Este artigo descreve a identificação de células piroptóticas usando citometria de fluxo após coloração dupla com anticorpos contra o fragmento N-terminal de GSDME de frango (chGSDME-NT) e iodeto de propídio (PI).
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Artigo de método
Exame de piroptose por citometria de fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada predominantemente impulsionada pela formação de poros da membrana plasmática pelo terminal N gerado a partir das proteínas da família Gasdermin clivada (GSDM). O exame de GSDM-NT ligado à membrana por Western Blot é o método mais comumente usado para avaliar a piroptose. No entanto, é difícil diferenciar células com piroptose de outras formas de morte celular usando este método. Neste estudo, células DF-1 infectadas pelo Vírus da Doença Infecciosa da Bursa (IBDV) foram empregadas como modelo para quantificar a proporção de células submetidas à piroptose por citometria de fluxo, utilizando anticorpos específicos contra o fragmento N-terminal da coloração GSDME de galinha (chGSDME-NT) e iodeto de propídio (PI). As células chGSDME-NT-positivas foram prontamente detectáveis por citometria de fluxo usando anticorpos anti-chGSDME-NT marcados com Alexa Fluor 647. Além disso, a proporção de células chGSDME-NT / PI duplamente positivas em células infectadas por IBDV (cerca de 33%) foi significativamente maior do que em controles infectados simulados (P < 0,001). Esses achados indicam que o exame de chGSDME-NT ligado à membrana por citometria de fluxo é uma abordagem eficaz para determinar células piroptóticas entre células submetidas à morte celular.
Introdução
A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada que depende principalmente da formação de poros da membrana plasmática pela Gasdermin (GSDM) D em mamíferos 1,2,3. Devido à deficiência genética de GSDMD em galinhas 4,5, o mecanismo de piroptose em galinhas permanece indefinido. A família Gasdermin compreende proteínas conservadas, incluindo GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 3,6. Estudos relataram que o GSDME de peixes teleósteos e patos ....
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Protocolo
Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de amostras de células
- Cultura de células DF-1 (fibroblastos de embrião de galinha imortal) em placas de seis poços (5 x 10,5 células por poço) com Meio de Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em uma incubadora de 5% de CO2 a 38 °C.
- Quando as células atingirem 80% de confluência, descarte o meio de cultura celular contendo soro, lave as células três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, e....
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Resultados
chGSDME-NT na membrana de células DF-1 com infecção por IBDV pode ser prontamente detectado por citometria de fluxo
Uma das características mais importantes das células piroptóticas é a formação de poros de membrana por fragmentos de GSDM-NT gerados a partir da clivagem de Gasdermin. Portanto, as células piroptóticas poderiam teoricamente ser detectadas por citometria de fluxo por meio do exame de GSDM-NT em membranas celulares usando anticorpos específicos. A.......
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Discussão
Este artigo descreve um método eficaz para examinar a piroptose usando citometria de fluxo, obtida por meio da coloração dupla de células infectadas com Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT McAb e PI. Essa abordagem também pode ser aplicada em vários tipos de células para diferenciar a piroptose de outros tipos de morte celular, como apoptose e necrose.
A piroptose, um tipo inflamatório de morte celular programada dependente principalmente da formação de poros da membrana plasmática indu.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Jue Liu por sua gentil assistência. Este estudo foi apoiado por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (nº 2022YFD1800300), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32130105) e do Fundo Destinado ao Sistema de Pesquisa Tecnológica da Agroindústria Moderna (nº. CARS-40), China.
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Materiais
2
Incubadora de CO da Thermo Fisher Scientific 3100 Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) de vórtice Gene Technology
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (12 &vezes; 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| Placa de Cultura de Células de 6 Poços | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 kits de rotulagem de anticorpos | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| Software CellQuest | BD Biosciences | ||
| Centrífuga de Congelamento Criogênica | |||
| Gibco by Life Technologies | C11995500BT | ||
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Citômetro de Fluxo | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Tampão de Coloração por Citometria de Fluxo | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Qiu-jing Reagente Bioquímico & Instrument Company (Xangai, China) | YX-JSB52 | ||
| IBDV Lx cepa | IBDV Lx cepa foi gentilmente cedida pelo Dr. Jue Liu, Academia de Agricultura e Silvicultura de Pequim, Pequim, China | ||
| Microscópio Invertido | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotecnologia | sc-2025 | |
| Tampão de fosfato salino (PBS) | M& C Tecnologia gênica | CC017 | |
| Iodeto de propídio (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Tripsina-EDTA, 0,25% | M & C Oscilador | CC008 | |
| MIULAB | MIX-28+ |
Referências
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Na....
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Reimpressões e permissões
