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Exame de piroptose por citometria de fluxo

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DOI:

10.3791/66912

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31 de maio de 2024

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1National Key Laboratory of Veterinary Public Health Security, 2Animal Epidemiology of the Ministry of Agriculture, 3College of Veterinary Medicine, China Agricultural University

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve a identificação de células piroptóticas usando citometria de fluxo após coloração dupla com anticorpos contra o fragmento N-terminal de GSDME de frango (chGSDME-NT) e iodeto de propídio (PI).

Resumo

A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada predominantemente impulsionada pela formação de poros da membrana plasmática pelo terminal N gerado a partir das proteínas da família Gasdermin clivada (GSDM). O exame de GSDM-NT ligado à membrana por Western Blot é o método mais comumente usado para avaliar a piroptose. No entanto, é difícil diferenciar células com piroptose de outras formas de morte celular usando este método. Neste estudo, células DF-1 infectadas pelo Vírus da Doença Infecciosa da Bursa (IBDV) foram empregadas como modelo para quantificar a proporção de células submetidas à piroptose por citometria de fluxo, utilizando anticorpos específicos contra o fragmento N-terminal da coloração GSDME de galinha (chGSDME-NT) e iodeto de propídio (PI). As células chGSDME-NT-positivas foram prontamente detectáveis por citometria de fluxo usando anticorpos anti-chGSDME-NT marcados com Alexa Fluor 647. Além disso, a proporção de células chGSDME-NT / PI duplamente positivas em células infectadas por IBDV (cerca de 33%) foi significativamente maior do que em controles infectados simulados (P < 0,001). Esses achados indicam que o exame de chGSDME-NT ligado à membrana por citometria de fluxo é uma abordagem eficaz para determinar células piroptóticas entre células submetidas à morte celular.

Introdução

A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada que depende principalmente da formação de poros da membrana plasmática pela Gasdermin (GSDM) D em mamíferos 1,2,3. Devido à deficiência genética de GSDMD em galinhas 4,5, o mecanismo de piroptose em galinhas permanece indefinido. A família Gasdermin compreende proteínas conservadas, incluindo GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 3,6. Estudos relataram que o GSDME de peixes teleósteos e patos é clivado por caspase-1/3/7 ou caspase-3/7 para induzir a morte celular piroptótica 7,8. No entanto, o papel da piroptose mediada por GSDME na resposta do hospedeiro a infecções patogênicas em galinhas ainda precisa ser elucidado.

A doença infecciosa da bursa (DII) é uma doença avícola aguda, altamente contagiosa e imunossupressora causada pelo IBDV9. O IBDV, um vírus de RNA de fita dupla (ds) bissegmentado não envelopado, pertence ao gênero Avibirnavirus da família Birnaviridae10. Estudos anteriores de outros e de nosso laboratório mostraram que a infecção por IBDV induz a morte celular em células hospedeiras por diferentes vias 11,12,13,14. Achados anteriores demonstraram que a infecção por IBDV desencadeia a liberação de lactato desidrogenase (LDH), um indicador de morte celular lítica 6,15, sugerindo que a infecção por IBDV induz a morte celular lítica em células hospedeiras. Além disso, os dados mostram que as células infectadas por IBDV exibem características morfológicas de morte celular piroptótica, incluindo inchaço celular com grandes bolhas soprando da membrana plasmática e coloração de iodeto de propídio (PI) positiva, sugerindo que a infecção por IBDV induz piroptose nas células.

Considerando que a formação de poros de membrana em células piroptóticas pelo fragmento N-terminal de GSDM clivado (GSDM-NT) é uma marca registrada da piroptose, teoricamente, as células piroptóticas poderiam ser detectadas por citometria de fluxo examinando GSDM-NT na membrana celular usando anticorpos específicos. Em células piroptóticas aviárias, o fragmento N-terminal de galinha Gasdermin E (chGSDME-NT) forma poros de membrana, permitindo que o iodeto de propídio (PI) passe e se ligue ao DNA. Assim, a proporção de células piroptóticas pode ser detectada por citometria de fluxo, distinguindo assim a piroptose de outras formas de morte celular, como apoptose e necrose. No entanto, o método de exame de células piroptóticas por citometria de fluxo não foi relatado. Neste estudo, as células DF-1 foram infectadas com IBDV, e a citometria de fluxo foi realizada para examinar células piroptóticas usando anticorpos monoclonais (McAb) contra o fragmento chGSDME-NT (ligado à membrana) e coloração PI. Surpreendentemente, as células piroptóticas foram efetivamente detectadas por citometria de fluxo. Além disso, a proporção de células piroptóticas pode ser quantificada. Essas descobertas fornecem um meio poderoso e eficaz para determinar a piroptose.

Este artigo descreve um método para examinar a piroptose em células infectadas por IBDV por citometria de fluxo usando coloração anti-chGSDME-NT McAb e PI. Este método também pode ser estendido a outras células infectadas por patógenos e aplicado para examinar vários tipos de células com piroptose, distinguindo-as de outras formas de morte celular.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de amostras de células

  1. Cultura de células DF-1 (fibroblastos de embrião de galinha imortal) em placas de seis poços (5 x 10,5 células por poço) com Meio de Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em uma incubadora de 5% de CO2 a 38 °C.
  2. Quando as células atingirem 80% de confluência, descarte o meio de cultura celular contendo soro, lave as células três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, adicione 2 mL de meio de cultura celular sem soro a cada poço.
  3. Adicione a solução de vírus IBDV (contendo MOI calculado) a cada poço e configure um controle infectado simulado adicionando o volume de DMEM igual ao da solução de vírus.
  4. Após 1 h de adsorção do vírus, descarte o meio de cultura, lave as células com PBS três vezes, adicione 2 mL de DMEM suplementado com 2% de FBS em cada poço e continue as culturas celulares por 24 h.
  5. 24 h após a infecção por IBDV, realizar tratamento com tripsina (500 μL por poço) por 1 min e posteriormente neutralizar por DMEM suplementado com 10% de FBS (2 mL por poço). Posteriormente, as células devem ser colhidas para preparar suspensões de célula única para citometria de fluxo.
  6. Centrifugue as células a 400 x g durante 5 min a 2-8 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.
  7. Ressuspenda o pellet celular em PBS e subtraia suavemente os tubos por 3 s.
  8. Centrifugue as células conforme descrito na etapa 1.6 (400 x g por 5 min a 2-8 °C).
  9. Repita a lavagem das células conforme descrito na etapa 1.7 e na etapa 1.8.
  10. Realize a contagem de células usando um hemocitômetro sob um microscópio. Em seguida, ressuspenda as células em um volume apropriado de tampão de coloração por citometria de fluxo (de modo que a concentração final da célula seja de 1 x 107 células / mL). Agite suavemente as suspensões.

2. Coloração celular para citometria de fluxo

  1. Adicione 100 μL das suspensões unicelulares da etapa 1.10 em tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (12 mm × 75 mm). Prepare células infectadas com simulações e IBDV para coloração de anticorpos anti-chGSDME-NT/CT e use IgG normal de camundongo como controle de isotipo. Enquanto isso, prepare o controle em branco e os tubos corados com células infectadas por IBDV.
  2. Adicione 1 μg de Alexa Fluor 647 marcado com anti-chGSDME-NT McAb, anti-chGSDME-CT McAb ou IgG normal de camundongo (como controle de isotipo) a tubos infectados por IBDV e controle simulado, respectivamente. Em seguida, agite suavemente os tubos por 3 s.
  3. Incube as células coradas a 2-8 °C ou no gelo por 30 min no escuro. Suavemente tubos de vórtice a cada 10 min.
  4. Lave as células com 1 ml de tampão de coloração por citometria de fluxo por centrifugação a 400 x g durante 5 min a 2-8 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.
  5. Repita a lavagem das células conforme descrito na etapa 2.4.
  6. Ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo.
  7. Corar as células do grupo infectado por IBDV e do grupo infectado simulado, bem como os tubos corados com IP simples, com 10 μg/mL de PI por 10 min à temperatura ambiente, seguido pela adição de 400 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo para o ensaio de citometria de fluxo.

3. Realização do ensaio de citometria de fluxo

  1. Ligue o citômetro de fluxo para inicializar o instrumento e iniciar o software.
  2. Comece executando o tubo de controle em branco seguido pelos tubos corados individuais para ajustar os parâmetros de tensão e compensação do citômetro de fluxo. Utilize os canais de fluorescência FL3 e FL4, que emitem a 635 nm, para detectar fluoróforos PI e Alexa Fluor 647, respectivamente.
  3. Depois de configurar todos os parâmetros, execute todos os exemplos sequencialmente.

4. Análise dos dados de citometria de fluxo

  1. Analise a coloração Alexa Fluor 647 de cada amostra no histograma do canal FL4.
  2. Para avaliar a proporção de células duplamente positivas em cada amostra, utilize o gráfico de pontos de quatro quadrantes de FL3/FL4.
  3. Defina limites positivos com base em amostras de coloração dupla IgG/PI de controle de isotipo, garantindo que a proporção de células duplamente positivas permaneça abaixo de 1%. Essa abordagem facilita a medição da proporção de células duplamente positivas em todas as amostras.

Resultados

chGSDME-NT na membrana de células DF-1 com infecção por IBDV pode ser prontamente detectado por citometria de fluxo
Uma das características mais importantes das células piroptóticas é a formação de poros de membrana por fragmentos de GSDM-NT gerados a partir da clivagem de Gasdermin. Portanto, as células piroptóticas poderiam teoricamente ser detectadas por citometria de fluxo por meio do exame de GSDM-NT em membranas celulares usando anticorpos específicos. Assim, as células DF-1 foram infectadas com IBDV, e as células piroptóticas foram examinadas por citometria de fluxo usando coloração anti-chGSDME-NT McAb e PI marcada com Alexa Fluor 647. Um número considerável de células positivas para chGSDME-NT foi detectado por citometria de fluxo após a infecção por IBDV (Figura 1). Em contraste, controles simulados ou células coradas com IgG de controle de isotipo mostraram células Alexa Fluor 647-positivas mínimas. Esses achados demonstram a detecção eficaz e específica de chGSDME-NT ligado à membrana por citometria de fluxo. É importante notar que, como os fragmentos C-terminais de chGSDME clivado (chGSDME-CT) foram retidos dentro do citoplasma em vez de translocados para a membrana plasmática como chGSDME-NT, os fragmentos de chGSDME-CT foram quase indetectáveis por citometria de fluxo usando coloração de antígeno de superfície de membrana, o que estava de acordo com o fato de que a piroptose estava associada a fragmentos de chGSDME-NT ligados à membrana.

A piroptose em células DF-1 pode ser determinada por citometria de fluxo usando coloração dupla de células com anti-chGSDME-NT marcado com fluoresceína, McAb e PI
Quando as células foram duplamente coradas com Alexa Fluor 647 marcado com anti-chGSDME-NT McAb e PI, seguido de análise de citometria de fluxo nos canais de fluorescência FL3 e FL4, as células piroptóticas puderam ser determinadas pela coloração chGSDME-NT e PI sendo positiva. Como mostrado na Figura 2A,B, um número considerável de células chGSDME-NT positivas com infecção por IBDV foi detectado por ensaios de citometria de fluxo, e a proporção de células chGSDME-NT/PI duplamente positivas em células infectadas por IBDV (cerca de 33%) foi significativamente maior do que a de controles simulados (P < 0,001), sugerindo que a formação de poros de membrana pelo chGSDME-NT foi sincronizado com a ruptura das membranas celulares, fazendo com que essas células infectadas pelo IBDV sofressem morte celular piroptótica. Esses dados mostram claramente que a infecção por IBDV induz piroptose mediada por chGSDME em células hospedeiras. Já as células PI single-positivas podem representar outras formas de morte celular induzida pela infecção por IBDV. Portanto, o exame de chGSDME-NT formador de poros por citometria de fluxo fornece um método valioso para distinguir células piroptóticas daquelas submetidas a outras formas de morte celular.

figure-results-1
Figura 1: Exame de células ligadas a chGSDME-NT por citometria de fluxo. As células DF-1 foram simuladas infectadas ou infectadas com IBDV em um MOI de 1. 24 h após a infecção, as células foram colhidas e coradas com Alexa Fluor 647 marcado com Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT / anti-chGSDME-CT McAb ou isotipo controle IgG, e analisadas com citometria de fluxo. A coloração chGSDME-NT positiva no ensaio de citometria de fluxo demonstrou as células chGSDME-NT ligadas à membrana com piroptose induzida por IBDV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Exame de piroptose por citometria de fluxo usando coloração dupla com chGSDME-NT e PI. (A) Análise de gráfico de pontos de células piroptóticas por citometria de fluxo. As células DF-1 foram infectadas com IBDV em um MOI de 1. 24 h após a infecção, as células foram colhidas, coradas com Alexa Fluor 647 marcado com anti-chGSDME-NT / anti-chGSDME-CT McAb e PI e analisadas com citometria de fluxo. (B) A porcentagem de células piroptóticas em cada grupo em (A) foi plotada e analisada estatisticamente. A ANOVA de duas vias foi empregada para analisar a significância estatística. Os dados representaram três experimentos independentes e foram apresentados como médias ± o DP. ***P < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este artigo descreve um método eficaz para examinar a piroptose usando citometria de fluxo, obtida por meio da coloração dupla de células infectadas com Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT McAb e PI. Essa abordagem também pode ser aplicada em vários tipos de células para diferenciar a piroptose de outros tipos de morte celular, como apoptose e necrose.

A piroptose, um tipo inflamatório de morte celular programada dependente principalmente da formação de poros da membrana plasmática induzida por Gasdermin (GSDM) D em mamíferos 1,2,3, tem sido tradicionalmente avaliada por meio de métodos como liberação de LDH 6,15, características morfológicas16 e detecção de fragmentos de GSDM-NT / GSDM-CT por meio de ensaios Western Blot ou IFA17. No entanto, nenhum desses métodos quantifica com precisão a porcentagem de células piroptóticas. Este estudo aproveita os poros característicos da membrana plasmática em células piroptóticas formadas por fragmentos de GSDM-NT para desenvolver uma estratégia baseada em citometria de fluxo para sua determinação.

Quando as células foram duplamente coradas com chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 e PI e posteriormente analisadas por citometria de fluxo nos canais de fluorescência FL3 e FL4, a piroptose foi discernível por meio de dois parâmetros simultaneamente: coloração chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 indicando formação de poros da membrana plasmática pelo fragmento N-terminal de chGSDME clivado e coloração PI indicando ruptura da membrana plasmática. Os dados demonstram que a proporção de células chGSDME-NT / PI duplamente positivas em células infectadas por IBDV (aproximadamente 33%) foi significativamente maior do que em controles infectados simulados (P < 0,001).

O método experimental requer várias considerações para garantir precisão e confiabilidade. Em primeiro lugar, cada tubo de amostra usado para análise de fluxo deve conter pelo menos 1 x 106 células para manter a precisão da análise de fluxo. Dadas as várias etapas de lavagem no protocolo, é aconselhável aumentar o número inicial de células em cada tubo na etapa 2.1 de acordo, por exemplo, para 2 x 106 células. É crucial lidar com a lavagem e transferência de células com extremo cuidado para evitar interrupções não intencionais da integridade celular. Além disso, lembre-se de que a densidade celular, a concentração de anticorpos e a duração da operação podem influenciar as configurações ideais dos parâmetros. Portanto, é necessário ajustar os parâmetros e configurações do citômetro de fluxo com base nas condições experimentais específicas. Neste estudo, os parâmetros utilizados foram os seguintes: FSC AmpGain foi ajustado para 1,40 e tensão SSC foi ajustada para 490 V. A porta no gráfico FSC / SSC foi definida para cobrir todas as populações de células para análise subsequente de FL3 / 4 canais. As tensões de fluorescência foram ajustadas para 600 V para o canal FL3 (PI) e 600 V para o canal FL4 (Alexa Fluor 647). A compensação foi fixada em 38,0% entre os canais FL4 e FL3. A taxa de fluxo foi definida como 200 eventos/s, com um limite de evento definido em 10.000.

Auxiliada pela nova abordagem, essa compreensão do papel da piroptose mediada por GSDME na resposta do hospedeiro a infecções patogênicas em galinhas e nos mecanismos subjacentes avançou significativamente. Através do uso de anticorpos específicos, pudemos examinar chGSDME-NT formadores de poros via citometria de fluxo, distinguindo células piroptóticas de outras e facilitando a determinação da proporção de células submetidas a piroptose. Como resultado, este método oferece uma vantagem distinta sobre os ensaios Western Blot ou IFA na detecção de células piroptóticas.

No entanto, a limitação deste protocolo reside no uso do fragmento N-terminal de GSDME de galinha em células infectadas por IBDV como um modelo experimental para estudar a piroptose. No entanto, este estudo marca a primeira utilização bem-sucedida da citometria de fluxo para determinar a piroptose.

Em resumo, o método de citometria de fluxo descrito aqui para examinar a piroptose tem grande potencial para avançar nossa compreensão dos mecanismos por trás da piroptose em mamíferos e aves. Este método se destaca como uma ferramenta eficaz que contribui para a pesquisa sobre morte celular em ciências da vida.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Jue Liu por sua gentil assistência. Este estudo foi apoiado por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (nº 2022YFD1800300), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32130105) e do Fundo Destinado ao Sistema de Pesquisa Tecnológica da Agroindústria Moderna (nº. CARS-40), China.

Materiais

2
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (12 &vezes; 75 mm)Corning Falcon352052
Placa de Cultura de Células de 6 PoçosCorning3516
Alexa Fluor 647 kits de rotulagem de anticorposThermo Fisher ScientificA20186
Anti-chGSDME-CT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0228
Anti-chGSDME-NT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0227
Software CellQuestBD Biosciences
Centrífuga de Congelamento Criogênica
Gibco by Life TechnologiesC11995500BT
Soro Fetal Bovino (FBS)Sigma-AldrichF0193-500ML
Citômetro de FluxoBD BiosciencesFACSCalibur
Tampão de Coloração por Citometria de FluxoThermo Fisher Scientific00-4222-26
Qiu-jing Reagente Bioquímico & Instrument Company (Xangai, China)YX-JSB52
IBDV Lx cepaIBDV Lx cepa foi gentilmente cedida pelo Dr. Jue Liu, Academia de Agricultura e Silvicultura de Pequim, Pequim, China
Microscópio InvertidoChongqing Photoelectric Instrument CompanyXDS-1B
Normal Mouse IgGSanta Cruz Biotecnologiasc-2025
Tampão de fosfato salino (PBS)M& C  Tecnologia gênicaCC017
Iodeto de propídio (PI)Sigma-AldrichP4170
Tripsina-EDTA, 0,25%M & C  OsciladorCC008
MIULABMIX-28+
Incubadora de CO da Thermo Fisher Scientific 3100 Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)  de vórtice Gene Technology

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