternativamente, adicionar um comentário).
  9. Com aproximadamente 15 minutos de reperfusão no modo de trabalho, feche a torneira de três vias.
  10. No final da reperfusão, salve o arquivo de dados, interrompa o fluxo através do circuito e desconecte o bloqueio cardíaco. Colete amostras do ventrículo esquerdo para processamento histológico e/ou congeladas para estudos futuros (por exemplo, extração de proteínas para estudos de western blot).
  11. Remova os filtros dos porta-filtros, drene o tampão do circuito e lave duas vezes com 5 L de água destilada.
    NOTA: Embora não seja necessário, ajuda a pré-aquecer a água destilada em um grande recipiente dentro do banho-maria.

8. Análise da recuperação funcional

  1. Abra o arquivo LabChart.
  2. Realce uma região de pelo menos 30 s de gravação e clique em Comando > Adicionar seleção de dados OU Adicionar vários dados aos dados. Isso adicionará os parâmetros desejados a um arquivo DataPad dentro do software.
  3. Selecione o menu suspenso Janela > DataPad.
  4. Realce e copie os valores de recuperação do DataPad para uma planilha para análise de recuperação funcional. Calcule a recuperação funcional como uma porcentagem de seu respectivo valor basal 1,6,7.

Resultados

Os resultados da perfusão basal determinarão se o experimento inicial (pré-armazenamento) foi bem-sucedido. O fluxo aórtico exibido durante o modo de Langendorff deve estar entre 14 - 22 mL/min. O fluxo de Langendorff é exibido como um valor negativo no medidor de vazão devido à perfusão retrógrada da aorta. Um exemplo de um traço de Langendorff aceitável é mostrado na Figura 4A.

Uma vez alternado para o modo de trabalho, o fluxo aórtico deve ser de pelo menos 30 mL / min assim que o coração se estabilizar. É normal que o fluxo aumente inicialmente para aproximadamente 50 mL/min, depois diminua para aproximadamente 25 mL/min antes de aumentar de volta para um fluxo aórtico basal estável. Uma vez que os parâmetros basais sejam satisfatórios (FA > 30 mL/min, FC 10-20 mL/min, FC 200-300 bpm), o coração pode ser armazenado. Um exemplo de um bom traçado de linha de base é mostrado na Figura 4B.

Dependendo da solução de preservação testada, alguns corações não produzirão uma boa recuperação após armazenamento estático prolongado a frio, apesar de terem uma excelente linha de base. Um exemplo de um traço indicando recuperação ruim no modo de trabalho é mostrado na Figura 4C.

A recuperação funcional final do fluxo aórtico pode ser calculada com base na leitura final do fluxo aórtico como uma porcentagem do valor basal. Por exemplo, se a FA basal do coração foi de 40 mL/min e a FA no final da reperfusão após armazenamento estático frio foi de 20 mL/min, a recuperação da FA para esse coração foi de 50%. Um exemplo dessa representação de dados é mostrado na Figura 5.

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Figura 1: Circuito de perfusão cardíaca em funcionamento. (A) Foto do circuito de perfusão cardíaca de rato em funcionamento isolado. A caixa vermelha indica onde o coração isolado está posicionado. (B) Esquema do circuito de perfusão cardíaca de trabalho isolado indicando a direção do fluxo do tampão KH através do circuito para perfusão de Langendorff (linha pontilhada) e modo de trabalho (linha sólida). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Configuração do software LabChart. (A) Configuração das configurações do canal para pressão aórtica, fluxo aórtico e frequência cardíaca. (B) Exemplo de modelo LabChart configurado com três canais. As janelas à direita mostram cada canal individual configurado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Canulação e cardioplegia. (A) Canulação do coração antes de ser colocada dentro da câmara da camisa de água. A cânula esquerda é inserida na aorta e a cânula direita é inserida no ventrículo esquerdo através do apêndice atrial esquerdo. Os vasos pulmonares foram amarrados e o tecido pulmonar dissecado. (B) Após a administração da cardioplegia, o coração é colocado em um béquer contendo a solução de cardioplegia. As cânulas foram presas com clipes de buldogue antes de se desconectarem da plataforma. (C) Exemplo de corações colocados dentro de uma caixa de gelo para armazenamento refrigerado prolongado. Aqui, dois corações foram armazenados para reperfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Exemplos de rastreamentos do LabChart. Traços de pressão (gráfico vermelho), fluxo aórtico (gráfico azul) e frequência cardíaca (gráfico verde) para um coração com (A) Bom traço de Langendorff, (B) Boa recuperação durante a reperfusão no modo de trabalho, (C) Má recuperação durante a reperfusão no modo de trabalho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Gráficos representativos da recuperação funcional. (A) fluxo aórtico, (B) fluxo coronariano, (C) débito cardíaco e (D) frequência cardíaca. Essa figura foi reutilizada com permissão de Gao et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Dada a natureza sensível da função basal do coração, deve-se tomar cuidado para manter o equipamento de perfusão limpo e com componentes compatíveis. Por exemplo, o tubo de PVC correto deve ser usado. Alguns materiais de tubulação, como silicone, podem contribuir para menor fluxo aórtico e contratilidade, o que pode ser devido à perda de oxigênio através da tubulação. Embora existam circuitos isolados de perfusão cardíaca de ratos disponíveis comercialmente, a maioria deles é usada principalmente apenas para perfusão de Langendorff. Geralmente, as medições funcionais podem ser obtidas em um modelo de perfusão de Langendoff por meio da inserção de um cateter-balão no ventrículo esquerdo para obter medições da pressão diastólica do ventrículo esquerdo (PDFVE). No entanto, a capacidade de medir as medições do fluxo aórtico bruto e do débito cardíaco em um sistema de perfusão de Langendoff não é possível. Uma das principais vantagens do protocolo de RHI é a capacidade de obter medidas funcionais do fluxo aórtico e do débito cardíaco sem a necessidade de intervenções adicionais do coração (ou seja, cateter balão). Existem opções comerciais para um sistema de perfusão cardíaca de rato em funcionamento e, embora possam ser personalizáveis para requisitos de estudo individuais, esses sistemas podem ser caros.

Existem etapas críticas no protocolo para garantir a função basal ideal do coração do roedor durante a perfusão. A preparação das soluções de reserva reguladora de KHB não deve ter mais de 4 semanas. O circuito de perfusão deve estar livre de bolhas de ar durante a preparação. Deve-se ter cuidado ao canular o apêndice atrial esquerdo. O manuseio excessivo do tecido pode aumentar o risco de ruptura e também pode aumentar a irritabilidade funcional do coração.

A qualidade do desempenho do circuito de perfusão IRRH geralmente pode ser determinada pelas leituras basais obtidas nos corações (FA > 30 mL/min, CF ~20 mL/min). Podem ser realizados outros testes de controlo de qualidade num modelo CSS através da detenção e armazenamento do coração em solução de preservação Celsior suplementada com 1 μmol/L de zoniporida mais 0,1 mg/ml de trinitrato de glicerilo. Os corações parados com Celsior suplementado com trinitrato de glicerilo mais zoniporida garantem a recuperação imediata da reperfusão de Langendorff e uma recuperação funcional final entre 40-60% após 6 h de armazenamento refrigerado. Em caso de dúvida se a sonda está funcionando bem, esta suplementação de controle de qualidade é útil para testar.

Os métodos de uso de corações de roedores obtidos por doação após morte circulatória foram descritos anteriormente10,11. Resumidamente, os ratos são anestesiados, a artéria carótida canulada e as leituras de pressão obtidas. A heparina (500 UI) é injetada através da cânula da artéria carótida. A traqueia é ligada para iniciar a retirada do suporte de vida. Uma vez atingido o tempo isquêmico quente necessário, o coração pode ser excisado e canulado no circuito de perfusão. Para a administração da solução de preservação no coração DCD, 60 mL de solução de preservação são lavados através da aorta (~ 20 mL / min) através da linha de pressão no circuito. Os vasos pulmonares são amarrados, os pulmões são dissecados, a cânula esquerda é inserida e, em seguida, 40 mL de solução de preservação são lavados através da linha de pressão. O coração é então perfundido de acordo com o protocolo acima. A recuperação funcional é tomada como um valor bruto da hemodinâmica funcional, e a análise estatística é realizada comparando os valores com os corações que foram operados de forma simulada (sem DCD, no entanto, lavado na plataforma).

Os métodos de uso de corações de roedores obtidos após morte encefálica foram descritos anteriormente12. Resumidamente, os animais são anestesiados, intubados e ventilados, com monitorização hemodinâmica de acordo com o protocolo de roedores DCD. Um orifício de rebarba é realizado no crânio temporoparietal e um cateter de embolectomia 3F é colocado subduramente. Os controles simulados têm orifícios de rebarba, mas sem inserção de cateter. O balão é inflado com 0,3 mL de água durante 2 min e mantido inflado por 1 h. Após 1 h de observação hemodinâmica, os corações são explantados e colocados no circuito de perfusão cardíaca isolado, as medições basais são registradas, a cardioplegia é administrada e os corações são armazenados a frio conforme descrito acima.

A principal limitação do uso do circuito de perfusão IWRH é a incapacidade de usar um tampão de perfusão baseado em sangue para circular pelo sistema. Seria impossível obter sangue de roedor suficiente para adicionar ao perfusado; portanto, a perfusão baseada em sangue não é viável. Modelos alternativos, como transplante cardíaco heterotópico de roedores ou estudos de transplante cardíaco ortotópico de animais grandes, provavelmente precisariam ser realizados para testar o impacto da perfusão baseada no sangue. No entanto, esses métodos alternativos requerem experiência em habilidades microcirúrgicas e/ou instalações cirúrgicas de animais de grande porte e anestesistas, perfusionistas e cirurgiões cardiotorácicos experientes.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os estudos descritos aqui foram financiados por doações concedidas a PS Macdonald do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália, da Fundação da Clínica de São Vicente e da Bolsa de Investigador Sênior de Capacidade de Pesquisa Cardiovascular da NSW Health.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo Eppendorff incolor de 1,5 mL, 1000 por caixaBio Strategy Pty Ltd0030.125.150
15 mL cent/tubos (S) Sleeve/25 PP ctn/500Sigma-aldrich Pty LtdCLS430791-500ea
BP Transdutor/Kit de cabosADInstrumentsMLT1199Data Acquisition
Bridge AmpADInstrumentsFE221Data Acquisition
Carbogen 555G2Termômetro BOCBOC002
Checktemp1Hanna InstrumentsHI98509Grampo de Construção de Rig
Pinch 1/4-7/16 PK 12Thomas Scientific2848Y40
W/Extensão Haste Med.Thomas Scientific8847T08Grampo de Construção de Rig
com Haste de Extensão Sm.Thomas Scientific8847T02Rig Construction
Clips, Vaso, 60 g PressãoCoherent Scientific14121Equipamento
Cirúrgico Conector FechadoThomas Scientific8847E25Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 preto pré-cortado 45 cm caixa de 24Suprimentos Médicos EspecializadosS195Consumíveis Cirúrgicos
Personalizados 250 mL Desgaseificador EncamisadoConstrução de Rig Custom Blown Glassware Pty LtdN/ACustom
750 mL ReservoirBlown Glassware Pty LtdN/ARig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltraSigma-aldrich Pty LtdG7528-1KgPara fazer Krebs Buffer
Dual Channel ConsoleADInstrumentsTS402Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L 
Filtro Microfibra tipo GF/C fibra de vidro 47 mm, 100Bio-strategy Pty Ltd1822047
Pinça, 15 cm, 0,3 mm, CRVDCoherent Scientific14114Equipamento Cirúrgico
Grampos de Quatro Pinos com braço de 9 mm x 115 mm de comprimento para segurar objetos de 2-70 mm de diâmetro. AquecedorConstrução de EquipamentoCirculador Met-App Australia Pty Ltd1352
. Controle de estado sólido digital. (1020 Watts/240 Volts)Thermoline ScientificTU3Rig Construção
Heparina 5000 U/5 mL caixa 50 Pfizer 02112115Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd1258693Drogas
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mLCenvet Australia Pty LtdX5010Anestésico
Johns Hopkins Bulldog ClampCoherent Scientific CS-WPI-14117
Cetamina 100 mg/50 mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1Anestesésico
Sulfato de Magnésio heptahidratado AR 500 g ChemsupplyBio Strategy Pty LtdMA048-500gPara fazer o Adaptador Articulado Macho/Fêmea Krebs
Buffer Thomas Scientific8847V08Rig Construction
Masterflex L/S Cabeça de Carga Fácil para Tubos de Precisão, PPS, RotorCRSJohn Morris1015164Rig Construction
Tesoura Metzenbaum, 11,5 cm curvadaCoherent ScientificWPI-501748Equipamento cirúrgico
Tesoura Metzenbaum, 14,5 cm retaCoherent ScientificWPI-501252equipamento cirúrgico
F/2-HEADS SSJohn Morris1014414Parafusos de montagem para cabeças de bomba
Conector de lado abertoThomas Scientific8847E05
Paraformadeído deSigma-AldrichP6148-500GProcessamento de amostras
de Cloreto de Potássio (AnalaR NORMAPUR) 500 gVWR Chemicals 26764.26Para fazer o tampão Krebs
fosfato de potássio monobásico Sigma-Aldrich Pty LtdP5379-500gPara fazer Krebs Buffer
Powerlab 2/26, gravador de 2 canais + software LabchartADInstrumentsML826Hardware e Software de Computador
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XFADInstrumentsME4PXNRig Construction
Scalpel com cabo descartável #11 pkt/10BSN Medical (Aust) Pty Ltd73252-36
Junta de Silicone para Swinnex 47 mm 5/PKMerck MilliporeSX0004701Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PKMerck MilliporeXX1104707Rig Construction
Single Buret ClampThomas Scientific8847T32Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µ m (borbulhador)Sigma-aldrich59277Rig Construction
Sm. 360 Conector de RotaçãoThomas Scientific8847E35Rig Construction
Bicarbonato de sódioSigma-Aldrich Pty LtdS6297 - 250gPara fazer Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mmMerck MilliporeSX0004700Rig Construction
seringas 1 mL caixa/100Becton Dickinson Pty Ltd302100
Três Grampos de Pinos com braço de 9 mm de diâmetro x 125 mm de comprimento e parafuso duplo para segurar 5-80 mmMet-App Australia Pty Ltd1356Módulo
Medidor de Vazão de Tubulação de Construção de Equipamento TS410ADInstrumentsTS410Tubulação de Aquisição
de Dados PVC 6,35 mm ID x 9,52 mm OD 50ft Rolo 15,24m, claro, livre de ftalato DEHP, grau alimentício atende REACThermo FisherNAL 8701-0600Construção de plataformas
Tubulação PVC 7,94 mm ID x 11,1 mm OD 50 pés Rolo 15,24 m, claro, DEHP livre de ftalatos, grau alimentício atende REACThermo FisherNAL 8701-0900Tubulação de construção de plataforma
PVC 9,52 mm ID x 12,7 mm OD 100 pés RoloThermo FisherNAL 8701-4120Construção de plataforma
Tesoura Vannas, 8,5 cm, reta, lâminas de 7 mm CoherentScientificWPI-500-086Equipamento Cirúrgico
Banho-maria 30 litros com bandeja suspensaThermoline ScientificTLWB-30Rig Construction
Grampo de Construção de Rig Made Custom de revestido de vinil Hardware de montagem de Construção de Rig de

Referências

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